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MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CELÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA

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UNIVERSIDAD DE GRANADA HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN DE LAS NIEVES

DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA

MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CELÍACA.

RELEVANCIA CLÍNICA TESIS DOCTORAL GRANADA 2009

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR: Miguel Ángel López Casado Bajo la dirección de los doctores: Maria Isabel Torres López Julio Romero González Antonio Ríos Guadix Granada, 2009

Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Miguel Ángel López CasadoD.L.: Gr 3915-2009ISBN: 978-84-692-7863-5

MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA

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Agradecimientos: - En primer lugar quiero dar las gracias a Maruja López Gutiérrez sin cuya ayuda no habría iniciado este estudio - A la Dra. Mª Isabel Torres directora de esta tesis por su inestimable ayuda y entusiasmo durante los años que se ha llevado a cabo esta investigación. - Al Dr. Julio Romero González que me supo alentar y me apoyó en los momentos más bajos y sin cuya ayuda este trabajo no habría visto su fin. - A Miguel, Victor y Mamen por las horas que no les he dedicado. - A los pacientes celiacos y sus familiares por su colaboración. A mis padres


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PUBLICACIONES RELACIONADAS CON LA SIGUIENTE TESIS: 1: Torres MI, Lopez Casado MA, Rios A. New aspects in celiac disease. World J Gastroenterol. 2007 Feb 28;13(8):1156-61. Review. PMID: 17451193 [PubMed - indexed for MEDLINE] 2: Torres MI, Lopez-Casado MA, Lorite P, Rios A. Tryptophan metabolism and indoleamine 2,3-dioxygenase expression in coeliac disease. Clin Exp Immunol. 2007 Jun;148(3):419-24. Epub 2007 Mar 15. PMID: 17362267 [PubMed - indexed for MEDLINE 3: Torres MI, Lopez-Casado MA, Luque J, Peña J, Rios A. New advances in coeliac disease: serum and intestinal expression of HLA-G. Int Immunol. 2006 May;18(5):713-8. Epub 2006 Mar 28. PMID: 16569678 [PubMed - indexed for MEDLINE] 4: Torres MI, Lorite P, López-Casado MA, Ríos A.A new approach using tissue alkaline phosphatase histochemistry to identify Crohn's disease.

Pathol Res Pract. 2007;203(6):485-7. Epub 2007 May 10.

PMID: 17498884 [PubMed - indexed for MEDLINE]

5: M.I. Torres, M.A. López-Casado, J. Luque, J. Peña, A. Ríos. Soluble HLA-G expression in celiac disease. Tissue Antigens 68 (2006) 349–368


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MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CELÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA

INDICE--------------------------------------------- -------------------------------------- 4 I. Justificación y objetivos------------------------------------------------------ 8 I.1. Antecedentes del tema.-------------------------------------------------------- 8 I.1.1. Complejo Mayor de Histocompatibilidad.-------------------------------- 9 I.1.2. Citoquinas.---------------------------------------------------------------------- 9 I.1.3. Células Th.----------------------------------------------------------------------- 10 I.1.4. Molécula de HLA_G. --------------------------------------------------------- 11 I.1.5. Enzima IDO. ------------------------------------------------------------------- 12 I.2. Objetivos.----------------------------------------------------------------------- 13 II. Introducción. --------------------------------- --------------------------------- 14 II.1. Concepto de enfermedad celiaca. ----------------------------------------- 14

II.2. Epidemiología. --------------------------------------------------------------- 18

II.2.1. Prevalencia.-------------------------------------------------------------------- 19

II.2.2. El Iceberg celiaco.------------------------------------------------------------- 21

II.3. Formas de presentación Clínica de la E. Celiaca. -------------------- 22

II.3.1. Enfermedad celiaca clásica. ----------------------------------------------- 23

II.3.2. Forma de comienzo precoz. ----------------------------------------------- 24

II.3.3. Formas No clásicas de la Enfermedad celiaca. ------------------------ 25

II.3.3.a. Enfermedad celiaca silente. --------------------------------------- 26

II.3.3.b. Enfermedad celiaca latente. --------------------------------------- 26

II.3.3.c. Enfermedad celiaca potencial. -------------------------------------- 27

II.3.3.d. Enfermedad celiaca Refractaria. Esprue refractario. ---------- 27

II.3.4. Cáncer/linfoma. --------------------------------------------------------------- 29

II.3.5. Mortalidad y Morbilidad. ------------------ ----------------------------------- 29

II.3.6. Infertilidad. ----------------------------- ---------------------------------------- 30

II.3.7. Desórdenes Autoinmunes asociadas a la EC. --------------------------- 30

II.3.8. Manifestaciones Hematológicas. ------------------------------------------ 31

II.3.9. Manifestaciones dermatológicas. ----------------------------------------- 31

II.3.9.a. Dermatitis Herpetiforme. ------------------------------------------- 31

II.3.10. Manifestaciones Endocrinas. ----------------------------------------- 32


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II.3.10.a. Diabetes mellitus insulindependiente. ------------------------------ 32

II.3.10.b. Manifestaciones tiroideas. -------------------------------------------- 33

II.3.10.c. Alteraciones en la mineralización ósea. ----------------------------- 33

II.3.11.Deficiencia selectiva de IgA. ---------------------------------------------- 34

II.3.12. Manifestaciones neurológicas.------------------------------------------- 35

II.3.12.a. Epilepsia.------------------------------------------------------------------ 35

II.3.12.b. Ataxia cerebelosa. ---------------------------------------------- 35

II.3.13. Manifestaciones reumatológicas. ---------------------------------------- 35

II.3.13.a. Artritis reumatoide. --------------------------------------------------- 35

II.3.13.b. Síndrome de Sjögren. ----------------------------------------------- 35

II.3.14. Manifestaciones digestivas.------------------------------------------------- 35

II.3.14.a. Alteraciones hepáticas. --------------------------------------------- 35

II.3.14.b. Enfermedad inflamatoria intestinal.------------------------------ 36

II.3.15.Hipoplasia del esmalte dentario.----------------------------------------- 37

II.3.16.Retraso del crecimiento. -------------------------------------------------- 37

II.3.17.Manifestaciones genéticas. ------------------------------------------------ 37

II.3.17.a.Síndrome de Down. ------------------------------------------------------ 37

II.4. Patogénesis de la Enfermedad celiaca. --------------------------------- 38

II.4.1. Factores ambienteales. ---------------------------------------------------- 40

II.4.1.1 Procesamiento de péptidos de unión a la molécula HLA DQ2.------ 43

II.4.1.2. Activación de LT CD4+ específicos de gluten de la lámina propia. 44 II.4.2. Tolerancia inmune (oral) --------------------------------------------------- 46

II.4.3. MHC Molécula de histocompatibilidad No Clásica: HLA-G.------- 47 II.4.3.1. Estructura de la molécula HLA-G y sus diferentes isoformas -- 49

II.4.3.2.Proteína HLA-G1.--------------------------------------------------------- 50

II.4.3.3.Proteínas HLA-G2.-G3 y –G4. ----------------------------------------- 51

II.4.3.4.Proteínas HLA-G5, G6 y G7. -------------------------------------------- 51

II.4.3.5.Papel de HLA-G in vivo.-------------------------------------------------- 53

II.4.3.6.HLA-G: molécula de tolerancia inmune.------------------------------ 53

II.4.3.7. Polimorfismo HLA-G. ------------------------------- -------------------- 55

II.4.4. Citokinas y Enfermedad celiaca.----------------------------------------- 55

II.4.5. Inmunogenetica: Variantes Alélicas implicadas. ---------------------- 59 II.5. Dagnóstico de la enfermedad celiaca.----------------------------------- -- 60


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II.5.1. Anticuerpos asociados con la enfermedad Celiaca.----------------- 61

II.5.2. Diagnóstico Diferencial.------------------------------------------------- 63

III. Material y Métodos. ------------------------- -------------------------- 65

III.1. Muestra. --------------------------------------------------------- 65 III.1.a. Pacientes. -------------------------------------------------------- 65 III.2. Diseño.------------------------------------------------------------ 65 II.2.1. Análisis estadístico. -------------------------------------------- 65 III.3. Método.----------------------------------------------------------- 66 III.3.1. Análisis serológicos e histológicos. ------------------------- 66 III.3.2. Análisis inmunohistoquímica. ------------------------------ 67 III.3.3. Tinciones Inmunohistoquímicas en IDO, TGF-β e Il-10 67 III.4 Técnicas inmunohisquímicas para estudio de la expresión de HLA-G, IDO,TGF-β e IL-10. ------------------------------ 68 III.5. Técnica de ELISA para estudio de isoformas de sHLA-G 72 III.6. Estadística.-------------------------------------------------------- 75 III.7. HPLC. Medición de triptófano, kinurenina y cociente k/T 75 IV. Resultados. ------------------------------------------------------- 77 IV.1. Diagnóstico. ------------------------------------------------------ 79 IV.1.1 Análisis serológicos e histológicos. --------------------------- 79 IV.1.1.a. Estudios serológicos. ------------------------------------------- 79 IV.1.1.b. Biopsia de intestino delgado. ---------------------------------- 79 IV.1.2 Expresión de HLA-G en biópsia intestinal. --------------------- 86 IV.1.3. Resultados de ELISA. ------------------------------------------ 87 IV.1.4. Estudios de polimorfismo 14-BP del Gen HLA-G.------- 90 IV.1.5. Expresión de citoquinas. ------------------- ------------------ 93 IV.1.6. Incremento de IL-17, IL-22 e IL-23. --------------------------- 95

IV.1.7. Expresión IDO en pacientes celiacos. ------------------------- 97

IV.1.8 . Concentración de triptófano y kinurenina. Cociente K/T. -- 98 V. Discusión. ------------------------------------------------------------------------- 102 V.1. Diagnóstico y prevalencia. ----------------------------------------------------- 102 V.2. Tolerancia. ------------------------------------------------------------------------ 103 V.3. Linfocitos. ------------------------------------------------------------------------- 105 V.4. Citoquinas. ------------------------------------------------------------------------ 105 V.5. HLA-G. ---------------------------------------------------------------------------- 107 V.6. Polimorfismo HLA-G. --------------------------------------------------------- 109 V.7. Expresión IDO y metabolismo del triptófano. ---------------------------- 110 V.8. Futuras direcciones. ----------------------------------------------------------- 113 VI. Conclusiones. -------------------------------------------------------------------- 115 VII. Bibliografía.-------------------------------- --------------------------------------- 117


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VIII. ANEXOS

Lista de abreviaturas:

HLA: antígenos leucocitarios humanos

IFNγ: interferón gamma

TH1: T helper 1

IL-15: interleuquina 15

IEL: linfocitos intraepiteliales

AGA Anticuerpos antigliadina

AEMA Anticuerpos antiendomisio

IMC Indice de masa corporal

EC Enfermedad celiaca

EMA Anticuerpo endomisio

sHLA-G HLA-G soluble

tTG Ac Anticuerpo antitransglutaminasa tisular

TG2 Transglutaminasa 2


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I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD

CELÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA.

I.1 Antecedentes del tema:

La enfermedad celiaca (EC) puede clasificarse clínica y biológicamente como

una enfermedad autoinmune, en la que influyen componentes genéticos, ambientales e

inmunológicos [Sollid, LM. 2002 & Alaedini, A, 2005]. Se caracteriza por una

respuesta inmune anormal frente a las prolaminas del trigo y otros cereales, como

centeno y cebada, que afecta a personas genéticamente susceptibles y se manifiesta por

una lesión intestinal con atrofia vellositaria, hiperplasia de criptas e infiltrado celular

inflamatorio. [Alaedini A, 2005 & Robins, G. 2005] El elemento central de la patogenia

son las células T CD4+ de la lámina propia, que reconocen péptidos de gliadina

modificados por el enzima Transglutaminasa 2 (TG2), con restricción HLA-DQ2/DQ8,

y liberan citoquinas implicadas en la inflamación y el desarrollo de las alteraciones

histológicas, además, la inmunidad innata podría desempeñar un papel importante en la

inflamación inicial. [Robins, G. 2005]

La enfermedad celiaca es una alteración enteropática caracterizada por tener una

fuerte asociación con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (HLA DQ).

Así, para el diagnóstico clínico de la enfermedad celiaca es frecuente emplear los

marcadores séricos HLA tipo II DQ2, DQ8 y DR, con el inconveniente de que estas

moléculas son altamente polimórficas y varían ampliamente de un individuo a otro.


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I.1.1 MOLECULAS COMPLEJO MAYOR HISTOCOMPATIBILIDAD

El complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) es el sistema genético más

polimórfico que se conoce, las moléculas del CMH de tipo I y II clásicas tienen un

papel fundamental en la inducción de una respuesta inmune específica mediante la

presentación de antígenos a las células T.

El complejo mayor de histocompatibilidad tipo I está compuesto de dos

antígenos diferentes: Los de tipo I clásicos, entre los que consideramos HLA-A, B y C ,

los cuales son los responsables de la identificación y de los mecanismos de defensa, y

los de tipo I no clásicos (HLA-E, F y G) que participan en la tolerancia inmune.

Dentro de estas moléculas llamadas no clásicas destacamos el papel de HLA-G por ser

una molécula de bajo grado de polimorfismo y de restringida distribución celular.

Se ha demostrado que la EC se asocia con la expresión de HLA-DQ2 y HLA-

DQ8. [Kim, CY 2004 & Louka, AS.2003] Además, la trasnglutaminasa 2 (TG2) puede

jugar un importante papel en el desarrollo de la EC, actuando como enzima de

deamidación y es el blanco autoantigénico en la respuesta inmune. [Freitag, T. 2004 &

Reif, S. 2004]

La exposición a la gliadina y prolaminas relacionadas en humanos con un

haplotipo HLA-DQ apropiado es necesaria pero no suficiente para el desarrollo de esta

enfermedad.

I.1.2. Citoquinas

En el paciente celiaco, junto a esta respuesta inmune adaptativa al contacto con

el gluten, se produce también una respuesta inmune innata al gluten en la que la

expresión local de la interleuquina 15 media la linfocitosis intraepitelial y la destrucción

de vellosidades, ambas propias de la EC. [Londei, M. 2004] La activación de los

Linfocitos T inducida por el gluten probablemente constituye un evento clave en el

desarrollo de la enfermedad. [Watson, RGP. 2004].

Verdaderamente, en pacientes celiacos la activación del sistema inmune

adaptativo probablemente pueda producirse al encontrar la gliadina en el intestino


10

delgado. [Leon, F. 2005. & Forsberg, G.2002] Además de esta hipersensibilidad para la

gliadina mediada por linfocitos T, la secreción de citoquinas también contribuye a la

lesión observada en esta patología. De hecho, las citoquinas juegan un papel central en

el desarrollo de una respuesta inmune a través de su efecto regulador en las células

inmunes, tales como los linfocitos Th y monocitos.

La Interleuquina 10 (IL-10) ejerce un papel inmunomodulador fundamental en la

inflamación de la mucosa intestinal, además regula a las moléculas del complejo mayor

de histocompatibilidad, y según algunos autores parece inducir la expresión de HLA-G,

estimulando la expresión de moléculas que son requeridas por parte de las células

presentadoras de antígenos y las interacciones de estas con las células T, y

conjuntamente con el factor de crecimiento transformador-alfa aumentan la secreción

de IgA por los linfocitos T activados e inhiben la síntesis de citoquinas

proinflamatorias: factor de necrosis tumoral-beta, IL-1b e IL-6 por los monocitos.

[Forsberg, G. 2002]

I.1.3. Células Th

En el intestino de los pacientes con EC, se observa una polarización Th1, con

predominio de interferón gamma (IFN-γ), e incremento de la expresión de factor del

crecimiento transformador beta (TGFβ), aunque la activación humoral (Th2) es

detectada también en la EC. En la EC los linfocitos T reactivos al gluten reconocen

predominantemente péptidos del gluten en los que los residuos de glutamina han sido

convertidos en ácido glutámico por la desaminación mediada por la transglutaminasa

tisular TG2. [Molberg, O.1998]

La activación de los linfocitos T CD4+ probablemente representa el elemento

clave en el desarrollo de la enfermedad, de otro lado, la EC está siempre asociada con el

heterodimero HLA DQ por los alelos DQA1*0501 y DQB1*0201, aunque estos genes

no explican por entero la susceptibilidad genética de la intolerancia al gluten. [Sollid,

L.2005]


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I.1.4. Molécula HLA-G

El gen del antígeno de histocompatibilidad humana HLA-G es una molécula de

tolerancia inmune implicada en diversas enfermedades inflamatorias, se ha sugerido

que los antígenos HLA-G pueden desempeñar un papel protector en la inflamación.

[Carosella, ED. 2001 & Torres, MI. 2004]

En tumores, la expresión HLA G les confiere protección frente a la actividad de

las células NK y T, pudiendo impedir la eliminación de las células tumorales por parte

de las células efectoras. En trasplantes cardiacos, la presencia de HLA G reduce de

forma significativa los rechazos agudos y muestra una total ausencia de los rechazos

crónicos. Cambios en los niveles de antígenos HLA en su forma soluble se han

relacionado con enfermedades autoinmunes, así se ha encontrado expresión de HLA-G

en enfermos con psoriasis y en procesos inflamatorios, habiendo expresión en las fibras

musculares en miopatías inflamatorias. En definitiva, podemos considerar HLA-G como

una molécula implicada en la tolerancia inmune. Esta molécula se expresa de forma

selectiva en los citotrofoblastos en la interfase feto-materna, los cuales pierden la

expresión de las moléculas del complejo de histocompatibilidad tipo I clásicos como la

HLA A y B. [Le Bouteiller, P.2003 & Hunt, J. 2000]

El gen HLA-G transcribe al menos siete isoformas diferentes de HLA-G

mRNAs: cuatro isoformas de HLA-G ligadas a la membrana, llamadas HLA-G1, -G2, -

G3 y -G4, y tres proteínas solubles, llamadas HLA-G5, -G6 y -G7. [Paul, P. 2000]

La presencia de HLA-G soluble (sHLA-G) en el fluido cerebroespinal en la

esclerosis múltiple [Fainardi,E.2003] y la aceptación del aloinjerto después del

trasplante [Lila,N.2001& Marchal-Brass,2001] sugieren una función tolerogénica para

esta molécula contra la respuesta inmune innata y celular adaptativa.

La molécula HLA-G ejerce un papel protector frente a la actividad lítica llevada

a cabo por las células natural killer (NK) de la decidua uterina, protegiendo al feto de

ser rechazado por la madre, creando un estado de tolerancia, induciendo la apoptosis de

los linfocitos T CD8+ y CD4+ efectoras aloproliferativos. [Rouas-Freiss,N.1997&

Bainbridge,DR.2000]


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HLA-G interacciona con las células NK inhibiendo su función lítica mediante la

interacción con los receptores KIRs, incluyendo IL T2, IL T4 y P49.

I.1.5. Enzima IDO

La IDO (indolamina 2,3-dioxigenasa) es una enzima intracelular contenida en la

hemoglobina que cataliza la degradación del triptófano a través de la vía de la

kinurenina. [Taylor,MW.1991] El triptófano es el único aminoácido cuyo metabolismo

ha sido relacionado con autoinmunidad. Diversos estudios han demostrado que el

catabolismo del triptófano ocurre en sitios de inflamación tisular y la expresión IDO

puede mejorar el daño tisular en estos lugares por ser antiinflamatoria. [Mellor et all,

1999. 2003] propone que IDO podría producir en las células un papel preventivo en la

iniciación de desórdenes autoinmunes. Sin embargo, cada desorden autoinmune es

establecido por la presencia de inflamación crónica que puede provocar una producción

sostenida de IDO y el fracaso de la IDO puede limitar la disregulación inmune bajo

estas condiciones patológicas. Diversos mediadores inflamatorios, incluyendo el más

potente, interferon (IFN)-γ, induce producción IDO. El estudio de [Wolf et al 2004]

proporciona la primera evidencia de que la enzima antiinflamatoria IDO está

sobreexpresada en las biopsias alteradas de los pacientes con enfermedad inflamatoria

intestinal y también ha demostrado que las citoquinas relacionadas con los linfocitos T

helper 1 (Th1) tales como IFN-γ y el Factor de necrosis tumoral (TNF)-α son potentes

inductores de la expresión IDO.


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I.2. OBJETIVOS

OBJETIVO PRINCIPAL : Analizar los posibles mecanismos implicados en el desarrollo de la enfermedad celiaca y de la tolerancia inmunológica 1. Realizar el diagnóstico de la enfermedad: 1.1.Analizar marcadores inmunes serológicos (anti gliadina (AGA), anti endomisio (EMA), anti transglutaminasa tisular (TGT) 1.2. Analizar marcadores genéticos. Tipaje HLA 1.3.Realizar inmunofenotipaje de los linfocitos intraepiteliales 1.4. Obtener mediante endoscpopia y realizar el análisia histológico de la biopsia intestinal. 1.5. determinar pacientes con enfermedades asociadas a la enfermedad celíaca (Síndrome de Down, diabetes, tiroidismo,etc--..) 1.6. detectar familiares en primer grado de pacientes con enfermedad celíaca.

2). Determinar la expresión de citoquinas en la enfermedad celíaca:

2.1 Determinar la expresión de IL-10.

2.2 Determinar la expresión INF-gamma

2.3 Determinar la expresión TGF-beta 2.4 Determinar la expresión Complejo Th17 (IL-17, IL-22, IL-23) 3. Determinar la expresión de antígenos de superficie de linfocitos T intraepiteliales: 3.1 Determinar CD3, CD4 y CD8 4. Determinar la expresión de moléculas implicadas en la tolerancia inmune: 4.1 molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) clase I no clásico :HLA-G 4.2 Indoleamina 2, 3-dioxygenasa (IDO) 5: Analizar el posible papel del metabolismo del triptófano y la actividad del enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la regulación immune de la enfermedad celiaca (EC 5. Determinar si existe una asociación entre polimorfismo del gen HLA-G y la susceptibilidad para padecer enfermedad celíaca


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II. INTRODUCCIÓN

II.1 CONCEPTO DE ENFERMEDAD CELIACA

La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía sensible al gluten que se define

como una intolerancia permanente a la fracción proteica del gluten, (gliadinas,

secalinas, hordeínas y, posiblemente, aveninas) que da lugar a una lesión severa

característica de la mucosa del intestino delgado proximal en individuos genéticamente

predispuestos, que ocasiona un defecto en la utilización de nutrientes (principios

inmediatos, sales y vitaminas) en el tracto digestivo, con una repercusión clínica

variable. Actualmente la enfermedad celíaca basa su diagnóstico en el hallazgo

alteraciones específicas en la mucosa intestinal. Sin embargo, la descripción, por una

parte, de marcadores serológicos (autoanticuerpos) de elevada especificidad y

sensibilidad, y por otra de los genes del sistema HLA (HLA-DQ2/DQ8) que se

comportan como un marcador de susceptibilidad genética de la enfermedad, nos han

permitido identificar las formas no típicas de la enfermedad, así como aumentar el

diagnóstico entre los familiares de celíacos y entre pacientes con enfermedades de

reconocida asociación a la enfermedad celíaca. Hoy se considera la intolerancia

alimentaria más frecuente en nuestro medio con una prevalencia estimada del 0,5-1%.

[Sollid, LM. 2002 & Alaedini, A. 2005]

La enfermedad celiaca (EC) puede clasificarse clínica y biológicamente como

una enfermedad autoinmune, en la que influyen componentes genéticos, ambientales e

inmunológicos. [Sollid, LM. 2002 & Alaedini, A. 2005] Se caracteriza por una

respuesta inmune anormal frente a las prolaminas del trigo y otros cereales, como

centeno y cebada, que afecta a personas genéticamente susceptibles y se manifiesta por

una lesión intestinal con atrofia vellositaria, hiperplasia de criptas e infiltrado celular

inflamatorio. [Alaedini, A. 2005 & Robins, G. 2005] El elemento central de la

patogenia son las células T CD4+ de la lámina propia, que reconocen péptidos de

gliadina modificados por la enzima de la Transglutaminasa 2 (TG2), con restricción

HLA-DQ2/DQ8, y liberan citoquinas implicadas en la inflamación y el desarrollo de las

alteraciones histológicas, además, la inmunidad innata también podría desempeñar un

papel importante en la inflamación inicial. [Robins, G. 2005]


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La enfermedad celiaca es una alteración enteropática caracterizada por tener una

fuerte asociación con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (HLA DQ).

Así, para el diagnóstico clínico de la enfermedad celiaca es frecuente emplear los

marcadores séricos HLA tipo II DQ2, DQ8 y DR, con el inconveniente de que estas

moléculas son altamente polimórficas y varían ampliamente de un individuo a otro.

Hoy la definición moderna de enfermedad celiaca es: enteropatía del intestino

delgado mediada por linfocitos T inducida por el gluten en individuos genéticamente

predispuestos.

La enfermedad es desencadenada en estas personas genéticamente vulnerables

tras ingerir alimentos que contienen proteínas del trigo, centeno o cebada. En la llamada

forma clásica de la enfermedad, los síntomas aparecen en una fase temprana de la vida

tras introducir estos cereales en la dieta, suele cursar con diarrea, malnutrición,

distensión abdominal, rechazo del alimento, carácter huraño. La supresión del gluten

mejora la sintomatología y normaliza la lesión intestinal para reaparecer sí se

reintroduce éste. La intolerancia al gluten de estos sujetos se mantiene a lo largo de toda

la vida. Parece ser que la introducción temprana de estos cereales en la dieta de

personas susceptibles, son factores de riesgo para su desarrollo.

El criterio diagnóstico que permite confirmar definitivamente la existencia de

enfermedad celiaca consiste en la respuesta positiva a la provocación del gluten, que

debe acompañarse de una reproducción de la lesión intestinal, con o sin presencia de

manifestaciones clínicas o funcionales de malabsorción.

La enfermedad puede detectarse por primera vez en la edad adulta sin los

síntomas típicos de la forma clásica.

En 1969 La Sociedad Europea de Gastroenterología y Nutrición

Pediátrica (ESPGHAN) definió conceptualmente la enfermedad celiaca en una reunión

en Interlaken con los siguientes criterios. [Meewise,GW. 1970]


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� La EC es una intolerancia permanente al gluten que cursa con atrofia

grave de vellosidades de intestino delgado y que asocia

habitualmente signos clínicos o funcionales de malabsorción.

� El establecimiento de un régimen estricto sin gluten lleva consigo

una normalización clínica y funcional así como la reparación de la

lesión vellositaria.

� La reintroducción del gluten en la alimentación se acompaña de una

reproducción de la lesión intestinal con o sin manifestaciones clínicas

o funcionales de malabsorción. Este criterio es fundamental para el

diagnóstico de enfermedad celiaca.

En la primera Conferencia Internacional sobre la Enfermedad Celiaca en 1970, Booth y

Dowling dieron una definición que precisaba cumplir para el diagnóstico, la presencia

de malabsorción con una biopsia de intestino delgado anormal y que tanto los síntomas,

como la biopsia patológica respondiesen a la dieta sin gluten. Era por lo tanto necesaria

la realización de tres biopsias para el diagnóstico de la enfermedad, una al inicio, otra

tras uno o dos años de dieta exenta de gluten y otra en la reintroducción, antes de los

dos años. Todos estos datos fueron reafirmados por [Visakorpi, 1974]. Posteriormente

los datos obtenidos del seguimiento de estos pacientes fueron discutidos en reuniones

anuales posteriores. Las mayores dificultades para la aplicación de los criterios parecían

residir en la realización de la provocación con gluten, que en pacientes de corta edad se

aconsejaba retrasar hasta que el niño tuviera un año de edad; y en la valoración de los

casos en que a los dos años de esta no había existido recaída.

En 1989 el comité de expertos de la ESPGHAN [Report of Working Group of

ESPGAN.1990] se reune en Budapest y revisa estos criterios y asume que en

determinadas situaciones se puede aceptar el diagnóstico de EC con unos criterios

menos exigentes, dado que la biopsia intestinal es la prueba más importante e

imprescindible para el diagnóstico, exige para el diagnóstico al menos una biopsia

intestinal, que se efectuará en el momento de efectuar el diagnóstico de sospecha y antes

de iniciar la dieta sin gluten. De efectuarse una segunda biopsia, se realizará al menos

dos años después de iniciar una dieta sin gluten permitiendo asegurar la normalización

histológica de la mucosa intestinal. Únicamente requeriría confirmación, y por tanto,


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provocación con gluten cuando el diagnóstico inicial se hubiera realizado sin biopsia

intestinal o la respuesta clínica la supresión del gluten de la dieta fuera dudosa.

La ESPGAN en 1989, publicó, modificados, los criterios diagnósticos iniciales:

• Existencia de una biopsia intestinal patológica con atrofia de vellosidades,

hiperplasia de criptas y epitelio superficial anormal mientras el individuo

está recibiendo gluten.

• Remisión clínica completa tras eliminar el gluten de la dieta.

• Es necesaria una biopsia de control, para comprobar una recuperación de la

mucosa, en casos muy concretos (personas con una respuesta clínica

equívoca a la dieta y en pacientes que no tienen síntomas en el momento de

la primera consulta, primera biopsia no definitoria y sobre todo en familiares

de primer grado de los pacientes). Esta, es recomendable que se realice a los

dos años de comenzar la dieta sin gluten.

Los pacientes con serología positiva se someterán a biopsia intestinal,

recomendándose, en este estudio, la biopsia por endoscopia. En pacientes que hay una

buena respuesta clínica y serológica no es necesaria la realización de más biopsias,

mientras que si la respuesta no es satisfactoria se repetirá la biopsia a los tres o seis

meses de la dieta sin gluten, y en los casos en que la biopsia intestinal inicial fuese

dudosa. En el resto de los casos la monitorización serológica es suficiente. Si embargo,

en Europa se tiende a considerar necesarias las tres biopsias intestinales para, evitar

mantener sin gluten de por vida a individuos que no son celiacos, y para descartar

enfermedad celiaca latente en individuos genéticamente predispuestos, cuya primera

biopsia intestinal haya sido normal. En los casos que tras dos años de iniciada la

provocación con gluten la mucosa continúe siendo normal, es obligado realizar

controles anatómicos cada cuatro o cinco años o bien en el momento en que se produzca

una recaída clínica o serológica. Por lo tanto en muchos casos seguirán siendo

necesarios los criterios de la ESPGAN de 1969 para el adecuado diagnóstico de la

enfermedad.


18

II.2. EPIDEMIOLOGÍA.

La verdadera incidencia de la enfermedad celiaca (EC) en poblaciones

susceptibles parece ser más elevada de lo que previamente se creía. Muchos casos

permanecen sin diagnosticar a menos que se realicen masivos screening serológicos. El

diagnóstico de la EC se relaciona con diversos factores (predisposición genetica, calidad

y cantidad de gluten, edad de introducción del gluten, y lactancia materna). [Polanco

I.2008]

La enfermedad celiaca es más frecuente en los sujetos de raza blanca, se creía

más frecuente en Europa que en EEUU, con un claro predominio en los 5 primeros años

de vida. La relación varón: mujer es de 1:1 en la infancia para pasar a 1:2 en la edad

adulta, quizás por la mayor facilidad diagnóstica pues la mujer en edad fértil tiene una

mayor demanda metabólica y las demandas de hierro y calcio son más llamativas.

La enfermedad celiaca es rara en africanos, chinos y japoneses [Sher KS. 1993]

Aunque tradicionalmente se ha pensado que era una enfermedad rara en la raza asiática,

se ha descrito que indios afincados en Inglaterra, tenían una incidencia 2,9 veces mayor

que los europeos de la misma área. Esto puede ser debido al cambio en sus hábitos

alimentarios, al pasar de un escaso consumo de gluten en su país, a tomar las cantidades

de gluten que se ingieren en Inglaterra, considerablemente más altas. [Hung JC.1995]

En el pasado se consideró que la prevalencia de la EC era muy variable según el

área geográfica, oscila desde 1/300 en la zona occidental de Irlanda hasta 1/10000 en

EE.UU estando la zona norte de Europa en cifras de 1/2500. [Fasano,A.2001]

Actualmente en Europa la prevalencia puede llegar al 1% de la población, se calcula

que la relación de personas sin diagnosticar frente a las diagnosticadas es de 8:1. En

EE.UU. existe una notable disparidad entre la alta frecuencia de anticuerpos positivos

entre la población donante de sangre y los pocos casos diagnosticados. Sin embargo,

con el mejor conocimiento de la enfermedad y la mayor accesibilidad a los test

serológicos, se ha producido un notable incremento en la identificación de nuevos

pacientes.


19

Figura 1: Gastroenterology. Abril 2005. Suplemento 1.

II.2.1. Prevalencia

Los datos del estudio más completo de Estados Unidos estiman, una

prevalencia global de la enfermedad celiaca en un grupo sin factores de riesgo

conocidos de 1:133 (0.8%), comparado con 1: 22 en familiares de primer grado de un

caso índice, 1:39 en familiares de segundo grado y 1:56 en individuos con síntomas

gastrointestinales o extragastrointestinales asociados con la enfermedad celiaca [Fasano

et al 2003].

[Gudjónsdóttir et al 2004] encontró que el riesgo de enfermedad celiaca en

familias con al menos dos niños afectados de aproximadamente tres veces más alto que

Prevalencia


20

en familias con un único niño afectado.La enfermedad celiaca raramente es

diagnosticada en individuos del África subsahariana, aunque se ha informado de

Afrocaribeños y Afroamericanos con enfermedad celiaca [Brar et al 2006]. La tasa de

infradiagnostico en estos otros grupos minonitarios puede ser alta.

La prevalencia de enfermedad celiaca está incrementada en las siguientes

entidades [Giannotti et al 2001, Fasano et al 2003, Hoffenberg et al 2003, Treem 2004,

Troncone et al 2004, Green 2005, NIH Consensus Committee 2005]:

• Síndrome de Down (prevalencia de enfermedad celiaca: 5%-12%)

• Síndrome de Turner ~3%)

• Síndrome de Williams (3%-10%)

• Deficiencia Selectiva de IgA (~2%-10%)

• Trastornos Autoimmunes como:

o Diabetes mellitus Insulin-dependiente (~6%)

o Síndrome de Sjögren (~5%)

o Tiroiditis (~2%-4%)

La prevalencia de sprue refractario no es conocida, pero probablemente es bastante

rara.

En España existen pocos estudios epidemiológicos pero las cifras son

comparables con el resto de Europa. A medida que se van realizando estudios va

variando la epidemiología en España, así en el año 1991 se realizó un estudio en

Vizcaya en el que la prevalencia de EC obtenida en la población estudiada fue de

1:2150 sin embargo en el año 2000 el Dr. Sabino Riestra realizó otro estudio en

Asturias en el que la prevalencia fue de 1:389. En El Hospital Severo Ochoa de Madrid,

[Cilleruelo ML et al, 2002] se realizó un estudio con 3.378 niños y encuentran una

prevalencia de enfermedad celíaca silente de 1/281 con una prevalencia global calculada

de 1/220 con una relación entre enfermedad celíaca conocida y no diagnosticada de

1/3,5. Más recientemente en el año 2004 en Barakaldo (Vizcaya) el Dr. Castaño realizó

otro estudio en el que la prevalencia fue de 1:118. Este último estudio también

recomienda por los resultados que obtuvieron, que la edad optima de screening de la EC


21

es entre los 2 y los 3 años, edad a la que el sistema inmune ya ha madurado y se pueden

diagnosticar muchos casos cuando la EC debuta en la edad infantil.

La susceptibilidad de padecer la enfermedad probablemente tenga un carácter

multigénico pero, hasta donde hoy conocemos, está ligada a la presencia de genes que

codifican las moléculas HLA de clase II. Por otro lado la ingesta de gluten que se

encuentra en el trigo, la cebada y centeno, y dudosamente en la avena, es imprescindible

para que se desarrolle la enfermedad [Goggins M.1994] Se precisa, por lo tanto, para

que se instaure la enfermedad, una cierta predisposición genética y el consumo habitual

de gluten. Esto hace que la prevalencia de la enfermedad celiaca en el planeta esté

ligada tanto a aspectos raciales y étnicos, como a la cultura nutricional de cada zona

geográfica. [Sierra Pérez, E. 2003]

II.2.2 El iceberg celíaco

La epidemiología de la EC está eficazmente representada por el modelo del

iceberg, el que conserva la validez en diferentes poblaciones del mundo. La incidencia

de la EC se puede expresar como el tamaño total del iceberg, que no está sólo

influenciado por la frecuencia de haplotipos de predisposición en la población, sino

también por el modelo de consumo de gluten. En muchos países la incidencia de EC

está apenas en el rango de 0.5-1% de la población general. Una porción mensurable de

estos casos se diagnostica correctamente como consecuencia de molestias sugestivas

(por ej. diarrea crónica, deficiencia inexplicable de hierro) u otras razones (por ej.

historia familiar de EC). Estos casos conforman la parte visible del iceberg celíaco,

expresados en términos cuantitativos por la incidencia de la enfermedad. En los países

desarrollados, por cada caso diagnosticado de EC, hay un promedio de 5-10 casos que

no se diagnostican (la parte sumergida del iceberg); usualmente debido a molestias

atípicas, mínimas o a veces inexistentes. Estos casos sin diagnóstico no reciben

tratamiento, por consiguiente están expuestos al riesgo de complicaciones a largo plazo.

La ‘línea del agua’, es decir la relación entre los casos que se diagnostican y los que no,

depende mayormente de la tendencia del médico a solicitar marcadores serológicos de

la EC en casos de baja sospecha clínica, por ej.: dominio de polimorfismo clínico de la

EC.


22

Figura 2: Iceberg celiaco.

II.3. Formas de Presentación clínica.

La enfermedad celiaca es una enfermedad inmune sistémica que puede asociar

tanto síntomas gastrointestinales (diarrea, pérdida del peso, dolor abdominal, anorexia,

intolerancia a la lactosa, distension abdominal, e irritabilidad) como síntomas

extraintestinales altamente variables (anemia por déficit de hierro, dermatitis

herpetiforme, fatiga crónica, dolor común/inflamación, jaquecas, depresión, déficit de

atención , epilepsia, osteoporosis/osteopenia, infertilidad y/o abortos de repetición,

déficits vitamínicos, estatura corta, fallo de medro, pubertad retrasada, defectos del

esmalte dental, y enfermedades autoinmunes). La enfermedad celiaca clásica, se

caracteriza por síntomas gastrointestinales moderados o severos, es menos común que la

enfermedad celiaca no clásica, caracterizada por la ausencia de síntomas

gastrointestinales.

El promedio de tiempo entre el inicio de los síntomas y el diagnóstico es de 11

años por el amplio rango de síntomas no específicos compartidos con otros trastornos,

alta variabilidad de edad de comienzo de los síntomas y la ausencia de síntomas en

ciertos individuos (p.ej, enfermad celiaca silente) [Green et al 2001]. Sin embargo, el


23

rango de tiempo entre el comienzo de los síntomas y el diagnóstico, puede ocurrir en

cualquier edad después del destete; en los adultos el pico de edad del diagnóstico puede

depender del grado de conciencia de la enfermedad y la presentación clínica del

paciente.

Las características fenotípicas de la EC pueden incluir:

Manifestaciones Gastrointestinales: Diarrea crónica o recurrente, malabsorción, dolor

y distensión abdominal, vómitos y pérdida de peso. Los pacientes a menudo se

diagnostican de síndrome de intestino irritable. (IBS) [Hill et al 2005]. Más del 50% de

individuos con enfermedad celiaca no tienen diarrea en el momento del diagnóstico.

Además muchos tienen diarrea o son obesos [Murray et al 2004].

Manifestaciones No gastrointestinales:Dermatitis herpetiforme, fatiga crónica, dolor

e inflamación articular, deficiencia de hierro, anemia, migrañas, depresión, défit de

atención, epilepsia, osteoporosis/osteopenia, infertilidad y abortos de repetición, déficits

vitamínicos, talla baja, fallo de medro, pubertad retrasada, defectos del esmalte dentario

y varias enfermedades autoinmunes secundarias (Enfermedades Autoinmunes

asociadas con la enfermedad celiaca) [Green & Jabri 2003, Hill et al 2005, NIH

Consensus Committee 2005].

II.3.1. Enfermedad celiaca clásica

Se refiere a la presencia de síntomas intestinales moderados o severos como

diarrea, fallo de medro, pérdida de peso, dolor abdominal, anorexia, intolerancia a la

lactosa, distensión abdominal e irritabilidad [Hill et al 2005]. Los niños con enfermedad

celiaca típicamente presentan síntomas entre los seis y los 24 meses de edad [Catassi

& Fabiani 1997, Fasano & Catassi 2005]

Aunque en nuestro medio sigue siendo la forma más frecuente de presentación

en el niño, no es así en todos los países. Suelen ser niños de entre 2 y 5 años que

presentan la típica diarrea, vómitos, cambios de carácter, anorexia y estacionamiento del

peso. Con el tiempo el paciente desarrolla el llamado “hábito celiaco” con aspecto triste,

indiferente, irritable y huraño, con escaso panículo adiposo y pobres masas musculares.

Piel pálida, lengua de aspecto seco y carencial, ocasionalmente aftas bucales y cabellos


24

ralos. El abdomen prominente y las nalgas aplanadas completan este aspecto. Puede

haber hemorragias por defecto en la absorción de vitamina K, y una fragilidad vascular

por hipovitaminosis C.

En la anamnesis de estos enfermos se objetiva que la ingestión de gluten

comenzó entre los 5 y 6 meses, y tras un intervalo libre de síntomas, progresivamente se

va conformando el cuadro anteriormente descrito, aparecen unas heces brillantes y

voluminosas, malolientes de color grisáceo.

En la adolescencia y segunda década de la vida es rara esta forma de

presentación, los síntomas son más insidiosos con anorexia, pérdida de peso o dolor

abdominal inespecífico. En algunos niños celiacos diagnosticados, cuando llega la

adolescencia se encuentran asintomáticos aunque ingieran gluten, lo que conlleva a que

hagan peor la dieta. En algunos casos diagnosticados en adultos, un 25-40% han tenido

clínica en la infancia que cedió durante la adolescencia [Polanco,I.1996] así ante un

cuadro de diarrea crónica o intermitente en la que se afecte el peso, debe hacer

sospechar el diagnóstico y constituye una indicación de biopsia intestinal. La Hipoplasia

del esmalte dentario es un dato característico de los pacientes celiacos sin tratamiento,

también se ha descrito la tríada: epilepsia, calcificaciones intracraneales occipitales

bilaterales y enfermedad celiaca, que responden a la dieta sin gluten.

II.3.2. Forma de Comienzo Precoz

Es una forma afortunadamente cada vez menos frecuente, que afecta a niños

pequeños entre 10 y 18 meses, el cuadro suele iniciarse con vómitos seguidos de una

diarrea líquida con heces espumosas que producen eritema perianal sugiriendo cuadros

producidos por una intolerancia a azúcares, una gastroenteritis aguda o intolerancia a

proteínas vacunas. Progresivamente se deteriora el estado nutricional del niño, no

responde a la terapia habitual y es preciso recurrir además de la dieta sin gluten a dietas

elementales o semielementales.

Con un interrogatorio detallado se comprueba que la ingestión de gluten se

produjo antes de los 3 meses de edad. Cuanto más precoz es la ingestión del gluten más


25

precoz suele ser el debut de la enfermedad y las manifestaciones clínicas pueden diferir

a las que se presentan posteriormente.

La lactancia materna también puede influir sobre el momento de aparición de los

síntomas en sujetos genéticamente predispuestos, dicho efecto protector parece ser

mayor en sujetos con fenotipos HLA-DR de alto riesgo como: 3/3, 3/7 y 5/7. [Polanco,

I. 2001]

II.3.3. Formas No clásicas. Asintomáticas.

Son formas definidas por la ausencia de manifestaciones clínicas a pesar de que

pueden presentar la atrofia severa de vellosidades característica de EC. El motivo que

ha indicado la biopsia intestinal es generalmente padecer una enfermedad de reconocida

asociación a la EC o la presencia de uno o varios marcadores inmunes de EC

detectados en un despistaje familiar o poblacional, es el caso del 10 % de los familiares

de primer grado de los pacientes celiacos, por lo que estos pacientes precisan un

seguimiento y suelen expresar los genes de susceptibilidad HLA-DQ2. [Trancone,

R.1996]

Se refiere a la enfermedad celiaca sín síntomas gastrointestinales sin embargo,

los individuos con enfermedad celiaca atípica pueden tener síntomas gastrointestinales

tales como reflujo, distensión, vómitos, estreñimiento y dispepsia siendo a menudo

maletiquetados como síndrome de intestino irritable: [IBS]. Aproximadamente el 70%

de pacientes son diagnosticados basándose en las manifestaciones extraintestinales

asociadas con enfermedad celiaca [Telega et al 2008].

La anemia por déficit de hierro es la forma de presentación más frecuente de la

de la enfermedad celiaca no clásica y puede ser el único hallazgo. La dermatitis

herpetiforme es un rash intensamente pruriginoso que afecta a las superficies de

extensión de las extremidades y es una manifestación no gastrointestinal frecuente.

Otras presentaciones extraintestinales incluyen osteoporosis/osteopenia,

hipoplasia del esmalte, infertilidad y/o abortos de repetición, déficits vitamínicos,

elevación de transaminasas, fatiga, síndromes psiquiátricos y varios trastornos


26

neurológicos que incluyen neuropatía periférica, ataxia, convulsiones, migrañas, déficits

de atención e hiperactividad (ADHD) y retrasos de escolarización.[Zelnik et al 2004,

Hill et al 2005, NIH Consensus Committee 2005, Niederhofer & Pittschieler 2006].

Usualmente la Enfermedad celiaca No Clásica se presenta en la infancia tardía o edad

adulta. Los niños con EC no clasica pueden presentarse como talla baja inexplicada,

síntomas neurológicos y pubertad retrasada.

La Forma No clásica de la EC es más común que la Forma Clásica de EC.

II.3.3.a Enfermedad Celiaca Silente.

Es definida como la ausencia de síntomas en presencia de anticuerpos positivos

para EC y atrofia vellositaria del intestino delgado en la biopsia. Los Individuos con EC

silente son a menudo identificados a través de un familiar afecto a través de programas

de screening [Hed et al 1986, Fasano & Catassi 2001].

II.3.3.b. Enfermedad celiaca Latente

Son formas de EC en las que el cuadro clínico es poco manifiesto y las

manifestaciones digestivas están ausentes o ocupan un segundo plano El estreñimiento,

asociado o no a dolor abdominal de tipo cólico, la distensión abdominal o la aparición

brusca de edemas, generalmente coincidiendo con alguna causa precipitante (infecciosa,

quirúrgica, etc) pueden constituir formas clínicas de presentación en niños mayores. El

retraso en la talla en la infancia o la aparición más tardía de la pubertad en la

adolescencia, pueden también ser datos evocadores para el pediatra. Otra forma aislada

de presentación, consiste en la aparición de una anemia ferropénica, debida a una

malabsorción de hierro y folatos en yeyuno.

En el celiaco adulto, la infertilidad, tanto en el hombre como en la mujer, los

abortos de repetición o la depresión psíquica, así como la osteoporosis, fracturas o

neuropatías, pueden constituir signos o síntomas aislados de la enfermedad [Polanco,

I.2001]

Se ha descrito enfermedad celiaca latente en pacientes con dermatitis

herpetiforme, en los cuales se desarrolló la enfermedad cuando tomaron un suplemento


27

de gluten en la dieta. [O´Mahoney S, 1990] comprueban que en los pacientes con

dermatitis herpetiforme tomando dieta con gluten, existe un aumento de la

permeabilidad intestinal, los anticuerpos en suero están en cifras normales, pero en el

aspirado yeyunal existe una elevación de anticuerpos antigliadina IgA e Ig M ,

indicando el inicio de actividad inmunológica local.

Así las Formas latentes de EC se definen por una biopsia de intestino delgado normal

en:

• Un individuo que habitualmente ingiere gluten, pero que previamente tuvo una

biopsia de intestino delgado compatible con enfermedad celiaca

• Un individuo con EMA positivos

II.3.3.c. Enfermedad celiaca Potencial

Se aplica a pacientes que en ningún momento han presentado atrofia vellositaria

característica, en los que sin embargo se detectan anormalidades, principalmente

inmunológicas, propias de los pacientes celiacos [Ferguson A, 1993] como son:

Un marcador (EMA) positivo, signos de activación de inmunidad celular,

aumento de Linfocitos Intraepiteliales en las vellosidades y especialmente de la

población que expresa TCR γδ o un patrón de Ac antigliadina a nivel de la mucosa de

intestino delgado característico de EC. Para el diagnóstico de estos enfermos también

será de ayuda la presencia de HLA-DQ2.

II.3.3.d. Enfermedad Celiaca Refractaria/Esprue celiaco.

El Esprue Refractario o ECR se refiere a la persistencia de los síntomas de

malabsorción franca con inflamación intestinal persistente y atrofia vellositaria y

niveles de anticuerpos elevados a pesar de una dieta estricta sin gluten en los últimos

seis a doce meses. Los individuos con esprue refractario tienen sobre los 20 años de

edad. Raro en adultos. Existen pocos estudios de personas con esprue refractario bien

caracterizados en la literatura.


28

El pronóstico es incierto, aunque algunas personas responden a corticosteroides o

agentes inmunosupresores:

• Esprue refractario primario : Describe la condición en la cual

los individuos no han tenido nunca respuesta a la dieta sin gluten.

En este gupo son importantes las Pruebas de genética Molecular

porque los individuos carecen de respuesta a la dieta sin gluten,

lo cual es uno de los criterios diagnósticos mayores.

• Esprue refractario secundario Se refiere a la condición por la

cual los individuos tienen una completa recuperación seguida de

una posterior recaída a pesar de una buena adherencia a la dieta

libre de gluten.

Una clasificación alternativa implica la determinación de los Linfocitos intraepiteliales

(IELs) en personas con ECR:

- En la Enfermedad celiaca activa no complicada, los IELs tienen expresión en

superficie de CD3 y CD8. Además, estos linfocitos no tienen restricción clonal.

- En ECR primario: los IELs son normales.

- En ECR secundario: Los IELs son anormales siguiendo varios caminos:

* Aquellos que pierden de su superficie la expresión CD3, CD8, y el TCR.

* CD3 es detectable dentro de las células.

* Generalmente de hacen clonales.

Se trata de un síndrome considerado recientemente un primer paso en la transformación

maligna de los IELs. Se caracteriza por la infiltración masiva de los IELs, (infiltración

monoclonal anormal de linfocitos T con expresión CD3c citoplasmática, sin expresión

en superficie de CD3 y CD8 y con alteración del gen receptor de los linfocitos T)

fenotipo muy similar al del Linfoma intestinal de células T asociado a enteropatía

(EITL). El 40% de pacientes con ECR presentarán un linfoma de alto grado, a nivel del

intestino delgado o en otra localización.


29

El esprue refractario ha sido tratado exitosamente con inmunosupresores ciclosporina) e

inmunomoduladores (Infliximab). [Chaudhary R et all 2005].

EL ECR secundario tiene un peor pronóstico que los ECR promariosos con una alta

mortalidad resultado de la pobre respuesta a la inmunosupresion y alta tasa de

progresión hacia la enteropatía asociada a Linfoma T (EATL). El alto riesgo para EATL

en personas con esprue refractario puede exceder del 50% [Green & Jabri 2003, Krauss

& Schuppan 2006].

II.3.4. Cáncer/linfoma.

En pacientes con EC el riesgo de adenocarcinoma de intestino delgado es

superior al de la población general, el predominio de linfoma asociado a EC es la

enteropatía asociada a linfoma de células T, el cual no responde a quimioterapia y es

rápidamente fatal. También son más frecuentes los carcinomas escamosos de esófago y

orofaringeo y linfoma no Hodgkin. La dieta sin gluten ha demostrado efecto protector

contra el desarrollo de enfermedades malignas, aunque esto puede no ser el caso para el

desarrollo del linfoma no Hodgkin. La estimulación crónica del gluten a los linfocitos

puede producir en éstos inestabilidad cromosómica, con el riesgo de transformación

maligna.

II.3.5. Mortalidad y morbilidad.

El espectro clínico de la enfermedad celiaca es amplio, desde una ausencia de

síntomas hasta síndromes con malabsorción severa. La enfermedad celiaca no tratada

pueden incluir déficits de vitaminas y minerales, anemia, osteoporosis, infertilidad y

trastornos neuropsiquiátricos, desórdenes autoinmunes secundarios y algunos tumores

maliganos incluidos linfomas no-Hodgkin, adenocarcinoma de intestino delgado y

carcinoma escamoso de esófago y orofaringe.

El conjunto de personas con EC no tratada o que no responden a la dieta sin gluten

tienen un incremento de mortalidad más precoz comparada con la población general,

principalmente por la mayor tasa de tumores malignos. El riesgo es mayor en el año


30

después del diagnóstico inicial, probablemente por el periodo prolongado de síntomas

no reconocidos como asociados a la enfermedad celiaca. La tasa de Malignidad y

mortalidad es alta en individuos con esprue refractario [Corrao et al 2001].

II.3.6. Infertilidad.

La Enfermedad Celiaca se ha asociado con infertilidad, abortos de repetición, retraso en

la menarquia, menopausia precoz, amenorrea. La EC no tratada se estima que es

responsable de aproximadamente el 3%-6% de todos los casos de infertilidad de causa

desconocida y neonatos de bajo peso y con crecimiento intrauterino retardado (CIR).

Un tratamiento adecuado con dieta sin gluten parece eliminar el riesgo de infertilidad y

resultados adversos en el embarazo [Meloni et al 1999, Wong et al 20003, Bradley &

Ludvigsson et al 2005].

II.3.7. Desórdenes Autoinmunes asociados con la enfermedad celiaca.

Los desórdenes Autoinmunes son tres veces más frecuentes en los individuos con

enfermedad celiaca que en la población general. Estos incluyen la diabetes mellitus tipo

1, tiroiditis, Síndrome de Sjögren, enfermedad de Addison, enfermedad hepática

autoimmune y desórdenes neurológicos tales como neuropatía periférica.

Aunque hay estudios que sugieren que una dieta libre de gluten no previene el

desarrollo de enfermedades autoimmunes [Sategna Guidetti et al 2001a], el inicio de

una dieta libre de gluten puede conferir un beneficio para los individuos con

enfermedad celiaca con varias enfermedades autoinmunes:

� Los autoanticuerpos específicos para la diabetes y tiroiditis tienden a

desaparecer en el curso del tratamiento con la dieta exenta de gluten [Ventura et

al 1999].

� Un estudio ha reconocido un mejor crecimiento lineal y control glucémico en el

cumplimiento de la dieta de niños con diabetes mellitus tipo 1 [Sanchez-

Albisua et al 2005], aunque [Nóvoa Medina et al 2008] recientemente se ha

informado que una dieta sin gluten no tuvo impacto en el control metabólico de

la diabetes.


31

� Una dieta sin gluten puede normalizar la función tiroidea en individuos con

enfermedad tiroidea [Sategna-Guidetti et al 2001b].

II.3.8. Manifestaciones Hematológicas

Las alteraciones hematológicas y bioquímicas no tienen relación con el grado de

intensidad de la atrofia vellositaria que tiene el paciente. El estado nutricional de estos

pacientes, sí varia según la severidad y duración de la malformación asociada

[Kemppainen TA, 1998]. La enfermedad celiaca se asocia frecuentemente a anemia

ferropénica (22%), trombocitosis, neutropenia, hipoalbuminemia, déficit de folatos

(35%), de vitamina B12 (11%) de factores de coagulación (II,VII,X) (32%), calcio

(43%), magnesio (13%) y zinc (31%) [Corazza, GR. 1995]

La anemia ferropénica es un hallazgo frecuente entre los celiacos, secundaria a

la malabsorción de hierro a nivel del duodeno proximal. En un estudio realizado por

Corazza, hasta un 5% de los pacientes con anemia ferropénica presentan celiaquía, y

Lazzari encuentran hasta un 6.2% entre 103 pacientes afectos de anemia de causa

desconocida y refractaria a tratamiento. Por lo tanto, estaría indicado en estos pacientes

el despistaje de la enfermedad celiaca mediante anticuerpos antigliadina o

antiendomisio. Esta anemia se corrige mediante dieta sin gluten. [Lazzari, R. 1995]

II.3.9. Manifestaciones Dermatológicas.

II.3.9.a. Dermatitis Herpetiforme (DH):

Es un marcador independiente de EC. Se trata de la misma enfermedad con

distintos órganos de expresión. La transglutaminasa tisular u epidérmica parece ser el

autoantígeno en el intestino y piel respectivamente. En general la afectación vellositaria

es menor en pacientes con DH y puede ser necesaria una segunda biopsia duodenal

para el diagnóstico de EC. Se presenta más frecuentemente entre los 15 y 40 años y

afecta hasta un 25% de los pacientes con EC. Se presenta clínicamente como una

erupción vesículo-ampollosa, pruriginosa, dolorosa, simétrica y con localización en

codos y superficies de extensión y cuero cabelludo. Cursa de forma crónica en brotes.


32

La DH se caracteriza anatomopatológicamente por un depósito de gránulos de

IgA en la dermis papilar y en la unión dermoepidérmica. La dieta sin gluten es eficaz en

el tratamiento de la DH. Aproximadamente hasta un 15-30% de pacientes con psoriasis

presentan datos serológicos de EC y de ellos la mitad tienen una enteropatía de diversa

intensidad. La dieta sin gluten es capaz de mejorar las manifestaciones cutaneas de la

nenfermedad en pacientes que presentan lesiones intestinales leves, incluso ausentes.

En cuanto al vitíligo y alopecia areata, existe una asociación débil, aunque puede

ser interesante para la búsqueda de EC subclínica en estos pacientes.

II.3.10. Manifestaciones Endocrinas.

II.3.10.a. Diabetes mellitus tipo I (DMID 1)

La DM1 es una de las enfermedades crónicas más frecuentes en la infancia, en

ella intervienen factores inmunes, genéticos y medioambientales. Se caracteriza por la

destrucción de las células beta pancreáticas, y como consecuencia, por un déficit

absoluto de insulina. En el niño la etiología autoinmunitaria es la más frecuente y hasta

en un 90% de los casos se encuentran marcadores humorales de proceso autoinmune. La

DM1 se asocia con frecuencia a otras enfermedades autoinmunes. Así, se ha observado

una mayor prevalencia de anticuerpos antitiroideos, relacionados con la enfermedad

celiaca, y otros muchos autoanticuerpos contra órganos endocrinos y no endocrinos [Liu

E, 2002]. La enfermedad autoinmune que más se asocia a la DM1 es la enfermedad

tiroidea autoinmune. La EC es otra enfermedad que debe tenerse en cuenta en niños con

DM1; las tasas de prevalencia se encuentran entre el 1-10% frente al 0,01-0,03% de la

población general. [Lopez Medina, JA. 2004]

Casi siempre aparece antes la diabetes que la celiaquía. Tras la instauración de

una dieta sin gluten se asiste a un mejor control metabólico de la hiperglucemia. La

monitorización de los anticuerpos antitransglutaminasa en diabéticos, es un buen

método de detección de una EC asociada.


33

II.3.10.b. Enfermedades tiroideas

La patología tiroidea se presenta muy frecuentemente asociada a la EC, con una

prevalencia variable (4-14%), fundamentalmente del tipo hipotiroidismo. Globalmente

la EC aparece asociada en un 3% de pacientes con hipertiroidismo y en un 5% de

pacientes con tiroiditis de Hashimoto. La dieta sin gluten origina una disminución de los

anticuerpos antitiroideos y mejora el control de la disfunción tiroidea [Rodrigo Sáez,

L.2005].

II.3.10.c. Alteraciones en la mineralización ósea

Es recomendable realizar una densitometría ósea al diagnóstico de la EC, ya que

suele existir una reducción de la densidad ósea tanto en adultos como en niños, que

suele ser más severa en la forma sintomática de la enfermedad y que está relacionada

con el riesgo de fracturas. El mecanismo subyacente de esta osteoporosis es

multifactorial incluyendo malabsorción de calcio y vitamina D, hiperparatiroidismo

secundario, deficiencia de magnesio, citoquinas inflamatorias circulantes e

hipogonadismo en el varón.

La disminución en los niveles de calcio se explica también por el atrapamiento

de iones Ca+2 en el intestino por las heces grasas y ácidas. La actividad de la hormona

paratiroidea hace que los niveles sanguíneos de calcio se encuentren dentro de los

límites de la normalidad. En los pacientes infantiles se ha visto que el tratamiento con la

dieta sin gluten durante un año, iguala la densidad ósea mineral con los niños sin esta

patología. [Vestergaard, P. 2003]

En cuanto a los niveles de calcio, fósforo y vitamina D, se detectó hipocalcemia

en 17% de los pacientes recién diagnosticados. Los niveles de calcio eran

significativamente más bajos en los pacientes no tratados, los niveles de fosfatos

estaban elevados en un 50% de los casos tanto en los pacientes tratados como en los no

tratados. Los niveles de 25-OH-D3 estaban más bajos en los pacientes no tratados, sin

embargo las diferencias no fueron estadísticamente significativas para los valores de

fosfatos, vitamina D y fosfatasa alcalina entre los pacientes con o sin dieta [Kavak, US.

2003]. Los niveles de paratohormona estaban elevados tanto en los pacientes con dieta,


34

como en los pacientes recién diagnosticados y las diferencias eran estadísticamente

significativas para los pacientes recién diagnosticados. Parece que está bien

documentado, que hay un balance negativo de calcio en los pacientes celiacos

producido por una disminución en la absorción del calcio y la vitamina D. La falta de

hipocalcemia en pacientes no tratados, se explicaría por una elevación de la

paratohormona que provoca un incremento en la reabsorción ósea. Sin embargo aunque

la densidad ósea mineral en los pacientes con dieta sin gluten se encuentra dentro de los

límites de la normalidad e incluso superiores, algunos estudios [Szathmári, M, 2001]

obtienen que los niveles de paratohormona se encuentran elevados. Sin embargo en los

pacientes adultos, aunque la dieta sin gluten mejora la densidad ósea mineral, no se

alcanzan los niveles de normalidad.

Tabla 1: Enfermedades Autoinmunes dependientes del gluten.

II.3.11. Deficiencia selectiva de IgA

La prevalencia de EC en este grupo, es de alrededor de un 8%. Para realizar este

diagnóstico en estos pacientes deben realizarse marcadores serológicos de tipo IgG y

cuantificar los niveles séricos de esta inmunoglobulina, así como descartar la presencia

de parasitosis asociada (tipo Giardia lamblia)

ENFERMEDAD GLUTEN DEPENDIENTE GLUTEN INDEPENDIENTE

DMIDI +

TIROIDISTIS AUTOINMUNE +

HEPATITIS AUTOINMUNE +

SÍNDROME DE SJOGREN +

E. DE ADDISON +

GASRITIS ATRÓFICA +

SÍNDROME DE DOWN +

SÍNDROME DE TURNER +

SÍNDROME DE WILIIAMS +

CARDIOPATÍAS CONGÉNITAS +

DÉFICIT DE IgA +


35

II.3.12. Manifestaciones Neurológicas:

II.3.12.a. Epilepsia

Responde mal al tratamiento farmacológico y bien a la dieta sin gluten si el

diagnóstico es precoz. Al igual que otros procesos, se relaciona la aparición de la

epilepsia con el tiempo de exposición al gluten. Existen algunos datos que hablan a

favor de la presencia de tipo vasculitis cerebral como sustrato morfológico de dicho

proceso.[Rodrigo Sáez, L. 2005]

II.3.12.b. Ataxia cerebelosa

Es el proceso neurológico más freceunetemente asociado a la EC. Generalmente

es de comienzo tardío y muchos pacientes además del temblor y alteraciones del

equilibrio, presentan una neuropatía periférica asociada. Frecuentemente se asocian

anticuerpos circulantes frente a las células de Purkinje del cerebelo. La respuesta a la

dieta sin gluten es buena cuando se instaura dentro de los 6 primeros meses.

II.3.13. Manifestaciones Reumatológicas:

II.3.13.a. Artritis Reumatoide (AR)

La prevalencia de EC entre pacientes con AR juvenil, es del orden del 1,5-2,5%.

Se han observado niveles elevados de AGA en pacientes con AR, tanto juvenil como

del adulto. Una explicación pudiera ser el aumento de la permeabilidad intestinal

inducido por la toma de AINE, si bien tampoco pudiera descartarse un mecanismo

inmunológico [Rodrigo Sáez, L. 2005].


36

II.3.13.b. Síndrome de Sjögren (SS)

Es el proceso con manifestaciones articulares que con mayor frecuencia se

asocia con la EC, pues hasta un 15% de pacientes presentan ambos procesos de forma

simultánea. Incluso en pacientes con SS sin EC asociada, se objetiva un estado de

activación inmunológica, a nivel de la mucosa intetinal.

II.3.14. Alteraciones Digestivas:

II.3.14.a. Alteraciones Hepáticas

Se ha descrito esteatosis hepática en adultos jóvenes, cursa con aumento de

aminotransferasas y se normalizan al retirar el gluten de la dieta, también se ha descrito

la asociación a hepatitis autoinmune y a cirrosis biliar primaria.

La prevalencia de EC en pacientes con transaminasas elevadas es del 10%. La

mayoría de ellos presentan una hepatitis reactiva en la biopsia, de mediana intensidad,

La instauración de una dieta sin gluten se sigue de una disminución de los niveles

séricos de AST y ALT, de forma lenta y paulatina.

La prevalencia de EC en pacientes con cirrosis biliar primaria (CBP) es del

orden del 6%. A las mujeres de mediana edad con EC que presenten un patrón de

colestasis disociada se les debe realizar un despistaje de CBP mediante la determinación

de los AMA y viceversa con anti-TGt para descartar una EC concomitante.

En pacientes con hepatitis autoinmune (HAI) la prevalencia de EC es del 5%. La

asociación de ambos procesos parece estar en relación con la presencia del haplotipo

HLA B8/DR3/DQ2, común para ambas enfermedades.

II.3.14.b. Enfermedad inflamatoria intestinal (EII)

Los pacientes con EC presentan cinco veces más riesgo de EII que la población

general. Es frecuente establecer un diagnóstico diferencial entre ambas entidades ya que

pueden presentar características clínicas y analíticas similares. Una complicación poco

frecuente de la EC es la aparición de yeyunoileitis ulcerativa, que puede evolucionar a

perforación intestinal o estenosis cicatricial.


37

II.3.15. Hipoplasia del esmalte dentario

Los defectos en el esmalte dentario son frecuentes en pacientes con EC, que se

caracterizan por ser bilaterales, simétricos y cronológicamente distribuidos en los cuatro

sectores de la dentición. La causa de este proceso no parece estar relacionado con la

presencia de defectos nutricionales, sino más bien con trastornos inmunológicos

asociados anticuerpos antiesmalte.

II.3.16. Retraso en el crecimiento

Entre un 5 y 20% de los niños con talla baja de causa desconocida han sido

diagnosticados de enfermedad celiaca al hacerles una biopsia intestinal. En estos niños

las cifras de hormona de crecimiento son normales. Presentan una velocidad de

crecimiento disminuida y la edad ósea está retrasada. En un estudio [Mora S ,1993], se

describió que la edad ósea estaba retrasada en 2,05±1,29 años. En niños no tratados, se

ha visto que la actividad de la somatomedina es baja, y retorna a la normalidad tras la

dieta sin gluten. Tras la supresión del gluten se observa un aumento de la velocidad de

crecimiento y de la ganancia ponderal en estos niños. La talla baja, sería una indicación

para la realización de biopsia intestinal particularmente si la edad ósea está retrasada

más de cuatro años y/o existen anormalidades hematológicas asociadas. [Groll, A.

1980]

II.3.17. Manifestaciones Genéticas: II.3.17.a Síndrome de Down.

La prevalencia de EC entre personas con trisomía 21 es del 6%. La patogenia de

ambos procesos es desconocida, aunque en ambos procesos existe una mayor riesgo de

presentar enfermedades autoinmunes, y en ambas, existe una clara base genética. En un

estudio multicéntrico en Italia con 1202 pacientes con Síndrome de Down se

encontraron 55 casos de EC, con un prevalencia de esta asociación del 4,6%. Otros

estudios europeos informan de una prevalencia del 6,6% en España, un 8% en Holanda

y un 3,9% en Suecia, situación no diferente de Estados Unidos que informan de

prevalencias entre el 3,2-10,3%. [Martin F, Kagnooff, 2005]


38

II.4. PATOGÉNESIS DE LA ENFERMEDAD CELIACA

La enfermedad celiaca está causada por una respuesta autoinmune en individuos

genéticamente predispuestos que conduce a la inflamación del intestino delgado, atrofia

vellositaria y malabsorción. La etiología de muchas manifestaciones extraintestinales no

está completamente aclarada.

Se han propuesto diversas teorías que implican factores ambientales,

inmunológicos y genéticos para explicar la patogenia de la enfermedad. Existiría una

alteración primaria en la respuesta inmune intestinal a las proteínas del gluten o sus

productos, alterando la inmunidad celular con una amplia repercusión sistémica y a la

vez una importante asociación con los genes HLA clase II y con otros factores genéticos

y/o ambientales aún no bien conocidos. La EC esta fuertemente asociada con los genes

de HLA clase II situados en el locus DQ. Se ha demostrado que la EC esta asociada con

la expresión de HLA-DQ2 y HLA-DQ8. [Kim CY, 2004]


39

La EC es un desorden multifactorial resultado de la interacción de variantes

específicas descritas en genes HLA, variantes menos reconocidas en genes No-HLA,

gliadina (un subcomponente del gluten), y otros factores ambientales.

Los genes HLA-DQA1 y HLA-DQB1 son variantes conocidas que se han

asociado con la susceptibidad para la enfermedad y son causa necesaria pero no

suficiente para padecer la enfermedad.

Un defecto en el procesamiento de los antígenos por las células epiteliales, junto

con las propiedades intrínsecas de las gliadina y del haplotipo HLA-DQ de los

individuos son considerados los principales factores implicados en la patogénesis de la

EC.[Robins G, 2005]

La presentación de péptidos de la gliadina a las células T constituye un evento

crucial en la patogénesis de la EC. Estos péptidos del gluten no son completamente

digeridos por la acción de los enzimas gástricos, intestinales y pancreáticos en los

enfermos celiacos. Un 33-meropeptido fue aislado e identificado como el iniciador

primario de la respuesta inflamatoria frente al gluten en enfermos celiacos. [Shan,

L.2002] Este péptido reacciona con la transglutaminasa tisular (tTG), el principal

autoantigeno en la EC que desamina ciertos residuos de la glutamina del gluten hasta

ácido glutámico. Este cambio de carga favorece la unión y presentación por las

moléculas HLA-DQ2 y DQ8, activando a las células T y subsiguiente producción de

citoquinas que conducen al daño tisular. [Molberg, O. 1998]

Figura 3. Factores predisponentes para el desarroll o de la EC

Enfermedad Celiaca

Dieta: Gliadina

Marcadores Genéticos: HLA DQ y otros

Inmunomodulación Tolerancia

Autoinmunidad


40

II.4.1. Factores ambientales

El principal factor ambiental implicado en la patogenia de la EC es el gluten,

pero también podrían intervenir otros factores desencadenantes y factores protectores

aún por identificar, lo que explicaría las discordancias entre gemelos monocigóticos o

hermanos con HLA similar. Pero es la exposición a alimentos que contienen cereales de

trigo, centeno, cebada, y probablemente avena el principal factor exógeno implicado. En

la década pasada se puso de manifiesto que el gluten, el enzima transglutaminasa tisular

y ciertos HLA están conectados en la patogénesis de la EC.

Dicke comprobó que los pacientes celiacos tenían una sensibilidad especial a

determinadas harinas, especialmente al trigo, demostró que la toxicidad del trigo es

producida por una fracción proteica: gluten (mezcla de proteínas en forma de gránulos

presentes en el trigo y otros cereales que queda como residuo insoluble en agua después

de la extracción del almidón) es una proteína compleja que contiene cuatro clases de

proteínas: gliadinas (fracción de endosperma parcialmente soluble en etanol),

gluteninas, albúminas y globulinas.

La enfermedad se caracteriza por una intolerancia a proteínas tales como

gliadinas (trigo), secalinas (centeno), hordeínas (cebada) y quizás aveninas (avena),

siendo éste el orden descendente de potenciación de la enfermedad. Todavía existe

cierta controversia sobre la toxicidad de la avena, un estudio Finlandés no encontró

evidencias sobre su toxicidad en pacientes con EC que fueron expuestos a cantidades

significativas de avena durante seis meses. [Janatuinen EK, 2002]

Las gliadinas son cadenas polipeptídicas con un peso molecular entre 30.000 y

75.000 con elevado contenido de glutamina y prolamina. La concentración de prolamina

y glutamina puede ser importante en la producción de patología, pues la ingestión de

glutamina pura no produce lesión alguna, se trataría pués de una intolerancia

permanente a las prolaminas de estos cereales en individuos genéticamente

predispuestos, y es el resultado de la interacción desfavorable entre genes de

predisposición y factores ambientales.


41

En la electroforesis de las gliadinas se identifican más de 40 componentes,

siendo los cuatro de mayor proporción los relacionados con la enfermedad celiaca: La

alfagliadina, (que es la fracción mayor en ciertas variedades de trigo y de más

importancia en la enfermedad celiaca) betagliadina, gammagliadina y las

omegagliadinas, estas tres últimas menos tóxicas.

La toxicidad de la gliadina se atribuye a una secuencia de aminoácidos de la

alfagliadina (residuos de 206-217 aminoácidos). Hay evidencias que apoyan la

presencia de epitopos inmunogénicos de la parte N-terminal de la molécula, estudios in

vivo confirman este dato observando cambios histológicos significativos en la mucosa

intestinal tras la administración de secuencias peptídicas de alfagliadina, produciendo

cambios en la mucosa.

Existen publicaciones que identifican un grupo de péptidos que son reconocidos

por las células T, obtenidos a partir de muestras de pacientes menores de 12 años,

encontrando respuesta de células T frente a nuevos epítopos de gliadinas y de

gluteninas. [Vader, W.2002] Demuestran que la mayoría de niños tienen células

reactivas contra péptidos de gluteninas, mientras la mitad reconoce los epítopos

inmunodominantes en adultos

Figura 4. El alto contenido de glutamina y prolina en las gliadinas y gluteninas del trigo es mayor que el de hordeinas y secalinas, jugando un importante pepel en la patogénesis de la enfermedad. (Tomado de Gastroenterology.Volumen 124. nº:4.suplem.1. 2005)


42

Algunos de los péptidos no necesitan desaminación para ser reconocidos, lo que

implicaría que la respuesta podría iniciarse hacia péptidos nativos del gluten y se iría

restringiendo con el tiempo hacia una especificidad dirigida frente a péptidos

desaminados. En base a algoritmos matemáticos [Koning y col, 2005] sugieren que

podrían existir por lo menos 50 péptidos en el gluten (trigo) y hordeínas (cebada).

Recientemente se ha identificado un mayor número de péptidos de α y γ gliadinas que

asociados a DQ2 son capaces de activar linfocitos T de mucosa [Arentz-Hansen,

H.2000].

Estos nuevos péptidos se encuentran agrupados en regiones ricas en prolina.

¿Por qué la giadina y no las aveninas? Porque el porcentaje de residuos de prolina

presentes en las aveninas es menor que en las gliadinas. La especificidad de la tTG

estaría determinada por la proporción de prolinas y glutaminas.

La alta cantidad de prolina de estas proteínas las hace relativamente resistentes a

la digestión proteolítica gástrica, pancreática, y de los enzimas del borde en cepillo del

intestino humano. Resultando péptidos largos y con alto contenido en prolina y

glutamina en el intestino delgado. Aunque esto solo no se ha visto como suficiente

causa de la enfermedad ni se conocen las diferencias entre la digestión proteica entre

individuos sanos y aquellos susceptibles de desarrollar la enfermedad. Sin embargo, es

concebible que el fallo en la degradación de estas proteínas puede ser exagerado en el

intestino delgado de individuos con enfermedad celiaca activa que tienen un daño

marcado en el borde en cepillo del epitelio y que estos se acompañarían de disfunción

pancreática.

En el año 2002, Lu Shan y col identificaron un epitopo peptídico de 33

aminoácidos, procedente de la degradación de la α-gliadina que resultó de particular

interés, como posible inductor de la respuesta inflamatoria al ser resistente a la digestión

por las proteasas pancreáticas, gástricas e intestinales.

Este producto de 33 aminoácidos: 33 meropéptido:

LQLQPFPQPQLPYPQPQLYPPQPOLPYPQPQPF, residuos 57 al 89. [Shan L, 2002]

Estos péptidos denominados como inmunodominantes están incluidos en este segmento

de 33 aa. Este péptido está presente en los cereales tóxicos para los enfermos celiacos

(trigo, cebada, centeno) y ausente en los cereales no tóxicos como avena, maíz y el


43

arroz. Este péptido se une con alta afinidad a DQ2 y no requiere de procesamiento para

ser presentado por la APC. [Qiao, SW.2004] Sin embargo existen por lo menos 15

péptidos de gluten reconocidos por las células T, muchos de los cuales no están

presentes en este fragmento de 33 aa.

De acuerdo con la teoría inmunológica, el elemento central de la patogenia de la

enfermedad celíaca es la pérdida de la tolerancia al gluten de la dieta, con activación

de linfocitos T reactivos al gluten de la lámina propia de la mucosa. Estos

acontecimientos pueden agruparse en la siguiente secuencia:

II.4.1.1 Procesamiento y selección de péptidos de unión a la molécula HLA

DQ2.

La respuesta inmune frente al gluten está controlada por las células T del

intestino que presentan restricción por moléculas DQ2 o DQ8 en el reconocimiento de

antígeno: Los heterodimeros DQ unen predominantemente péptidos de gluten

modificados por el enzima Transglutaminasa tisular (tTG) mediante desaminación,

sustitución de glutamina cargado positivamente, situado en la posición 6 del péptido

PQQPQQSFPQQRP de la gliadina, por ácido glutámico cargado negativamente, que

son presentados a los linfocitos T específicos de gluten junto a moléculas DQ2 o DQ8

en la membrana de células presentadoras de antígeno.[Sollid,LM,2002] La tTG,

además de tener una función esencial en el procesamiento del gluten en el intestino, es

también el principal autoantígeno de los anticuerpos específicos para esta enfermedad.

[Dieterich, W.1997]

Otros genes fuera de la región HLA podrían tener un papel distinto en grupos

diferentes de pacientes y contribuir a la diversificación de los mecanismos patogénicos.

Por ejemplo, genes del sistema HLA de clase I no clásico, (MICA, MICB) [López-

Vazquez,A.2002] genes de citoquinas (como los polimorfismos de TNFα)

[Garrote,JA.2002] o de moléculas coestimuladoras (CTLA-4) ).[Djilali-Saiah,I.1998]


44

El hecho de que solo el 1 ó 2 % de los individuos con DQ2 ó DQ8 que toman

gluten desarrollen enfermedad implica la existencia de otros factores microambientales

que ejercerían un papel en la activación de la respuesta de las células T lesivas para el

intestino. El gluten e incluso otros péptidos desaminados en el intestino, o el enzima

tTG, no parecen ser factores limitantes en la EC. Sin embargo una alteración en la

inmunidad local, característica en la EC, puede ser determinante en el desarrollo de la

enfermedad.

II.4.1.2. Activación de linfocitos T CD4+ específicos de gluten de la lámina propia. En el intestino sano las respuestas inmunes siguen fundamentalmente un patrón

TH1 predominando las citoquinas proinflamatorias, probablemente debido a la

presencia de IL-12 en las placas de Peyer, mediante un proceso en el que intervienen

moléculas de la familia de los factores transductores de la señal y activadores de la

transcripción (STAT-4 y T-bet), migrando después a la lámina propia donde producen

especialmente INFγ, y mueren por apoptosis [Neurath, MF, 2002]

Las moléculas HLA de clase II son expresadas en la superficie de las células

presentadoras de antígeno donde pueden unirse y posteriormente presentar péptidos

extraños encontrados en el ambiente extracelular de las poblaciones de linfocitos CD4

que son reconocidos por los complejos DQ2 o DQ8 péptidos. Estos péptidos que se

unen a DQ2 o DQ8 en el caso de la enfermedad celiaca son ricos en glutamina y prolina

Figura 5 . Las moléculas de HLA clase II que expre sadas en la superficie de las APC (Ej., macrófagos, células dendríticas, células B) DQ2 y DQ8 unen adecuadamente Péptidos de “gluten,” tomado de Gastroenterology.Vo lumen 124. nº:4.suplem.1. 2005)


45

y permanecen en el intestino después de la digestión del gluten de la dieta. Así, es de

suponer que el enigma de porqué los péptidos del gluten cargados negativamente eran

los preferidos para unirse a los heterodimeros DQ2 o DQ8, y en ausencia de esta unión

era improbable activar las células CD4.

Este dilema fue solventado después del descubrimiento en pacientes con EC de

estos autoanticuerpos anti-tTG, que pueden desaminar la glutamina, conviertiéndola en

acido glutámico, cargado negativamente.

La observación de que los péptidos de gliadinas desamidados por tTG

presentaban mayor capacidad de unión a HLA-DQ2 y mayor estimulación de las líneas

T, introdujo un cambio sustancial en la interpretación del papel de la tTG en la

patología.[Van de Wal, Y. 1998] La desamidación de la glutamina por tTG no es al

azar, ya que estudiando substratos naturales o péptidos de síntesis, se establecieron

ciertos requisitos de secuencia para la deamidación selectiva.[Vader, W.2006] Por otro

lado, los estudios de unión de péptidos a la molécula HLADQ2 [Costantini S, 2005] y a

DQ8, [Van der Wal,Y.1998] permitieron establecer las restricciones de anclaje y definir

las secuencias de gliadinas que tienen mayor afinidad de unión. Considerando en

conjunto las restricciones de secuencia para la desamidación selectiva y las restricciones

de anclaje de las moléculas HLA-DQ2/DQ8, fue posible proponer algoritmos que

predicen, en forma teórica, las secuencias potencialmente tóxicas.[Vader,W.2003] La

estimulación in vitro de biopsias de intestino delgado de pacientes celíacos con

fragmentos de gliadinas obtenidos por digestión enzimática o con péptidos sintéticos,

induce una respuesta de tipo TH1, en la que predomina el IFNγ, cuyos niveles se

normalizan en la fase de remisión. [Forsberg, G. 2002]

Se ha confirmado que péptidos del gluten modificados por la enzima

transglutaminasa tisular aumentan su afinidad para unirse a las moléculas DQ2/DQ8 en

la superficie de las células presentadoras de antígeno, siendo reconocidos por los

linfocitos T reactivos específicos de gluten, localizados en el intestino de pacientes con

EC. La molécula DQ8 tiene una función similar en pacientes con DQ2 negativo. El

TNF-α se produce también por clones específicos de linfocitos T, que junto al IFN-γ

producen un efecto tóxico de la misma forma que éste puede inducir moléculas de HLA

II en la superficie de los enterocitos.


46

En la mucosa intestinal, además de la inmunidad específica o adaptativa

mediada por los linfocitos T CD4+ podría intervenir también la inmunidad innata (no

específica de antígeno). La IL-15 es la principal citoquina inducida por la vía innata.

Está producida por células del mesénquima, monocitos y células epiteliales, y se

relaciona con TGFβ, interviene en la modulación de los cambios epiteliales en la fase

activa de la EC, induciendo la infiltración del epitelio por las células linfoides (IELs) y

la apoptosis de los entericitos.[Maiuri,L.2001] También controla la inflamación

inducida por gluten, la expresión COX-2 y las células CD25+ , además regula la

expresión de receptores coestimuladores para los ligandos MHC clase I no clásicos, a

través de los cuales se activan los linfocitos TCRγδ y células NK intraepiteliales. Las

moléculas HLA II tienen como misión la presentación de antígenos a los linfocitos T,

que una vez reconocidos podrían tener al enterocito como célula diana.

En la enfermedad celiaca, una respuesta inmune inapropriada conduce a una

inflamación crónica y a daño. Las dos principales categorías de respuesta inmune

implicadas en la enfermedad celiaca son: la respuesta inmune adaptativa (HLA-

específica) y la respuesta inmune innata (independiente del tipo de HLA). [Sollid &

Jabri 2005]

II.4.2. TOLERANCIA IMMUNE (ORAL)

El sistema inmune del intestino está expuesto a una amplia variedad de

antígenos derivados de los alimentos, de las bacterias residentes y de los

microorganismos invasivos. La tolerancia oral es una condición fisiologica

caracterizada por la inducción de insensibilidad inmune hacia los antígenos alimentarios

y las bacterias de la flora intestinal. Multiples mecanismos celulares y moleculares están

implicados en la regulación de esta propiedad fundamental del sistema inmunológico

del intestino. [Dubois,B.2005] La EC es la enteropatía sensible a alimentos más

frecuente en humanos y está causada por una pérdida de la tolerancia inmune (tolerancia

oral) hacia el gluten del trigo y otras fracciones de prolaminas del centeno y de la

cebada. Han sido identificados diferentes péptidos del gluten que son reconocidos por

las células T del intestino. [Arentz-Hansen H.2002]


47

Ya hemos comentado anteriormente que la activación de estas células T

reactivas al gluten representan el elemento clave en la patogénesis de la EC [Sollid

LM,2002]. La mucosa de los pacientes con EC esta caracterizada por una alta

proporción de linfocitos intraepiteliales T portando cadenas gamma-delta como

receptores antigénicos de las células T (γδ IEL). [Ebert EC 1990]. La ingestión de

gliadina es el agente disparador de esta enfermedad, pudiendo atravesar la barrera

epitelial y obtener linfocitos T dañinos mediando la respuesta inmune. A las células

dendríticas se les supone un papel central en el esquema de la respuesta inmune [Alpan,

O. 2001] Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por unos bajos niveles de

expresión del MHC de clase II y moléculas co-estimuladoras y que pueden mediar en la

tolerancia, presumiblemente por inducción de las células T reguladoras (Treg cells).

[Steinman RM.2000] Además, la liberación de IL-10 por las Treg cells pueden modular

la función de las células dendríticas inmaduras e inhibir su diferenciación, amplificando

la presencia local de ‘‘células dendríticas tolerantes’’ [Jonuleit H.2000] La IL-10

modula a las células dendríticas induciendo anergia de las células T efectoras a través

de mecanismos aún no definidos que requieren contacto célula- célula. Por lo tanto, la

dirección de la respuesta inmune hacia la tolerancia inmune depende del estado de

maduración y de las propiedades funcionales de las células dendríticas. Los péptidos de

la gliadina pueden contribuir a la superación del estado de indiferenciación de las

células dendríticas inmaduras induciendo la maduración funcional y fenotípica de las

células dendríticas, haciendo más eficiente la presentación y procesamiento de los

péptidos de la gliadina a los linfocitos T específicos [Palova-Jelinkova L .2005]

II.4.3. COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC) . MOLÉCULA DE HISTOCOMPATIBILIDAD NO CLÁSICA: HLA-G

El complejo mayor de histocompatibilidad se localiza en la porción distal de la

banda 6p21.3, en el brazo corto del cromosoma 6, y supone aproximadamente un 0.1%

del genoma humano. Se han conseguido identificar unos 400 genes en el MHC humano

o murino, y se piensa que se han podido conservar unidos en grupos (clusters) durante

la evolución.


48

El sistema MHC, en humanos, se conoce con el nombre de HLA y se puede

subdividir en tres subregiones: clase I, clase II y clase III. La región de clase I, más

cercana al telomero, contiene los loci HLA-A, -B, -C que agrupan genes que codifican

series de antígenos definidos serológicamente y, posteriormente, confirmados por

técnicas moléculares y son conocidos como los antígenos HLA clásicos de trasplante,

estos genes se conocen como de clase MHC Ia. Otros tres genes de clase I,

denominados MHC Ib, HLA-E, -F, -G codifican moléculas funcionales. La región de

clase II engloba los genes: HLA-DR, -DQ y –DP (Figura 5). Más cercanos al

centrómero se encuentra la región de clase III que originariamente se creía circunscrita a

los genes del complemento C4, C2 y Bf, e incluye también genes tan importantes como

los del factor de necrosis tumoral (TNF-α y TNF-β), los de la enzima 21-hidroxilasa y

los que codifican para tres miembros de la familia de las “proteínas de choque térmico”

(Heat shock protein). Uno de los hechos más relevantes del complejo HLA es su

polimorfismo extremo. Debido a esto la heterocigosidad es de un 90%, y la mayoría de

los alelos tienen una frecuencia menor de 0,15. Los antígenos HLA se heredan de una

forma Mendeliana dominante. Esta combinación de determinantes genéticos es referida

como haplotipo. Ya que el cromosoma 6 es un autosoma, todos los individuos tienen

dos haplotipos HLA (uno para cada cromosoma).


49

Figura 6.Ordenación génica del complejo mayor de histocompatibilidad

II.4.3.1 ESTRUCTURA DE LA MOLÉCULA HLA-G Y SUS

DIFERENTES ISOFORMAS FUNCIONALES.

El transcrito primario de HLA-G sufre un splicing alternativo, dando como

resultado siete ARNm alternativos que codifican para cuatro isoformas de membrana

(HLA-G1,-G2, - G3, -G4) y tres isoformas solubles (HLA-G5, -G6, -G7) (Figura 6)

[Kirszenbaum et al., 1994]. A continuación se describen las peculiaridades de las

distintas isoformas.


50

Figura 7. Estructura y ordenación génica de las isoformas de HLA-G-. Imagen cedida por la

Dra. MI Torres (facultad Ciencias Experimentales, Univ. Jaén)

II.4.3.2. Proteína HLA-G1

ARNm HLA-G1 codifica una proteína de 39 kDa que contiene los dominios α1,

α2 y α3 unidos al dominio transmembrana codificado por el exon 5 y a una reducida

cola citoplasmática, debido a la existencia de un prematuro codon de parada en el exon

6. Esta isoforma presenta una estructura similar a otras moléculas HLA de clase I en

que está asociada con β2-microglobulina y une un péptido de 9 aas [Lee et al., 1995a]

(Figura 7).

Varias líneas de evidencia indican que la función primaria de HLA-G1 es servir

como un ligando inhibidor para células immunocompetentes, contribuyendo al

establecimiento de una tolerancia periférica. HLA-G1 es reconocido por los receptores,

ILT2 (Immunoglobulin-like transcript) expresado en células mielomonociticas

[Colonna et al., 1998], ILT4 expresado en monocitos, macrófagos y células dendríticas

y p49/KIR2DL4 (CD158d) expresado en células NK y células T. A través de estos

receptores HLA-G1 puede interactuar directamente con las células NK, T, B, y APC


51

Células transfectadas con HLA-G1 han mostrado que modulan la producción de

citoquinas de células mononucleares tanto deciduales como de sangre periférica. Las

cantidades de TNF-α e INF-γ liberadas por células mononucleares deciduales y de

sangre periférica se vieron descendidas, mientras que la cantidad de IL-4 secretada se

aumentó [Kanai et al., 2001a] También se ha asociado una respuesta Th2 (supra-

regulación de IL-10 e IL-4, y subregulación de TNF-α e INF-γ) con la exposición a

altas concentraciones de HLA-G1 purificada. Recientemente se ha descubierto que

HLA-G1 afecta la producción general de citoquinas en linfocitos granulares de la

decidua de una forma no consistente en el paradigma Th1/Th2 (descenso de la

producción de IL-10, IL-13, TNF-α, INF-γ y GM-CSF) [Rieger et al., 2002].

II.4.3.3. Proteínas HLA-G2.-G3 y –G4

Los transcritos primarios de HLA-G2, G3 y G4 que respectivamente excluyen

exon 3, exon 3 y 4, y exon 4, generan isoformas truncadas que poseen solo el dominio

α1 en HLA-G3, los dominios α1 y α3 para HLA-G2, y los dominios α1 y α2 para

HLA-G4, unidos a la región transmembrana (Figura 6).

Estas isoformas son expresadas fisiológicamente en el citotrofoblasto Menier et

al., 2000] y patológicamente en células tumorales, como las de coriocarcinoma [Adrian

et al., 1999], y melanoma [Paul et al., 2000] así como en células transfectadas [Mallet et

al., 2000]. Se ha observado que estas isoformas inhiben la citolisis tanto de las células

NK como la mediada por las células CTL especificas mediante una ruta HLA-E

específica [Riteau et al., 2001]. Quizás estas isoformas truncadas tengan mayor

relevancia en situaciones en las que la expresión de HLA-G1 esté impedida.

II.4.3.4. Proteínas HLA-G5, G6 y G7

Las isoformas solubles de HLA-G están desprovistas de las partes transmembrana

y citoplásmica, debido a las presencia de un codon de parada en el intron 4 (-G5, y –G6)

o en el intron 2 (-G7) dejando una cola específica C-Terminal para estas formas

solubles. (Figura 7). La isoforma completa HLA-G5 es una glicoproteina de 37 kDa que

guarda idénticos dominios líder, α1, α2 y α3 pero incluyendo una secuencia del intron

4 que produce una región de lectura abierta que codifica para 21 aas unidos al dominio


52

α3 y excluye el dominio transmembrana [Lee et al., 1995b]. De igual manera, la

isoforma HLA-G6 mantiene la secuencia del intron 4, dando lugar a una proteína

soluble la cual carece del dominio α2 [Paul et al., 2000b]. HLA-G7 es la isoforma que

ha sido descrita más recientemente, es una proteína soluble de 17 kDa producida por

una variante de splicing en la cual la secuencia de lectura abierta continúa en el intron 2,

el cual contiene un codon de parada. HLA-G7 está formada por el dominio α1 unido a

dos aas codificados por el intron 2 [Paul et al., 2000ª].

Debido a la disponibilidad de anticuerpos, como el anticuerpo monoclonal 16G1,

el policlonal PAG5-6 y actualmente con el monoclonal 5A6G7 que son específicos

para el extremo C-terminal (residuos codificados por el intron 4) tanto de HLA-G5

como HLA-G6, se ha podido investigar estas moléculas.

La isoforma HLA-G5 ha sido descrita en varios fluidos corporales, como el

liquido amniótico y suero de mujeres embarazadas [Rebmann et al. 1999;, 1999;Hamai

et al., 1999], pacientes con cáncer [Ugurel et al., 2001;Adrian et al., 2001] pacientes

trasplantados de corazón [Lila et al., 2000b;Lila et al., 2002]. También ha sido descrito

en trofoblasto [Fournel et al., 2000;], oocitos [Menicucci et al., 1999] embriones pre-

implantados [Jurisicova et al., 1996;Fuzzi et al., 2002] y durante la reactivación del

citomegalovirus humano [Onno et al., 2000].

La proteína HLA-G5 recombinante exhibe propiedades inhibitorias y se une a

CD8 y receptores inhibidores, como lo hace HLA-G1. De hecho, la isoforma HLA-G5

inhibe la lisis mediada por células NK y células T CD8+ [Marchal-Bras-Goncalves et

al., 2001b;Contini et al., 2003] y la respuesta alogénica de los CTLs. Por otra parte, la

isoforma HLA-G5 producida naturalmente por células T CD4+ aloreactivas inhibe su

respuesta proliferativa, a través de de efectos inhibitorios por feedback [Lila et al.,

2001c]. También se ha observado que la proteína recombinante HLA-G5 influencia la

liberación de citoquinas por las PBMCs estimulando su liberación de IL-10, TNF-α, e

INF-γ [Kanai et al., 2003].


53

II.4.3.5. Papel de HLA-G in vivo.

HLA-G es una molécula que en circunstancias normales no está expresada,

excepto en la interfase materno fetal y en las células epiteliales tímicas. Por otra parte se

ha demostrado que hay expresión de HLA-G en pacientes trasplantados de corazón,

Higado y riñon [Lemaoult et al., 2005] y esta correlacionado con la ausencia de rechazo

de estos trasplantados [Creput et al., 2003a;Creput et al., 2003b.]

HLA-G en inflamación y autoinmunidad

Con base en las funciones tolerogénicas que presenta HLA-G, podemos considerar que

esta molécula está implicada en las enfermedades autoinmunes e inflamatorias. En este

sentido, se ha descrito previamente expresión de HLA-G en los tejidos como la piel

[Gazit, E. et al.2004], el músculo, el páncreas, el tracto digestivo , y el sistema nervioso

central participando en procesos inflamatorios que a menudo tienen una etiología

autoinmune.[Carosella ED,2001] de los niveles plasmáticos de sHLA-G o menor

expresión de HLA-G se han encontrado en monocitos de pacientes con artritis

reumatoide, asma, o esclerosis múltiple [Lila N, et al, 2001]. Esta baja expresión de

HLA-G se correlaciona positivamente con los parámetros de actividad de la

enfermedad, lo que indica que la HLA-G no protege eficazmente a los tejidos dañados

de las células NK y T. Curiosamente, la expresión de HLA-G por los monocitos de

pacientes con esclerosis múltiple puede ser estimulada por el interferón-beta, que se

utiliza comúnmente para el tratamiento de esta enfermedad [Fainardi, E, et al 2003].

Los efectos beneficiosos del tratamiento con IFN-beta puede ser debido a la

restauración de la expresión de HLA-G por los monocitos que son así capaces de ejercer

la función tolerogénicas en estos pacientes.

II.4.3.6. HLA-G: molécula de tolerancia inmune

HLA-G es una molécula no clásica de clase I del Complejo mayor de

histocompatibilidad que se expresa selectivamente en la intefase materno-fetal en las


54

células del citotrofoblasto protegiendo al feto del rechazo inmune por parte de la madre

y creando un estado general de tolerancia. HLA-G exhibe propiedades tolerogénicas

vía interacción con receptores inhibitorios presentes en las células natural killer (NK),

células T y células presentadoras de antígenos (APC). [Le Rond S. 2005]

La molécula HLA-G pertenece a la familia de moléculas de histocompatibilidad no

clásicas y se caracterizan por un limitado polimorfismo y una distribución celular y

tisular restringida al trofoblasto fetal y células del epitelio tímico. Esta molécula puede

presentarse en siete isoformas distintas, codificadas por splicing alternativo, cuatro de

ellas son proteínas unidas a membrana (HLAG1, G2, G3 Y G4), y otras tres isoformas

que son proteínas solubles (HLA-G5, G6 Y G7 ).

Otras características de esta molécula son:

• Es reconocida por ciertos receptores inhibidores, tales como KIR2DL4, ILT-2 y

ILT-4 y, en consecuencia posee, capacidad de inhibir la lisis mediada por células

NK y ciertas células T.

• Está relacionada con la inducción de tolerancia materno-fetal. Se ha demostrado

que la molécula HLA-G es capaz de inhibir la actividad de las células NK de los

leucocitos de la decídua sobre los trofoblastos durante el primer trimestre de

gestación. Parece participar en la vigilancia del sistema inmune frente a tumores

y se ha descubierto un aumento en el nivel de la expresión de esta molécula en la

superficie de las células infectadas por el HIV, que podría ser una forma del

virus de escapar de la destrucción por el sistema inmune.

La presencia de HLA-G soluble (sHLA-G) en el fluido cerebroespinal de

enfermos con esclerosis múltiple [Fainardi, E.2003] y en receptores de aloingerto

después de un trasplante [Lila N.2001] sugieren una función tolerogénica para esta

molécula contra la respuesta celular inmune innata y adaptativa. Curiosamente, nuestro

grupo investigador y otros autores han sugerido que los antígenos HLA-G juegan un

papel protector en la inflamación. [Carosella, ED.2001]. Así, las moléculas de sHLA-G

inhiben la actividad lítica de las células NK, induciendo apoptosis de CD8+ CTLs y

afectan la alloproliferación de CD4+. [Bainbridge DR.2000] Las propiedades

inmunomoduladoras del sistema sHLA-G explican su potencial interés en EC. La


55

expresion de HLA-G soluble en la EC es de especial interés porque su molécula juega

un importante papel en la inducción de la tolerancia inmune.[Rouas – Freiss, N.2000]

II.4.3.7. POLIMORFISMO HLA-G

El Polimorfismo de HLA-G se reduce a sólo 9 HLA variantes diferentes de la proteína

G codificada por 28 alelos, de los cuales 23 corresponden a las sustituciones en la

secuencia de codificación. El Polimorfismo en regiones no codificadoras también afecta

a la expresión de los genes HLA-G y tiene un significado funcional. En este sentido,

nivel de mRNA y la estabilidad, así como la expresión del HLA-G soluble (sHLA-G) e

IL-10 por las células mononucleares de sangre periférica se relacionan con el

polimorfismo de de 14 pares de bases de HLA-G. En enfermedades humanas, los alelos

HLA-G han sido estadísticamente asociados con el aborto espontáneo recurrente, el

pénfigo vulgar , la enfermedad inflamatoria intestinal, y la sarcoidosis .

II.4.4. Citokinas y Enfermedad celiaca.

Las características de una respuesta inflamatoria dependen de las citokinas

producidas durante esta respuesta. La producción de citoquinas po las células T y

macrófagos es de potencial importancia en las lesiones histológicas que aparecen en la

EC.

Células Th1: Las lesiones de la EC asocian una marcada infiltración de células Th1

dominadas por la síntesis de citoquinas proinflamatorias, IFN-gamma y TNF-α. [Nilsen

EM.1995] La IL-15 también tiene un importante papel en la EC, por orquestar cambios

en los linfocitos intraepiteliales en esta enfermedad. Ciertas partes del gluten pueden

estimular la respuesta inmune innata, y la IL-15 es un elemento central en la respuesta

inmune inducida por el gluten, produciendo la activación de los IELs en la

EC.[Maiuri,L.2000] La sobreexpresión de IL-15 por las células epiteliales en el

intestino conducen a una masiva expansión de células T CD8+ intestinales que

acompaña a una enteropatía CD-like. Además, la IL-15 induce la expresion de MICA,

el ligando epitelial de NKG2D.[Hue, S.2004]

La IL-10 actúa predominantemente como un potente factor antiinflamatorio y

agente supresor de la respuestas Th1. TGF-beta es el principal factor para la producción


56

de inmunoglobulina A (IgA) y actua como un potente mediador en la reparación del

daño tisular. [Cataldo,F.2003]

Curiosamente, la tTG, se ha descrito como el principal autoantígeno hacia el

que van dirigidos los anticuerpos antiendomisio en la EC. Es necesaria para la

activación de TGF-beta [Hansson,T.2002] Los niveles elevados de Il-10 y TGF-beta

son insuficientes para la inhibición de la reacción autoinmune, y podrían modular la

respuesta inmune e inducir la activación de los linfocitos B. Estas citoquinas pueden

jugar un importante papel en la inducción de HLA-G. Esta consideración, el posible

papel de la IL-10 en la inducción de la expresión protéica de HLA-G ya ha sido descrita

previamente en la enfermedad celiaca [Torres,MI.2006]

Uno de los primeros estudios sobre citoquinas en EC demostró mediante

técnicas de inmunohistoquímica, que la mucosa de los enfermos celiacos presentaba

menor porcentaje de IELs (3,5% v 13,5%) y de LPL (10,3% vs 47.2%) productores de

IFN-γ que los controles . Este dato fue puesto en duda por otro grupo de autores quienes

demostraron más tarde por hibridación in situ, mayor número de LPL productores de

IFN-γ en celiacos que en controles, sugiriendo que el balance Th1/Th2 estaría alterado

[Kontakou, M. 1994].

El incremento de citoquinas Th1 se demostró en biopsias de mucosa

provenientes de enfermos celiacos, que tras la ingestión de proteínas de trigo, a las

cuatro horas incrementaban la síntesis de mRNA de IFN-γ, IL-12 y TNF-α.

Clones de LPL CD4+ aislados de mucosa celiaca y específicos de gliadina,

muestran un patrón Th1 con producción de IFN-γ cuando los péptidos son presentados

por DQ2, y un patrón Th1/Th0 (IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, TGF-β) cuando

lo hacen asociados a DQ8. [Nilsen, EM. 1995]. Otro estudio sobre clones CD4+

específicos de gliadina y restringidos por DQ2, producen mayoritariamente IFN-γ

aunque algunos también IL-4 [Troncone, R. 1998] Este patrón observado en clones

específicos de gliadina confirmaría los estudios realizados en biopsias de mucosa.

Células Th3: Son células T CD4 + productoras de TGF-β que se aislan de

nódulos linfáticos mesentéricos tras la administración oral de antígenos a bajas dosis.

En el año 1994, en el modelo de EAE (encefalitis autoinmune experimental) se


57

describen un tipo de células productoras de TGF-β que impedían la inducción de la

enfermedad por MBP o PLP.

Células CD4+ CD25+: Los linfocitos CD4+ CD25+ son otra población a las que

se atribuye la supresión activa de autorreactividad. Son células derivadas del timo que a

través de mecanismos moleculares no muy claros, median activamente la inhibición de

las células T (autorreactividad, síntesis de citoquinas). El efecto principal de esta célula

sería el de reducir/inhibir la expresión de IL-2 en las células CD4+ CD25-. In Vitro, el

efecto supresor requiere la activación de las células supresoras, el contacto entre ésta y

la efectora, y no es mediado por citoquinas. El efecto se inhibe con adición de anti-

CD28, lo cual sugiere que estarían actuando sobre la señal coestimulatoria. Sin

embargo, las CD4+ CD25+ pueden inducir supresión de síntesis de citoquinas en un

sistema libre de APCs. Es la única población en ratón que expresa constitutivamente

CTLA-4. Se desconoce si el CTLA-4 está involucrado en la función reguladora de esta

población. Su efecto supresor parece ser independiente de la IL-4 e IL-10. Si bien la

supresión y/o tolerancia están generalmente vinculadas a la producción de dos

citoquinas, la IL-10 y el TGF-β, hasta el momento no se ha visto un efecto directo de

estas en el proceso de diferenciación o en la función efectora de las células T

reguladoras. Aún queda por resolver si las Treg actúan a través del contacto célula-

célula o a través de mediadores solubles, qué marcadores las diferencian, qué antígenos

reconocen y sobre qué tipos de células actúan.

Los linfocitos T y B son los mediadores de la respuesta inmune, pero de

la presencia de células dendríticas dependerá la correcta diferenciación de las mismas

[Banchereau, J. 1998] La secreción de citoquinas por parte de las CD y de las células T

condicionará en muchos casos el resultado final, es decir, la polarización hacia una

respuesta de tipo Th1 ó Th2 [Neurath, MF. 2002] Algunas enfermedades tienen una

clara asociación con la presencia de determinadas citoquinas, como ocurre en las

enfermedades inflamatorias intestinales

CÉLULAS TH17. IL-17/IL-23

El paradigma que establece una dicotomía de respuestas inmunológicas frente a

antígenos, basado en la existencia de linfocitos Th1 y Th2 continua sin aclarar del todo.

La evidencia de un nuevo tipo de linfocito T cooperador, denominado Th17, trae nuevas


58

luces y complejidades a la comprensión de los mecanismos de inmunoregulación,

inmunopatología y su rol en enfermedades autoinmunes e inflamatorias.

Los linfocitos Th1 producen grandes cantidades de IFN-gamma participan en procesos

inflamatorios, mientras que los Th2 productores de IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13 están

asociados con la protección frente a alergias. Los linfocitos Th17 son distintos a los Th1

y Th2 y se caracterizan por producir IL-17, TNF-alfa, IL-6, IL-22 y GM-CSF.

Asimismo, se ha descrito para ellas un efecto proinflamatorio queles permite hacer de

puente entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa. Las citocinas implicadas en

el control de la actividad TH17 son la IL-23, el (TGF-β) y la IL-6. El TGF-β y la IL-6

promueven la diferenciación de los linfocitos quiescentes en células TH17. Los

diferentes tipos de células colaboradoras se inactivan mutuamente, de modo que los

TH1(a través de lIFN-γ) inhiben selectivamente la actividad de los TH2 y los TH17. A

su vez, los TH2 inhiben la proliferación de los TH1 y los TH17 mediantela IL-10 y la

IL-4, y los TH17 inhiben a TH1 y a TH27. Hasta hace unos años se consideraba que los

principales causantes del daño tisular en las enfermedades autoinmunes eran las células

TH1, pero actualmente se considera que las TH17 son las principales inductoras de

enfermedad autoinmune. Recientemente se ha demostrado que los linfocitos Th17

también participan en la patogénesis de enfermedades inflamatorias. [Blauvelt (2007]

propone que la psoriasis debe ser una enfermedad Th17. De igual manera, los linfocitos

Th17 pueden ser importantes en otras enfermedades o desordenes caracterizadas por

inflamación y autoinmunidad.

La investigación sobre los Th17 ha permitido señalar tres vías independientes y

exclusivos de respuestas inflamatorias: IL-12/ IFN-gamma, IL-4/IL-5/IL-13 e IL-

23/IL-17. La identificación de la vía involucrada en las distintas formas clínicas o

estadios de una enfermedad permitirá la aplicación de esquemas terapéuticos más

precisos y certeros


59

Figura 8

II.4.5. Inmunogenetica: Variantes Alélicas implicadas.

La enfermedad celiaca muestra una de las asociaciones más fuertes con la región

HLA-clase II conocida hasta ahora. En la mayoría de las poblaciones estudiadas (una

excepción es la población indígena sudamericana) el 95 % de los pacientes son

portadores del heterodímero HLA-DQ2, que se asocia a DR3 (más común en el centro y

norte de Europa); o a DR7/DR5 en heterocigotos (más frecuente en países

mediterráneos). Sin embargo, alrededor del 25-30% de la población general tiene el

heterodímero DQ2, lo que sugiere que otros genes (probablemente no HLA) podrían ser

relevantes. Más del 95% de los pacientes con EC presentan los alelos de riesgo

DQB1*02 y DQA1*0501 o DQB1*0302 y DQA1*03 [Karell, K. 2003] y los casos

DQ2/DQ8 negativo, suelen tener al menos uno de los alelos de riesgo por separado

(DQA1*0501 ó DQB1*02), siendo muy raros los casos en los que ambos están

ausentes. Sin embargo, la concordancia de EC en gemelos monocigotos es del 75% y

sólo un 1-2% de los individuos portadores de HLA-DQ2/DQ8 desarrollan la

enfermedad, lo que sugiere que otros factores serían responsables de la activación (o

cronificación) de la respuesta inmune local frente a las prolaminas tóxicas en individuos

genéticamente predispuestos.


60

El resto de los pacientes (5-10%) suelen portar un segundo heterodímero, DQ8

(mayoritario entre los pacientes indígenas de Sudamérica), asociado normalmente a

DR4. Por último los pacientes no portadores de DQ2 ni de DQ8, pueden mostrar al

menos uno de los alelos del DQ2 por separado, y se han descrito muy pocos casos en

los que ambos alelos de riesgo están ausentes. Además dentro de la región HLA se han

estudiado otros genes no-DQ, que podrían estar asociados a la susceptibilidad.

Las proteínas HLA-DQ2 y DQ8 son heterodimeros encontrados en la superficie de las

células presentadoras de superficie (APCs). Las proteínas DQ2 y DQ8 constan de una

cadena α y una cadena β codificadas por secuencias variantes específicas codificadas

por los genes HLA-DQA1 y HLA-DQB1 respectivamente.

Los individuos con enfermedad celiaca que tienen DQ2:

• Poseen el haplotipo de susceptibilidad para enfermedad celiaca DR17-

DQ2 [HLA-DRB1*0301;HLA-DQA1*0501;HLA-DQB1*0201] o

• Son heterocigotos para los haplotipos de susceptibilidad celiaca

DR11 o DR12-DQ7 [HLA-DRB1*11/12;HLA-

DQA1*0505;DQB1*0301] o DR7-DQ2 [HLA-DRB1*07;HLA-

DQA1*0201;HLA-DQB1*0202]

Los individuos con enfermedad celiaca que tienen DQ8 tienen el haplotipo de

susceptibilidad celiaca DR4-DQ8 (HLA-DRB1*04;HLA-DQA1*03;HLA-

DQB1*0302) [Sollid 2002, Sollid & Lie 2005].

II.5. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD CELIACA

El diagnóstico de enfermedad celiaca se realiza a través de la combinación de los

siguientes: [Hill et al 2005, NIH Consensus Committee 2005, Green & Cellier 2007]:

• Biopsia de intestino delgado que muestra las alteraciones histológicas

características

• Mejoría posterior (clinica y/o histológica) a la dieta sin gluten


61

Además descubrir en muchos individuos afectados:

• Alteraciones analíticas (aunque algunos individuos están

asintomáticos y carecen de alteraciones analíticas)

• Anticuerpos específicos asociados a la Enfermedad Celiaca

Aunque la positividad de las pruebas de anticuerpos especifícos tienen

una fuerte asociación con el diagnóstico de enfermedad celiaca y

ayudan muchísimo a su diagnóstico [Fasano 2001, Farrell et al 2002],

la biopsia de intestino sigue siendo el “gold standard” en la

confirmación del diagnóstico de la enfermedad celiaca.

• La enfermedad celiaca se asocia con los (HLA) human leukocyte

antigen

II.5.1. Anticuerpos asociados con la enfermedad Celiaca

(1) Es importante que tanto los niveles de anticuerpos como la biopsia intestinal se

realicen tomando una dieta con gluten, porque los niveles de anticuerpos y las

anormalidades histológicas revierten a la normalidad gradualmente después de instaurar

una dieta sin gluten.

(2) Para los individuos que toman gluten en su dieta, el diagnostico de enfermedad

celiaca puede ser realizado con los test de anticuerpos y biopsia intestinal que seguirán a

los cambios de gluten de la dieta (p.ej., comer alimentos con gluten [el equivalente a

tres rebanadas de pan al día] al menos tres meses si no se observan síntomas). Sin

embargo, los cambios del gluten pueden causar un daño importante en algunos

individuos.

a) Anticuerpos Anti transglutaminasa tisular (tTG) IgA. Medir la concentración

de anticuerpos anti transglutaminasa tisular (tTG) de clase IgA es recomendable

para el diagnóstico inicial por su alta sensibilidad y Especificidad para la

enfermedad celiaca, con relativo bajo coste, y de fácil realización y alta fiabilidad.

Sin embargo, la sensibilidad y Especificidad difieren entre laboratorios [Abrams et

al 2006]. Los resultados Falsos positivos pueden ocurrir en personas con síndrome

coronario agudo y en individuos con hepatopatías crónicas y cirrosis.


62

b) Anticuerpos Antiendomisio (EMA) IgA. La concentración en suero de

anticuerpos antiendomisio (EMA) IgA tienen una alta Especificidad (~99%),

pero es más caro y llevan demasiado tiempo su realización y son potencialmente

más propensos a presentar falsos negativos que la concentración sérica de

anticuerpos tTG IgA. Porque son determinados por inmunofluorescencia

indirecta, la concentración sérica de EMA IgA está sometida a la variabilidad

subjetiva del observador, lo que afecta su sensibilidad [Murray 2004] Cuando

son relizados por un analista experto, este test tiene una alta Especificidad

(cercana al 100%) tanto o más que los anticuerpos tTG y son útiles en

individuos con cirrosis.

c) Anticuerpos anti péptidos desaminados relacionados con la gliadina (a-

DGP) IgA e IgG. Este nuevo test detecta anticuerpos que se unen a péptidos

sintéticos desaminados relacionados con la gliadina (DGPs). Estudios

preliminares examinan grupos con alta prevalencia de enfermedad celiaca,

ambos isotipos (IgA e IgG) demostraron tener una alta sensibilidad y

especificidad para la enfermedad celiaca activa. La Especificidad es mayor que

la de los anticuerpos antigliadina (AGA) y similar a la de los anticuerpos tTG.

Un incremento de los niveles de anticuerpos DGP pueden preceder al

incremento de la concentración sérica de anticuerpos tTG-IgA en niños [Liu et

al 2007]. Sin embargo, con todos estos test, una minoria de individuos tienen

resultados falsos negativos.

d) Medición de la concentración sérica de IgA total para evaluar la deficiencia

selectiva de IgA. La prevalencia de la deficiencia selectiva de IgA, tiene una

causa desconocida, afecta a 1:700 de la población general. Se descococe el

porqué la prevalecia de la deficiencia selectiva de IgA es más alta (1:50) en

individuos con enfermedad celiaca que en la población general [Wong el al

2003, Alaedini & Green 2005].

i. Los individuos con déficit selectivo de IgA no producen

anticuerpos IgA, la EC se asocia anticuerpos tTG IgA y EMA

de clase IgA y no están presentes en estos individuos. Por tanto,


63

en estos individuos, se recomienda realizar anticuerpos

específicos para EC de clase IgG (tTG IgG) o DGP-IGG que

pueden ser realizados en su lugar.

e) Anticuerpos Antigliadina (AGA) IgA e IgG. En la NIH Conferencia sobre el

Consenso y Desarrollo sobre la Enfermedad Celiaca se hicieron

recomendaciones contra el uso de AGA en el diagnóstico de enfermedad celiaca

por la baja Especificidad de esta prueba y la disponibilidad de test de más

sensibilidad y especificidad, incluidos tTG y EMA IgA [Hill et al 2005].

La sensibilidad global de las pruebas de anticuerpos relacionados con la enfermedad

celiaca puede incrementarse ligeramente cuando se hacen los cuatro tests

(concentraciones séricas de tTG IgA, EMA IgA, total IgA, y AGA IgA e IgG). No

obstante, el uso de paneles que incorporan AGA incrementan marcadamente la tasa de

falsos positivos, como resultado de un único positivo en los anticuerpos AGA y el valor

predictivo positivo hasta niveles bajos excepto en el caso de un pretest con una muy

alta prevalencia.

Aunque un resultado en las pruebas de anticuerpos asociados a la enfermedad celiaca es

probable que sea diagnóstico, pueden ocurrir falsos positivos y a la inversa, resultados

normales en las pruebas de anticuerpos no excluyen el diagnóstico de enfermedad

celiaca, especialmente en presencia de grados bajos de atrofia intestinal o en personas

que toman una dieta sin gluten en pruebas previas.

II.5.2. Diagnóstico Diferencial

La enfermedad celiaca está infradiagnosticada por su presentación clínica variable y que

puede ser superponible con otras entidades.

Las condiciones que tienden a enmascarar el diagnóstico de enfermedad celiaca

incluyen dispepsia, SII, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), esprue tropical,

estreñimiento, fatiga crónica y varios síndromes neurológicos [Alaedini & Green 2005,

NIH Consensus Committee 2005]. Algunas de estas condiciones pueden ocurrir


64

conjuntamente con la enfermedad celiaca. Se estima que el 36% de individuos

diagnosticados de enfermedad celiaca iniicialmente ha tenido el diagnóstico de SII

[Green et al 2001]. Aproximadamente el 5% de individuos con SII y el 2% de

personas con IBD también tienen enfermedad celiaca [Yang et al 2005].

Sensibilidad al gluten No-celiaca: Es una condición distinta de la enfermedad celiaca

y que está presente en algunos individuos que no tienen enfermedad celiaca pero tienen

sensibilidad al gluten que mejora con una dieta sin gluten. Los mecanismos patogénicos

para esta condición no son completamente conocidos. Un estudio reveló que los

individuos diagnosticados de SII que respondían a la retirada del gluten eran DQ2

positivos. Los individuos con síntomas neurológicos o gastrointestinales en ausencia

de enfermedad celiaca que informaron de mejoría con una dieta sin gluten son difiles

de evaluar y pueden recibir la etiqueta de sensibilidad o intolerancia al gluten.


65

III. Material y Métodos

III.1. Muestra

III.1.a. Pacientes:

El estudio fue realizado después de ser aprobado por la Comisión de Ética. Las

biopsias de intestino delgado fueron obtenidas mediante endoscopia gastrointestinal,

contando con el consentimiento informado de los pacientes para ser investigados para

EC (los pacientes fueron seguidos en el Hospital Virgen de las Nieves de Granada,

España). Se obtuvieron dos muestras de biopsia de cada paciente, empleándose una de

ellas para análisis inmunohistoquímico. Veinte y cuatro pacientes tuvieron los hallazgos

típicos de la EC y nueve pacientes en los que la EC fue excluida fueron incluidos en el

grupo control de no celiacos (pacientes con síndrome de intestino irritable (n=2),

síndrome de malabsorción (n=2) y enfermedad de Crohn (n=5)).

Para la segunda parte del estudio, metabolismo del triptófano y expresión de la

2,3 indolamina dioxigenasa (IDO), se usaron las biopsias de intestino Delgado de los

veinticuatro pacientes anteriores que tenían características de EC típica activa. Doce

pacientes en los que la EC fue excluída se incluyeron como grupo control de No

celiacos [pacientes sanos (n = 5) y pacientes con enfermedad de Crohn (n = 7)].

III.2.Diseño

III.2.1. Análisis estadístico:

Todos los resultados fueron expresados como media + SEM. Los datos fueron

evaluados para significación estadística usando el programa STATGRAPHICS Plus 5.

Se usó un test no paramétrico (test de Kruskal-Wallis) para determinar las diferencias

entre grupos. El test de Kolmogorov-Smirnov fue usado para comparar la distribución

entre grupos. Se consideraron significativos valores de P < 0.05.


66

Para la segunda parte del estudio Todos los resultados fueron expresados como

media y como error estándar de la media (s.e.m.) Las comparaciones fueron realizadas

por el test de Kruskal– Wallis. Los valores de P menores de 0·05 fueron considerados

como diferencia significativa. El test de Kolmogorov–Smirnov fue usado para comparar

la distribución entre grupos. Todos los análisis estadísticos fueron realizados usando el

programa statgraphics Plus 5 m.

III.3.Método

III.3.1. Análisis serológicos e histológicos:

El diagnóstico de EC es establecido mediante tests de screening serológico

acompañados por biopsia del intestino delgado y confirmación de una respuesta clínica

a la eliminación del gluten de la dieta. Los pacientes fueron estudiados

prospectivamente para EC usando anticuerpos antiendomisio (EMAs), anticuerpos

antigliadina (AGAs), anticuerpos anti transglutaminasa tisular (tTGAs) y tipaje HLA

específico de EC. La mejor determinación para screening es la Ig A humana

recombinante antitransglutaminasa tisular, medida por medio de ELISA, el cual tiene

una alta sensibilidad y especificidad para EC. [Lock, R. J.2004]

El diagnóstico histopatológico estuvo basado en las lesiones típicas de la mucosa

intestinal con hiperplasia de criptas, atrofia de las vellosidades y aumento del número de

linfocitos intraepiteliales. Todos los pacientes con EC fueron positivos para los

anticuerpos antiendomisio (EMA) y anti-transglutaminasa (tTG Ac)

En el momento del diagnóstico. Ningún paciente con Sprue refractario fué

enrolado en el estudio.


67

III.3.2. Análisis inmunohistoquímicos:

Las muestras fijadas en formalina e inmovilizadas en parafina fueron usadas

para inmunohistoquímica. El HLA-G fue detectado usando un mAb MEM-G/1 (Exbio,

Praga, Republica Checa), que reacciona con las cadenas pesadas de HLA-G

desnaturalizado, y 5A6G7 (Exbio) que reconoce isoformas de sHLA-G. Se usó como

control negativo un mAb isotópico IgG1. La tinción inmunohistoquímica fue realizada

usando el sistema de detección UltraTech HRP Streptavidin-Biotin Universal

(Inmunotech, Francia).

Después de desparafinización y rehidratación, (las secciones de las muestras de

biopsia) fueron sometidas al microondas en 10 nM de citrato buffer (pH, 6.0) para

recuperar antígenos. Las secciones fueron congeladas en PBS, y la actividad de

peroxidasa endógena fue saturada con peróxido de hidrógeno en agua destilada. Las

secciones fueron tratadas con el agente bloqueante de proteínas, incubadas

secuencialmente con el anticuerpo primario, y luego con un anticuerpo secundario

biotinilatado y con el reactivo streptavidina-peroxidasa. La inmunoreacción fue

visualizada con una solución AEC (3-amino-9-etil-carbazol) (Inmunotech) que actúa

como cromógeno. Finalmente, las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina.

Siempre se consideró un control positivo y otro negativo.

III.3.3. Tinciones Inmunohistoquímicas para IDO, TGF-β e Il-10

Secciones de parafina fueron desparafinadas en xyleno, seguido por hidratación a

través de alcohol. Usamos los siguientes anticuerpos: rabbit anti-human IFN-g

(Biosource), sheep antihuman indoleamine 2, 3-dioxygenase (Serotec), mouse

antihuman transforming growth factor (TGF)-b (Serotec) y mouse anti-human IL-10

(Santacruz Biotechonology). Las tinciones inmunohistoquímicas fueron realizadas

usando UltraTech, en la cual el anticuerpo primario fue sustituido por el

correspondiente anticuerpo control isotipo.


68

III.4 TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA PARA EL ESTU DIO DE LA

EXPRESIÓN DE HLA-G, IDO, IL-10, TGF-beta.

Material en parafina

Se obtendrán secciones de 3-4 micras mediante micrótomo rotatorio

convencional, montándose sobre portaobjetos con adhesivo celular. Se secan a

temperatura ambiente durante una hora y después se depositarán en una estufa a 37º C,

para favorecer la adherencia de la sección. No usándose temperaturas mayores para

evitar daños antigénicos.

Anticuerpos.

Se utilizarón los anticuerpos monoclonal anti-HLA-G humana MEM-G/01

(Exbio, Praga. R. Checa) y 4H84 (Cedido por el Dr Carosella) los cuales reconocen

todas las isoformas desnaturalizadas de HLA-G. El anticuerpo 5A6G7 (Exbio, Praga. R.

Checa) que reconoce las isoformas solubles HLA-G5 y HLA-G6.

Buffers Usados

Se utilizaron como buffers o tampones el fosfato salino tamponado (Phosphate

Buffered Saline: PBS), 0.01M, a pH 7.2 y se prepara como sigue: a un litro de agua

destilada se añade 1.48g de fosfato sódico dibásico anhídro, 0.43g de fosfato potásico

mono básico anhídro y 7.2g de cloruro sódico. Tras cada nuevo elemento añadido se

agitará la disolución para que no quede poso. Una vez preparado se comprobará el pH

mediante pHmetro convencional, ajustándolo si fuese necesario. La solución se

guardará a 4º C.

Tampón citrato para la recuperación antigénica se utilizó el de la casa DAKO

(DakoCytomation Target Retrieval Solution, Citrate pH 6. S 2369)


69

Técnica de inmunotínción

Se utilizó el método avidina-biotina-peroxidasa mediante al Kit para

inmunomarcaje de Immunotech (HRP 2391. Marseille, Francia)

Realización de la técnica:

• Se secarán las secciones de la estufa y se dejan a temperatura ambiente así como

en el resto de material que vamos a utilizar.

• Desparafinar, en dos cubas con xilol las secciones son introducidas 10 minutos

en cada una.

• Hidratación en alcohol etílico decreciente (absoluto, 90º ,70 º y 50º) 10 minutos

para cada paso

• Las muestras se calentaran con tampón citrato

• Se dibujará sobre el porta y alrededor de la sección un círculo mediante el lápiz

hidrófobo (Dako, Glostrup, Dinamarca; S-2002) que dá una lámina de un

polímero plástico hidrófobo, que evita el desparramamiento de las soluciones

por el porta, asegurando una cantidad adecuada y uniforme de reactivo sobre la

sección.

• Inhibición de la peroxidasa endógena con H2O2 al 3%, durante 5 minutos. Esta

solución deberá prepararse en el acto.

• Lavaremos en PBS, 5 minutos

• Incubaremos con el anticuerpo primario adecuadamente diluido (1/1000)

durante una hora a t.a.

• Lavaremos tres veces con PBS, 5 minutos cada repetición.


70

• Incubación con anticuerpo anti ratón biotinilado del kit comercial HRP 2391;

Immunotech, Marsella. Francia) durante 10 minutos a t.a.


• Incubación con complejo avidina-biotina-peroxidasa durante 10 minutos a t.a.


• Incubación con la solución cromógena del kit , durante 8 minutos a t.a. , recién

preparada.

• Lavado en agua corriente, 5 minutos

• Contratínción nuclear con hematoxilina convencional. Aprox 2 minutos.

• Lavado abundante con agua destilada

• Secamos con papel absorbente los excesos de agua.

• Montaje permanente con gel fijador (Glicergel, Dako, Dinamarca).

• Colocaremos un cubre y depositaremos en oscuridad hasta que la sección se fije.

Valoración de las tinciones

La cuantificación de marcaje se ha realizado mediante el software WCIF ImageJ

(Western Research Institute. Toronto. Canadá)


71

Controles de las técnicas

A) Control negativo

Su función es detectar alteraciones del tejido en estudio que produzcan tinciones

inespecíficas o bien alteraciones en el sistema de detección (anticuerpo, complejo

del sistema de detección, cromógeno)

Para ello se usaron secciones de tejidos conocidamente negativos que fueron

inmunoteñidos de forma similar a las secciones de estudio, no debiéndose obtener

tinción si la técnica está bien hecha.

B) Control positivo

Su función es chequear el adecuado comportamiento del anticuerpo usado y

secundariamente del sistema de detección.

Para ello utilizaremos secciones de trofoblasto materno donde ha sido ampliamente

descrita la presencia de HLA-G1 [Kavak et al., 2003].


72

III.5 TECNICA DE ELISA (ENZIME LINKED IMMUNOABSORB ENT

ASSAY) PARA EL ESTUDIO DE LAS ISOFORMAS SOLUBLES SHLA-

G1+HLA-G5 Y sHLA-G TOTAL EN PLASMA.

Muestras de plasma

La sangre total se recogió en tubos EDTA, el plasma se obtuvo centrifugando a

1700 rpm la sangre total quedándonos con la parte soluble de la sangre total. Esta se

almacenará en tubos Eppendorf y se congelará a -20ºC hasta su posterior análisis.

Cuantificación de sHLA-G1 y HLA-G5 en plasma

La cuantificación se llevó a cabo mediante el Kit de sHLA-G de Exbio (Cat.

RD194070100, Exbio, Praga), todos los componentes necesarios para la realización del

ELISA vienen suministrados en este Kit. Previamente se preparó la solución de lavado

que se hace como sigue: Se diluye 100 ml de la solución de lavado del Kit sHLA-G

(Exbio) con 400 ml de agua deionizada y destilada.

Por otra parte se ha de reconstituir la proteína estándar sHLA-G (Exbio) con 0.2

ml de agua destilada y deionizada, La concentración de HLA-Gs resultante es de 1000

Unid/ml (solución stock). Para la preparación de la curva estándar realizamos diluciones

seriadas de la solución stock:

Volumen del estándar Tampón de dilución Concentración del estándar

Solución stock estándar ---- 1000 Unid/ml

100 µl de Solución stock estándar 400 µl 200 Unid/ml

100 µl of est. 200 Unid/ml 100 µl 100 Unid/ml



100 µl of est. 25 Unid/ml 100 µl 12.5 Unid/ml

100 µl of est. 12.5 Unid/ml 100 µl 6.25 Unid/ml

100 µl of est. 6.25 Unid/ml 100 µl 3.125 Unid/ml


73

Realización de la técnica

1) Pipetear 50 µl del tampón de dilución en los pocillos.

2) Pipetear 50 µl de las muestras y de los estándares en duplicado. En los pocillos

apropiados.

3) Incubar la placa a temperatura ambiente (24°C) durante 1 hora, en un agitador

de microplacas.

4) Lavar los pocillos 3 veces con solución de lavado (0.35 ml por pocillo).

5) Añadir 10 µl de la solución conjugada.

6) Incubar la placa a temperatura ambiente (24°C) durante una hora en un

agitador de microplacas.


8) Añadir 100 µl de la solución sustrato. (No colocar la placa en exposición

directa a la luz solar). Se cubrirá con papel de aluminio.

9) Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.

10) Añadir 100 µl de la solución de parada.

11) Determinar la absorbancia de la placa a 450nm. (La Absorbancia se debe leer

en menos de cinco minutos después del paso 10).

Cuantificación de sHLA-I total en plasma

Las moléculas solubles HLA de tipo I totales se cuantificaron utilizando el

anticuerpo monoclonal W6/32 (8 µg/ml) como anticuerpo de captura. Como

muestras estandar se utilizó muestras de suero de nuestro laboratorio para calibrar

y calcular los datos de densidad optica

Realización de la técnica

1) Preparación del tampon carbonato a pH=9,5 Na2CO32H2O + NaHCO3 + NaN3

2) Tapizado de la placa con el anticuerpo W6/32 diluido 1/400 en el tampón

carbonato.

3) Incubar la placa a 4º C overnight.


74

4) Añadir BSA (2-3%) e incubar durante 1 hora a 37º C en agitador de placas.


6) Añadir las muestras de plasma (100µ) Incubar la placa a temperatura ambiente

(24°C) durante una hora en un agitador de microplacas.


8) Añadir Ac 2º conejo anti human β2-microglobulina e incubar durante 1 hora a

temperatura ambiente en agitación.


10) Incubar 30 min con el amplificador DAKO Envision System HRP rabbit


12) Revelamos con sustrato cromógeno orthofenilenediamina (Sigma, St Louis,

MO, USA) y 8µl H2O2 30%, durante 20 min en la oscuridad.

13) Añadir solución de Parada H2SO4 3M

14) Determinar la absorbancia de la placa a 492 nm.

Estudio del polimorfismo 14-bp en el gen HLA-G

Para estudiar el polimorfismo de la inserción/deleción de 14-bp en el exón 8 del

gen de HLA-G. se extrajo el ADN de PMBC de pacientes celáicos y sanos que actúan

como control. Posteriomente se realizó una amplificación de este fragmento de ADN

mediante PCR. Los cebadores usados fueron el RHG4 5’-

GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA y el GE14HLAG 5’-

GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC [Hviid et al, 2002] y se generaron fragmentos

de ADN de 224 y 210 bp dependiendo de si el individuo poseía o no la deleción de 14-

bp. las condiciones para la amplificación fueron las siguientes: desnaturalziación inicial

a 92ºC durante 5minutos, 30 ciclos de 92ºC durante 30 segundos, 64ºC durnate 1 minuto

y 72ºC durnate 2 minutos y APRA finalizar un paso final de elongación de 72ºC durnate

10 minutos. Se amplificaron 100ng de ADN genómico en 25ul que contenía dNTPs

0,2mM, MgCl2 1,5mM, cebadores a una concentración de 10pmol cada uno y 1 U de

Taq polimerasa. Los productos resultantes de esta amplificación fueron analizados pro

eelctroforesis en un gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio


75

III.6. ESTADISTICA

Los análisis estadísticos se realizaron mediante SPSS versión 12.0 software y

JMP IN Statistical software package (4.0.2 version. SAS Institute, Cary, NC, USA) para

entorno Windows. Se utilizó el test Kolmogorov-Smirnov para comprobar la

normalidad de las variables. En el caso de variables con distribución normal se

compararon mediante el test T de Student cuando estaban reunidas en dos grupos, en el

caso de más de dos grupos se utilizó el test ANOVA paramétrico. Cuando las muestras

no presentaron una distribución normal, las comparaciones se realizaron mediante el

test no paramétrico Mann-Whitney para dos grupos, si fue entre más grupos se utilizó el

test Kruskal-Wallis. Si el test ANOVA resultó significativo. Los valores de P < 0.05 se

consideraron significativos.

Muestras de sangre

Las muestras de sangre fueron recogidas y centrifugadas inmediatamente, el

suero fue almacenado a -20°C hasta que se realizaron las mediciones.

III.7. HPLC. Medición de triptófano, kinurenina y niveles de

kinurenina/triptófano

Los metabolitos del triptófano fueron determinados por Cromomatografía

líquida de alta calidad (HPLC). Brevemente, las muestras fueron desproteinizadas con

ácido tricloroacético y separadas en fase invertida con C18 usando material 0·015 M

de buffer de fosfato de potasio (pH 6·4). La fase mólvil fue de 15 mm ácido

acético/acetate de sodio (pH 4·0) conteniendo 27 ml/l de acetonitrilo. El triptófano fue

monitorizado por su fluerescencia native a 285 nm de excitación y 365 nm de

emisión. La kinurenina fue detectada por absorción UV a 360 nm de longitud de onda

en algunas series cromatográficas. Las concentraciones de triptófano y kinurenina

fueron estandarizadas por el peso húmedo de las muestras. La ratio

kinurenina/triptófano fue calculada dividiendo las concentraciones de kinurenina

(mmol) por las concentraciones de triptófano (mmol). La solución de Nitrotirosina

usada es standard. Fueron usadas tres muestras de plasma, cada una de las tres

diferentes concentraciones de mezcla standard. La mezcla de soluciones estándar,


76

conteniendo varias cantidades de cada una, fue preparada. La solución standard interna

y ácido perclórico fueron adicionadas a las soluciones standard, hasta asegurar que su

composición fue comparable con las muestras. Las curvas de Calibración fueron

preparadas desde areas de picos de cromatografía de las mezclas de solución standard.


77

IV. Resultados

Los niños celiacos presentaron afectación del crecimiento, diarrea crónica,

distensión abdominal, anorexia o astenia. Los pesos y tallas medias de los sujetos con

EC no fueron significativamente diferentes de los de la población de referencia del

mismo sexo y edad (peso medio 13.43 + 6.14, talla media 90.79 + 20.05, edad media

3.74 + 3.07), y el índice de masa corporal (IMC) en los pacientes celiacos indicó bajo

peso para la edad con un IMC inferior al percentil 5. Hammer, L.1991 El diagnóstico de

EC se estableció por medio de tests serológicos de screening acompañados por biopsia

de intestino delgado y confirmación de una respuesta clínica a la eliminación del gluten

de la dieta. En nuestro estudio, la AGA IgA estuvo elevada en el 83 % de los casos; los

anticuerpos antiendomisio (EMAs) fueron elevados en el 79 % de este grupo de niños.

No hubo pacientes con déficit de Ig A.

Las características demográficas, clínicas e inmunológicas de los pacientes con

enfermedad celiaca son presentadas en la tabla1

TABLA 3. Datos pacientes


78

Considerados en conjunto, hubo un 29 % de niños en los que se encontraron

otros problemas médicos potencialmente relacionados con el desarrollo de EC: tres

pacientes tenían trisomía 21, tres pacientes tiroiditis autoinmune y otros tres pacientes

alergia. Nueve de los 24 pacientes (37.5 %) tuvieron una historia familiar de EC en

familiares de primer grado.

Los casos con histología positiva fueron definidos como aquellos que cumplían

los criterios de Marsh tipo I-IV. Marsh clasificó el espectro de anomalías mucosas

vistas en la EC. El setenta y cinco por ciento de los pacientes celíacos tuvieron lesiones

Marsh 3, el 17 % de los pacientes tuvieron lesiones Marsh 2 y el 8 % de los pacientes

tuvo lesión Marsh 1. La EC activa fue confirmada en pacientes por análisis histológico

que demostró atrofia vellositaria, hiperplasia críptica y una aparente infiltración

linfocítica. La mucosa intestinal está ensanchada por incremento del número de células

linfoides tanto en el compartimento intraepitelial, en el cual hay un incremento de

células T, como en la lámina propia, la cual está ensanchada por linfocitos y células

plasmáticas. Las criptas intestinales están elongadas por un incremento de células

epiteliales en división, y los villi están acortados, debido a la rápida pérdida de células

epiteliales maduras del vértice de las vellosidades.

Tabla. 4 Clasificación de Marsh modificada: Tipo 0: Mucosa normal con menos de 40 LIE/100 células epiteliales (CE).Estado Preinfiltrativo Tipo 1: (Tipo Infiltrativo): Normal arquitectura de las vellosidades, normal altura de criptas y un aumento en el número de LIE hasta más de 40 LIE/100 CE. Incremento de linfocitos intraepiteliales Tipo 2: (Tipo Hiperplástico): Normal arquitectura vellositaria, aumento de LIE superior a 40 LIE/100 CE. Tipo 3: (Tipo Destructivo): Divido en tres subgrupos: 3.a. Caracterizado por aplanamiento moderado de vellosidades, incremento en tamaño de las criptas y aumento del número de LIE superior a 40/100 CE. Atrofia parcial vellositaria 3.b. Caracterizado por un marcado aplanamiento vellositario, aumento en el tamaño de las criptas y aumento en el número de LIE superior a 40 LIE/100 CE. Atrofia vellositaria subtotal 3.c. Caracterizado por aplanamiento total vellositario, aumento en el tamaño de las criptas y aumento en el número de LIE superior a 40 LIE/100 CE. Atrofia vellositaria total Tipo 4: (Muy rara, lesión hipoplástica) con aplanamiento de la mucosa con normal tamaño de criptas y normal cuantificación de LIE. Atrofia vellositataria total con hipoplasia de criptas


79

IV.1. DIAGNÓSTICO

IV.1.1. Análisis Serológicos e Histológicos

IV.1.1.a. Estudios Serológicos

Los anticuerpos Anti-gliadina de clase IgG (AGA IgG) estuvieron elevados (media: 84;

rango 40–200) en el 83% de pacientes con EC, los anticuerpos antiendomisio (EMA)

estuvieron elevados (media: 1/245, rango 1/80–1/360) en el 79% y los anticuerpos anti-

transglutaminase (tTG Ac) estuvieron elevados (media: 80; rango 30–165) en el 60%

de pacientes con EC. Ningún paciente tenía deficit de IgA.

IV.1.1.b. Biopsia de intestino delgado

Los pacientes con EC presentaban atrofia parcial o total de vellosidades con incremento

en el número de linfocitos intraepiteliales. Los casos con histología positiva fueron

clasificados considerando los criterios de Marsh (tipos I–IV). En el setenta y cinco por

ciento de enfermos celiacos se encontró que tenían lesiones grado III de Marsh (atrofia

parcial vellositaria), el 17% de pacientes tenía lesiones del grado II de Marsh

(hiperplasia de criptas con linfocitosis intraepitelial) y un 8% tenían lesiones de grado I

de Marsh (Infiltración linfocitaria con arquitectura normal).

La utilidad de los marcadores serológicos y genéticos de la enfermedad celiaca debe ser

siempre considerada en el contexto de la clínica, y teniendo a la biopsia intestinal como

la principal prueba diagnóstica. El estudio del HLA, permite seleccionar individuos de

alto riesgo entre familiares de celiacos, y entre pacientes con enfermedades asociadas

(diabetes mellitus, Síndrome de Down o algunas enfermedades autoinmunes, etc). Estos

casos con marcadores positivos, exigen mantener un grado de vigilancia mayor y un

seguimiento clínico y analítico periódico.

Los marcadores genéticos, son un criterio importante para dirigir el diagnóstico

diferencial ante la sospecha clínica, en especial cuando la biopsia o las pruebas


80

serológicas son poco claras.Tampoco hay que olvidar que el 30% de la población

general es portadora de estos alelos y, por lo tanto, no puede utilizarse como prueba

específica.

Estrategias de diagnóstico

Estrategia de pruebas para establecer el diagnóstico de enfermedad celiaca en

individuos sintomáticos previos a la dieta sin gluten (por descripción de síntomas

clínicos):

� Anticuerpos específicos asociados a la enfermedad celiaca

(excepto AGA). Resultados positivos o equívocos podrían

seguirse de una biopsia intestinal.

� Si la sospecha clínica para la enfermedad celiaca es fuerte o

existe una malabsorción franca, la biopsia intestinal debe ser

realizada sin tener en cuenta los resultados de las pruebas de

anticuerpos específicos para enfermedad celiaca.

� Cuando los anticuerpos específicos para la enfermedad celiaca

están ausentes, las pruebas de genética molecular: alelos HLA

asociados a la enfermedad celiaca pueden ayudar en descartar o

determinar la susceptibilidad para la enfermedad celiaca en el

resto de casos sospechosos de enfermedad celiaca.

� Un diagnóstico definitivo de enfermedad celiaca es realizado en

presencia de una biopsia de intestino delgado que demuestre las

alteraciones histológicas características y clínica y/o mejoría con

la dieta sin gluten; sin embargo, hay excepciones en aquellos

individuos con enteritis autolimitadas y esprue tropical que no

mejoran con una dieta sin gluten.

� Para los individuos en los que no se detectan los alelos HLA

asociados a la enfermedad celiaca en las pruebas de genética

molecular, es necesario examinar si esos síntomas pueden tener

causas alternativas.


81

� Los Individuos que continúan teniendo síntomas después de la adherencia a la

dieta sin gluten es improbable que tengan enfermedad celiaca; las pruebas de

genética molecular para la enfermedad celiaca: Los alelos HLA pueden

permitir excluir la enfermedad celiaca en una proporción sustancial de tales

individuos. En estos individuos, hay que examinar causas alternativas.

� Si las pruebas de genética molecular detectan los alelos HLA asociados y el

grado de sospecha clínica es alto, el paciente puede someterse a dieta

(consistente en dieta con gluten por al menos un mes o hasta que aparezcan

síntomas) previos a la biopsia intestinal que confirme el diagnóstico.

� Si los individuos no desean introducir el gluten en su dieta por miedo a enfermar

y al daño intestinal, no es posible establecer un diagnóstico definitivo de

enfermedad celiaca. Para establecer el diagnóstico en estos individuos con

certeza y continuar con dieta sin gluten si se alivian los síntomas.

Estrategia Diagnóstica para establecer el diagnóstico de enfermedad celiaca en

individuos sintomáticos con anticuerpos específicos asociados a la enfermedad

celiaca ambiguos o en valor límite incluyendo la combinación de pruebas de tTG,

EMA, DGPs IgA e IgG, e IgA total, si no se ha hecho previamente:

� Para individuos que continúan teniendo valores límite o ambiguos en los

anticuerpos asociados a enfermedad celiaca, se recomiendan las pruebas de

genética molecular: HLA asociados a EC para excluir o determinar la

susceptibilidad para la enfermedad celiaca.

� La biopsia de intestino delgado se recomienda en aquellos individuos que

poseen los alelos HLA asociados a EC y tienen un alto grado de sospecha clínica

y está bien establecido el contenido en gluten de la dieta (el equivalente a una a

tres rebanadas de panal día durante tres meses o aparezcan los síntomas).

� El diagnóstico definitivo de enfermedad celiaca puede ser realizado en personas

que tienen una biopsia de intestino delgado positiva y clínica y/o mejoría

histológica con la dieta sin gluten.

Estrategia Diagnóstica en individuos sintomáticos que no han respondido a la dieta sin

gluten está indicado revisar los resultados de los anticuerpos específicos de la EC (si

están realizados) previos al inicio de la dieta sin gluten y revisar la biopsia original (si

realizada) por un patólogo experto en gastroenterología para confirmar el diagnóstico de


82

enfermedad celiaca. Si los resultados son negativos o no concluyentes, se recomienda lo

siguiente:

Pruebas de genética molecular: Alelos HLA para determinar la

susceptibilidad genética para la enfermedad celiaca.

� Investigación de otras causas de los síntomas además de la enfermedad celiaca.

� Consultar con un dietista experto para analizar posibles fuentes ocultas de gluten

y evaluar una posible intolerancia a la fructosa o fructosa, la cual puede

contribuir a una pobre respuesta a la dieta sin gluten.

� Si se sospecha esprue refractario , el seguimiento recomendado es:

� Valorar estudios inmunohistoquímicos para IELs anormales.

� Estudios para genes reparadores del receptor (TCR) de clones de los linfocitos

T.

� Valoración para el linfoma de células T, si está indicado (ver también Tipos de

enfermedad celiaca, Esprue Refractario/enfermedad celiaca)

� Estudios de imagen para las complicaciones benignas o malignas

Estrategia diagnóstica en familiares asintomáticos de individuos con enfermedad

celiaca que incluyen pruebas de genética molecular para determinar la ausencia de los

haplotipos HLA de susceptibilidad para la enfermedad celiaca:

� Los test de genética molecular que revelan los alelos HLA asociados a EC se

seguirán de anticuerpos específicos para la EC a intervalos de tres a cinco años.

o Se recomienda la biopsia de intestino delgado cuando los anticuerpos

asociados a la EC son positivos.

o El diagnóstico definitivo de enfermedad celiaca es realizado a personas

con biopsia positiva de intestino delgado y clínica y/o mejoría

histológica con la dieta sin gluten.

� Los test de genética molecular que no detectan los alelos HLA asociados a EC

excluyen esencialmente el diagnóstico de enfermedad celiaca. Se espera que

aproximadamente un tercio de los miembros de una familia estén en esta

categoría [Bonamico et al 2006]. No se recomienda un seguimiento clínico

especial.


83

PREVALENCIA

En la actualidad, la forma clínica de presentación más frecuente de EC está

cambiando. En nuestra experiencia la EC es un trastorno muy frecuente, y son muchos

los individuos que tienen formas atípicas o silentes de la enfermedad, las cuales son

también las formas de presentación más prevalentes en nuestra población.

Verdaderamente hemos observado un porcentaje más elevado de pacientes que

asocian la molécula HLA-DQ8 en la EC (alrededor del 20%-25%) que han sido

descritos previamente en otros estudios, los cuales estiman que el porcentaje de

pacientes con HLA DQ8 se estiman sobre el 10% [Tighe, MR.1992]. Además, los

pacientes con EC Y HLA-DQ8 se asocian frecuentemente con síntomas de

presentación extraintestinales y están frecuentemente asociados con otras enfermedades

autoinmunes.

LINFOCITOS INTRAEPITELIALES, CD3, CD4 Y CD8

En la biopsias intestinales de pacientes celíacos encontramos células CD4+, CD8+ y

CD3+. Mediante anticuerpos unidos a fluorescencia que reconocen esos tipos de células

T observamos que esas células T se localizaban a nivel de la lámina propia de la mucosa

intestinal. No encontramos en ningún caso células positivas en la capa epitetelial. En

contramos mayor porcentaje de células CD4+


84

Figura 9. Expresión CD4+ en lámina propia en biopsia de celíacos


85



86


IV.1.2. EXPRESIÓN DE HLA-G EN BIOPSIA INTESTINAL

Se analizó la expresión del antígeno HLA-G en las biopsias de pacientes

celíacos activos. Nuestros resultados aportan la primera evidencia de expresión de

HLA-G en pacientes celíacos. En efecto, todos los pacientes testados mostraron una

expresión positiva de HLA-G con diferente grado de inmunoreacción, como se

demuestra por inmunohistoquímica usando el anticuerpo 5A6G7, el cual permite

discriminar entre proteína de sHLA-G y las formas de HLA-G unidos a la membrana.

Nuestros resultados no demostraron la expresión de HLA-G de superficie en la EC.

Curiosamente, sólo detectamos la presencia de isoformas de sHLA-G y no las formas de

HLA-G unidas a la membrana, como lo demuestra el hecho de no hallar

inmunorreactividad cuando se usó el anticuerpo que reconoce las formas de HLA-G

unidas a membrana.


87

Figura 12. Expresión HLA-G a nivel de las criptas de Lieberhün en

biopsia de celíacos

Figura 13. Expresión HLA-G a nivel epitelio de la mucosa en biopsia de celiacos.


88

IV.1.3. Resultados de ELISA

A la vista de los resultados anteriores, decidimos seguir analizando el sHLA-G

en suero de pacientes celiacos y no celiacos mediante ELISA. Establecimos los

siguientes grupos de pacientes para el análisis ELISA: pacientes celiacos con otras

enfermedades asociadas, como síndrome de Down o tiroiditis autoinmune (EC1, n=7);

pacientes celiacos con transgresiones dietéticas (EC2, n=7) y pacientes celiacos con

dieta exenta de gluten con más de 5 años sin transgresiones (EC3, n=7) y pacientes no

celiacos (C, n=9).

Los niveles de sHLA-G en suero fueron mas altos en los pacientes del grupo

EC1 (400 Uml-1 + 50), el grupo 2 de pacientes celiacos (EC2) presentó valores medios

de sHLA-G (55,52 Uml-1 + 12,5) y el grupo 3 de pacientes celiacos (EC3) niveles bajos

o muy bajos de sHLA-G ( < 10,5 Uml-1 + 2,5). Por lo tanto, los resultados en los

pacientes del grupo EC3 probablemente fueron debidos a la larga duración de la dieta

exenta de gluten. El grupo C presentó muy bajos niveles de sHLA-G (1,5 Uml-1 + 0,3).

Hubo diferencias significativas entre los pacientes del grupo EC1 y los otros dos grupos

(EC2 y EC3), así como entre los pacientes del grupo EC1 y los pacientes no celiacos

(C) (Figura 2). Aunque sin significación estadística, hubo también diferencias entre los

pacientes del grupo EC2 y los pacientes no celiacos.

Es interesante señalar el comportamiento de uno de los pacientes (JP), padre de

un niño celiaco (MBP). Este paciente fue considerado como no celiaco, presentando una

biopsia normal y valores normales de los tests serológicos para anticuerpos

antiendomisio (EMAs) y tTG Ac. Sin embargo, el paciente presentó baja

inmunorreactividad para sHLA-G en la biopsia intestinal y valores positivos de sHLA-

G en suero (25 Uml-1).


89

Expresión sHLA-G en el suero de pacientes celíacos. Gráficos A y B

Hemos demostrado una asociación de EC con la expresión sHLA-G (Gráficos

Ay B) y hemos encontrado correlación entre el incremento de los niveles de la

expresión de sHLA-G y EC asociada con otras enfermedades autoinmunes, siendo

dependiente de una asociación genética con estas enfermedades a través de los genes

HLA


90

IV.1. 4. ESTUDIOS DE POLIMORFISMO 14-BP DEL GEN HLA-G

La enfermedad celiaca es el resultado de una respuesta inmunológica anómala frente a

al gluten mediada por linfocitos T y con base genética. La susceptibilidad genética a la

enfermedad celiaca ha sido asociada con heterodímeros DQ2 y DQ8 del antígeno HLA

tipo II, pero también está claro que otros genes dentro o fuera de la región HLA

parecen estar involucrados en el desarrollo de la enfermedad.

Hemos demostrado la presencia de niveles elevados de expresión de HLA-G en su

forma soluble (sHLA-G) en biopsias intestinales y en plasma de pacientes celiacos. Los

niveles más elevados de sHLA-G se detectaron en aquellos pacientes celiacos que

presentaban otras enfermedades asociadas de naturaleza genética o autoinmune, tales

como, síndrome de Down y tiroiditis autoinmune. Dada la gran variabilidad

interindividual observada en los niveles de sHLA-G plasma´ticos, se analizó si existía

alguna relación entre dichos niveles plasmáticos y el polimorfismo 14-bp del gen HLA-

G. El objetivo de este estudio fue investigar la posible asociación del polimorfismo de

14 pb del gen HLA-G con la susceptibilidad a padecer enfermedad celíaca y determinar

si este polimorfismo influye en la estabilidad del ARNm y en la expresión proteica de

HLA-G

En nuestro estudio hemos evaluado el polimorfismo de HLA-G en pacientes pediátricos

con enfermedad celiaca, diagnosticados con los criterios estándar. Se estudiaron 40

pacientes celiacos y 42 pacientes sanos, utilizados como control. Los polimorfismos se

definieron mediante PCR, calculándose posteriormente las frecuencias genotípicas y

alélicas.

Los pacientes se clasificaron según presentaran o no la inserción/deleción de 14 pares

de bases en el exon 8 del extremo 3’ del gen HLA-G, definiéndose los siguientes

genotipos:

1) homocigoto negativo (-14/-14pb)

2) heterocigoto (+14/-14pb)

3) homocigoto positivo (+14/+14-pb).


91

Figura 14. Electroforesis en gel d eagarosa de los fragmentos del exón 8 del gen HLA-G

amlificados por PCR. El alelo -14 da lugar aun fragmento de 210bp mientras que el alelo +14

da lugar a un fragmento de 224bp

Se analizó inicialmente si las frecuencias alélicas para el polimorfismo de 14-bp en

nuestros pacientes se correspondían a las d euna población en equilibrio de Hardy-

Weinberg, y se observó que así era (x=) (Tabla 5)

Tabla 5 . Frecuencias Alélicas

Alelos HLA-G 14-pb Frecuencias celíacos Frecuencias controles

- 14 30 (54%) 32 (64%)

+ 14 26 (46%) 18 (36%)

Genotipo HLA-G 14-pb Frecuencias celíacos Frecuencias controles

-14 pb /-14 pb 9 (26%) 18 (50%)

-14 pb /+14 pb 21 (60%) 13 (42%)

+14 pb /+14 pb 5 (14 %) 2 (8%)


92

En nuestro estudio, hemos observado que hay diferencias significativas en las

frecuencias genotípicas entre la población control y la población de enfermos celiacos

para el polimorfismo de HLA-G. También se detecta una relación entre el polimorfismo

de HLA-G y los niveles plasmáticos de HLA-G. En este sentido, los mayores niveles de

expresión de sHLA-G se presentan en aquellos pacientes celiacos que tienen el genotipo

-14/-14pb. Por el contrario, los niveles mas bajos de sHLA-G, se encontraron en

aquellos pacientes celiacos que presentaban el genotipo +14/+14pb, indicando que

podría existir un efecto dominante del alelo +14pb en reducir la estabilidad del ARNm

y la producción proteica de HLA-G. Consecuentemente, este estudio muestra por una

parte, que el polimorfismo de 14pb del gen HLA-G influye en la expresión de sHLA en

enfermos celiacos, y por otra parte nuestros resultados sugieren que el polimorfismo de

14pb del gen HLA-G tiene influencia sobre la susceptibilidad para desarrollar la

enfermedad celiaca y puede ser un marcador genético a considerar.

Figura 15. Niveles plasmáticos de sHLA-G en relación con el polimorfismo 14-

bp del gen HLA-G


93

V.1.5. EXPRESIÓN DE CITOQUINAS

Incremento de TGF-b, IL-10 y expresión IFN-γ en la lamina propia de

pacientes celiacos

También hemos encontrado en los pacientes con EC un incremento de los

niveles de citoquinas antiinflamatorias IL-10 y TGF-beta a nivel de la lámina propia en

muestras de biopsias de pacientes con atrofia intestinal e incremento del infiltrado de

linfocitos intraepiteliales (Figura 1B y C). Hemos determinado la producción de IL-10

en pacientes con EC. La inmunohistoquímica para IL-10 fue realizada en tejidos fijados

con formalina y la inmunorreactividad fue determinada de forma semicuantitativa. En

los pacientes celiacos observamos una intensa inmunorreactividad a IL-10 en la lámina

propia (Figura 3). Esta citoquina fue expresada principalmente en áreas de infiltración

por células inflamatorias.

La expression celular de TGF-b fue detectada en muestras de lámina propia de

enfermos con EC. Encontramos una fuerte inmunoreactividad, con un alto número de

células etiquetadas intensamente marcadas (Fig. 1a). En suma, la inmunoreactividad de

la IL-10 fue particularmente fuerte en la lámina propia de pacientes celiacos (Fig. 1b).

La alta expresión de TGF-b y IL-10 fue encontrada principalmente en áreas infiltradas

por células inflamatorias.

Finalmente, la producción de IFN-g en pacientes con EC esta también incrementada

(Fig. 1c), con una fuerte inmunoreactividad a nivel de la lámina propia.


94

Figura 16. Expresión de IL-10 a nivel de lámina propia en biopsia celiacos.

Figura 17. Expresión de TGF-beta a nivel de lámina propia en biopsia celiacos.

-


95

Figura 18. Nivel de expresión de IFN-gamma en

IV.1.6. INCREMENTO DE IL-17, IL-22 e IL-23

Examinamos los cortes y encontramos que hay un incremento en la expresión de IL-17

e IL-22 en las muestras de pacientes celíacos en comparación con pacientes control. La

expresión de estas citoquinas se localizaba en las células presentes en la lámina propia

de la mucosa intestinal y también en la submucosa. Nuestros resultados parecen indicar

que ambos subconjuntos de células, las CD8 y CD4 probablemente contribuyen a la

respuesta inmune, ya que ambos tendrían la capacidad de producir IL-17 y están

presentes en cantidades significativas en la infiltración a nivel de la mucosa intestinal.


96

Figura19. Expresión de Il-17 en la lámina propia en biopsias de pacientes celíacos

Figura 20. Expresión de IL-22 en la lámina propia en biopsias de pacientes celíacos


97

Mediante las técnicas de ELISA analizamos los niveles serológicos de IL-23 en

pacientes celiacos. En nuestro análisis encotramos un fuerte incremento que alcanzó

significación estadística en los nivéles séricos de IL-23 en celiacos en comparación con

los pacientes controles.

Figura 21. Expresión sérica de IL-23 en pacientes celíacos

IV.1.7. EXPRESIÓN IDO EN PACIENTES CELIACOS

Definir cual es el tipo de célula que expresa IDO, su mejor localización,

determinar la tinción inmunohistoquímica para IDO en secciones de intestino delgado

de pacientes celiacos. La expresión de IDO fue localizada en la lámina propia y en la

capa epitelial (Fig. 1d). Las células que expresan IDO muestran una morfología típica

inflamatoria de mononucleares y células dendríticas en la lámina propia. Además, en la


98

capa epitelial la inmunorreactividad fue menos intensa a la presentada en las células

caracterizadas por una morfología linfoide-like. Un isotipo- negativo para la tinción

control fue siempre considerado.

De otro modo, la expresión IDO fue también encontrada en biopsias de pacientes con

enfermedad de Crohn en la lámina propia y en la capa epitelial. En controles sanos

pudimos detectar solo unos pocos casos de expresión IDO en células de la lámina

propia .

Figura 22. Expresión de IDO a nivel de lámina propia en biopsia celiacos.

IV.1.8. CONCENTRACIÓN DE TRIPTOFANO Y KINURENINA Y COCIENTE K/T

La Kinurenina, representa el primer producto del catabolismo del triptófano, fue

significativamente más alta en muestras de suero de pacientes con EC (4·2 mmol/l _

0·27) que en el suero de controles sanos (2·6 mmol/l _ 0·54, P < 0·0024) (Fig. 2a). Los

niveles de kinurenina fueron más elevados en pacientes celiacos que otras enfermedades

como síndrome de Down o tiroiditis autoimmune.


99

De forma similar, la ratio entre kinurenina y triptófano (¥100) fue más alta en

muestras de pacientes con EC (11·5 mmol/ l _ 1·01 versus 6·5 mmol/l _ 1·57, P <

0·0072, pacientes con EC y controles, respectivamente) (Figuras Ay B). La

concentración de triptófano en el suero de pacientes con EC fue más baja que en los

individuos sanos (Figura C).

Curiosamente, las concentraciones de kinurenina (4·2 mmol/l _ 0·27 versus 4·9

mmol/l _ 0·44, P < 0·17), triptófano (35·8 mmol/l _ 1·3 + 33·7 mmol/l _ 2·01, P < 0·4,

EC y C), y kinurenina/triptófano ratio ¥ 100 (11·5 mmol/l _ 1·01 versus 14·6 mmol/l _

1·4, P < 0·13) no presentan diferencias significativas entre EC y enfermedad de Chrohn

respectivamente (Fig. A, B, C).


100


101

Hemos detectado un incremento de kinurenina (4·2 mmol/l _ 0·27 versus 2·6

mmol/l _ 0·54, P < 0002) y de la ratio kinurenina/triptofano en muestras de pacientes

celiacos (11·5 mmol/l _ 1·01 versus 6·5 mmol/l _ 1·57, P < 0005) en comparación con

los sujetos sanos, respectivamente, y no hemos encontrado diferencias con los

pacientes con enfermedad de Crohn. Los análisis de Immunohistoquímica de las

muestras de biopsias intestinales de los pacientes celiacos mostraron un incremento de

la expresión de IDO, interferon-gamma, interleukina-10 y Factor beta de crecimiento

transformante. Nuestros datos sugieren que los mecanismos dependientes del

catabolismo del triptófano pueden regular la respuesta inmune en la EC.


102

V. DISCUSIÓN

V.1. DIAGNÓSTICO Y PREVALENCIA Creemos que los criterios diagnósticos actuales para la EC deben ser revisados, ya que a

menudo el diagnóstico de EC permanece oculto porque muchos individuos no presentan

los síntomas gastrointestinales clásicos de la enfermedad. De hecho, el porcentaje de

población infradiagnosticada está incrementándose de manera clara, y los riesgos y

complicaciones significativos que se asocian con la EC no tratada. (Tabla 1). Es un

trastorno multifactorial, la EC puede presentarse con una gran diversidad de

manifestaciones clínicas.

Los pacientes con EC típicamente desarrollan síntomas extraintestinales (no

clásicos) con ausencia de síntomas gastrointestinales tales como diarrea, dolor

abdominal, distensión abdominal o pérdida de peso.

En nuestra población pediátrica, los síntomas no clásicos son a menudo los más

frecuentes como formas de presentación de los casos nuevamente diagnosticados de EC.

Estos incluyen alopecia autoimmune, deficiencia de hierro o niveles elevados de

transaminasas y que a menudo puede ser la única manifestación de la EC en un

individuo afectado En nuestra experiencia, la biopsia de intestino Delgado es crucial

para el diagnóstico de pacientes con serología negativa para EC y con HLA compatible

para esta enfermedad. Aunque consideramos la biopsia intestinal como el ”gold

standard” para el diagnóstico de EC, en ocasiones el permiso para la biopsia intestinal

es rechazado. Tanto los test serológicos como genéticos son necesarios para seleccionar

los sujetos que necesitan biopsia.


103

La EC es más común en ciertos grupos de riesgo. Familiares de primer grado de

pacientes celiacos representan el grupo de estudio más importante. La determinación de

HLA es el primer escalón útil que podría excluir aproximadamente un tercio de los

familiares de primer grado de enfermos con EC. Nosotros encontramos una alta

prevalencia de EC entre familiares y el mayor porcentaje fue observado entre las hijas.

Los familiares de enfermos con EC son una población de riesgo para el desarrollo de

intolerancia al gluten y proponemos que un extenso estudio de tales grupos pueda ser

emprendido. Es digno de mención que después del primer diagnóstico de EC, la familia

estará más concienciada en el reconocimiento precoz de los síntomas relacionados con

la enfermedad.

El primer escalón en el diagnóstico de la EC son los test serológicos. Los

mejores test disponibles son los que usan anticuerpos de clase (IgA) antihumanos anti

transglutaminasa tisular (tTG) y anticuerpos IgA antiendomisio por inmunofluorescence

(EMA) por su extremadamente alta especificad y sensibilidad. No obstante, la

confirmación histológica de los cambios característicos del intestino delgado, (atrofia

intestinal, hiperplasia de criptas y linfocitosis intraepitelial) son considerados esenciales

para el diagnóstico de EC.

Los patólogos suelen usar los Criterios de Marsh’s modificados para clasificar el grado

de atrofia vellositaria necesario para confirmar el diagnóstico de EC. En el dinámico

proceso de desarrollo de las lesiones asociado con las manifestaciones clínicas, el

incremento de IELs y la hiperplasia de criptas son el primer cambio en la arquitectura,

mientras que en la presencia de altos grados de alteración histológica (tipos 3a-3b-3c de

la clasificación de Marsh’s) con incremento de IEL e hiperplasia de criptas se asocian

siempre a atrofia vellositaria. [Collin, P. 2005]

V.2. TOLERANCIA

El sistema inmunológico del intestino se expone a una amplia variedad de antígenos

derivados de los alimentos, las bacterias residentes e invadiendo microorganismos. La

tolerancia oral es una condición fisiológica caracterizada por la inducción de la falta de

respuesta inmune intestinal hacia antígenos alimentarios y de bacterias de la flora

intestinal. Múltiples mecanismos celulares y moleculares están implicados en la


104

regulación de esta propiedad fundamental de del sistema inmune intestinal [Rouas

Freiss et al, 2000].

El gluten es el alimento más común en la enteropatía sensible en los seres humanos y es

causada por la falta de tolerancia inmunológica (por vía oral de tolerancia) de gluten de

trigo y las fracciones de prolamina el centeno y la cebada. Muchos de los diferentes

péptidos del gluten reconocidos por las células T intestinales han sido identificados

[Kim, CH-Y, et al 2004].

La activación por parte del gluten de estas células T reactivas representa un

acontecimiento clave en la patogénesis de la enfermedad celíaca [Sollid, L. M. 2002.,

Alaedini, A.2005]. La mucosa intestinal de los pacientes con celiaquía se caracteriza por

presentar una proporción alta de células T intraepiteliales (γδ IEL) [Leon F, et al.2005].

El gluten ingerido, agente desencadenante de la enfermedad, puede cruzar la barrera

epitelial y obtener una respuesta inmune mediada por linfocitos T reactivos. Las células

dendríticas se supone que desempeñan un papel fundamental en la conformación de la

respuesta inmunitaria [Steinman RM, 2000].

Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por presentar niveles bajos de

expresión de MHC de clase II y moléculas co-estimuladoras que pueden mediar en la

tolerancia, por inducción de la células T reguladoras (células Treg). Por otra parte, la

IL-10 liberada por las células Treg puede modular la función de las células dendríticas

inmaduras e inhibir su diferenciación. Las células dendríticas moduladas por IL-10

inducen a las células T efectoras (anergia) a través de mecanismos que requieren

contacto célula-célula. Por lo tanto, la dirección de la respuesta inmune o la tolerancia

hacia la inmunidad depende de la etapa de maduración y las propiedades funcionales de

las células dendríticas. Péptidos de la gliadina puede contribuir mediante la inducción

de células dendríticas fenotípicas y funcionalmente maduras, dando lugar a un proceso

de presentación de péptidos de la gliadina a células T específicas.

La adquisición de la respuesta inmune innata implica a los linfocitos T helper CD4+

descritos en la enfermedad celíaca, una respuesta innata implica a los linfocitos T

intraepiteliales CD8+ citotóxicos (IELs) que ejercen un papel en la patogénesis de la

enfermedad celiaca.


105

En el intestino, la tTG desamina la gliadina, introduciendo cargas negativas en

los péptidos del gluten. Ambas proteínas DQ2 y DQ8, situadas en la superficie de las

células presentadoras de antígeno (APCs) de la lamina propia, unen preferentemente

estos péptidos del gluten desaminados cargados negativamente. Las células T- helper

(con marcador de superficie CD4 positivo) son activadas tras el reconocimiento de

péptidos de gluten desaminados unidos a DQ2 o DQ8 en las APCs y producen

citoquinas como el interferon gamma (IFN-γ).

La respuesta inflamatoria resulta en la liberación de citoquinas adicionales y sustancias

químicas importantes que conducen al daño y atrofia vellositaria. Como repuesta a la

inflamación, las células plasmáticas en el tejido intestinal inflamado liberan anticuerpos,

incluyendo anticuerpos antigliadina, antiendomisio y anticuerpos autoinmunes contra

la tTG. [Treem 2004, Alaedini & Green 2005, Sollid & Lie 2005].

V.3. LINFOCITOS

En nuestro estudio hemos encontrado células T CD3 positivas, células T CD4 positivas

y células T CD8-positivos presentes en las biopsias de la mucosa intestinal de los

pacientes celíacos a nivel de la lámina propia. La mayor expresión se correspondía con

células T CD4 y CD3 positivas. Estos datos sugieren que las células CD4 y CD3

desempeñan el papel fundamental en la enfermedad celíaca.

Estudios de Inmunohistoquímica mediante la determinación de niveles de mRNA han

encontrado niveles superiores de INF-γ en pacientes celiacos que reciben gluten en

contraste con controles sanos, El interfero liberado puede incrementar la permeabilidad

epitelial y la producción de citoquinas proinflamatorias durante la infección

incrementando la expresión de péptidos de gluten unidos al DQ2 y DQ8 de las APC de

la mucosa facilitando la activación de células inmunes e inflamatorias adicionales,

facilitando la respuesta patológica de los péptidos del gluten.

V.4. CITOQUINAS

la inflamación presente en la enfermedad celíaca es mediada por citoquinas pro- y

contra-inflamatorias. Las células T CD4 se han subdividido en diversas sub-poblaciones

en gran parte en base a las citoquinas que producen. Estas sub-poblaciones incluyen

células Th1, Th2 y las células T reguladoras. Las células Th1 inducen la producción de

IFN-gamma y TGF-beta, las cuales estimulan la producción de citoquinas pro-

inflamatorias e induce la inmunidad celular. Otra población de células T se ha descrito,


106

las Th17, que se caracterizan por la producción de IL-17. Estas células desempeñan un

papel primordial en la inflamación y en la autoinmunidad.Las células Th17 pueden

promover respuestas protectoras o patogénicas dpendiendo de que otros fáctores

adicionales estén presentes. Los mecanismos que regulan la respuesta de las células

Th17 aún no se conocen.

El desarrollo de las células Th17 es promovido por otras citoquinas como la IL-23 y

TGF-beta en presencia de IL-6. La IL-23 y la IL-17 constituyen un nuevo eje via

formación de células Th17 en la patogénesis de enfermedades inflamatorias y

autoinmunes. En las biopsias intestinales de los pacientes celíacos se observó una alta

expresión de IL-17 en las células de la lámina propia y también nos encontramos

expresión a nivel de la capa epitelial. Células Th17 ahora se sabe que desempeñan un

papel importante en la patogénesis de la inflamación y enfermedades autoinmunes

[Ìwakura Y et al., 2006]. Selectivamente las células Th17 producen citoquinas

proinflamatorias, como IL-17 e IL-22. Células T CD4 + son los principales productores

de IL-17, pero además en CD8 + células T, neutrófilos y células NKT también producir

esta citocina. IL-17 produce células T CD4 + representa un nuevo subgrupo de

linfocitos T (células Th17), que son cruciales en la mediación de las respuestas

inflamatorias.

Otra citoquina producida por células Th17 es la IL-22, que pertenece a la misma familia

que la IL-10 expresandose en las células T activadas, las células Th1 y células NK. De

hecho, hemos encontrado una alta expresión de IL-22 en pacientes celíacos. Si bien es

claro que la IL-22 e IL-17 puede contribuir a la patogénesis de enfermedades

autoinmunes, también es notable que la IL-22 también tiene importantes efectos anti

inflamatorios. Nuestros datos indican un importante papel de las células Th17 en la

enfermedad celíaca. Estos hechos indican la complejidad de las células Th17, que

producen citoquinas múltiples y tienen diversas funciones durante la inflamación y su

importancia puede variar entre los diferentes enfermedades autoinmunes, como en la

enfermedad celíaca, que es una enfermedad inflamatoria inducida por células Th1/Th17.


107

V.5. HLA-G

En este estudio, hemos demostrado una asociación de EC con la expresión de

HLA-G, IDO. Que conozcamos, este es el primer estudio que describe la expresión de

sHLA-G en muestras de biopsia y en suero de pacientes con EC. Por el contrario, no

hubo expresión de moléculas de HLA-G de membrana en pacientes celiacos. La falta de

expresión de HLA-G de membrana puede estar ligada a un proceso de regulación

específico en el engarce alternativo del HLA-G transcrito, lo cual puede favorecer la

selección de isoformas solubles.

Las propiedades inmunomoduladoras del sHLA-G justifican su potencial interés

en el control de enfermedades inflamatorias, como la EC. En este estudio, hemos

demostrado que el nivel plasmático de sHLA-G fue mas elevado en pacientes celiacos

con otras enfermedades asociadas, como síndrome de Down o tiroiditis autoinmune,

elevado o en niveles medios en pacientes celiacos con transgresiones dietéticas y bajo o

incluso en valores negativos en pacientes celiacos con mas de 5 años de dieta sin gluten

sin transgresiones. Hasta ahora, una dieta sin gluten es la única terapia que podemos

ofrecer a los pacientes celiacos. Además, a veces es difícil seguir una dieta

completamente exenta de gluten y algunos pacientes continuan tomando gluten en su

dieta. Como resultado de ello, en algunos individuos, la recuperación de la mucosa

intestinal se prolonga y puede tardar más de 18 meses. [Cataldo,F.2003]

Por otra parte, la EC puede definirse como “silente” en un sujeto aparentemente

sano. Muchos de ellos tienen una arquitectura de la mucosa intestinal normal o

minimamente anormal y no tienen el típico genotipo HLA predisponente (DQ2 o DQ8)

y también tienen negativos los anticuerpos AEMs y/o TTGAs. Curiosamente, en nuestro

estudio, un paciente silente fue positivo para la expresión de sHLA-G a nivel sérico y de

la mucosa. Aunque este resultado es preliminar y se requiere un elevado número de

casos, sugiere que la expresión de sHLA-G puede ser considerado como un marcador

útil de EC silente.

La prevalencia aumentada de enfermedades autoinmunes en pacientes celiacos,

incluyendo diabetes mellitus insulin-dependiente y enfermedades tiroideas

autoinmunes, ha sido ampliamente comunicada. [Troncone,R.2004] Nuestros resultados


108

muestran una correlación entre niveles incrementados de sHLA-G y EC asociada con

otras enfermedades autoinmunes. En consonancia con esto, la conexión entre EC y otros

desordenes autoinmunes puede depender de una vinculación genética de estas

patologías mediada por estos genes HLA.

La forma soluble de HLA-G es de especial interés porque su molécula juega un

importante papel en la inducción de la inmunotolerancia.[Rouas-Freiss,N.2000] Una

función inmunosupresora del HLA-G puede así contribuir al control de las actividades

CD4+ y CD8+, jugando como consecuencia de ello un importante papel en la inmunidad

adaptativa. [LeMaoult, J.,2004] En este sentido, sHLA-G tiene la función de inhibir la

proliferación de células T activadas, e inducir apoptosis dosis dependiente de las células

T, reforzando el papel inmuno inhibitorio del sHLA-G que puede ser secretado en la EC

como parte de un mecanismo de restauración del proceso de la tolerancia a antígenos

orales. Respecto a la respuesta adaptativa en EC, una poderosa respuesta

antiinflamatoria a la gliadina puede ocurrir durante el desarrollo de la enfermedad. En

pacientes celiacos, se ha visto que el aporte de gluten causa una sobrerreacción de

linfocitos T intraepiteliales, con producción incontrolada de HLA-G e IL-10. Esto puede

causar reclutamiento de linfocitos intraepiteliales, llevando a un círculo vicioso con

actividad inmune amplificada y mantenimiento de lesiones intestinales.

Las citoquinas, pueden jugar importantes papeles en la inducción de la expresión

de HLA-G. De hecho, se ha demostrado que la IL-10, favorece la expresión de HLA-G.

[Urosevic,M.2002] Por lo tanto, no podemos descartar que en situaciones

particularmente estimulatorias, las citoquinas secretadas induzcan la expresión de

HLA-G. Aquí, consideramos la posibilidad de que la producción de sHLA-G es

afectada por citoquinas secretadas por macrófagos. Los macrófagos pueden controlar la

respuesta inmune secretando citoquinas antinflamatorias como la IL-10. El papel de la

IL-10 en la inducción de la expresión de la proteína HLA ha sido ya demostrada en

monocitos y en células trofoblásticas purificadas. [Moreau,P.1999] Además, se ha

demostrado una asociación entre IL-10 y expresión de HLA-G en linfomas cutáneos y

en colitis ulcerosa.[Torres,MI.2004]

En conclusión, el mayor incremento en la expresión de sHLA-G en la EC podría

ser debido a que es parte de un mecanismo para tratar de restaurar el proceso de

tolerancia a antígenos orales en una enfermedad causada por la pérdida de tolerancia a


109

antígenos dietéticos. Una potente respuesta antiinflamatoria a la gliadina podría ocurrir

durante el desarrollo de la enfermedad con una producción incontrolada de HLA-G e

IL-10 que contrarrestan la inflamación y/o puede causar reclutamiento de linfocitos

intraepiteliales, manteniendo las lesiones intestinales. Además, la expresión de sHLA-G

puede convertirse en un parámetro inmunohistológico para el diagnóstico de EC. Esto

tiene una importante relevancia en pacientes con síntomas típicos o no clásicos, incluso

clínicamente silentes, que permanecen sin diagnosticar y expuestos al riesgo de

complicaciones a largo plazo aunque no muestren manifestaciones clínicas de EC.

Pensamos que el aumento en la expresión del sHLA-G encontrado en la EC

puede ser parte de un mecanismo para restablecer la tolerancia al gluten. HLA-G puede

actuar a través de receptores inhibitorios (ILT) cuya interacción puede conducir al

desarrollo de células dendríticas tolerogénicas con la inducción de anergia y células T

inmunosupresoras, y/o detener la maduración/activación de las células dendríticas. La

expresion de estos receptores ILT en las células dendríticas esta fuertemente controlada

por estímulos inflamatorios y por citoquinas. Así, una poderosa respuesta

antiinflamatoria hacia la gliadina puede ocurrir durante el desarrollo de esta enfermedad

con producción incontrolada de HLA-G y citoquinas antiinflamatorias, tales como IL-

10 y TGF-beta, las cuales contrarrestan la inflamación y/o pueden causar reclutamiento

de linfocitos intraepiteliales, manteniendo las lesiones intestinales presentes en la EC.

V.6. POLIMORFISMO HLA-G

En contraste con el extensivo polimorfismo de los genes clase I clásicos del HLA, se ha

considerado bajo el grado de polimorfismo en el locus del HLA-G presentando una

l imitada heterogeneidad de secuencias y con pocos alelos descritos ()

Existe una gran variablidad interindividual en los niveles de sHLA-G plasmático de

pacientes celíacos. En este estudio intentamos averiguar si esta variabilidad pueden

deberse a las distintas variantes alélicas para el polimorfismo de 14-bp presente en el

gen HLA-G

Los resultados obtenidos en nuestro estudio mostró diferencias significativas en la

distribución del polimorfismo de HLA-G d 14-pb entre la enfermedad celíaca y los

sujetos sanos. Los alelos polimórficos el gen HLA-G muestran una deleción /

polimorfismo de inserción de una secuencia de 14 pares de bases (14bp) en el exón 8 en

la región 3' no traducida. Se ha asociado la presencia del alelo 14bp inserción (+14 pb) a


110

un ARN mensajero inestable y una menor producción de la proteína HLA-G, lo que

sugiere una habilidad diferente para contrarrestar la inflamación entre los distintos

genotipos. En nuestra población estudiada el alelo -14 tiene un carácter dominante y

está asociado a unos mayores niveles de HLA-G plasmático

V.7. EXPRESIÓN IDO Y METABOLISMO DEL TRIPTÓFANO

Este estudio proporciona la primera evidencia de que el enzima antiinflamatorio

IDO está altamente expresado en las biopsias intestinales de pacientes con EC. Además

este incremento en los niveles de IDO es resultado de una elevación en los niveles

séricos de kinurenina de pacientes con EC. La respuesta antiinflamatoria representada

en la EC puede ser el resultado de la vía de la kinurenina, la que intensificaría

potencialmente la inflamación.

En nuestro estudio, no ha sido posible establecer una correlación entre la

expresión IDO o los niveles de los metabolitos del triptófano con los diferentes grados

de de actividad inflamatoria en las biopsias de enfermos celiacos deacuerdo con la

clasificación de Marh’s. Los niveles más altos de kinurenina fueron encontrados en

pacientes con enfermedad celiaca con otra enfermedad asociada tales como síndrome de

Down o tiroiditis autoinmune, contribuyendo al daño. Nuestros datos presentados aquí

están en la línea de los descubrimientos de Wolf et al. [Wolf, AM.2004] quienes

describen una sobreespresión de IDO en otras enfermedades inflamatorias crónicas del

tracto grastrointestinal mediadas por un mecanismo Th1 tales como la enfermedad de

Crohn con un incremento en los niveles de kinurenina y con una alta relación

kynurenina/triptófano. Nosotros hipotetizamos un posible papel de la IDO en la

enfermedad celiaca y la enfermedad de Crohn, ya que ambas están caracterizadas por

una respuesta exagerada por células Th1. En nuestro estudio encontramos un

incremento de los niveles de IFN-gamma, que podría ser un potente inductor de la

expresión IDO en esta enfermedad. En este sentido, el estudio de Wolf et al. han

demostrado que el IFN-gamma y el TNF-alfa son potentes inductores de la expresión

IDO.


111

En suma, hemos encontrado un incremento en la expresión de IL-10 y TGF-beta.

Las células IDO-positivo pueden ejercer sus funciones reguladoras induciendo la

producción de estas dos citoquinas inmunosupresoras.

Una fuente importante de IL-10 y TGF-beta es la producida por los monocitos y

macrófagos y es una consecuencia del bajo efecto regulador en la inflamación. TGF-

beta está implicado en la regulación de la respuesta inmune y en la inflamación. Esta

citoquina es el principal factor para la producción de inmunoglobulina A (IgA) y actúa

como un potente mediador de la reparación tisular.[Hanson,T.2002] Interesantemente,

tTG, ha sido descrito como el principal autoantígeno hacia el que se dirigen los

anticuerpos antiendomisio en la EC, es necesario para la activación de TGF-b.[Cataldo,

F.2003] Los niveles elevados de IL-10 y TGF-b encontrados en pacientes con CD ,

aunque insuficiente para la total inhibición de la reacción autoinmune, podría modular

la respuesta inmune y es un efecto secundario que causa activación de los linfocitos B.

Igualmente, bajo condiciones inflamatorias tales como la EC, el incremento de la

expresión de IDO puede ayudar a reducir el riesgo de un exceso de respuesta a

autoantígenos. De hecho, un importante cuerpo de la evidencia lo soporta la hipótesis de

que las células regulan la expresión de IDO, la respuesta inflamatoria mediada por

células T, rechazo de trasplantes, embarazo y cáncer.[Mellor, A.L..2004]

Verdaderamente, recientes informes confirman que los metabolitos de la vía de la

kinerunina son activos en la supresión de la proliferación de las células T e inducción de

apoptosis.[Fallarino,F.2003]

Nosotros hemos demostrado que las moléculas supresoras como IDO y HLA-G

están expresadas en EC. La expresión de sHLA-G [Torres,MI.2006] en conjuncción con

un incremento de la expresión IDO en pacientes con EC podría ser una pieza esencial

del mecanismo para intentar restaurar la tolerancia hacia estímulos de la dieta. Así, el

incremento en la actividad IDO refleja un intento de control del estímulo crónico del

antígeno por down-regulation de las células T que median la reacción inmune. IDO y

HLA-G pueden cooperar en la supresión de la respuesta inmune en la EC activa.

Nuestros resultados están en la línea de los descubrimientos de [López AS et all ,2006]

quinenes demuestran que las moléculas supresoras IDO y HLA-G s son expresadas en

células dendríticas y estas moléculas pueden producir inmunosupresión . Queda por ser

investigado si la expresión IDO está aumentada o no en pacientes celiacos después de


112

una dieta sin gluten. En suma, nuestros datos sugieren que los mecanismos dependientes

de los mecanismos dependientes del metabolismo del triptófano que reponde

positivamente y puede regular la respuesta inmune en la EC.

El HLA-G y la IDO presentan propiedades comunes con respecto a la expresión,

función y regulación. De hecho, en humanos la expresión de IDO y HLA-G se ha

demostrado en placenta, en órganos trasplantados, y pueden ser expresadas

ectópicamente por tumores. [Uyttenhove C, 2003 & Rouas-Freiss N,2003] En estas

situaciones, tanto la IDO como el HLA-G tienen funciones comunes, ya que ambas

contribuyen al mantenimiento de la tolerancia materno-fetal, a la aceptación del

trasplante, así como al escape tumoral. [Urosevic M, et al.2002]

Como se ha descrito anteriormente, la enzima IDO inhibe la proliferación de las células

T. Así mismo, diversos estudios demuestran que el HLA-G presenta esta misma acción

por mecanismos diferentes. [Mellor A, et al. 2004] El HLA-G5 soluble inhibe la

proliferación de células T CD4+ alogénicas. Además, el HLA-G soluble inhibe la

proliferación de células T alogénicas inducidas por células dendríticas humanas sin

afectar a su diferenciación y maduración. Las células presentadoras de antígeno que

expresan HLA-G1 también son capaces de inhibir a las células T CD4+. Recientemente,

se ha demostrado que el HLA-G derivado de monocitos puede actuar como un potente

inhibidor de la activación de células T CD4+ autólogas y puede estar implicado en el

control de la activación de células T autoreactivas. Además, estas moléculas

inmunosupresoras pueden contribuir a la inducción de tolerancia en los órganos donde

migran las células tumorales y contribuir así a la aparición de metástasis y comprometer

la eficacia de ciertos citostáticos. Las estrategias de tratamiento tumoral se basan en

muchas ocasiones en el disparo de la respuesta inmunológica, y así favorecer la

actuación de los agentes quimioterapéuticos. De hecho, estudios recientes demuestran

que alguno de los tratamientos empleados en el cáncer colorrectal pueden estar

implicados en la neutralización de los efectos inmunosupresores del tumor.[Izcue A, et

al.2009]

Ambos mecanismos de supresión no actúan de forma independiente, sino que están

relacionados entre ellos, y probablemente con otros factores de supresión y activación.

De hecho, tanto la IDO como el HLA-G pueden ser estimulados por las mismas

moléculas, como el interferón y los metabolitos de la IDO pueden afectar a la expresión


113

de HLA-G.[ López AS, et al.2006] Otro factor implicado es el estado redox celular. De

hecho, la IDO puede ser regulada por el óxido nítrico y así se puede interferir en la

tolerancia inducida por IDO. Una producción mantenida del mismo disminuye el nivel

de IDO en líneas celulares de carcinoma de pulmón y carcinoma uroepitelial humano.

Cabe destacar el papel antioxidante de la IDO al usar como substrato al anión

superóxido o el de su metabolito 3-hidroxi-antranílico.

Hemos demostrado previamente que el HLA-G es expresado en pacientes con EC.

[Torres MI, 2006]. Un nuevo concepto ha emergido en EC, lo cual indica que el

aumento en la expresión de HLA-G llevando a unificar las propiedades reguladoras.

Una respuesta inflamatoria potente hacia la gliadina puede ocurrir durante el desarrollo

de esta enfermedad, junto con una incontrolada producción de HLA-G. En

consecuencia, puede ocurrir un reclutamiento de linfocitos intraepiteliales manteniendo

algunas de las propiedades de IDO y HLA-G: ambas tienen capacidad tolerogénica y

son altamente expresadas en la placenta humana [Honing, A. 2004 & Rouas-

Freiss,N.1997] y en tumores y su expresión puede ser regulada por algunas citoquinas

(IFN-γ, IL-10). [Moreau,P.1999]

Los mecanismos dependientes del metabolismo del triptófano pueden estar implicados

en la regulación de la respuesta inmune en la EC. Además, hemos demostrado que los

niveles de triptófano y kinurenina en el suero de enfermos celiacos, es una buena

determinación analítica de los niveles de IDO en estos pacientes.

V.8. FUTURAS DIRECCIONES

Hay muchas preguntas sin respuesta a cerca de la EC. Cómo se rompe la

tolerancia oral. Restaurando la tolerancia inmunológica al gluten podría representar el

tratamiento ideal de esta enfermedad. Sin embargo, si las células T específicas para el

gluten pudieran ser inactivadas o suprimidas, la tolerancia al gluten podría ser restituida.

¿Cual es el significado del amplio número casos no diagnosticados actualmente con esta

enfermedad? ¿Cuál es el significado del incremento en el número de personas con

síntomas extraintestinales o sín síntomas clásicos de la EC? Nosotros hemos anticipado

que el ritmo de diagnóstico continuará ascendiendo, ello podría ser importante en el


114

futuro de nuestro entendimiento de la patogénesis de la EC y mejorar su diagnóstico

(Tabla 3). La diversidad en la presentación clínica de la EC puede complicar el

diagnóstico y retrasar el inicio del tratamiento. En nuestra experiencia, el test

diagnóstico más importante para la EC es “la sospecha de la enfermedad”. El screening

de la EC debe comenzar con un test serológico (para anticuerpos antiendomisio de clase

IgA e IgG y anti-tTG anticuerpos), y tipificación HLA. Si los pacientes genéticamente

compatibles con esta enfermedad (igual con serología negativa) deben realizarse

precozmente una biopsia intestinal con endoscopia, se han realizado muchos esfuerzos

para identificar los factores de riesgo que presdisponen a EC. La carencia de tolerancia

inmune (Tolerancia oral) en la EC puede ocurrir debido a los polimorfismos de algunas

moléculas del sistema MHC implicadas en la inducción, regulación o expresión de la

respuesta inmune de la mucosa, tales como la IL-10 , TGF-beta, IFN-gamma. Muchos

de estos polimorfismos afectan genes de transcripción influenciando la susceptibilidad

individual para la EC. En suma, diversas asociaciones entre diferentes genes

polimórficos localizados en la región MHC han sido informados. Además, hemos

encontrado evidencia de que HLA-G es un gen interesante candidato en la EC. Estos

descubrimientos pueden abrir nuevas perspectivas en la identificación genética para la

EC.

º

Tabla 19. Futuras direcciones en la Enfermedad Celia ca

Preguntas sin respuesta

Inmunopatogénesis ¿Cómo se rompe la tolerancia oral? Células T específicas al gluten Diagnóstico ¿Cuál es el significado del amplio número de personas sin diagnosticar con esta enfermedad? ¿Cuál es el significado del incremento en el número de personas con síntomas extraintestinales o sin síntomas clásicos en la EC? Genética Identificar los factores de riesgo genéticos que predisponen a EC

Direcciones Futuras

Restaurando la tolerancia inmunológica al gluten podría representar la cura ideal para la EC. Células T gluten-específicas podrían ser inactivadas o suprimidas, podria restaurarse la tolerancia al gluten. La relación de diagnósticos podría continuar con un mejor diagnóstico. “La sospecha de la enfermedad” Genes polimórficos localizados en la región MHC y EC polimorfismos genéticos de citoquinas que pueden influenciar el riesgo de EC asociando polimorfismos con marcadores serológicos de polimorfismos de HLA-G


115

VI. CONCLUSIONES

1) El primer escalón en el diagnóstico de la EC son los test serológicos. Los

mejores test disponibles son los que usan anticuerpos de clase (IgA)

antihumanos anti transglutaminasa tisular (tTG) y anticuerpos IgA

antiendomisio por inmunofluorescence (EMA) por su extremadamente alta

especificad y sensibilidad. No obstante, la confirmación histológica de los

cambios característicos del intestino delgado (atrofia intestinal, hiperplasia de

criptas y linfocitosis intraepitelial) y el tipaje HLA son considerados esenciales

para el diagnóstico de EC.

2) Observamos un porcentaje más elevado de pacientes que asocian la molécula

HLA-DQ8 en la EC (alrededor del 20%-25%) Además, los pacientes con EC Y

HLA-DQ8 se asocian frecuentemente con síntomas de presentación

extraintestinales y están frecuentemente asociados con otras enfermedades

autoinmunes.

3) Nuestros resultados sugieren que las células CD4+ y CD3+ desempeñan un

papel fundamental en la enfermedad celíaca.

4) La IL-23 y la IL-17 constituyen un nuevo eje via formación de células Th17 en

la patogénesis de enfermedad celíaca

5) En los pacientes celíacos activos hay un incremento en la expresión de IL-10 y

TGF-beta

6) En la enfermedad celíaca en su fase activa se produce un incremento en los

niveles plasmáticos de HLA-G en su forma soluble

7) el incremento de los niveles de la expresión de sHLA-G en la enfermedad

celíaca se asocia con otras enfermedades autoinmunes, siendo dependiente de

una asociación genética con estas enfermedades a través de los genes HLA

8) El polimorfismo de 14 pb del gen HLA-G influye en la expresión de la isoforma

HLA-G5 en pacientes celiacos

9) El polimorfismo de 14 pb del gen HLA-G tiene influencia sobre la

susceptibilidad para desarrollar la enfermedad celiaca y puede ser un marcador

genético a considerar.

10) El incremento de HLA-G en plasma se debe a la isofroma HLA-G5


116

11) Se observa un incremento del enzima IIDO tanto a nivel plasmático como en

biopsis intestinal y una disminución de los niveles de triptófanoen pacientes

celíacos .


117

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