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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Comparación de dos técnicas para determinación de calprotectina fecal en
laboratorios de referencia NetLab 2018
Trabajo de investigación previo a la obtención del título de: Bioquímica Clínica
Autor: Juan Patricio Oyagata Suasnavas
Tutora: Dra. Walkyrie Aguilar Alfaro
Quito, 2019
ii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Derechos de autor
Yo Juan Patricio Oyagata Suasnavas en calidad de autor y titular de los derechos morales y
patrimoniales del trabajo de titulación: Comparación de dos técnicas para determinación de
calprotectina fecal en laboratorios de referencia NetLab 2018, modalidad Proyecto de
Investigación, de conformidad con el Art.114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA
SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad
Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial
de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor
sobre la obra, establecidos en la normativa citada
Así mismo autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por
cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y libreando a la Universidad de
toda responsabilidad
Juan Patricio Oyagata Suasnavas
C.I.: 1720480357
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Constancia de aprobación del tutor
Yo Alba Walkyrie Aguilar Alfaro en calidad de tutora del proyecto de investigación titulado:
“Comparación de dos técnicas para determinación de calprotectina fecal en laboratorios
de referencia NetLab 2018.” elaborado por el estudiante Juan Patricio Oyagata Suasnavas,
para optar por el título Profesional en Bioquímica Clínica dejo constancia que he leído el
trabajo de titulación y considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el
campo metodológico y en el campo epistemológico, por lo que APRUEBO, a fin de que sea
sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.
Dado en la ciudad de Quito a los 8 días del mes de abril del 2019
Firma del Tutor
Dra. Walkyrie Aguilar
C.I.: 1704992856
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Constancia de aprobación del trabajo final por el tribunal
El Tribunal constituido por el Dr. Walter Remache, la Dra. Lourdes Pazmiño y la Dra. Walkyrie
Aguilar luego de revisar el trabajo de investigación titulado: “Comparación de dos técnicas
para determinación de calprotectina fecal en laboratorios de referencia NetLab 2018.”
Previo a la obtención del título Bioquímica Clínica presentado por el señor Juan Patricio
Oyagata Suasnavas, APRUEBA el trabajo presentado.
Dr. Walter Remache Dra. Lourdes Pazmiño
Dra. Walkyrie Aguilar
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Lugar donde se realizó la investigación
El presente trabajo titulado: Comparación de dos técnicas para determinación de
calprotectina fecal en laboratorios de referencia NetLab 2018, se realizar á en las
instalaciones de laboratorios de referencia NetLab.
vi
Dedicatoria
Dedico el trabajo resumido en estas hojas a mis padres como muestra de
agradecimiento por brindarme la oportunidad y apoyo en el proceso de mi formación
como profesional.
Juan Patricio Oyagata Suasnavas
vii
Agradecimiento
Agradezco el haber culminado esta meta académica planteada a mi Dios, gracias por
permitirme formarme como profesional, pero aún más le agradezco el poder creer en él.
Agradezco a mis padres Juan Oyagata y Gladys Suasnavas por ese amor abnegado que me
han demostrado con su esfuerzo, dedicación y valentía por con su hijo.
Agradezco a mis hermanas Johanna Oyagata y Alexandra Oyagata, a mis hermanos
Fernando Coronel y Leonardo Oyagata por su apoyo en este proceso.
Agradezco a mi familia: mis abuelas, tíos, tías, primos y primas por su compañía y
motivación.
Agradezco a mis amigas Jaquelin Jaramillo y Karla Murillo por todo el apoyo que me han
brindado en estos años.
Agradezco a la doctora Walkyrie Aguilar por las oportunidades brindadas y por ser tutora
del presente trabajo de investigación.
Juan Patricio Oyagata Suasnavas
viii
Índice de contenidos
Derechos de autor ...................................................................................................................... ii
Constancia de aprobación del tutor .......................................................................................... iii
Lugar donde se realizó la investigación ..................................................................................... v
Dedicatoria ................................................................................................................................ vi
Agradecimiento ........................................................................................................................ vii
Índice de contenidos .............................................................................................................. viii
Índice de tablas ........................................................................................................................ xii
Índice de gráficos ................................................................................................................... xiii
Índice de anexos ...................................................................................................................... xiv
Lista de abreviaturas ................................................................................................................ xv
Resumen .................................................................................................................................. xvi
Abstract .................................................................................................................................. xvii
Introducción ............................................................................................................................... 1
Capítulo I ................................................................................................................................... 3
1. El problema ................................................................................................................ 3
1.1. Planteamiento del problema ....................................................................................... 3
1.2. Formulación del problema ......................................................................................... 4
1.3. Preguntas directrices o de investigación .................................................................... 4
1.4. Objetivos .................................................................................................................... 4
1.4.1. Objetivo general. ........................................................................................................ 4
1.4.2. Objetivos específicos. ................................................................................................ 4
1.5. Justificación e importancia ........................................................................................ 5
Capítulo II .................................................................................................................................. 6
2. Marco referencial ....................................................................................................... 6
ix
2.1. Antecedentes .............................................................................................................. 6
2.2. Fundamentación teórica ............................................................................................. 7
2.2.1. Calprotectina. ............................................................................................................. 7
Proteínas s100. ........................................................................................................... 8
2.2.2. Mucosa intestinal. .................................................................................................... 15
Sistema inmunitario de la mucosa intestinal. .......................................................... 16
2.2.3. Calprotectina fecal. .................................................................................................. 18
Enfermedad inflamatoria intestinal. ........................................................................ 19
Importancia clínica de la calprotectina fecal. .......................................................... 24
2.2.4. Pruebas de diagnóstico. ............................................................................................ 29
Parámetros de una prueba de diagnóstico. .............................................................. 31
2.2.5. Comparación de pruebas diagnósticas. .................................................................... 36
Concordancia entre técnicas. ................................................................................... 36
Correlación entre técnicas. ...................................................................................... 40
2.2.6. Técnica ELISA......................................................................................................... 41
Principio. ................................................................................................................. 41
Métodos. .................................................................................................................. 41
2.2.7. Técnica inmunocromatográfica. .............................................................................. 44
Principio. ................................................................................................................. 44
Métodos. .................................................................................................................. 44
2.3. Fundamentación legal .............................................................................................. 46
2.4. Hipótesis .................................................................................................................. 47
2.4.1. Hipótesis de trabajo (Hi). ......................................................................................... 47
2.4.2. Hipótesis nula (Ho). ................................................................................................. 47
2.5. Sistema de variables ................................................................................................. 47
x
Capitulo III ............................................................................................................................... 48
3. Metodología ............................................................................................................. 48
3.1. Diseño de investigación ........................................................................................... 48
3.2. Población y muestra ................................................................................................. 49
3.3. Selección de la muestra ............................................................................................ 50
3.3.1. Criterios de inclusión para el estudio. ...................................................................... 50
3.3.2. Criterios de exclusión para el estudio. ..................................................................... 50
3.4. Métodos y materiales ............................................................................................... 50
3.4.1. Método de la técnica inmunocromatográfica. .......................................................... 50
Fundamento de la técnica inmunocromatográfica. .................................................. 50
Procedimiento de la técnica inmunocromatográfica. .............................................. 51
3.4.2. Materiales de la técnica inmunocromatográfica. ..................................................... 52
Reactivos. ................................................................................................................ 52
3.4.3. Método de la técnica ELISA. ................................................................................... 52
Fundamento de la técnica ELISA. ........................................................................... 52
Procedimiento de la técnica ELISA. ....................................................................... 53
3.4.4. Materiales de la técnica ELISA. .............................................................................. 54
Reactivos. ................................................................................................................ 54
3.5. Matriz de operacionalización de las variables ......................................................... 55
3.6. Técnicas e instrumentos de recolección de datos .................................................... 56
3.7. Validez y confiabilidad ............................................................................................ 56
3.8. Técnicas de procesamiento y análisis de datos ........................................................ 56
3.9. Consideraciones bioéticas ........................................................................................ 56
Capítulo IV............................................................................................................................... 58
4. Análisis de resultados .............................................................................................. 58
xi
Capítulo V ................................................................................................................................ 64
5. Conclusiones y recomendaciones ............................................................................ 64
5.1. Conclusiones ............................................................................................................ 64
5.2. Recomendaciones .................................................................................................... 65
Referencias ............................................................................................................................... 66
5.3. Anexos ..................................................................................................................... 69
xii
Índice de tablas
Tabla 1. Principales síntomas y hallazgos de laboratorio en la colitis ulcerosa. ..................... 22
Tabla 2. Principales síntomas y hallazgos de laboratorio en la Enfermedad de Crohn. .......... 23
Tabla 3. Resultados del diagnóstico de 47 pacientes pediátricos ............................................ 25
Tabla 4. Diagnóstico definitivo de los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal ...... 25
Tabla 5. Concentraciones medias de calprotectina fecal en distintas enfermedades
gastrointestinales ...................................................................................................................... 26
Tabla 6. Escala de valoración de kappa según Landis y Koch. ............................................... 38
Tabla 7. Matriz de operacionalización de variables. ................................................................ 55
Tabla 8. Presentación de características analíticas de las técnicas inmunocromatográfica y
ELISA en la determinación de calprotectina fecal. ................................................................. 58
Tabla 9. Resultados de la determinación de calprotectina fecal por las técnicas
inmunocromatográfica y ELISA. ............................................................................................. 58
Tabla 10. Parámetros comparativos de concordancia y correlación entre técnicas
inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de calprotectina fecal. ......................... 59
Tabla 11. Resumen del nivel de acuerdo en la determinación de calprotectina fecal por las
técnicas inmunocromatográfica y ELISA ................................................................................ 59
Tabla 12. Resumen de coeficientes de contingencia. .............................................................. 60
xiii
Índice de gráficos
Figura 1. Estructura cristalina del complejo calprotectina. ...................................................... 11
Figura 2. Estructura de la mucosa intestinal del intestino delgado. ......................................... 16
Figura 3. Estructura anatómica del tejido linfoide mucoso del intestino delgado.. ................. 17
Figura 4. Liberación de calprotectina por neutrófilos hacia la luz intestinal en respuesta a un
proceso inflamatorio. ............................................................................................................... 19
Figura 5.Distribución anatómica de la enfermedad inflamatoria intestinal. ............................ 20
Figura 6. Distribución del número de pacientes con diferentes diagnósticos de enfermedad
gastrointestinal y la concentración de calprotectina fecal. ....................................................... 27
Figura 7. Contraste a manera de columnas entre los coeficientes obtenidos y los coeficientes
óptimos en una comparación de técnicas. ................................................................................ 61
Figura 8. Contraste a manera de gráfico de superficie entre los coeficientes obtenidos y los
coeficientes óptimos en una comparación de técnicas. ............................................................ 62
Figura 9. Algoritmo de diagnóstico para enfermedad inflamatoria intestinal. ........................ 63
xiv
Índice de anexos
Anexo A. Árbol de problemas ................................................................................................. 69
Anexo B. Categorización de variables ..................................................................................... 70
Anexo C. Instrumento de recolección de datos ....................................................................... 71
Anexo D. Matriz de validación de instrumentos ..................................................................... 76
Anexo E. Oficio de aprobación de laboratorios de referencia NetLab .................................... 79
Anexo F. Certificado de viabilidad ética. ................................................................................ 80
xv
Lista de abreviaturas
CF: Calprotectina fecal.
CU: Colitis ulcerosa.
EC: Enfermedad de Crohn.
EII: Enfermedad inflamatoria intestinal.
ELISA: Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas.
GALT: Tejido linfoide asociado a la mucosa intestinal.
ICAM-1: Moléculas de adhesión intercelulares.
IFN-ϒ: Interferón gamma.
IL-4: Interleucina 4.
IL-8: Interleucina 8.
IL-12: Interleucina 12.
MDSC: Células supresoras de origen mieloide.
MMP-7: Metaloproteinasa de matriz 7
NF-kb: Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas.
NOS-2: Óxido nítrico sintasa 2.
MAPK: Proteína cinasas activadas por mitógenos.
PMA: Tetradecanoil-forbol acetato.
RAGE: Receptor para productos finales de glicación avanzada.
SII: Síndrome de intestino irritable.
xvi
TITULO: Comparación de dos técnicas para determinación de calprotectina fecal en
laboratorios de referencia NetLab 2018
Autor: Juan Patricio Oyagata Suasnavas
Tutora: Dra. Alba Walkyrie Aguilar Alfaro
RESUMEN
La enfermedad inflamatoria intestinal es un grupo de enfermedades intestinales crónicas cuya
prevalencia en el mundo occidental supera el 0,3%. El gold standard para el diagnóstico de esta
patología son las pruebas endoscópicas, pruebas invasivas que en el caso de la población
pediátrica requieren de sedoanalgesia. Lo cual ha dado paso a la búsqueda de alternativas de
diagnóstico. La calprotectina una proteína citosólica de neutrófilo se ha relacionado a procesos
inflamatorios y su determinación en heces se ha implementado como prueba de diagnóstico y
seguimiento para la enfermedad inflamatoria intestinal. La determinación de calprotectina fecal
se la realiza bajo varias técnicas siendo la técnica ELISA el gold standard. Sin embargo, su
tiempo de respuesta y costos de implementación requieren de técnicas alternativas como la
técnica inmunocromatográfica. La técnica inmunocromatográfica posee mejores tiempos de
respuesta y costos, sin embargo, para la implementación de este tipo de prueba es necesario
conocer el nivel de confiabilidad de sus resultados. El propósito de la presente investigación
fue evaluar el nivel correlación y concordancia que existe entre las técnicas
inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de calprotectina fecal. La metodología
utilizada al ser un estudio prospectivo y comparativo consistió en la determinación de
calprotectina fecal de 39 muestras por las técnicas inmunocromatográfica y ELISA. Se
determinaron los coeficientes comparativos de: contingencia C de Pearson (0,530), correlación
de Spearman (0,624), coeficiente Kappa de Cohen (0,602) y nivel de acuerdo entre técnicas
(84,6%). Los coeficientes establecieron que los resultados de la técnica inmunocromatográfica
poseen una correlación y concordancia de tipo moderada en contraste con los resultados de la
técnica ELISA, por lo que, se establece que la técnica inmucromatografica brinda resultados
confiables con mejores tiempos de respuesta y costos.
PALABRAS CLAVE: CALPROTECTINA FECAL, TÉCNICA
INMUNOCROMATOGRÁFICA, TÉCNICA ELISA, CONCORDANCIA, CORRELACIÓN.
xvii
TITLE: Comparación de dos técnicas para determinación de calprotectina fecal en laboratorios
de referencia NetLab 2018
Author: Juan Patricio Oyagata Suasnavas
Tutor: Dra. Alba Walkyrie Aguilar Alfaro
ABSTRACT
The inflammatory bowel disease is a group of chronic intestinal diseases whose prevalence in
the western world exceeds 0.3%. The gold standard for the diagnosis of this pathology are
endoscopic tests, invasive tests that in the case of the pediatric population require
sedoanalgesia. Which has given way to the search for diagnostic alternatives. Calprotectin, a
neutrophil cytosolic protein, has been linked to inflammatory processes and its determination
in feces has been implemented as a diagnostic and monitoring test for inflammatory bowel
disease. The determination of fecal calprotectin is carried out under several techniques, the
ELISA technique being the gold standard. However, their response time and implementation
costs require alternative techniques such as the immunochromatographic technique. The
immunochromatographic technique has better response times and costs, however, for the
implementation of this type of test it is necessary to know the level of reliability of its results.
The purpose of the present investigation was to evaluate the level of correlation and agreement
that exists between immunochromatographic and ELISA techniques in the determination of
faecal calprotectin. The methodology used to be a prospective and comparative study consisted
in the determination of fecal calprotectin of 39 samples by immunochromatographic and
ELISA techniques. The comparative coefficients of: Pearson C contingency (0.530), Spearman
correlation (0.624), Cohen's Kappa coefficient (0.602) and agreement level between techniques
(84.6%) were determined. The coefficients established that the results of the
immunochromatographic technique have a moderate correlation and a moderate agreement in
contrast to the results of the ELISA technique, therefore, it is established that the
immunochromatographic technique provides reliable results with better response times and
costs.
KEYWORDS: FECAL CALPROTECTIN, IMMUNOCROMATOGRAPHIC TECHNIQUE,
ELISA TECHNIQUE, CONCORDANCE, CORRELATION.
1
Introducción
Los síntomas más comunes presentes en trastornos gastrointestinales son el dolor
abdominal y la diarrea, ambos síntomas presentes en la enfermedad inflamatoria
intestinal y en procesos de origen funcional. El diagnóstico diferencial entre la patología
orgánica y la patología funcional tiene como patrón de oro la realización de exámenes
endoscópicos, procesos invasivos que en niños requieren de anestesia general, además
de ser costosos y de no poderse repetir frecuentemente en los pacientes.
La calprotectina, una proteína tetramérica de 36,5 Kd formada por un complejo de
proteínas fijadoras de calcio S100A8 y S100A9 se encuentra presente en los neutrófilos
formando un 60% del total de proteínas solubles de su citoplasma y un 5 % de sus
proteínas totales. Su elevación en heces se induce por un aumento de la permeabilidad
de la mucosa intestinal en trastornos gastrointestinales orgánicos (infecciosos,
inflamatorios o tumorales). Lo cual en los últimos años la ha posicionado como una
posible prueba para el diagnóstico diferencial entre la patología orgánica y la funcional,
además de sugerirse ser usada como una prueba de criterio pre endoscópico para
pacientes con sospecha de enfermedad inflamatoria intestinal.
La técnica ELISA es considerada el gold standard para la determinación de
calprotectina en heces, pero la diferencia entre los costos de implementación y sus
prolongados tiempos de respuesta en comparación a la prueba inmunocromatográfica
rápida de cassette son considerables, con lo que, el uso de las pruebas rápidas por
inmunocromatografía optimizan el tiempo entre la entrada de la muestra y su resultado
(Schulz, Wex, Arnim, & Malfertheiner, 2016). El objetivo del presente estudio pretende
evaluar comparativamente si los resultados de la técnica inmunocromatográfica poseen
una adecuada concordancia y correlación con lo reportado por la técnica ELISA. De esta
manera se propondrá evidencia científica de la eficacia de los resultados reportados por
la prueba rápida de cassette, misma que tiene un mejor tiempo de respuesta y un menor
costo con respecto a la técnica ELISA.
2
Capítulo I: El problema
Consta del planteamiento y formulación del problema, preguntas directrices, objetivo
general y específicos, además se describe la importancia y justificación de la presente
investigación.
Capítulo II: Marco referencial
Se describen los antecedentes investigativos, marco teórico, marco legal, hipótesis
planteadas y el sistema de variables.
Capítulo III: Metodología
Se detalla la metodología de investigación, la cual incluye el diseño de la
investigación, métodos y materiales, diseño experimental, análisis estadístico y
consideraciones bioéticas.
Capítulo IV: Análisis de resultados
Se mencionan los resultados obtenidos con la mención de discusión de los mismos.
Capítulo V: Conclusiones y recomendaciones
En este capítulo se mesionan las conclusiones y recomendaciones de la presente
investigación.
3
Capítulo I
1. El problema
1.1.Planteamiento del problema
La enfermedad inflamatoria intestinal es un grupo de afecciones gastrointestinales
inflamatorias crónicas asociada a países industrializados con una prevalencia mayor al
0.3% en el mundo occidental (Ricciuto & Griffiths, 2019). La calprotectina, una proteína
citosólica de neutrófilo vinculada a procesos inflamatorios, ha sido estudiada e
implementada como diagnóstico de enfermedad inflamatoria intestinal. La determinación
de calprotectina para el diagnóstico de enfermedad inflamatoria intestinal es medida en
heces. El análisis de calprotectina fecal se encuentra disponible en varias técnicas, como
las técnicas inmunocromatográfica y ELISA. Siendo la técnica ELISA considerada como
el gold standard (Ricciuto & Griffiths, 2019).
La técnica ELISA es considerada la técnica de referencia y además las más utilizada
debido a su alta sensibilidad y especificad. Sin embargo, la determinación de
calprotectina fecal mediante la técnica inmucromatografica presenta determinadas
ventajas con respecto a las técnica ELISA como son: mayor rapidez en la determinación,
la posibilidad de realizar el análisis individual, una mayor facilidad de manejo e
interpretación de sus resultados para el clínico, además de reducir el costo por prueba
(Rodríguez, Lobatón, Rodríguez, & Guardiola 2013).
El conocer en qué medida los resultados de la prueba rápida inmunocromatográfica
son similares a la técnica ELISA considerada gold standard, nos brinda evidencia
científica acerca de la fiabilidad de resultados de la técnica inmunocromatográfica. La
determinación del nivel de concordancia y correlación entre las técnicas
inmunocromatográfica y ELISA mediante estadística dimensionan la similitud entre
resultados y la fiabilidad de la técnica inmunocromatográfica.
La determinación de coeficientes de concordancia, correlación y de las medidas
tradicionales del valor diagnóstico de la prueba rápida inmunocromatográfica con
4
respecto a la técnica ELISA nos brindaría una valoración de la validez de resultados de
la técnica inmucromatografica en la determinación de calprotectina fecal.
1.2.Formulación del problema
¿Los resultados de las técnicas inmunocromatográfica y ELISA en la determinación
de calprotectina fecal son semejantes?
1.3.Preguntas directrices o de investigación
¿Cuál es el nivel de concordancia entre las técnicas inmunocromatográfica y
ELISA en la determinación de calprotectina fecal?
¿Cuál es el nivel de correlación entra las técnicas inmunocromatográfica y
ELISA en la determinación de calprotectina fecal?
¿Se puede realizar un algoritmo de trabajo para el diagnóstico de enfermedad
inflamatoria intestinal que incluya a la prueba de calprotectina fecal
determinada por la técnica inmunocromatográfica?
1.4.Objetivos
1.4.1. Objetivo general.
Comparar las técnicas inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de
calprotectina fecal en Laboratorios NetLab 2018.
1.4.2. Objetivos específicos.
Determinar el nivel de concordancia entre las técnicas inmunocromatográfica
y ELISA en la determinación de calprotectina fecal.
Establecer el grado de correlación entra las técnicas inmunocromatográfica y
ELISA en la determinación de calprotectina fecal.
Realizar un algoritmo de trabajo para el diagnóstico de enfermedad
inflamatoria intestinal que incluya a la prueba de calprotectina fecal
determinada por la técnica inmunocromatográfica.
5
1.5.Justificación e importancia
La enfermedad inflamatoria intestinal se ha venido desarrollando principalmente en
la población de ciudades industrializadas. Se habla que a nivel del mundo occidental la
prevalencia supera el 0,3% (Ricciuto & Griffiths, 2019). La causa de la enfermedad
inflamatoria intestinal aun es desconocida y su gravedad varia de paciente a paciente.
El gold standard de diagnóstico para la enfermedad inflamatoria intestinal es la
endoscopia, por lo que, ante una fuerte sospecha de enfermedad inflamatoria intestinal
algoritmos de trabajo sugieren la realización directa de una prueba endoscópica, la cual
es una técnica invasiva con riesgos de hemorragia además del uso de sedoanalgesia o
anestesia general en pacientes pediátricos (García, 2007). La decisión de proceder con
endoscopia en pacientes con sospecha de enfermedad inflamatoria intestinal se podría
ver sustentada en un test rápido de calprotectina fecal lo cual resultaría en una
disminución del número de endoscopias no necesarias.
El tiempo de respuesta de una prueba de laboratorio clínico muchas veces es
considerada como un limitante para su uso. La determinación de calprotectina fecal por
la técnica ELISA posee un elevado tiempo de respuesta con lo que se dificulta el
considerar a la medición de calprotectina fecal como criterio pre endoscópico, el conocer
el grado de similitud de los resultados proporcionados entre las técnicas
inmunocromatográfica y ELISA puede resolver la inclusión del test calprotectina fecal
como prerrequisito para una prueba endoscópica lo cual reduciría el número de
endoscopias no necesarias (Cano & Fuentes Arderiu, 2019).
La determinación de calprotectina fecal por un medio rápido y no invasivo no
solamente proporciona los beneficios como criterio pre endoscópico en pacientes
candidatos a una endoscopia, si no que alberga la capacidad de monitorear el avance del
tratamiento de una forma en que la calidad de vida del paciente no empeore a
consecuencia del diagnóstico o a su vez en el seguimiento clínico.
6
Capítulo II
2. Marco referencial
2.1.Antecedentes
En julio del 2016 se publicó el estudio “Validation of Two Calprotectin Rapid Tests
in Daily Routine”, en el cual se evaluó la sensibilidad y especificad de dos pruebas
rápidas para la determinación de calprotectina fecal con respecto a la técnica ELISA
como gold standard. En el estudio se utilizó un tamaño de muestra de 68 pacientes con
diagnóstico de enfermedad inflamatoria intestinal confirmada. Las muestras de estos
pacientes fueron analizadas mediante las pruebas Quantum Blue, PreventID® y ELISA.
En comparación con la técnica ELISA como gold standard los resultados de sensibilidad
de las pruebas rápidas Quantum Blue y PreventID® fueron correspondientemente de
93% y 99,9%, los valores predictivos negativos de Quantum Blue y PreventID® fueron
correspondientemente de 99,8% y 84,2%. De dichos valores se concluyó que tanto
Quantum Blue como PreventID® proporcionan una alta precisión diagnóstica a la vez
que consumen menos tiempo en la rutina diaria en comparación a la técnica ELISA para
la determinación de calprotectina fecal. La implementación de la técnica ELISA para la
determinación de calprotectina fecal en un laboratorio sería una opción válida en
laboratorios con altos números de muestras (Schulz et al., 2016).
En un estudio publicado en agosto del 2018 titulado “Comparative evaluation of
four methods for fecal calprotectin testing: One-step card test, a point-of-care
lateral flow assay, a standard and an automated ELISA”, se planteó comparar cuatro
métodos para la medición de calprotectina fecal tomando en cuenta los parámetros de
rendimiento, sensibilidad y especificidad diagnósticas, el valor predictivo positivo y
negativo, la coincidencia y las correlaciones entre pruebas. Para esto se usaron 41
muestras de heces de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal y 12 pacientes
sanos, las muestras de los pacientes se analizaron por las pruebas One-step card test,
Quantum Blue y dos tipos de pruebas ELISA (Ridascreen and Alegría). Los resultados
del estudio mostraron que la prueba Quantum Blue posee mayor sensibilidad para el
diagnóstico de enfermedad inflamatoria intestinal, seguido de los dos ELISA. Todas las
7
pruebas tuvieron una especificidad del 100% y un valor predictivo positivo del 100%,
excepto el método ELISA de Ridascreen el cual para especificidad y valor predictivo
positivo tuvo 92% y 94-97%, respectivamente. El mejor valor predictivo negativo
perteneció al sistema Quantum Blue. La coincidencia de los resultados tuvo una variación
del 85.36% al 97.56% entre las pruebas con una mayor coincidencia entre métodos
ELISA y el nivel de correlación de moderadas a fuertes entre pruebas. Se concluyó que
los cuatro métodos proporcionaron resultados comparables, por lo que, se tomaron como
aceptables y convenientes para el uso clínico (Velikova et al., 2018).
El artículo científico “Faecal calprotectin: comparative study of the Quantum
Blue rapid test and an established ELISA method” publicado en abril del 2013
comparó el método rápido para detección de calprotectina fecal Quantum Blue y el
método ELISA. La determinación de calprotectina fecal por ambas técnicas se realizó en
142 muestras en búsqueda de un coeficiente de determinación y de los valores de corte
óptimos de la prueba Quantum Blue para lo cual se utilizaron las herramientas
Microsoft® Excel 2002 y MedCalc Software versión 10.0.0.0. En la comparación del
método se encontró un coeficiente de determinación 𝑅2 = 0.89. El análisis de regresión
de Passing Bablok mostró una desviación significativa de la linealidad. Considerando un
valor de corte de 30 μg / g de heces con una zona gris de 30–110 μg / g de heces mostraron
los mejores resultados de concordancia entre las pruebas ELISA y Quantum Blue, con
un 89,4% de concordancia y un 10,6% de desacuerdos entre técnicas. Se concluyó que la
prueba Quantum Blue puede servir como alternativa confiable a la técnica ELISA.
Además, parece ser confiable en el seguimiento de pacientes con enfermedad
inflamatoria intestinal (Coorevits, Baert, & Vanpouke, 2013).
2.2.Fundamentación teórica
2.2.1. Calprotectina.
La calprotectina es un complejo de dos proteínas de unión al calcio llamadas
calgranulina A y calgranulina B. Pertenecen a la familia de las proteínas S100, las cuales
dentro de esta familia toman los nombres de proteína de unión al calcio S100A8
(calgranulina A) y S100A9 (calgranulina B). Con el fin de brindar soporte a la barrera
epitelial la calprotectina se expresa en queratinocitos de la mucosa escamosa, su
8
expresión se induce durante procesos inflamatorios en queratinocitos epidérmicos,
células epiteliales gastrointestinales y fibroblastos, además de producirse
abundantemente en neutrófilos y monocitos (Stríz & Trebichavský, 2004).
Proteínas s100.
La familia de proteínas S100 debe su nombre a la capacidad que tiene para
solubilizarse en sulfato de amonio. Esta familia de proteínas forma el subgrupo más
grande dentro de la superfamilia de proteínas que poseen el dominio EF-hand de unión
al calcio (Marenholz, 2004), dicho dominio se caracteriza por poseer una estructura
hélice – bucle - hélice con capacidad de unirse al calcio (Walter, 2012). Los genes que
expresan estas proteínas en el humano son 24, 19 genes que expresan el grupo A están
localizados dentro del cromosoma 1q21. Las proteínas S100 cumplen con funciones tanto
intracelulares como extracelulares específicas de tejido y en consecuencia valores
alterados de proteína S100 se asocia a patologías como miocardiopatías, cáncer,
trastornos neurodegenerativos e inflamatorios (Marenholz, 2004).
Las proteínas S100 se han clasificado funcionalmente en tres subgrupos principales
según su espacio de función: reguladores intracelulares, reguladores intracelulares y
reguladores extracelulares. A nivel intracelular regulan la proliferación, diferenciación,
apoptosis, homeostasis del calcio, metabolismo energético e inflamación a través de
interacciones con proteínas como: enzimas, subunidades de citoesqueleto, receptores,
factores de transcripción y ácidos nucleicos. A nivel extracelular son excretadas y
cumplen regulación de funciones celulares de forma autócrina y parácrina mediante la
activación de receptores de superficie, receptores acoplados a proteínas G, receptores de
depuración o proteoglicanos de heparán sulfato y N-glicanos (Donato, 2013).
De esta forma las proteínas extracelulares S100 ejercen actividades reguladoras sobre:
monocitos, macrófagos, microglía, neutrófilos, linfocitos, mastocitos, condrocitos
articulares, células musculares lisas endoteliales y vasculares, neuronas, astrocitos,
células de Schwann, células epiteliales, mioblastos y cardiomiocitos. Participando en
respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, en la migración celular y quimiotaxis,
desarrollo y reparación de tejidos e invasión de leucocitos y células tumorales (Donato,
2013).
9
Proteínas s100 como marcadores de enfermedades.
En cuadros clínicos de inflamación aguda o crónica generalmente se encuentran
elevados las concentraciones de S100A8, S100A9 y S100A12, probablemente liberados
por neutrófilos y macrófagos activados, por lo que, estas proteínas se refieren como
marcadores inespecíficos de la activación del fagocito. La presencia de S100A8, S100A9
y S100A12 no son específicos de determinada enfermedad ya que se encuentran
elevadas en pacientes que sufren numerosas infecciones o trastornos inflamatorios
agudos y crónicos, diversos tipos de tumores, obesidad y enfermedad de Alzheimer,
aunque, el análisis del origen de la muestra puede ayudar a discriminar el lugar en donde
se está produciendo la inflamación o infección. Las proteínas S100 pueden estar
presentes en secreciones como: lágrimas, saliva, esputo, líquido quístico, líquido
cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y heces. Las concentraciones de proteínas S100
se correlacionan con el curso de la enfermedad y la gravedad de esta, así como para
evaluar el curso del tratamiento (Donato, 2013).
Dentro de las mediciones de las proteínas S100 destacan el complejo S100A8 / A9
conocido como calprotectina y la proteína S100A12, las cuales son medidas en
circulación o en heces en pacientes con inflamación intestinal. La utilidad clínica de esta
prueba fecal no invasiva es particularmente útil para casos pediátricos y los niveles
pueden usarse como marcadores para el diagnóstico diferencial y para monitorizar el
avance de la enfermedad inflamatoria intestinal. A nivel cardiaco las proteínas S100 se
utilizan para evaluar la enfermedad cardiovascular, el aumento de los niveles plasmáticos
de S100A8 / A9 (calprotectina) ayuda a predecir anomalías en la fisiología
cardiovascular. Al encontrar pacientes con niveles elevados de calprotectina plasmática
se relacionan con un riesgo 2.0 veces mayor de sufrir un evento cardiovascular (Donato,
2013).
Los niveles de calprotectina también están elevados en pacientes con artritis
inflamatoria, y puede ser un marcador para evaluar el avance del tratamiento en la fase
temprana de la artritis reumatoide. A concentraciones altas de S100A8, S100A9 y
S100A12 en el líquido sinovial permiten diferenciar de manera precisa la artritis
reumatoide de las artritis inflamatorias diversas. La proteína S100A12 puede usarse
10
como marcador de trastornos pulmonares, en los cuales se encontrará elevada en esputo
como en la evaluación del asma eosinofílica. Las altas concentraciones de MMP-7,
ICAM-1, IL-8 y S100A12 lograron predecir un mal avance de la enfermedad de los
pacientes con fibrosis pulmonar idiopática y en pacientes con lesión pulmonar aguda en
etapa temprana la determinación de S100A12 resultó útil como marcador temprano de
lesión (Donato, 2013).
En cuanto al uso clínico de las proteínas S100 para evaluación de determinados tipos
de cáncer se ha determinado que pueden llegar a ser útiles. En el caso de la medición de
S100A9 puede usarse en el diagnóstico temprano de pacientes con cáncer de pulmón de
células no pequeñas, así como su sobre expresión se relaciona con un mal pronóstico en
este tipo de cáncer. En pacientes con adenocarcinoma pancreático la proteína S100A11
puede llegar a ser un marcador tumoral significativo y como un predictor de estado de
pacientes que han sido sometidos a cirugía de resección. En pacientes con cáncer de
colon, recto y gástrico la medición de A100A4 resulta útil para el diagnóstico de
metástasis debido a que esta proteína presenta propiedades inductoras de metástasis. La
concentración nuclear elevada de S100A7 está asociado con un mal pronóstico en
pacientes con: melanoma cutáneo, cáncer de cabeza, cuello y mama invasivo (Donato,
2013).
En pacientes con una lesión del sistema nervioso central como en el caso de: accidente
cerebrovascular, hemorragia subaracnoidea y traumatismo cerebral las concentraciones
de S100B se elevan alcanzando su pico máximo en 2 a 3 días después de la lesión y la
medición de esta proteína puede utilizarse como marcador en la mejora del paciente
conforme avanza el tratamiento. La proteína S100B también puede ser liberada por
células no nerviosas, por lo que se pueden elevar en casos de: isquemia cardíaca,
cardiomiopatía, infecciones extra cerebrales, esquizofrenia, trastornos depresivos o
bipolares, obesidad y en pacientes que se han sometido a intervenciones quirúrgicas
cardiotorácicas o tuvieron un trauma sin lesión cerebral (Donato, 2013).
El complejo S100A8/A9 conocido como calprotectina debido a su actividad
protectora durante el curso de procesos infecciosos e inflamatorios, es un complejo
proteico formado por la unión de dos tipos de calgranulinas, la calgranulina A y la
11
calgranulina B, conocidas también como proteínas S100A8 y S100A9
correspondientemente, las cuales forman parte de la familia de proteínas S100. El
complejo S100A8/A9 está conformada por homodímeros de S100A8 y S100A9
conformando estructuras tetraméricas biológicamente activas del complejo calprotectina
(Hsu, y otros, 2009). Las proteínas S100A8 y S100A9 también pueden encontrarse como
homodímeros y en este estado cambiaran en forma y función en comparación a la
calprotectina heterodimérica de S100A8/A9 (Kenneth Hsu et al., 2009).
Figura 1. Estructura cristalina del complejo calprotectina S100A8 (amarillo) –
S100A9 (verde) unida a manganeso (purpura) y calcio (gris). Damo S. (2013). Molecular
basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune
response to invading bacterial pathogens. Figura. Recuperado de
https://www.ncbi.nlm.nih.gov.
El complejo S100A8/A9 (Calprotectina) está conformado por proteínas notablemente
multifuncionales, de las cuales resaltan su actividad antimicrobiana a nivel intra y
extracelular y sus propiedades antiinflamatorias. El mecanismo de la función
antimicrobiana de la calprotectina implica la capacidad de quelación de cationes
divalentes como el manganeso y el zinc, provocando la inhibición del crecimiento
12
intracelular y extracelular de una amplia gama de bacterias y hongos que usan dichos
metales como sustrato para sus funciones biológicas (Hsu, y otros, 2009).
Las calgranulinas también pueden modular las respuestas inflamatorias secundarias a
procesos infecciosos. La resolución exitosa de la infección implica el reclutamiento de
neutrófilos y monocitos en los sitios de infección, los leucocitos activados liberan
péptidos antimicrobianos, especies reactivas de oxígeno y especies de nitrógeno
antiinflamatorio, los cuales tienen una actividad pro inflamatoria y que el complejo
calprotectina tiene la capacidad de eliminar y neutralizar (Hsu, y otros, 2009).
Funciones intracelulares.
Diferenciación celular y respuesta inflamatoria
El complejo intracelular S100A8/A9 (Calprotectina), tiene distintos tipos de función
dependiendo con el tipo de célula que interaccione. En el caso de las células progenitoras
hematopoyéticas su proliferación y maduración pueden verse reguladas mediante la
variación de la concentración del complejo S100A8/A9, produciéndose específicamente
una inhibición de la caseína quinasa I y II, enzimas que fosforilan la topoisomerasa I y la
ARN polimerasa I y II (Murao, 1989). En células mieloides inmaduras el aumento de la
concentración de S100A9 inhibe la diferenciación de células dendríticas y macrófagos
(Cheng, 2008).
Una repuesta a nivel mieloide a la proteína S100A9 lleva a una producción mejorada
de células supresoras de origen mieloide (MDSC) (Cheng, 2008). Las MDSC provocan
un aumento de la tolerancia inmune al suprimir la activación de las células T CD4 y CD8
debido a una regulación del metabolismo del aminoácido esencial L-arginina mediante
la arginasa I y el óxido nítrico sintasa 2 (NOS-2) por parte de los MDSC, estas enzimas
además de tener un papel inmunodepresor pueden hacer sinergia con moléculas de
peroxinitritos y provocar apoptosis en las células T (Hsu, y otros, 2009). Provocando de
este modo una modulación del sistema inmunológico hacia la tolerancia y por ende a la
disminución de la inflamación (Hsu, y otros, 2009).
13
Funciones antimicrobianas.
La calprotectina posee directamente actividad antimicrobiana a nivel extra como
intracelular debido a su propiedad quelante para secuestrar a los metales zinc, calcio y
manganeso, las células que expresan calprotectina como el caso de los queratinocitos que
expresan este complejo se adhieren 3 veces menos e internalizan 10 veces menos
bacterias invasivas en comparación a las células que no expresan dicho complejo. Esta
actividad está relacionada directamente con la unión del calcio a la porción de S100A9
dentro del tetrámero de calprotectina y mas no de la interacción de la superficie celular
con los antígenos (Kenneth Hsu et al., 2009). Sin embargo, la proteína S100A8 sí que se
ve estimulada a ser expresada por el contacto extracelular de moléculas bacterianas y por
antígenos virales (Hsu, y otros, 2009).
Las células que expresan calprotectina generalmente son menos invadidas por
patógenos. A pesar de esto Listeria, un patógeno invasivo celular parece inhibir esta
actividad mediante la translocación de S100A8/A9 intracelular a microtúbulos y se ha
determinado que cuando la calprotectina se colocaliza con tubulina los queratinocitos
contienen más Listeria intracelular que en las células sin colocalización con tubulina
(Zaia, 2009). En estudios in vitro se ha observado la neutralización de la actividad
antimicrobiana de la calprotectina contra la Listeria en presencia de microtúbulos
polimerizados (Zaia, 2009).
Protección extracelular.
Liberación de calgranulinas
Para la liberación de la calprotectina del medio citoplasmático al espacio extracelular
tanto en monocitos como en neutrófilos depende de la interacción entre los productos
bacterianos como el lipopolisacárido y la membrana celular. Otro factor a cumplirse es
la activación de la proteincinasa C inducida por tetradecanoil forbol acetato (PMA), lo
cual requiere de una red de tubulina completamente funcional, además de una unión al
lípido especifico de la membrana plasmática para la translocación a la superficie y
liberación de la célula (Hsu, y otros, 2009).
14
Infección e inflamación
Durante procesos de infección celular la liberación de calprotectina puede ser
señalizada por la activación de la proteína cinasa C, elevación de calcio intracelular,
estímulos pro inflamatorios o por contacto con endotelio activado. Específicamente el
lipopolisacárido bacteriano, así como la molécula de del complemento C5a causan una
rápida liberación de S100A8 y S100A9 de neutrófilos y monocitos en un proceso activo
dependiente de tubulina. Como acción antiinflamatoria el complejo calprotectina inhibe
el estallido oxidativo espontáneo, posiblemente mediado por los receptores de adenosina
P1 y por la liberación de ácido araquidónico al endotelio mediante la captación mediada
por CD36 con lo que se estabiliza y protege el leucotrieno A de procesos de hidrolisis,
por lo que de este modo aumenta la disponibilidad de leucotrienos bioactivos (Rector,
2009). In vitro las calgranulinas en contacto pueden ejercer sus efectos antimicrobianos
directamente con un amplio espectro que incluyen bacterias como Capnocytophaga
sputigena, Cándida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermis, Borrelia burgdorferi y Listeria monocytogenes (Kenneth Hsu et al., 2009).
Sin embargo, in vitro se ha observado que el complejo calprotectina estimula el
crecimiento de Mycobacterium tuberculosis y también promovería la actividad
transcripcional del VIH-1 y la replicación viral en los linfocitos T CD4 infectados y la
regulación positiva de estos genes S100 en monocitos estimulados por dsRNA
potenciaría este efecto (K Hsu, 2005).
El uso de zinc y manganeso en las vías metabólicas de las bacterias mencionadas
anteriormente son indispensables para el su crecimiento, por lo que a este nivel la
calprotectina cumpliría procesos de quelación, secuestrando estos metales del medio e
inhibiendo el crecimiento bacteriano. La cantidad de calprotectina liberada depende del
número de neutrófilos que hayan sido reclutados durante el proceso inflamatorio o
infeccioso, ya que durante la muerte de los neutrófilos se libera gran cantidad de la
calprotectina intracelular (Hsu, y otros, 2009).
En los fluidos de las mucosas existen gran cantidad de calgranulinas que pueden
contribuir a limitar el crecimiento de los organismos comensales y prevenir la intrusión
de patógenos. La calprotectina, se encuentra en las secreciones de las vías respiratorias
15
humanas, en el fluido gingival y en las bolsas periodontales. Además, la calprotectina es
prominente en los abscesos de la mucosa en asociación con la candidiasis, también se
expresan en mucosa gástrica inflamada de niños infectados con Helicobacter pylori, pero
no en mucosa normal. Por lo tanto, las calgranulinas pueden servir como proteínas
antimicrobianas innatas para limitar las infecciones en las superficies mucosas (Hsu, y
otros, 2009).
La concentración que tome el medio extracelular de complejo calprotectina dependerá
mucho de las acciones que desencadene a nivel extracelular, por un lado, ya se detallado
sus actividades antinflamatorias y antimicrobianas, sin embargo, se debe considerar que
dichas propiedades antiinflamatorias se producen a concentraciones de calprotectina
liberadas por macrófagos activados en el orden superior a los pico moles, a nivel pico
molar las funciones que desencadena la calprotectina en el proceso de protección al
huésped son de carácter pro inflamatorio, que incluso el complejo calprotectina seria
tomado como un marcador de inflamación (Hsu, 2009). A nivel pico molar el complejo
calprotectina cumple con la función de agente quimiotáctico para neutrófilos y células
tumorales, por lo que, se le considera como un facilitador de la invasión de células
tumorales (Donato, 2013). Mediante la vía de proteína cinasas activadas por mitógenos
p38 (vía p38 MAPK) y el factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las
células B activadas (NF-κB), se puede activar a los monocitos y macrófagos para la
secreción citosinas pro inflamatorias y mediante la producción de factores pro
inflamatorios mediadas por el receptor de producto final de glicación avanzada (RAGE),
se podría desencadenar el desarrollo de tumores, como en el caso de la unión de
moléculas de glicanos carboxilados al receptor RAGE en el cáncer de colon (Donato,
2013).
2.2.2. Mucosa intestinal.
La mucosa intestinal está compuesta por una capa de células epiteliales columnares
simples, la lámina propia subyacente y la mucosa muscular por debajo de estas dos. La
mucosa intestinal representa una importante barrera selectiva del contenido luminal que
ingresa hacia el interior del organismo. Protege a manera de contención de moléculas
antigénicas de distintos orígenes (alimentarias, microorganismos, toxinas) a la par de que
16
mantiene activa la capacidad de absorción de nutrientes del espacio luminal (Peakman &
Vergani, 2011).
Figura 2. Estructura de la mucosa intestinal del intestino delgado. Sepúlveda J.
(2014), Atlas de Histología Biología celular y tisular. Figura. Recuperado de
https://accessmedicina.mhmedical.com.
Sistema inmunitario de la mucosa intestinal.
En el ser humano la mayor cantidad de tejido linfoide pertenece al tejido linfoide
asociado a la mucosa intestinal (GALT), la cual participa de manera potencial en el
equilibrio inmunológico del ser humano. La respuesta inmunitaria intestinal se ve
regulada por la acción que ocurre en los tejidos linfoide en forma de agregados como los
folículos asociados a las placas de Peyer y en los ganglios linfáticos mesentéricos,
además, también se puede desarrollar en los tejidos linfoides difusos en la lámina propia
de la mucosa o en el epitelio intestinal (Borruel , 2003).
El intestino delgado cuenta con 250 placas de Peyer formado por un agregado folicular
y miles de folículos solitarios, los cuales en el colon están en mayor proporción., los
17
folículos de la placa de Peyer están asociados a un tipo de células especializadas llamadas
células microfold o células M, las cuales cumplen con el transporte de los antígenos hacia
el tejido linfoide (Borruel , 2003). Continuamente el intestino se encuentra procesando
una serie de antígenos de la luz intestinal lo cual provoca una alta activación a los
folículos linfoides de la mucosa (Borruel , 2003).
Figura 3. Estructura anatómica del tejido linfoide mucoso del intestino delgado.
Peakman M. (2011). Inmunología Básica y Clínica. Figura. Recuperado de
https://books.google.com.ec.
Cuando se produce la activación por contacto con un antígeno los linfocitos T y B que
se encuentran en las placas de Peyer adyacentes a las células M se multiplican a manera
de clones, los cuales ingresan a torrente sanguíneo y de ahí regresan nuevamente hacia
la lámina propia (Borruel , 2003). En la lámina propia se encuentran linfocitos T CD4 y
células B las cuales se transforman en células plasmáticas secretoras de IgA, cual tiene
la propiedad de resistir la proteólisis intestinal y no activa la vía del complemento
(Borruel , 2003).
La tolerancia intestinal se mantiene en una constante armonía entre los antígenos
alimentarios, bacterianos de la propia flora comensal y los mecanismos de tolerancia
18
inmunológica, este equilibrio mantiene al intestino sin procesos patológicos, lo cual se
conoce como inflamación fisiológica (Borruel , 2003).
2.2.3. Calprotectina fecal.
La calprotectina fecal es una proteína tetramérica formada por un complejo de
proteínas S100, específicamente un complejo de 36,5 Kd formado por proteínas S100A8
Y S100A9. El complejo calprotectina está presente en neutrófilos, monocitos y
macrófagos en una concentración de alrededor del 60% de sus proteínas solubles. En
procesos patológicos gastrointestinales de origen orgánico (infección, inflamación o
tumoral) se induce un aumento de la permeabilidad de la mucosa intestinal provocando
una mayor migración de granulocitos y monocitos hacia la luz intestinal. Una vez en la
luz intestinal los neutrófilos y monocitos desencadenan una serie de acciones
antibacterianas y pro inflamatorias en respuesta al origen de la patología gastrointestinal
orgánica, dentro de las cuales, se encuentra la liberación de calprotectina al lumen
intestinal. La concentración de calprotectina fecal en procesos inflamatorios permite
discriminar los procesos de la patología inflamatoria de la funcional (Hsu, y otros, 2009).
En los procesos inflamatorios crónicos del tracto intestinal de tipo autoinmune en la
enfermedad inflamatoria intestinal provoca una alteración de capa mucosa del
intestino. El epitelio intestinal evita la entrada de bacterias o antígenos en la circulación
mediante uniones intracelulares selladas. En la enfermedad inflamatoria intestinal, estas
uniones están defectuosas debido a una falla de la función de barrera primaria o como
resultado de una inflamación severa. Las reacciones inflamatorias excesivas conducen a
un deterioro continuo del epitelio y una mayor exposición a los microbios intestinales, lo
que aumenta el empeoramiento de la inflamación. Esta alteración o destrucción de la
mucosa intestinal desencadena la infiltración de neutrófilos polimorfonucleares hacia la
submucosa, dicho proceso desencadena el cruce de los neutrófilos polimorfonucleares
hacia el lumen intestinal, una vez en el espacio intestinal los neutrófilos al morir liberan
cantidades considerables de calprotectina, la cual es un indicador de este proceso
inflamatorio que se produce en la enfermedad inflamatoria intestinal (Hsu, y otros, 2009).
19
Figura 4. Liberación de calprotectina por neutrófilos hacia la luz intestinal en
respuesta a un proceso inflamatorio. Tarbet A, (2016). De-escalating Inflammatory
Bowel Disease Therapies. Recuperado de https://www.alpco.com.
Enfermedad inflamatoria intestinal.
La enfermedad inflamatoria intestinal abarca dos tipos de enfermedades
gastrointestinales idiopáticas las cuales se limitan a distintas partes del tracto
gastrointestinal. Así la enfermedad inflamatoria intestinal se divide en dos grupos
principales:
Colitis ulcerosa
Enfermedad de Crohn
20
La colitis ulcerosa se caracteriza por estar limitada al colon y por provocar daño
únicamente en la capa submucosa, por otro lado, la enfermedad de Crohn afecta cualquier
segmento del tracto gastrointestinal y provoca daño a nivel de toda la barrera intestinal,
ambas enfermedades se caracterizan por provocar inflamación recurrente de los
segmentos intestinales y por desarrollar diversas manifestaciones clínicas
gastrointestinales (Peakman & Vergani, 2011).
Figura 5.Distribución anatómica de la enfermedad inflamatoria intestinal. Estructura
anatómica del tejido linfoide mucoso del intestino delgado. Rajalakshmi V. (2018).
Inflammatory Bowel Disease. Figura. Recuperado de https://www.myupchar.com.
La colitis ulcerosa como la enfermedad de Crohn no presenta asociación en cuanto al
sexo, sin embargo, se ha observado que es más frecuente en pacientes caucásicos que en
afrodescendientes, por otro lado la mayor incidencia se encuentra en pacientes de 15 a
35 años de edad y se ha observado que en los países industrializados su incidencia
aumenta (Peakman & Vergani, 2011).
La asociación de la enfermedad con factores genéticos se ha demostrado mediante la
agrupación familiar y la mayor frecuencia de desarrollar la enfermedad en gemelos
univitelinos que en bivitelinos. Estas asociaciones genéticas están más presentes con un
21
50% de los casos para enfermedad Crohn que en la colitis ulcerosa con un 10% (Peakman
& Vergani, 2011). Mediante estudios de marcadores de microsatelites se ha identificado
que una mutación en el gen NOD2 del cromosoma 16 es un factor predisponente para la
enfermedad de Crohn (Peakman & Vergani, 2011).
Los estudios en ratones de laboratorio han demostrado que la enfermedad de Crohn
no se desarrolla o se desarrolla en menor medida, en ratones criados en medios asépticos,
los cuales en su tracto intestinal no cuentan con una colonización bacteriana (Peakman
& Vergani, 2011).
Anatomía patológica.
En la colitis ulcerosa se produce afectación de la mucosa del colon, lo cual desarrolla
un colon ulcerado, hiperémico y hemorrágico. El íleon se encuentra inflamado e
hiperémico, el mesenterio y los ganglios linfáticos del mesenterio con eritema. La
mucosa superficial se encuentra destruida y se produce una infiltración de neutrófilos
polimorfonucleares en la submucosa. Las lesiones penetran en la submucosa y muscular
provocando fisuras y fistulas (Peakman & Vergani, 2011).
En la enfermedad de Crohn el proceso inflamatorio es por segmentos a lo largo de
tracto gastrointestinal mientras que en la colitis ulcerosa se desarrolla de manera continua
a lo largo del colon, los granulomas son exclusivos de la enfermedad de Crohn en el 50
a 60% de los casos (Peakman & Vergani, 2011).
Patogenia.
Una respuesta exagerada hacia la flora bacteriana comensal desencadenaría los
procesos inflamatorios intestinales con la presencia de linfocitos TH1 en la enfermedad
de Crohn y de linfocitos TH2 en la colitis ulcerosa (Peakman & Vergani, 2011). En la
enfermedad de Crohn se produce una liberación elevada de IL-12 por los macrófagos y
de IFN-ϒ por los linfocitos T, el tratamiento con anticuerpos contra IL-12 provocan una
elevada mejoría en el paciente, lo que evidencia la vinculación de la IL-12 en el proceso
inflamatorio (Peakman & Vergani, 2011).
22
En la colitis ulcerosa, aunque no se encuentra elevada la IL-4 característica de
linfocitos TH2 la IL-5 si se encuentra elevada, además de la asociación de los linfocitos
TH2 con la presencia de anticuerpos anticitoplasma de neutrófilo con tinción perinuclear
clásica y anticuerpos antitropomiosina (Peakman & Vergani, 2011). La evidencia en pro
a un defecto en los linfocitos T CD4 CD25 responsables de la regulación inmunitaria
cada vez aumenta, este fallo celular desempeñaría un papel permisivo en la producción
de ambas patologías gastrointestinales (Peakman & Vergani, 2011).
Manifestaciones clínicas.
En la siguiente tabla se resumen los principales síntomas y hallazgos de laboratorio
en la colitis ulcerosa.
Tabla 1. Principales síntomas y hallazgos de laboratorio en la colitis ulcerosa.
Síntomas Hallazgo de laboratorio clínico
Diarrea sanguinolenta Anemia
Dolor abdominal Leucocitosis
Fiebre Aumento de velocidad de
sedimentación
Pérdida de peso Aumento de proteína c reactiva
Presencia de pANCA ( en el 70 % de
pacientes con colitis ulcerosa)
Recuperado de Peakman & Vergani (2011)
En la siguiente tabla se resumen los principales síntomas y hallazgos de laboratorio
en la enfermedad de Crohn.
23
Tabla 2. Principales síntomas y hallazgos de laboratorio en la Enfermedad de Crohn.
Síntomas Hallazgo de laboratorio clínico
Fiebre Anemia
Dolor abdominal Anemia de las enfermedades crónicas
Diarrea a menudo sin sangre Ferropenia
Astenia Déficit de vitamina B12
Déficit de folato
Leucocitosis
Aumento de la velocidad de
sedimentación
Hipoalbuminemia
Desequilibrio electrolítico en presencia
de diarrea crónica
Proteína C reactiva (como marcador de
seguimiento de la enfermedad)
Trombocitosis
Recuperado de Peakman & Vergani (2011)
24
Diagnóstico.
El patrón de oro en las enfermedades inflamatorias intestinales son procesos
endoscópicos, además de pruebas claves de radiología e histológicos. En el diagnóstico
de enfermedad inflamatoria intestinal el protocolo es la realización de colonoscopía con
biopsia y una gammagrafía de leucocitos marcados, ambas técnicas invasivas lo cual
implica un riesgo implícito y de posibles complicaciones por irradiación y en el caso de
la colonoscopia en pacientes pediátricos requiere administración de anestesia general
(Bonnín Tomàs, Vila Vidal, & Rosell Camps, 2007).
Los parámetros bioquímicos de inflamación usados clásicamente, como la velocidad
de sedimentación globular y la proteína C reactiva, carecen de suficiente especificidad o
sensibilidad diagnóstica.
La determinación de calprotectina fecal en los últimos años ha tomado notoriedad
como marcador útil de enfermedad inflamatoria intestinal, en diversos estudios se
demuestra la asociación de niveles de calprotectina y el grado de inflamación intestinal,
lo cual demuestra su uso en el monitoreo y evaluación de la respuesta al tratamiento de
enfermedad inflamatoria intestinal (Bonnín Tomàs, Vila Vidal, & Rosell Camps, 2007).
Importancia clínica de la calprotectina fecal.
La importancia clínica de la calprotectina fecal yace en la relación que se establece
entre el punto de corte de 50 µg/g. Los valores superiores a este se considera que el origen
de la enfermedad intestinal es inflamatorio, cabe mencionar que el descarte de
enfermedades infecciosas es el primer paso antes de usar a la calprotectina fecal como
marcador inflamatorio, en la discriminación entre enfermedad inflamatoria intestinal y
enfermedad funcional. Esto se debe a que la calprotectina fecal en procesos infecciosos
también se encuentra elevada por encima del punto de corte, provocado por el
reclutamiento de neutrófilos en procesos infecciosos (Bonnín Tomàs, Vila Vidal, &
Rosell Camps, 2007).
En un estudio realizado con 47 pacientes pediátricos comprendidos entre los 3 meses
y 15,3 años, con sintomatología de posible patología gastrointestinal orgánica se les
realizó determinación de calprotectina fecal. Siguiendo los criterios de Roma para
25
patología funcional intestinal se realizaron pruebas de laboratorio, de imagen y
endoscópicas (Bonnín Tomàs, Vila Vidal, & Rosell Camps, 2007). Los resultados fueron
analizados y el diagnostico se resume en la siguiente tabla.
Tabla 3. Resultados del diagnóstico de 47 pacientes pediátricos
Diagnóstico
Número de pacientes
Patología intestinal funcional 13
Enfermedad intestinal orgánica 34
Recuperado de Bonnín A. y otros. (2007)
Dentro de la patología orgánica se diagnosticaron 15 pacientes con enfermedad
inflamatoria intestinal y 19 pacientes restantes se les diagnosticó enfermedad orgánica
de origen no inflamatorio (colitis infecciosas, alergias alimentarias) (Bonnín Tomàs, Vila
Vidal, & Rosell Camps, 2007). En el siguiente cuadro se resume el diagnóstico definitivo
de los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal.
Tabla 4. Diagnóstico definitivo de los pacientes con enfermedad inflamatoria
intestinal
Diagnóstico
Número de pacientes
Colitis ulcerosa 3
Enfermedad de Crohn 12
26
Recuperado de Bonnín A. y otros. (2007)
Los resultados de medición de calprotectina fecal en los pacientes con enfermedad
inflamatoria intestinal resulto ser bastante mayor que en los pacientes con enfermedad
intestinal funcional. Los pacientes con enfermedad orgánica de origen no inflamatorio
también presentaron resultados mayores a los de enfermedad funcional (Bonnín Tomàs,
Vila Vidal, & Rosell Camps, 2007). En el siguiente cuadro se observan las
concentraciones medias de calprotectina fecal para cada diagnóstico.
Tabla 5. Concentraciones medias de calprotectina fecal en distintas enfermedades
gastrointestinales
Enfermedad
inflamatoria
intestinal
Enfermedad
Orgánica no
inflamatoria
Enfermedad
funcional
Control
Número de
pacientes
12 18 13 13
Mediana de
concentración de
calprotectina
fecal µg/g
1218,9 112,6 20,0 19,2-32,5
Recuperado de Bonnín A. y otros. (2007)
Según la concentración de calprotectina fecal y el tipo de patología gastrointestinal en
la figura 6 se puede analizar que en el caso de las patologías de origen inflamatorio como
la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn posee una concentración muy por encima
del valor de corte de 50 µg/g. Para el caso de enfermedad funcional se puede observar
que no cruzan el valor de corte de 50 µg/g, al igual que los pacientes control. La figura 6
demuestra la capacidad diagnóstica de la calprotectina fecal con un punto de corte de 50
µg/g en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal, en los cuales se haya
descartado una enfermedad de origen infecciosa o intoxicación alimentaria (Bonnín
Tomàs, Vila Vidal, & Rosell Camps, 2007).
27
Figura 6. Distribución del número de pacientes con diferentes diagnósticos de
enfermedad gastrointestinal y la concentración de calprotectina fecal. La línea en 50 µg/g
representa el punto de corte para enfermedad inflamatoria intestinal. Bonnín A. (2007).
Calprotectina fecal como marcador diferencial entre patología gastrointestinal orgánica
y funcional. Figura. Recuperado de http://scielo.isciii.es.
Diferenciación entre enfermedad inflamatoria intestinal y síndrome de intestino
irritable.
Los pacientes con síndrome de intestino irritable o enfermedad inflamatoria intestinal
a menudo tienen síntomas en común, como dolor abdominal, distensión abdominal y
diarrea. Los estudios iniciales de calprotectina fecal se centraron en su capacidad para
distinguir entre estas dos condiciones en pacientes referidos a los departamentos de
gastroenterología de la atención primaria (Walsham & Sherwood, 2016). En un estudio
de 602 pacientes consecutivos que asistieron a una clínica de gastroenterología en el
King's College Hospital (Londres, Reino Unido), a los pacientes se les midió la
calprotectina fecal y se los evaluó mediante el cuestionario Roma (cuestionario para la
evaluación de enfermedades funcionales), la calprotectina fecal tuvo 89% de sensibilidad
y 79% de especificidad para la detección de la enfermedad intestinal orgánica. La
sensibilidad de un cuestionario de Roma positivo para el síndrome de intestino irritable
fue del 85% con una especificidad del 71%, sin embargo, la combinación de ambos tuvo
un valor predictivo para enfermedad inflamatoria intestinal que se aproxima al 100%
(Walsham & Sherwood, 2016).
28
Gisbert y McNicholl estudiaron datos de 2,475 pacientes y obtuvieron una
sensibilidad media del 83% y una especificidad del 84% para la calprotectina para
distinguir la enfermedad orgánica y la no orgánica, la precisión diagnóstica fue mayor
para enfermedad de Crohn con una de sensibilidad de 83% y especificidad del 85% en
comparación con colitis ulcerosa con una sensibilidad 72%, especificidad 74%. von
Roon et al analizaron 30 estudios con un total de 5,983 pacientes y se encontró una
sensibilidad del 95% y una especificidad del 91% (Walsham & Sherwood, 2016).
Un reciente metaanálisis de calprotectina fecal en estudios pediátricos los cuales
incluyeron nueve estudios con un total de 853 paciente, informó una sensibilidad del 97%
con una especificidad del 70%, usando un valor de corte de 50 µg / g, se habrían
producido 17% de resultados falsos positivos y 2% falsos negativos (Walsham &
Sherwood, 2016).
La incorporación de calprotectina en la consideración de la necesidad de una
endoscopia habría permitido una reducción del 67% en las endoscopias a expensas del
6% de los casos con diagnóstico diferido de enfermedad inflamatoria intestinal debido a
un resultado falso negativo, la especificidad fue significativamente menor en los niños
en comparación con los adultos para la misma sensibilidad en niños fue del 76% y en
adultos del 96% (Walsham & Sherwood, 2016).
Evaluación de la actividad de la enfermedad.
Se ha demostrado que la calprotectina diferencia entre enfermedad inflamatoria
intestinal activa e inactiva. Varios estudios han relacionado la calprotectina fecal con la
actividad de la enfermedad evaluada endoscópicamente, en un estudio en pacientes con
enfermedad inflamatoria intestinal, la calprotectina fecal se correlacionó bien con la
actividad de la enfermedad endoscópica medida con el índice de Rachmilewitz =
0,834. En otro estudio similar en la colitis ulcerosa, pero utilizando el índice de barón
modificado, también encontró que la calprotectina fecal se correlacionó mejor con la
actividad de la enfermedad endoscópica que la PCR, con un r = 0,821 y 0,556
respectivamente (Walsham & Sherwood, 2016).
29
Evaluación de la respuesta al tratamiento.
El objetivo del tratamiento en la enfermedad inflamatoria intestinal es asegurar y
mantener la remisión, con el objetivo final de lograr la curación de la mucosa,
el tratamiento farmacológico incluye esteroides, amino salicilatos, tiopurinas,
metotrexato, inmunosupresores y anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral
alfa. La evaluación de la eficacia del tratamiento se ha basado tradicionalmente en el
alivio subjetivo de los síntomas, puntuaciones clínicas como el Índice de Actividad de la
Enfermedad de Crohn (CDAI) y el Índice de la Actividad de la Colitis Ulcerosa
(UCDAI), y los cambios en la concentración de PCR. Roseth et al realizaron
colonoscopias en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal en remisión clínica y
encontraron que, en 38 de 45 pacientes con histología normal, la concentración de
calprotectina fecal estaba dentro del rango de referencia. Un estudio posterior en
pacientes con EC encontró que una calprotectina <250 µg / g identificó la curación de la
mucosa con una sensibilidad del 94% y una especificidad del 62% (Walsham &
Sherwood, 2016).
Predicción de la recaída de la enfermedad.
Varios estudios han informado que la calprotectina fecal puede predecir la recaída de
la enfermedad inflamatoria intestinal en los siguientes 12 meses en pacientes en
remisión. Costa et al demostraron un riesgo 14 veces mayor de recaída en pacientes con
colitis ulcerosa si la calprotectina era > 150 g / g, pero esto no era cierto para los pacientes
con enfermedad de Crohn (Walsham & Sherwood, 2016).
2.2.4. Pruebas de diagnóstico.
El diagnóstico de una determinada patología es la base de la práctica médica, en el
proceso del diagnóstico se hace uso de pruebas diagnósticas las cuales son procesos que
determinan si un determinado individuo padece o no una enfermedad (Delgado
Antequera, 2015). Las pruebas diagnósticas se las realiza con los siguientes propósitos:
Proporcionar información fiable acerca de la condición de un individuo.
Incidir en el tratamiento del individuo.
30
Proponer mecanismos de la enfermedad y su curso a través de procesos
investigativos.
La utilidad clínica de determinada prueba yace en que nos permita diferenciar dos o
más condiciones las cuales podrían ser confusas (Delgado Antequera, 2015). Las pruebas
de diagnóstico se clasifican en:
Binarios: Pruebas de diagnóstico con dos posibles resultados, uno positivo que
indica la presencia de un evento y uno negativo la cual indica la ausencia del
evento en el paciente. El evento puede ser de origen patológico o de estado
fisiológico.
Cuantitativos: Pruebas expresadas en valores numéricos, los cuales guardan su
proporción con el estado del paciente.
Ordinales: Pruebas expresadas en valores ordinales, estas pruebas permiten
clasificar la presencia de una patología de la siguiente forma definitivamente
no, probablemente no, probablemente sí, definitivamente sí.
(Delgado Antequera, 2015)
Para la interpretación de una prueba de diagnóstico hay que tomar en cuenta tres
factores:
La capacidad de la prueba para distinguir entre sanos y enfermos.
Las características del paciente.
Las condiciones ambientales en las que se realizó el análisis.
(Delgado Antequera, 2015)
En los estudios de pruebas diagnósticas la determinación de la existencia de sesgo en
el diseño proporciona su grado de validez, una vez confirmada su validez se analiza la
adecuada interpretación de los resultados, dichos resultados deben ser arrojados bajo las
condiciones pre establecidas para que estos tengan utilidad clínica. La certeza absoluta
31
de un resultado es inalcanzable independientemente de las técnicas y número de
determinaciones que se realicen, por lo que, el objetivo es reducir la incertidumbre lo
suficiente como para tomar una decisión clínica confiable (Delgado Antequera, 2015).
En la medición de utilidad de una prueba diagnóstica, uno de los factores que
intervienen en el diagnóstico es medir la exactitud de dos test diagnósticos, para esto es
necesario tener un estimador insesgado de la exactitud del test, por lo que el diagnóstico
definitivo del paciente en este tipo de estudios es un buen estimador insesgado (Delgado
Antequera, 2015). El conocido procedimiento llamado Gold standard permite conocer el
estado real del individuo. Se debe tomar en cuenta que no siempre es factible la
realización de este tipo de pruebas ya que suelen tratarse de pruebas invasivas, esto
genera un problema conocido como problema de la verificación parcial de la enfermedad
(Delgado Antequera, 2015).
Parámetros de una prueba de diagnóstico.
La calidad de la prueba de diagnóstico binario se mide por su capacidad para
discriminar dos condiciones (sano o enfermo) en las que se puede encontrar un individuo
(Delgado Antequera, 2015). El potencial de una prueba se puede cuantificar con medidas
como:
Sensibilidad y especificidad
Valores predictivos
Razones de verosimilitud
Área bajo una curva ROC
Índice de Youden
Odds-Ratio
Dependiendo de la medida de calidad se pueden valorar aspectos de discriminación
del estado de un paciente y la capacidad de predecir la probabilidad de que un individuo
padezca o no una enfermedad (Delgado Antequera, 2015). Es importante considerar que
32
estos valores varían en función de la población y de la prevalencia de la enfermedad, por
lo que, es importante conocer cómo interpretar estos datos y bajo qué condiciones se
realiza el estudio (Delgado Antequera, 2015).
Sensibilidad y especificidad.
Las probabilidades de acierto de una prueba de diagnóstico son sintetizadas en dos
medidas, la sensibilidad y especificidad.
La sensibilidad de una prueba es la probabilidad de que un resultado del test es
positivo cuando el individuo está enfermo. Así:
Se =Vp
Vp + Fn
Donde:
Se: Sensibilidad
Vp: Verdaderos positivos
Fn: Falsos negativos
Al acierto que hace referencia la sensibilidad se denomina verdadero positivo.
La especificidad es la probabilidad de que el resultado de una prueba sea negativo
cuando el individuo no está enfermo. Así:
Sp =Vn
Vn + Fp
Donde:
Se: Sensibilidad
Vn: Verdaderos negativos
Fp: Falsos positivos
33
Al acierto al que hace referencia la especificidad se le denomina verdadero negativo.
Según estas definiciones resulta más útil para descartar la enfermedad cuanto menor
sea la probabilidad de un falso negativo, es decir, cuanto mayor sea la sensibilidad.
Mientras que, utilizaremos la prueba para confirmar la enfermedad cuanto mayor sea la
especificidad, lo que indicará una menor probabilidad de falso positivo (Delgado
Antequera, 2015).
Valores predictivos positivos y negativos.
La sensibilidad y la especificidad proporcionan información sobre la posibilidad de
obtener un resultado concreto en función de la verdadera condición del individuo, sin
embargo, en la práctica, no se conoce. Cuando el resultado ya sea este positivo o negativo
es útil conocer cuál es la probabilidad de que realmente esta sea la verdadera condición
del individuo. Para esto resulta útil la determinación de los valores predictivos (Delgado
Antequera, 2015).
El valor predictivo positivo es la probabilidad de padecer la enfermedad si el resultado
del test es positivo. Por el Teorema de Bayes, esta probabilidad se interpreta como la
proporción entre los resultados verdaderos positivos sobre los resultados positivos del
test (Delgado Antequera, 2015). Así:
Vpp =Vp
Vp + Fp
Donde:
Vpp: Valor predictivo positivo
Vp: Verdaderos positivos
Fp: Falsos positivos
El valor predictivo negativo (VPN) es la probabilidad de que un sujeto cuyo test ha
resultado negativo, esté realmente sano.
34
Vpn =Vn
Vn + Fn
Donde:
Vpn: Valor predictivo negativo
Vn: Verdaderos negativos
Fn: Falsos negativos
Ambas medidas pueden depender de la prevalencia de la enfermedad si se calculan a
partir de sensibilidad, especificidad y prevalencia de la enfermedad (Delgado Antequera,
2015).
Razones de verosimilitud.
Debido a que los valores predictivos son influenciados por valores de prevalencia no
es recomendable usarlos para comparar dos métodos diagnósticos. La determinación de
índices que no dependan de la prevalencia es necesaria y se los conoce como razones de
similitud, los cuales miden cuanto es más probable un resultado positivo o negativo según
la presencia o ausencia de la enfermedad (Delgado Antequera, 2015).
Razón de verosimilitud positiva es el cociente entre la probabilidad de que el resultado
del test sea positivo en pacientes enfermos y la probabilidad de que el resultado sea
positivo en pacientes sanos (Delgado Antequera, 2015). Así:
LR+ =Se
1 − 𝑆𝑝
Donde:
LR+: Razón de verosimilitud positiva
Se: Sensibilidad
Sp: Especificidad
35
Razón de verosimilitud negativa es el cociente entre la probabilidad de que el
resultado del test sea negativo en pacientes enfermos y la probabilidad de que el resultado
sea negativo en pacientes sanos (Delgado Antequera, 2015). Así:
LR−=1 − Se
𝑆𝑝
Donde:
LR-: Razón de verosimilitud positiva
Se: Sensibilidad
Sp: Especificidad
Esta medida relaciona la sensibilidad y especificidad, y como no depende de la
prevalencia, se puede utilizar para la comparación de pruebas en un mismo diagnóstico
(Delgado Antequera, 2015).
Índice de Youden.
El índice de Youden es la suma de la sensibilidad y especificidad menos la unidad.
Así:
J = Se + Sp − 1
Donde:
J: Índice de Youden
Se: Sensibilidad
Sp: Especificidad
Las pruebas diagnósticas deben poseer un índice de Youden mayor a 0, si el índice es
0 la sensibilidad y la especificidad son complementarios, y si su valor es menor a 0
36
entonces los resultados de la prueba deben intercambiarse, el resultado positivo es en
realidad el negativo y viceversa (Delgado Antequera, 2015).
Estimación bajo un muestreo transversal.
El estudio de muestreo transversal es aquel en el cual se aplica la prueba diagnóstica
a evaluar y la prueba gold standard a cada uno de los individuos que forman parte del
tamaño muestral aleatorio. En dichos estudios podemos conocer la presencia o ausencia
de determinado analíto mediante el conocimiento previo de un punto de corte en la
técnica considerada gold standard, el cual nos permitirá estimar sin sesgos los resultados
de pruebas binarias (Delgado Antequera, 2015).
De esta forma se conoce los verdaderos resultados determinados por la prueba gold
standard, con lo cual se realizará la estimación del potencial diagnóstico de la prueba
binaria (Delgado Antequera, 2015).
2.2.5. Comparación de pruebas diagnósticas.
El nivel de concordancia y de correlación son determinados a partir de un cálculo
estadístico, en el que se comparan los aciertos de una técnica con respecto a la técnica
estándar en el caso de la concordancia y en el caso de correlación la medición de la
tendencia en el que las determinaciones tienden a ser las mismas. Estos coeficientes nos
ayudan a tener una idea del grado de similitud entre las técnicas (Delgado Antequera,
2015).
Concordancia entre técnicas.
El análisis de concordancia nos permite conocer mediante la estadística el nivel de
similitud de los resultados emitidos entre una técnica a evaluar y una técnica estándar. El
resultado de la concordancia se pondera de –1 a 1, mientras más se acerque el valor de
concordancia a 1 la similitud de los resultados será mayor, en la presente investigación
se hará uso del coeficiente de concordancia Kappa de Cohen que se describe a
continuación (Delgado Antequera, 2015).
37
Coeficiente Kappa de Cohen.
El uso de herramientas estadísticas para la comparación de técnicas nos permite
conocer si los resultados concuerdan o están correlacionados entre sí. La estadística
kappa de Cohen mide la confiabilidad entre determinaciones por varias técnicas. La
confiabilidad o precisión entre determinaciones ocurre cuando los datos ofrecidos entre
técnicas otorgan el mismo resultado o poseen un determinado grado de concordancia
(Minitab, 2019).
Kappa es un coeficiente en la que se expresa la relación entre la proporción de veces
en que los resultados de las técnicas concuerdan y la proporción máxima de las veces que
estas técnicas podrían concordar, este coeficiente corrige la concordancia que se puede
producir en base a las probabilidades (Minitab, 2019).
Se puede calcular la kappa de Cohen cuando los datos cumplen lo siguiente:
Para calcular el kappa de Cohen por evaluador se debe realizar 2 ensayos por
evaluador.
Para calcular el kappa de Cohen entre evaluadores se debe contar con 2
evaluadores con 1 ensayo.
Para calcular el kappa de Cohen a cada evaluador en contraste al estándar o
evaluadores frente al estándar se debe especificar un valor estándar para cada
muestra.
(Minitab, 2019)
Interpretación de resultados
El rango de resultado de kappa varía de –1 a +1, a mayor valor de kappa la
concordancia será más fuerte (Minitab, 2019). Así:
Kappa = 1, existe concordancia perfecta.
Kappa = 0, la concordancia es igual a la producida por las probabilidades.
38
Kappa < 0, la concordancia es menor a las probabilidades, es un caso muy
infrecuente.
(Minitab, 2019)
El grupo AIAG sugiere que un valor de kappa de al menos 0.75 indica una
concordancia adecuada. Sin embargo, se prefieren valores de kappa más grandes, como
0.90 (Minitab, 2019).
Existe otra escala propuesta por Landis y Koch en la que se pondera literalmente a el
valor de kappa de la siguiente manera:
Tabla 6. Escala de valoración de kappa según Landis y Koch.
Kappa Grado de acuerdo
< 0,00 Sin acuerdo
>0,00 - 0,20 Insignificante
0,21 - 0,40 Discreto
>0,41 - 0,60 Moderado
0,61 - 0,80 Sustancial
0,81 - 1,00 Casi perfecto
Valoración del coeficiente kappa Recuperado de Landis y Koch (1977)
El error estándar estimado del coeficiente kappa de Cohen mide la precisión de la
estimación, mientras menor sea el error estándar, más precisa será la estimación (Minitab,
2019).
39
Valor Z
El valor z es el estadístico de prueba normal aproximado, este valor es utilizado para
la determinación del valor p (Minitab, 2019).
El valor P
El valor p es una probabilidad que mide la evidencia en contra de la hipótesis nula.
Los valores p más bajos proporcionan fuerte evidencia en contra de la hipótesis nula
(Minitab, 2019). El valor p de kappa sirve para determinar si se debe rechazar o no las
siguientes hipótesis nulas
H0 para por evaluador: la concordancia por evaluador se debe a las
probabilidades.
H0 para cada evaluador contra el estándar: la concordancia entre los
evaluadores y el valor estándar se debe a las probabilidades.
H0 para entre los evaluadores: la concordancia entre los evaluadores se debe a
las probabilidades.
H0 para evaluadores contra el estándar: la concordancia entre los evaluadores
y el valor estándar se debe a las probabilidades.
(Minitab, 2019)
Interpretación
Para concluir si la concordancia se debe a las probabilidades se realiza la comparación
del p valor con el nivel de significancia que se esté trabajando, en el presente estudio se
ha establecido un nivel para alfa de 0.05 el cual funciona bien, un nivel de significancia
de 0.05 indica que el riesgo de concluir que los evaluadores coinciden, cuando en realidad
no es así, es de 5% (Minitab, 2019).
Valor p ≤ α: La concordancia de los evaluadores no se debe a las probabilidades
(Rechazar H0)
40
Cuando el p valor es menor que o igual al nivel de significancia se rechaza la hipótesis
nula y se concluye que la concordancia de los evaluadores es significativamente diferente
a lo producido por las probabilidades (Minitab, 2019).
Valor p > α: La concordancia de los evaluadores se debe a las probabilidades (No
rechazar H0)
Cuando el p valor es mayor que el nivel de significancia no se puede rechazar la
hipótesis nula, porque no cuenta con suficiente evidencia para concluir que la
concordancia de los evaluadores es diferente a lo producido por las probabilidades
(Minitab, 2019).
Correlación entre técnicas.
El coeficiente de correlación se determina al medir el grado en el que dos variables
tienen la tendencia de cambiar al mismo tiempo, describe la fuerza y dirección en el que
la relación se presenta.
Correlación de Spearman.
El coeficiente de correlación de Spearman evalúa la relación entre dos variables
continuas u ordinales. En relación monótona se produce la tendencia de que las variables
cambien al mismo tiempo, pero no necesariamente a un ritmo constante (Minitab, 2019).
La correlación de Spearman indica la dirección de asociación entre una variable y la
otra. Si las variables tienden a cambiar al mismo tiempo el coeficiente de correlación de
Spearman es positivo. Si las variables tienden a cambiar, el coeficiente de correlación de
Spearman es negativo. Una correlación de Spearman de cero indica que no hay tendencia
a que la variable A aumente o disminuya cuando B aumenta. La correlación de Spearman
aumenta en magnitud a medida que A y B se acercan más a ser funciones monótonas
perfectas entre sí. El rango de valores que toma el coeficiente de correlación de Spearman
es de -1 a 1 (Minitab, 2019).
41
2.2.6. Técnica ELISA.
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas más conocido por sus siglas en inglés
como ELISA, es una técnica de ensayo en placa utilizada para ensayos cualitativos y
cuantitativos en los que puede medir varios tipos de epítopos de péptidos, proteínas,
anticuerpos y hormonas. En la técnica ELISA el antígeno se inmoviliza en una superficie
sólida y luego se une a un anticuerpo que esta conjugado con una enzima. La detección
óptica se realiza por medio de la actividad de la enzima conjugada a través una incubación
con un sustrato para producir un cambio de color (Ridascreen, 2017).
La técnica ELISA se realiza típicamente en placas de poliestireno de 96 pocillos,
dentro de estos pocillos, en la superficie de la micro placa se inmovilizan los reactivos
con mayor avidez por el analíto deseado, esto hace que sea fácil separar el enlace del
material no unido durante el ensayo. Esta capacidad para lavar analítos no
específicamente unidos a los reactivos de la placa hace del ELISA una herramienta
poderosa para medir analítos específicos (Ridascreen, 2017).
Principio.
La técnica ELISA comprende una serie de reacciones inmunoquímicas y enzimáticas,
La inmovilización de antígenos o anticuerpos en fondo del pocillo de reacción dependerá
del método de ELISA empleado, sin embargo, en principio la formación de un complejo
que comprenda el analíto de interés y la parte inmovilizada es el objetivo de la reacción,
posterior a esto después de un lavado que elimine la parte no fijada, el complejo
inmovilizado formará un nuevo complejo con un anticuerpo conjugado con una enzima,
posterior a un nuevo lavado, la formación de este nuevo complejo con capacidad
oxidativa provocará una reacción enzimática de óxido-reducción de una solución
adicionada, la cual al ser oxidada provocará una variación óptica. Mediante la técnica de
espectrofotometría esta variación óptica será medida mediante la absorbancia de un haz
de luz a una determinada longitud de onda, la cual es amplificada y cuantificada.
Métodos.
La técnica ELISA se puede realizar bajo los siguientes métodos más comunes:
42
Método directo
Método indirecto
Método sándwich
Método competitivo
La variación de método a método depende del tipo de molécula fijada en el pocillo, la
forma en que el anticuerpo conjugado se une al complejo y la forma de titular la
concentración. La técnica empleada para la medición de la señal emitida puede ser
medida mediante un espectrofotómetro, fluorómetro o un luminómetro, sin embargo,
aquí se detalla el proceso mediante la espectrofotometría.
Método directo.
El método indirecto se caracteriza por un fijado de los antígenos a ser determinados
en el fondo del pocillo, mediante la adición de una solución tampón a la muestra se
produce la adhesión de los antígenos al plástico del pocillo a través de las interacciones
de carga, después de esto se procede a adicionar una solución de proteína para cubrir
cualquier espacio de plástico del pocillo que no se ha cubierto por el antígeno. La
adhesión de un anticuerpo primario conjugado a una enzima se adiciona para que forme
el complejo antígeno – anticuerpo conjugado, después de eliminar por lavado a los
anticuerpos conjugados que no encontraron antígeno para unirse, se procede a añadir un
sustrato el cual es oxidado por la enzima conjugada. Este proceso enzimático de tipo
oxido – reducción el cual provoca un cambio de color en la solución. La variación óptica
producida es medida por un espectrofotómetro como absorbancia a una longitud de onda
especifica. En la práctica se disponen de soluciones de lavado y de parada. Todos los
procesos de formación de complejos antígeno - anticuerpo necesitan un tiempo de
incubación. Las soluciones de lavado eliminan las moléculas no unidas a sus dianas entre
cada adición de anticuerpos marcados o no, mientras que la solución de parada detiene
el proceso oxidativo (Lin, 2015).
Método indirecto.
El proceso del método indirecto guarda el mismo mecanismo que el método directo
con la variación que después del proceso de fijado del antígeno al fondo del pocillo se
43
produce una adición de un anticuerpo el cual se unirá al antígeno fijado y formará el
complejo antígeno – anticuerpo. La adición de un anticuerpo conjugado cuya diana es la
región constante del anticuerpo que está unido al antígeno, formará un complejo antígeno
– anticuerpo – anticuerpo conjugado, posterior a esto se producirá la oxidación del
sustrato y la posterior lectura (Lin, 2015).
Método Sándwich.
El método sándwich se caracteriza por la adhesión previa de un tipo de anticuerpos en
el fondo del pocillo, cualquier espacio sin ocupación por parte de estos anticuerpos está
bloqueado, de manera que al adicionar la muestra los antígenos contenidos formarán el
complejo antígeno – anticuerpo, posterior a un lavado para eliminar los antígenos sin
acomplejar, se procede a adicionar un anticuerpo cuyo diana es el antígeno acomplejado
con el anticuerpo fijado, para eliminar a los anticuerpos no unidos se procede a otro
lavado. La adición de un anticuerpo conjugado con una peroxidasa formará el complejo:
anticuerpo fijado – antígeno – anticuerpo – anticuerpo conjugado. Este conjugado se
encargará de oxidar el sustrato guardando el mismo mecanismo que los anteriores
métodos (Lin, 2015).
Método competitivo.
Para el método competitivo se realiza la adición de un número conocido de
anticuerpos, el cual se puede decir que se encuentra en exceso, la adición de la muestra
con los antígenos de dichos anticuerpos se procede a incubar. Los complejos formados
por los anticuerpos en exceso y los antígenos de la muestra son vertidos en un pocillo
cuyo fondo se encuentra recubiertos de antígenos diana de los anticuerpos en exceso. La
placa se lava eliminado a todos aquellos anticuerpos que no se han fijado, aquí hay que
tomar en cuenta que los anticuerpos que se eliminan son aquellos que ya se encontraban
en forma de complejo con los antígenos de la muestra y que los complejos nuevos
formados son entre los anticuerpos en exceso de concentración conocida y los antígenos
que se encontraban fijados en la placa, a esto se le conoce como competencia. La adición
de un anticuerpo conjugado específico de la cadena contante del anticuerpo unido al
antígeno es el que provocará el mecanismo enzimático de óxido reducción en el sustrato,
44
que a la vez causará un cambio de la densidad óptica como ya se ha mencionado (Lin,
2015).
2.2.7. Técnica inmunocromatográfica.
La técnica inmunocromatográfica de cassette es un dispositivo en el cual según el
presente estudio es de diagnóstico binario, el cual permite conocer el resultado en poco
tiempo. El cassette de inmunocromatografía consta de una abertura para la adición de la
muestra y una ventana de resultados en la que se presenta la franja de resultados y otra
de control. La almohadilla de muestra suele estar compuesto por un material poroso que
permita el paso por capilaridad de las sustancias formadas hasta que lleguen a las franjas
tanto de resultados como de control, en las cuales sucederán las reacciones que se
explican en el principio de la técnica (Biotec S.L., 2019).
Principio.
El principio de la técnica inmunocromatográfica se caracteriza por una serie de
reacciones inmunoquimicas, dentro de la ventana de resultados se encuentra una
membrada fabricada de nitrocelulosa que provocan el efecto de capilaridad, en dicha
venta de muestra se encuentran impregnados diferentes anticuerpos conjugados con
partículas de color, los cuales al contacto con los analítos (antígenos) formarán
inmunocomplejos con color. Estos inmunocomplejos serán arrastrados por capilaridad
hasta llegar a la franja de resultados, en la cual serán retenidos por anticuerpos
inmovilizados, produciendo una acumulación de inmunocomplejos coloreados y en
consecuencia la tinción de la franja. La intensidad del color de la franja en la mayoría de
las pruebas es directamente proporcional a la concentración del analíto (Biotec S.L.,
2019).
Métodos.
La técnica inmunocromatográfica se utiliza bajo el método sándwich para la
determinación de la mayoría de los analítos con importancia clínica, aunque, no es raro
encontrar presentaciones comerciales que utilicen el método competitivo. Los métodos
sándwich y competitivo se describen a continuación (Biotec S.L., 2019).
45
Método sándwich.
El método sándwich en la inmunocromatografía de cassette se caracteriza por poseer
en la franja de resultados varios tipos de anticuerpos, así en la franja destinada para el
control de calidad de la prueba se encuentran anticuerpos policlonales contra a una
proteína específica y en la franja destinada para el resultado se encuentran los anticuerpos
monoclonales contra el analíto. En la ventana para muestra el material de dicho espacio
está dotado por una preparación de anticuerpos monoclonales contra el antígeno (analíto)
conjugados con partículas de látex de poliestireno rojo y de anticuerpos contra proteína
especifica conjugados con látex de poliestireno verde. Cuando la muestra es dispensada
en el espacio de muestra, si la prueba es positiva los antígenos se unirán a los anticuerpos
contra calprotectina humana marcados con poliestireno rojo, y por capilaridad
ascenderán hacia la ventana de resultados, en la cual al llegar a la franja de resultado
estos complejos se inmovilizarán en dicha franja al unirse con los anticuerpos
inmovilizados y revelarán un color rojo. En cuanto al control, la proteína especifica que
en este caso es el antígeno de los anticuerpos marcados con poliestireno verde, migrarán
de igual forma por capilaridad hacia la franja de control, en la cual se inmovilizarán
debido a los anticuerpos anti proteína especifica que se encuentran en dicha franja y
revelaran un color verde (Biotec S.L., 2019).
Si la muestra diluida posee una concentración de antígeno por debajo del valor de
corte no se producirá un cambio de color en la franja de resultados, de forma contraria si
la muestra posee una concentración mayor al valor de corte la prueba se revelará como
positiva, cabe mencionar que únicamente se fijaran y revelarán resultado las moléculas
de antígeno que hayan formado el complejo antígeno – anticuerpo conjugado en la
ventana de muestra. La prueba quedará invalidada si la franja de control no revela cambio
de color, una correcta coloración de esta franja indica la correcta adición de volumen de
muestra, el adecuado flujo y el control interno de reactivos (Biotec S.L., 2019).
Método competitivo.
El método competitivo en la inmunocromatografía de cassette se caracteriza por
poseer en la almohadilla de muestra una determinada concentración de antígeno marcado
con partículas de color, las cuales son arrastradas hacia la franja de resultados al añadir
46
la muestra diluida que contiene el antígeno no marcado (analíto), al empezar a migrar
estos dos antígenos entran en competencia por los anticuerpos inmovilizados en la franja
de resultados. La unión de los antígenos marcados se va a ver impedida en proporción a
la concentración de los antígenos de la muestra, de manera que, mientras más color
presente la franja de resultados menor será la concentración del analíto. La franja de
resultados que presente color será considerada negativa (Biotec S.L., 2019).
Pruebas cuantitativas.
Si bien las pruebas de inmunocromatografía de cassette brindan resultados
diagnósticos de tipo binario, se han desarrollado dispositivos capaces de cuantificar la
intensidad de coloración de la franja de resultados. Los dispositivos para lectura de estas
pruebas poseen un emisor de luz a una longitud de onda establecido y un sensor CMOS
(complementary - symmetry metal – oxide – semiconductor) el cual es un sensor que
interpreta la intensidad de la coloración de la franja de resultados. Lo cual por medio de
algoritmos matemáticos permite la cuantificación de la intensidad de dicha franja (Biotec
S.L., 2019).
2.3.Fundamentación legal
En la sección séptima salud artículo 32 de la constitución del Ecuador se establece
que:
Art. 32.- La salud es un derecho que garantiza el Estado, cuya realización se vincula
al ejercicio de otros derechos, entre ellos el derecho al agua, la alimentación, la
educación, la cultura física, el trabajo, la seguridad social, los ambientes sanos y otros
que sustentan el buen vivir. (Asamblea Nacional República del Ecuador, 2008).
El Estado garantizará este derecho mediante políticas económicas, sociales, culturales,
educativas y ambientales; y el acceso permanente, oportuno y sin exclusión a
programas, acciones y servicios de promoción y atención integral de salud, salud
sexual y salud reproductiva. La prestación de los servicios de salud se regirá por los
principios de equidad, universalidad, solidaridad, interculturalidad, calidad,
eficiencia, eficacia, precaución y bioética, con enfoque de género y generacional.
(Asamblea Nacional República del Ecuador, 2008).
47
En la sección segunda salud artículo 362 de la constitución del Ecuador se establece
que:
Art. 362.- La atención de salud como servicio público se prestará a través de las
entidades estatales, privadas, autónomas, comunitarias y aquellas que ejerzan las
medicinas ancestrales alternativas y complementarias. Los servicios de salud serán
seguros, de calidad y calidez, y garantizarán el consentimiento informado, el acceso a
la información y la confidencialidad de la información de los pacientes. Los servicios
públicos estatales de salud serán universales y gratuitos en todos los niveles de
atención y comprenderán los procedimientos de diagnóstico, tratamiento,
medicamentos y rehabilitación necesarios. (Asamblea Nacional República del
Ecuador, 2008).
En la sección primera educación artículo 350 de la constitución del Ecuador se
establece que:
Art. 350.- El sistema de educación superior tiene como finalidad la formación
académica y profesional con visión científica y humanista; la investigación científica
y tecnológica; la innovación, promoción, desarrollo y difusión de los saberes y las
culturas; la construcción de soluciones para los problemas del país, en relación con
los objetivos del régimen de desarrollo. (Asamblea Nacional República del Ecuador,
2008).
2.4.Hipótesis
2.4.1. Hipótesis de trabajo (Hi). Existe concordancia y correlación clínica
significativas entre las técnicas inmunocromatográfica y ELISA en la
determinación de calprotectina fecal.
2.4.2. Hipótesis nula (Ho). La concordancia y correlación clínica entre las técnicas
inmunocromatográfica y ELISA se debe a lo producido por las probabilidades.
2.5.Sistema de variables
Variable 1: Comparación entre técnicas inmunocromatográfica y ELISA.
Variable 2: Determinación de calprotectina fecal.
48
Capitulo III
3. Metodología
3.1.Diseño de investigación
El enfoque de la investigación pretende comparar a modo cuantitativo las técnicas
inmunocromatográfica y el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas para la
determinación de calprotectina fecal, mediante la determinación de medidas de
discriminación, valores predictivos y coeficiente de correlación con respeto al método de
referencia ELISA.
El nivel de investigación del estudio de comparación de técnicas
inmunocromatográfica y ELISA para la determinación de calprotectina fecal es de nivel
relacional el cual pretende evaluar el grado de concordancia y correlación que existe
entre estas dos técnicas.
El tipo de investigación según la clase del objetivo planteado es de tipo aplicativo
debido a que se realizara un análisis de la concordancia y concordancia entre las técnicas
mencionadas.
Por el lugar de investigación es de campo ya la investigación se desarrollará en el área
de pruebas especiales en laboratorios NetLab.
Por la fuente de datos de la investigación es de tipo de campo debido a que los datos
serán recolectados directamente de donde están siendo generados.
Por la intervención del investigador la investigación es de tipo observacional debido
a que el investigador intervendrá en el análisis de las muestras en ambas técnicas.
Por la planificación de las mediciones la investigación es de tipo prospectivo ya que
los resultados serán generados para su posterior análisis comparativo.
Por la factibilidad el proyecto es de tipo de desarrollo debido a que se pretende llegar
al análisis comparativo entre técnicas que poseen características analíticas distintas.
49
3.2.Población y muestra
Para el cálculo del tamaño de la muestra de un estudio con la finalidad de obtener un
coeficiente de correlación se lo obtiene mediante una aproximación clásica basada en la
amplitud del intervalo de confianza y el uso de la teórica de los grandes números
mediante el teorema del límite central, de manera que este tamaño se obtiene para una
desviación estándar dada del coeficiente de concordancia y una diferencia porcentual
esperada del verdadero valor del coeficiente de correlación (Delgado Antequera, 2015).
Así:
n = (Z ⋅ E
π ⋅ PC)
2
Donde:
n = Numero de mediciones necesarias con los métodos A y B
Z = Percentil de distribución
E = Desviación estándar esperada
Π = Diferencia porcentual esperada del verdadero coeficiente de concordancia
Pc = Coeficiente de concordancia esperado
n = (1,98 ⋅ 0,03
0,01 ⋅ 0,95)
2
n = 39
Para:
Z = 1,98
E = 3%
Π = 1%
Pc = 0,95
50
3.3.Selección de la muestra
3.3.1. Criterios de inclusión para el estudio.
Muestra fecal referida a laboratorios NetLab.
Cumplir con criterios pre analíticos de aceptación y rechazo de muestra.
Tener pedido clínico para determinación de calprotectina fecal.
Sexo: masculino – femenino.
3.3.2. Criterios de exclusión para el estudio.
No enviar muestra fecal a laboratorios NetLab.
No cumplir con criterios pre analíticos de aceptación y rechazo de muestra.
No tener pedido clínico para determinación de calprotectina fecal.
3.4.Métodos y materiales
3.4.1. Método de la técnica inmunocromatográfica.
Fundamento de la técnica inmunocromatográfica.
La prueba para determinación de calprotectina fecal mediante la técnica de
inmunocromatografía es de la casa comercial BioTec llamada CerTest calprotectin, esta
prueba de tipo semicuantitativa expresa resultados como positivos cuando, según el
fabricante, la concentración de calprotectina fecal es superior al punto de corte de 50
mg/g.
El principio de la prueba CerTest Calprotectin viene dada por las siguientes
reacciones, dentro de la venta de resultados se encuentra una membrana fabricada de
nitrocelulosa en la cual se encuentran impregnados diferentes anticuerpos, así en la franja
destinada para el control de calidad de la prueba se encuentran anticuerpos policlonales
de conejo contra una proteína específica y en la franja destinada para el resultado de
calprotectina fecal se encuentran los anticuerpos monoclonales de ratón contra
calprotectina fecal humana. En la ventana para muestra el material de dicho espacio está
dotado por una preparación de anticuerpos monoclonales de ratón contra calprotectina
humana conjugados con partículas de látex de poliestireno rojo y de anticuerpos contra
51
proteína especifica conjugados con látex de poliestireno verde. Cuando la muestra es
dispensada en el espacio de muestra, si la prueba es positiva los antígenos calprotectina
humana se unirán a los anticuerpos contra calprotectina humana marcados con
poliestireno rojo, y por capilaridad ascenderán hacia la ventana de resultados, en la cual
al llegar a la franja de resultado estos complejos se inmovilizarán en dicha franja al unirse
con los anticuerpos anti calprotectina humana inmovilizados y revelarán un color rojo.
En cuanto al control, la proteína especifica que en este caso es el antígeno de los
anticuerpos marcados con poliestireno verde, migrarán de igual forma por capilaridad
hacia la franja de control, en la cual se inmovilizarán debido a los anticuerpos anti
proteína especifica que se encuentran en dicha franja y revelaran un color verde (Biotec
S.L., 2019).
Si la muestra diluida no posee o posee una concentración de CH por debajo del valor
de corte de 50 mg/kg no se producirá un cambio de color en la franja de resultados, de
forma contraria si la muestra posee una concentración mayor al valor de corte la prueba
se revelará como positiva, cabe mencionar que únicamente se fijaran y revelaran
resultado las moléculas de CH que hayan formado el complejo CH – anticuerpo
conjugado. La prueba quedara invalidada si la franja de control no revela cambio de
color, ya que esto revelara la correcta adición de volumen de muestra, el adecuado flujo
y el control interno de reactivos (Biotec S.L., 2019).
Procedimiento de la técnica inmunocromatográfica.
Para cada muestra de heces con petición de determinación de calprotectina se realizara
un previo acondicionamiento a una temperatura de 15 a 30 y se abrirá el cassette de
CerTest calprotectin, en cada sobre contiene un frasco con una solución diluyente, las
muestras deberán ser recogidas con el palito que viene fijada en la tapa del frasco, la toma
con este palito deberá ser de 4 zonas distintas de la muestra y tan solo una pequeña
cantidad, si la consistencia de la muestra fecal es líquida se debe alicuotar un volumen
de 15 uL, una vez ingresada la muestra dentro del frasco este debe ser agitado
vigorosamente hasta su completa dilución, de la muestra diluida se debe colocar 4 gotas
en el cassette dentro de la abertura para muestra y esperar 10 min para realizar la lectura.
La lectura no se debe realizar después de los 10 minutos.
52
Para la lectura de los resultados se debe tomar en cuenta que toda prueba sin una
coloración verde de la línea de control quedara invalidada, los resultados dependerán de
la coloración roja de la línea de resultados, si el test es positivo se producirá la tinción de
la línea de resultado y si es negativo esta no se presentará. La intensidad de la tinción de
la línea de resultados dependerá de la concentración de calprotectina humana presente en
la muestra.
3.4.2. Materiales de la técnica inmunocromatográfica.
Los materiales necesarios para la ejecución de la técnica inmunocromatográfica son:
Guantes de nitrilo
Gafas
Mascarilla
Marcador Permanente
Cronómetro
Recipiente para recogida de
muestra
Recipiente para residuos de
laboratorio con solución de
hipoclorito 0,5%
Toallas desechables
Instrucciones de uso del kit
Reactivos.
Kit Biotec CerTest Calprotectin:
Cassette CerTest de calprotectina
Tubos para dilución de muestra con diluyente
3.4.3. Método de la técnica ELISA.
Fundamento de la técnica ELISA.
La técnica ELISA se realizará en un equipo Elisys Quattro® de la casa comercial
Human Diagnostics® mediante el método sándwich que usa el Kit Ridascreen®
Calprotectin. El método sándwich usado por el kit empleado hace uso de anticuerpos
monoclonales contra calprotectina humana, dichos anticuerpos son fijados en la
superficie de los pocillos de la placa de reacción, al adicionar una muestra previamente
tratada dentro de los pocillos esta pasa por un primer paso de incubación para la
formación del inmunocomplejo calprotectina – anticuerpo. Tras un lavado que elimina
53
las proteínas de calprotectina humana no unidas, se procede a adicionar un conjugado de
anticuerpo monoclonal con una peroxidasa de rábano seguido de otra incubación para la
formación del complejo anticuerpo – calprotectina – conjugado, conocido como
sándwich. Tras un nuevo lavado para eliminar el exceso de conjugado no fijado al
complejo calprotectina - anticuerpo, se adiciona un sustrato que mediante una oxidación
enzimática por parte del conjugado cambia el color de la solución a un tono azul la cual
se tornara a un color amarillo luego de la adición de una solución de parada, la cual
detiene la reacción de oxidación. La absorbancia de esta solución es directamente
proporcional a la concentración de calprotectina fecal humana (Ridascreen, 2017).
Procedimiento de la técnica ELISA.
El procedimiento de la técnica Elisa precisa que tanto las muestras como los reactivos
del kit Ridascreen calprotectin tengan una temperatura ambiente (20 - 25 °C). Las
soluciones deben ser reconstituidas de la siguiente manera, para el tampón de lavado se
debe preparar una dilución 1:10 wash - agua destilada. El tampón de extracción una
dilución 1:3 extract – agua destilada. Las muestras a ser procesadas deben haberse
conservado continuamente 2 - 8 °C por un máximo de 3 días y con un máximo de 6 meses
a -20 °C y antes de su preparación deben aclimatarse a temperatura ambiente (Ridascreen,
2017).
La preparación de las muestras se realiza mediante la adición de 100mg de muestra o
si la consistencia de la muestra es líquida se debe alicuotar 100 ul dentro de un tubo
etiquetado, a este adicionar 5ml de la solución de extracción para a agitar con vortex
hasta la completa homogenización. La suspensión se debe centrifugar a 3000 g durante
10 minutos, posterior a esto se diluye 20 μL del sobrenadante con 980 del tampón de
dilución y las muestras están listas para ser ingresadas al equipo Elisys Quattro®
(Ridascreen, 2017).
Una vez ingresados los tubos etiquetados con la muestra tratada el equipo Elisys
Quattro® realiza de manera automatizada lo antes mencionado en el fundamento de la
técnica según el kit Ridascreen Calprotectin, lo cual consiste en la adición de reactivos,
lavado, lectura de absorbancia y cálculo de concentración a partir de esta. Sin embargo,
cabe mencionar que la preparación del equipo incluye el proceso de gestión de calidad y
54
del ingreso de la placa de pocillos, la solución de lavado y la selección de posición de los
siguientes reactivos: estándares del 1 al 5, control negativo (tampón de dilución), control
positivo bajo, control positivo alto, conjugado, sustrato y solución de parada (Ridascreen,
2017).
Para el reporte de resultados se debe considerar como positivo todo resultado con una
concentración > 50 mg calprotectina/kg heces. Si el resultado está por debajo de 50
mg/Kg las muestras deben considerarse negativas (Ridascreen, 2017).
3.4.4. Materiales de la técnica ELISA.
Los materiales necesarios para la ejecución de la técnica ELISA son:
Guantes de nitrilo
Gafas
Mascarilla
Marcador Permanente
Cronómetro
Recipiente para residuos con
solución de hipoclorito 0,5%
Toallas desechables
Micropipetas de 20 - 100 ul y
1 ml
Probeta 100 y 1000 ml
Gradilla
Tubos punta cónica
Tubos plásticos de 5ml
Mezclador de vórtice
Centrifugadora
Instrucciones de uso del kit
Reactivos.
Tampón de extracción, contiene NaN3 0,05%.
Tampón de dilución de muestra; solución salina tamponada con proteína,
contiene NaN3 0,1%.
Tampón de lavado solución salina tamponada con fosfato, contiene timerosal
0,1% y 0,1%.
Calibrador, contiene NaN3 0,1%.
Estándares con 5 concentraciones de calprotectina diferentes, del 1 al 5
correspondientemente sus concentraciones son: 19,5 / 56 / 95 / 275 / 800
mg/kg.
55
Control positivo, contiene NaN3 0,1%.
Control positivo bajo, contiene NaN3 0,1%.
Conjugado de anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa en
solución proteica estabilizada.
Sustrato contiene peróxido de hidrógeno / tetrametilbencidina.
Reactivo de parada contiene ácido sulfúrico 1 N.
3.5.Matriz de operacionalización de las variables
Tabla 7. Matriz de operacionalización de variables.
Variables Dimensiones Indicador Instrumento Fuente
Determinación de
calprotectina fecal por
técnicas
inmunocromatográfica
y ELISA
Punto de corte: > 50
ug/g de heces
Viraje de
color:
Positivo
Test
Cassette IC
Certest®
calprotectin
Base de
datos
laboratorios
de
referencia
NetLab
No viraje
de color:
Negativo
Calprotectina fecal
mg/Kg
Equipo
ELISA
Elisys
Quattro –
Human
Diagnostics
Comparación entre
técnicas
Coeficiente
de
concordancia
Coeficiente
de
correlación
Coeficiente
de
contingencia
Porcentaje SPSS
Base de
datos
laboratorios
de
referencia
NetLab
56
3.6.Técnicas e instrumentos de recolección de datos
Los datos serán generados mediante la determinación de calprotectina en muestras de
heces por las técnicas de inmunocromatografía y ELISA, las muestras corresponderán a
pacientes usuarios de laboratorios NetLab y serán tomadas de forma aleatoria. Los datos
serán recolectados en una hoja de Excel para posterior análisis estadístico.
3.7.Validez y confiabilidad
La tabla de recolección de datos será validada haciendo uso de una encuesta realizada
a tres profesionales pertinentes. La tabla de recolección de datos se adjunta como (Anexo
C) y la encuesta de validación se adjunta como (Anexo D).
3.8.Técnicas de procesamiento y análisis de datos
El análisis estadístico estará comprendido por los coeficientes de concordancia kappa
de Cohen, coeficiente de correlación de Spearman, coeficiente de contingencia C de
Pearson, medidas de discriminación (sensibilidad y especificidad) y valores predictivo
positivo y negativo. Las medidas de discriminación y los valores predictivos serán
calculados con respecto a la técnica ELISA tomando a esta como referencia. Para la
determinación de estos parámetros estadísticos se hará uso de las herramientas
informáticas Microsoft Excel 2016 e IBM SPSS Statistics 25. Los resultados serán
presentados mediante tablas, pasteles y gráficos.
3.9.Consideraciones bioéticas
En la presente investigación el investigador obtuvo 39 muestras al azar referidas de
distintos puntos de salud a los laboratorios de referencia NetLab, durante el proceso no
se tuvo contacto directo con los pacientes y la información obtenida se manejó de forma
codificada, además de considerar el código de la niñez y la adolescencia, así como el
artículo 8 de la Declaración universal sobre Bioética y Derechos Humanos emitida por
la UNESCO. Los beneficiarios directos de este trabajo fueron los profesionales de
laboratorios de referencia NetLab, los cuales obtuvieron evidencia científica acerca de la
técnica con mayor capacidad diagnóstica para el reporte de resultados clínicos con mayor
fiabilidad. Como beneficiarios indirectos fueron los usuarios de laboratorios de
57
referencia NetLab, los cuales contarán con resultados fiables. Se señala que los
investigadores poseen las competencias éticas y la experticia profesional así como la no
existencia de conflicto de intereses.
58
Capítulo IV
4. Análisis de resultados
En el presente estudio comparativo se analizaron un total de 39 muestras fecales para
la determinación de calprotectina fecal por las técnicas inmunocromatográfica y ELISA.
Los 39 individuos fueron referidos a los laboratorios de referencia NetLab para la
determinación de calprotectina fecal de los cuales el 48,7% fueron mujeres y el 51,3%
fueron hombres. Dentro de los pacientes el 51,3% eran adultos con un rango de edad de
18-71 años. El 48,7 % de los pacientes fueron niños con un rango de edad de 0-17 años.
Tabla 8. Presentación de características analíticas de las técnicas
inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de calprotectina fecal.
Parámetro Técnica inmunocromatográfica Técnica ELISA
Método Tipo sándwich Tipo sándwich
Resultado Cualitativo Cuantitativo
Unidades Positivo - Negativo mg / kg - µg / mg
Punto de corte > 50 mg / kg > 50 mg / kg
Intervalo Positivo - Negativo 0 - 2500
Tiempo de ensayo 10-15 min / prueba 240-300 min / serie
Elaborado por Oyagata J.
Tabla 9. Resultados de la determinación de calprotectina fecal por las técnicas
inmunocromatográfica y ELISA.
Técnica ELISA
Técnica
Inmunocromatográfica
Positivo Negativo Total general
Positivo 26 1 27
Negativo 5 7 12
Total general 31 8 39
Elaborado por Oyagata J.
Los resultados proporcionados por ambas técnicas fueron analizados mediante
parámetros comparativos para la evaluación de concordancia y correlación clínica los
cuales fueron coeficiente de contingencia C de Pearson (0,530), coeficiente de
correlación de Spearman (0,624), coeficiente Kappa de Cohen (0,602) y el nivel de
59
acuerdo entre técnicas (84,6%). Los coeficientes se muestran en la tabla 10 y el nivel de
acuerdo en la tabla 11.
Tabla 10. Parámetros comparativos de concordancia y correlación entre técnicas
inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de calprotectina fecal.
Valor Error estándar
asintótico
T aproximada Significación
aproximada
Nominal por
Nominal
Coeficiente de
contingencia
0,530 0,000
Ordinal por
ordinal
Correlación de
Spearman
0,624 0,133 4,863 0,000
Medida de
acuerdo
Kappa 0,602 0,142 3,899 0,000
N de casos válidos 39
Elaborado por Oyagata J.
Tabla 11. Resumen del nivel de acuerdo en la determinación de calprotectina fecal
por las técnicas inmunocromatográfica y ELISA
Muestras Número de coincidencias Porcentaje IC de 95%
39 33 84,62 69,47 - 94,14
Elaborado por Oyagata J.
El valor obtenido de coeficiente de contingencia C de Pearson fue de 0,530 con un
valor de p = 0,000. El valor del coeficiente de contingencia C máximo para la tabla de
contingencia utilizada fue de 0,707. En el caso de existir una máxima asociación entre
las mediciones de ambas técnicas el coeficiente de contingencia C sería igual al
coeficiente de contingencia C máximo (0,707) lo cual generaría una relación del 100%
como se menciona en la guía estadística de la universidad de Granada (Universidad de
Granada, 2019).
El coeficiente de contingencia C de Pearson obtenido (0,530) al ser relacionado con
el coeficiente de contingencia C máximo (0,707) estableció una asociación entre
variables del 75%. Este valor nos indica que existe una asociación del 75% entre los
resultados que se obtuvieron por las técnicas inmunocromatográfica y ELISA en la
determinación de calprotectina fecal.
60
El valor p al ser menor a 0.05 comprueba el rechazo de Ho estableciendo que la
relación de los resultados entre las técnicas inmunocromatográfica y ELISA no se debe
a lo producido por las probabilidades. En la tabla 10 se muestra los valores del
coeficiente de contingencia C y C máximo, así como su porcentaje de relación.
Tabla 12. Resumen de coeficientes de contingencia.
Coeficiente de contingencia C coeficiente de contingencia C
máximo
Relación coeficiente de
contingencia C y C máximo
0,530 0,707 75%
Elaborado por Oyagata J.
El coeficiente de correlación de Spearman calculado fue de 0,624 con un valor de p =
0,000. El nivel de correlación de 0,626 en el rango de correlación donde el valor de 1
muestra la máxima correlación, indica una correlación de tipo moderada entre las
técnicas inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de calprotectina fecal.
Los resultados obtenidos contrastan con el estudio según Velikova (2016) en el cual
se obtuvo un coeficiente de correlación de Spearman de 0,780, p <0.001 estableciendo
una correlación de tipo moderada en un estudio de comparación de técnicas
inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de calprotectina fecal, así como en
la presente investigación (Velikova, y otros, 2018).
El valor p = 0,000 al ser menor a α = 0.05 comprueba el rechazo de Ho estableciendo
que la correlación de los resultados entre las técnicas inmunocromatográfica y ELISA no
se debe a lo producido por las probabilidades. En la tabla 9 se muestra los valores del
coeficiente de correlación de Spearman.
El coeficiente de concordancia kappa de Cohen calculado fue de 0,602 con un valor
de p = 0,000, lo cual según la escala de valoración de kappa según Landis y Koch
corresponde a una concordancia de tipo moderada entre las técnicas
inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de calprotectina fecal.
61
Los resultados obtenidos en una investigación de Acevedo (2018) en la cual se
comparan dos técnicas para la determinación de calprotectina fecal se establece un
coeficiente kappa de Cohen de 0.7766 y lo establece como un acuerdo de tipo sustancial
entre ambas técnicas (Acevedo, Salvador, Girbes, & Estan, 2018).
El valor p = 0,000 al ser menor α = 0.05 comprueba el rechazo de Ho estableciendo
que la concordancia de resultados entre las técnicas inmunocromatográfica y ELISA no
se debe a lo producido por las probabilidades. En la tabla 9 se muestra los valores del
coeficiente de concordancia kappa de Cohen.
En las figuras 7 y 8 se contrastan a manera de grafico de columnas y radial una
comparación entre los coeficientes obtenidos y los coeficientes máximos u óptimos que
se esperaría en la comparación entre técnicas de diagnóstico.
Elaborado por Oyagata J.
Figura 7. Contraste a manera de columnas entre los coeficientes obtenidos y los
coeficientes óptimos en una comparación de técnicas.
0,9
0,9
0,9
0,9
0,6 0
,62
0,7
5
0,8
4
K A P P A D E C O H E N S P E A R M A N C O N T I N G E N C I A C O I N C I D E N C I A
Coeficientes óptimos en una comparación Coeficientes obtenidos
62
Elaborado por Oyagata J.
Figura 8. Contraste a manera de gráfico de superficie entre los coeficientes obtenidos
y los coeficientes óptimos en una comparación de técnicas.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Kappa de Cohen
Spearman
Contingencia
Coincidencia
Coeficientes óptimos en una comparación Coeficientes obtenidos
63
Figura 9. Algoritmo de diagnóstico para enfermedad inflamatoria intestinal.
Elaborado por Oyagata J.
64
Capítulo V
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1.Conclusiones
Se compararon las técnicas inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de
calprotectina fecal mediante la estimación de coeficientes para la evaluación de
concordancia y correlación entre técnicas. Los cuales demostraron estadísticamente el
rechazo de la hipótesis nula y la aceptación de la hipótesis de trabajo que establece que
existe concordancia y correlación clínica significativas entre las técnicas
inmunocromatográfica y ELISA en la determinación de calprotectina fecal.
Se determinaron para las técnicas inmunocromatográfica y ELISA en la
determinación de calprotectina fecal los parámetros de comparación coeficiente de
contingencia C de Pearson (0,530), coeficiente de correlación de Spearman (0,624),
coeficiente Kappa de Cohen (0,602) y el nivel de acuerdo entre técnicas (84,6%). Dichos
coeficientes demuestran que existe un nivel de asociación entre resultados del 75%, un
nivel de correlación entre técnicas de tipo moderada, un nivel de concordancia de tipo
moderada y un porcentaje de coincidencias de resultados entre técnicas del 84,6%. Con
lo que se establece que existe un grado de acuerdo de tipo moderado entre las técnicas
analizadas, con lo que se establece la fiabilidad de los resultados emitidos por la técnica
inmucromatografica.
Se realizó un algoritmo de trabajo para el diagnóstico de enfermedad inflamatoria
intestinal en el cual se incluye la determinación de calprotectina fecal como requisito
antes de la realización procesos endoscópicos invasivos.
65
5.2.Recomendaciones
Se recomienda para próximas investigaciones en las que se realice la comparación de
técnicas contar con pacientes diagnosticados como sanos o enfermos de determinada
patología mediante la técnica de referencia y sobre este diagnóstico realizar las
determinaciones de correlación y concordancia.
Se recomienda realizar estudios epidemiológicos de la enfermedad inflamatoria
intestinal para la población ecuatoriana, con lo cual se podrían estimar parámetros
técnicos de pruebas de diagnóstico como los valores predictivos, que dependen de la
prevalencia ajustada a la población sobre la cual se requiere aplicar dicha prueba.
Los valores de concordancia y correlación entre las técnicas revelaron una correlación
moderada y una concordancia sustancial, lo cual revela que el uso de pruebas rápidas con
uso de la técnica inmunocromatográfica son una opción considerable en lugares en lo
que no existe una alta frecuencia para la prueba de calprotectina fecal, tomando en cuenta
los datos estadísticos que se mencionan en la presente investigación.
Se recomienda la determinación de calprotectina fecal en pacientes en general y
especialmente en pacientes pediátricos de los cuales se sospeche de enfermedad
inflamatoria intestinal a manera de cribado o requisito antes de la realización de procesos
endoscópicos invasivos.
66
Referencias
Delgado Antequera, L. (2015). Universidad de granada. Obtenido de
http://masteres.ugr.es/moea/pages/curso201415/tfm1415/delgadoantequera_tfm/!
Acevedo, D., Salvador, M., Girbes, J., & Estan, N. (2018). Fecal Calprotectin: A Comparison
of Two Commercial Enzymoimmunoassays and Study of Fecal Extract Stability at
Room Temperature. Journal of Clinical Medicine Research, 396–404.
Asamblea Nacional República del Ecuador. (20 de Octubre de 2008). Asamblea Nacional.
Obtenido de www.asambleanacional.gob.ec
Bernstein, C., Eliakim, A., Fedail, S., Fried, M., Gearry, R., Goh, K.-L., . . . LeMair, A. (2015).
Enfermedad intestinal inflamatoria. Milwaukee: Organización Mundial de
Gastroenterología.
Biotec S.L. (26 de Febrero de 2019). Certest Biotec S.L. Obtenido de www.certest.es
Bonnín Tomàs, A., Vila Vidal, M., & Rosell Camps, A. (2007). Calprotectina fecal como
marcador diferencial entre patología gastrointestinal orgánica y funcional. Revista
Española de Enfermedades Digestivas, 689-693.
Borruel , N. (2003). Interacciones bacterianas con el sistema inmunológico intestinal:
inmunomodulación. Gastroenterología y Hepatología, 1-84.
Calderón M, M. N. (2018). Inflammatory Bowel Disease in Latin America: A Systematic
Review. Value in Health Regional Issues, 126-134.
Cheng, P. (2008). Inhibition of dendritic cell differentiation and accumulation of myeloid-
derived suppressor cells in cancer is regulated by S100A9 protein. The Journal of
Experimental Medicine, 2235-2249.
Coorevits, L., Baert, F., & Vanpouke, H. (2013). Faecal calprotectin: comparative study of the
Quantum Blue rapid test and an established ELISA method. Clinical Chemistry and
Laboratory Medicine, 825-831.
Damo, S., Kehl-Fie, T., Sugitani, N., Holt, M., Rathi, S., Murphy , W., . . . Chazin, W. (2013).
Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate
immune response to invading bacterial pathogens. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 3841-3846.
Donato, R. (2013). Functions of S100 Proteins. Current Molecular Medicine, 24-57.
67
Espinoza, E. (2018). Guíade validación de métodos de ensayo en laboratorios clínicos. Quito:
Servicio de Acreditación Ecuatoriano.
García, A. (2007). Gastroenterología. Endoscopia Diagnóstica y Terapéutica. Buenos Aires:
Panamericana.
Hsu, K. (2005). Regulation of S100A8 by glucocorticoids. The Journal of Immunology, 2318-
2326.
Hsu, K., Champaiboon, C., Guenther, B., Sorenson, B., Khammanivong, A., Ross, K., . . .
Herzberg, M. (2009). Anti-infective protective properties of s100 calgranulins.
Antiinflamm Antiallergy Agents Med Chem, 290-305.
Levine, A., Koletzko, S., Turner, D., Escher, J. C., Cucchiara, S., de Ridder, L., . . . Dias, J. A.
(2014). ESPGHAN Revised Porto Criteria for the Diagnosis of Inflammatory Bowel
Disease in Children and Adolescents. Journal of Pediatric Gastroenterology and
Nutrition, 795-806.
Marenholz, I. (2004). S100 proteins in mouse and man: from evolution to function and
pathology (including an update of the nomenclature). Biochemical and Biophysical
Research Communications, 1111-1122.
Méndez, J. P., Moreno, G. O., Plata, A. L., Molina, L. L., Ordoñez, K. A., Gamio, J. L., . . .
Baños, F. J. (2016). Características epidemiológicas y clínicas de la enfermedad
inflamatoria intestinal en un hospital de referencia de Lima-Perú. Revista de
Gastroenterología del Perú, 209-218.
Minitab. (2019). Soporte de Minitab® 18. Obtenido de www.support.minitab.com
Murao, S. (1989). A protein containing the cystic fibrosis antigen is an inhibitor of protein
kinases. The Journal of Biological Chemistry, 8356-8360.
Peakman, M., & Vergani, D. (2011). Inmunología Básica y Clínica. Barcelona : Elsevier.
Rector, C. (2009). Interaction of S100A8/S100A9-arachidonic acid complexes with the
scavenger receptor CD36 may facilitate fatty acid uptake by endothelial cells. The
Journal of Lipid Research, 2064-2071.
Ridascreen. (30 de Marzo de 2017). R-Biopharm AG. Obtenido de www.clinical.r-
biopharm.com
Rodríguez, F., Lobatón, T., Rodríguez, L., & Guardiola , J. (2013). Calprotectina fecal en el
diagnóstico de enfermedades inflamatorias. Gastroenterología y Hepatología, 375-442.
68
Ruiz Morales, Á., & Morillo Zárate, L. (2004). Epidemiología Clínica. Bogotá: Editorial
Médica Panamericana.
Ryckman, C. (2002). HIV-1 transcription and virus production are both accentuated by the
proinflammatory myeloid-related proteins in human CD4+ T lymphocytes. The Journal
of Immunology, 3307-3313.
Schulz, C., Wex, T., Arnim, U., & Malfertheiner, P. (2016). Validation of Two Calprotectin
Rapid Tests in Daily Routine. Clinical Laboratory, 1249-1254.
Sepúlveda Saavedra, J., & Soto Domínguez, A. (2014). Texto Atlas de Histología. Biología
celular y tisular. Mexico: McGraw-Hill Global Education Holdings.
Stríz, I., & Trebichavský, I. (2004). Calprotectina Pleiotropic Molecule in Acute and Chronic.
Physiological Research, 245-253.
Universidad de Granada. (28 de Mayo de 2019). Universidad de Granada. Obtenido de
https://www.ugr.es
Velikova, T., Shentova, R., Spassova, Z., Tumangelova - Yuzeir, K., Krasimirova, E., Ivanova-
Todorova, E. Altankova, I. (2018). Comparative Evaluation of Four Methods for Fecal
Calprotectin Testing: One-Step Card Test, A Point-of-care Lateral Flow Assay, A
Standard and an Automated ELISA. Scimaze Gastroenterology & Hepatology.
Walter, J. (2012). Relating Form and Function of EF-hand Calcium Binding Proteins. Accounts
of Chemical Research (ACS Publications), 171-179.
Yepes Barreto, I., Carmona, R., Díaz, F., & Marín Jiménes, I. (2010). Prevalencia y
características demográficas de la. Revista Colombiana de Gastroenterología, 107-11.
Zaia, A. (2009). Subversion of antimicrobial calprotectin (S100A8/S100A9 complex) in the
cytoplasm of TR146 epithelial cells after invasion by Listeria monocytogenes. Mucosal
Immunology - Nature, 43-53.
69
5.3.Anexos
Anexo A. Árbol de problemas
70
Anexo B. Categorización de variables
Comparación de técnicas
Pruebas de diagnóstico
Evaluación de técnicas de diagnóstico
Comparación de técnicas de diagnóstico
Técnica Inmunocromatográfi
ca
Principio
Métodos
Técnica ELISA
Principio
Métodos
Determinación de calprotectina
Calprotectina
Calprotectina fecal
Importancia clínica
Enfermedad inflamatoria
intestinal
Enfermedad de Chron
Colitis Ulcerosa
71
Anexo C. Instrumento de recolección de datos
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
BIOQUÍMICA CLÍNICA
INSTRUMENTO DE RECOLECCION DE DATOS
Nº Código Nº de
Orden
Género Edad Diagnóstico
presuntivo
Técnica
IC
Técnica
ELISA [mg/Kg]
Concordancia Comentario
CPF0001
CPF0002
CPF0003
CPF0004
CPF0005
76
Anexo D. Matriz de validación de instrumentos
77
78
79
Anexo E. Oficio de aprobación de laboratorios de referencia NetLab
80
Anexo F. Certificado de viabilidad ética.