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i
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
COMPARACIÓN DEL EFECTO NOOTRÓPICO EN BASE AL CONTENIDO DE
VITAMINA E, OMEGA 3, OMEGA 6 Y OMEGA 9, EN ACEITE Y POLVO DE
LINAZA ECUATORIANA (Linum usitatissimum) EN RATONES MUS
MUSCULUS
Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título
de Química Farmacéutica
Autora: Mónica Alexandra Chiguano Ibaza
Tutora: Borja Espín Dayana Paulina
DMQ, mayo 2018
ii
DEDICATORIA
A mis padres por su ejemplo, por su guía, consejos y por ser los pilares
fundamentales en mi vida a lo largo de los años.
A mi esposo Javier por su amor, apoyo incondicional y paciencia durante el
trascurso de la elaboración de esta investigación.
iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios por darme la vida, salud y protegerme durante todo mi
camino y por darme fuerzas para superar los obstáculos y dificultades que se han
presentado a lo largo de mi vida.
A mis padres por sus consejos, apoyo incondicional y por formarme con
valores que me han permitido crecer como persona.
Agradezco a mi esposo Javier por brindarme su apoyo su amor,
comprensión y ser mi compañero de vida.
Agradecimientos sinceros a todos quienes estuvieron presentes durante la
realización de este trabajo de investigación.
A la Dra. Dayana Borja por su guía, paciencia y amistad que me ha
brindado desde las aulas de clases y como tutora del presente trabajo.
Al Dr. Javier Santamaría por su exigencia desde las aulas y guía las cuales
me han ido formando y fueron de mucha utilidad durante la ejecución de este
trabajo de investigación.
A la Dra. Liliana Naranjo por ser una guía y por compartir su conocimiento
a través de las materias impartidas.
Al Dr. Walter Remache por sus recomendaciones que fueron de gran ayuda
para la realización de esta investigación.
A mis amigas Dayana, Angy, Belén, Magui que con su amistad han hecho
de la vida universitaria una de las experiencias más especiales.
iv
Yo, MONICA ALEXANDRA CHIGUANO IBAZA en calidad de autor del trabajo
de investigación: COMPARACIÓN DEL EFECTO NOOTRÓPICO EN BASE AL
CONTENIDO DE VITAMINA E, OMEGA 3, OMEGA 6 Y OMEGA 9, EN
ACEITE Y POLVO DE LINAZA ECUATORIANA (Linum usitatissimum) EN
RATONES MUS MUSCULUS, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a
hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contiene
esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en
los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización
y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación
Superior.
v
Yo, DAYANA BORJA en calidad de tutora del trabajo de investigación titulado
COMPARACIÓN DEL EFECTO NOOTRÓPICO EN BASE AL CONTENIDO
DE VITAMINA E, OMEGA 3, OMEGA 6 Y OMEGA 9, EN ACEITE Y POLVO
DE LINAZA ECUATORIANA (Linum usitatissimum) EN RATONES MUS
MUSCULUS, elaborado por la estudiante MONICA ALEXANDRA CHIGUANO
IBAZA de la Carrera de QUÍMICA FARMACÉUTICA, Facultad de CIENCIAS
QUÍMICAS de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne
los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo
epistemológico, incluidas las páginas preliminares, por lo que lo APRUEBO, a fin
de que sea sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se
designe.
En la ciudad de Quito, a los 13 días, del mes de abril del 2018.
vi
El Tribunal constituido por: Dra. Dayana Borja, Dr. Javier Santamaría y Dr. Walter
Remache, luego de revisar el trabajo de investigación titulado: COMPARACIÓN
DEL EFECTO NOOTRÓPICO EN BASE AL CONTENIDO DE VITAMINA E,
OMEGA 3, OMEGA 6 Y OMEGA 9, EN ACEITE Y POLVO DE LINAZA
ECUATORIANA (Linum usitatissimum) EN RATONES MUS MUSCULUS
previo a la obtención del título (o grado académico) de QUÍMICO
FARMACÉUTICO presentado por el señorita MONICA ALEXANDRA
CHIGUANO IBAZA APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman:
vii
Índice de Contenidos
Resumen ......................................................................................................................... xiv
Introducción…………………………………………………………………………….1
Capítulo I ......................................................................................................................... 2
1. El problema .............................................................................................................. 2
1.1. Planteamiento del problema .............................................................................. 2
1.2. Formulación del problema. ............................................................................... 3
1.3. Preguntas de investigación. ............................................................................... 3
1.4. Objetivos de la investigación. ........................................................................... 3
1.4.1. Objetivo general. ....................................................................................... 3
1.4.2. Objetivos específicos. ................................................................................ 4
1.5. Justificación e importancia ............................................................................... 4
Capítulo II………………………………………………………………………………6
2. Marco teórico ........................................................................................................... 6
2.1. Antecedentes. ....................................................................................................... 6
2.2. Fundamento teórico .............................................................................................. 8
2.2.1. Semilla de linaza ............................................................................................ 8
2.2.2. Descripción taxonómica. ................................................................................ 9
2.2.3. Descripción botánica. ..................................................................................... 9
2.2.4. Composición Química: ................................................................................... 9
2.2.5. Otros componentes. ........................................................................................ 9
2.2.6. Toxicidad de las semillas de linaza. ............................................................. 11
2.2.7. Estabilidad de la linaza y recomendaciones para su almacenamiento. ........ 11
2.2.8. Dosis diarias de consumo recomendadas de linaza. ..................................... 12
2.2.9. Control de calidad de drogas. ....................................................................... 12
2.2.10. Control de calidad de aceites fijos. ............................................................ 14
2.2.11. Componentes determinados en el aceite y polvo de linaza. ....................... 15
2.2.12. Relación de omega-3 con la neuroprotección. ........................................... 16
2.2.13. Fundamento de Ginkgo biloba como estándar. .......................................... 16
2.2.13. Enfermedad de Alzheimer (EA). ................................................................ 17
2.2.14. Fundamento para la determinación del efecto nootrópico. ........................ 18
2.2.15. Fundamento del test de aprendizaje. .......................................................... 19
2.2.16. Laberinto acuático de Morris. .................................................................... 20
viii
2.2.17. Laberinto radial de ocho brazos. ................................................................ 20
2.3. Marco legal ......................................................................................................... 21
2.4. Hipótesis. ............................................................................................................ 24
2.4.1. Hi: hipótesis de trabajo ................................................................................. 24
2.4.2. H0: hipótesis nula ......................................................................................... 24
2.5. Conceptualización de variables. ......................................................................... 25
2.5.1. Variables independientes ............................................................................. 25
2.5.2. Variables dependientes ................................................................................. 25
Capítulo III……………………………………………………………………………26
3. Marco metodológico ....................................................................................... 26
3.1. Diseño de la investigación. ............................................................................. 26
3.2. Población y muestra. ....................................................................................... 26
3.3. Métodos y Materiales. ..................................................................................... 26
3.3.1. Métodos: .................................................................................................. 27
3.3.2. Materiales .................................................................................................... 38
3.4. Diseño experimental. .......................................................................................... 40
3.5. Operacionalización de variables. .................................................................... 41
3.6. Técnicas e instrumentos de recolección de datos. .......................................... 41
3.7. Técnicas de procesamiento y análisis de datos. .............................................. 42
Capitulo IV……………………………………………………………………………43
4. Análisis y discusión de resultados .......................................................................... 43
4.1. Etapa1: búsqueda bibliográfica e identificación taxonómica. ............................ 43
4.2. Etapa 2: Control de calidad de semillas y aceite de linaza de linaza. ................ 43
4.2.1. Control de calidad de semillas de linaza. ..................................................... 43
Determinación de porcentaje de material extraño en semillas de linaza. .............. 43
Control microbiológico .......................................................................................... 44
4.2.2. Extracción del aceite de semillas de linaza ..................................................... 46
4.2.3. Control de calidad de aceite de linaza. ............................................................ 47
4.3 Etapa 3: Proceso Experimental. .......................................................................... 54
4.3.1. Laberinto acuático de Morris. ...................................................................... 54
4.3.2. Laberinto radial de ocho brazos ................................................................... 58
4.3.3. Pesaje de animales de experimentación. ...................................................... 63
4.3.4. Necropsia de animales de experimentación ................................................. 66
Capítulo V……………………………………………………………………………..70
ix
5. Conclusiones y recomendaciones .......................................................................... 70
5.1. Conclusiones ...................................................................................................... 70
5.1.1. Etapa 1: Búsqueda bibliográfica e identificación taxonómica. .................... 70
5.1.2. Etapa 2: Control de calidad de semillas y aceite de linaza........................... 70
5.1.3. Etapa 2: Fase experimental. ......................................................................... 71
5.1.4. Pesaje de animales de experimentación. ...................................................... 71
5.1.5. Necropsia. ..................................................................................................... 71
5.2. Recomendaciones ............................................................................................... 72
5.2.1. Control de calidad de semillas y aceite de linaza. ........................................ 72
5.2.2. Laberinto acuático de Morris. ...................................................................... 72
5.2.3. Laberinto radial de ocho brazos. .................................................................. 73
5.2.4. Pesaje de animales de experimentación. ...................................................... 73
5.2.5. Necropsia. ..................................................................................................... 73
Bibliografía……………………………………………………………………………74
Anexos ....................................................................................................................... 79
Ilustraciones. ............................................................................................................. 91
Índice de Anexos
Anexo A. Árbol de problemas ...................................................................................... 79
Anexo B. Certificado de identificación taxonómica de la planta de linaza .................. 80
Anexo C. Registro de calidad ficha de chequeo de entrega de biomodelos y fluidos
sanguíneos. .................................................................................................................... 81
Anexo D. Certificado de análisis de cuantificación de vitamina E en linaza tostada y
sin tostar. ....................................................................................................................... 82
Anexo E. Laberinto Acuático de Morris: Resultados del tiempo de latencia. .............. 83
Anexo F. Laberinto radial: resultados del tiempo de latencia. ..................................... 84
Anexo G. Laberinto Radial: Número de desaciertos .................................................... 85
Anexo H. Peso de los ratones en gramos en función de las semanas de
experimentación ............................................................................................................ 86
Anexo I. Laberinto acuático de Morris: Comparaciones de cada tratamiento con
respecto al primer día. ................................................................................................... 87
x
Anexo J. Laberinto acuático de Morris: comparaciones de cada tratamiento con
respecto al primer día. ................................................................................................... 88
Anexo K. Laberinto radial: Comparaciones de cada tratamiento con respecto al primer
día. ................................................................................................................................. 89
Anexo L. Laberinto radial: Comparaciones de significancia entre tratamientos por
días. ............................................................................................................................... 90
Índice de Ilustraciones
Ilustración I. Laberinto acuático de Morris usado para la evaluación de memoria y
aprendizaje. ....................................................................................................................... 35
Ilustración II. Laberinto radial de ocho brazos usado para la evaluación de memoria y
aprendizaje ........................................................................................................................ 36
Ilustración III. Cromatografía de semilla de linaza sin tostar. .......................................... 49
Ilustración IV. Cromatografía de semilla de linaza tostada .............................................. 50
Ilustración V. Semillas de linaza………………………………………………………...91
Ilustración VI. Material extraño encontrado en semillas de linaza……………………...91
Ilustración VII. Linaza Sin Tostar (TSA)…………………………………………..……91
Ilustración VIII. Linaza tostada (TSA)……………………………………………...…...91
Ilustración IX. Vista al microscopio (bacilos Gram positivos)……………………….....92
Ilustración X. Linaza Sin tostar (SAB) ............................................................................. 92
Ilustración XI. Linaza tostada (SAB) ................................................................................ 92
Ilustración XII. Vista al microscopio de levaduras ........................................................... 92
Ilustración XIII. Proceso de tostado de semillas de linaza ................................................ 93
Ilustración XIV. Determinación cualitativa de ácido cianhídrico….................................93
Ilustración XV. Resultados de la prueba de presencia de ácido cianhídrico…………….93
Ilustración XVI. Proceso de extracción de aceite de linaza..............................................93
Ilustración XVII. Prensa hidráulica utilizada para la extracción de aceite de linaza........94
Ilustración XVIII. Aceite de linaza……………………………………………............…94
Ilustración XIX. Determinación de la densidad de aceite de linaza……………………..94
Ilustración XX. Determinación del índice de Acidez…………………………............…94
xi
Ilustración XXI. Determinación del índice de Yodo…………………......…………….95
Ilustración XXII.Determinación del índice de Saponificación…………...................…..95
IlustraciónXXIII. Determinación del índice de Peroxido ………….............……………95
Ilustración XXIV. Administración de aceite de linaza con micropipeta………………...96
Ilustración XXV. Administración de polvo de linaza con sonda neonatal………………96
Ilustración XXVI. Laberinto acuático de Morris...............................................................96
Ilustración XXVII. Laberinto radial de ocho brazos.........................................................96
Ilustración XXVIII. Ratón hembra administrado polvo de linaza: En el que se puede
observar alopecia en el hocico que podría ser un efecto adverso......................................97
Ilustración XXIX. Disección de animales de experimentación.........................................97
Índice de Tablas
Tabla 1. Cantidad de ginkgo biloba, aceite y polvo de linaza administrados. .................. 33
Tabla 2. Dimensiones e indicadores de las variables. ....................................................... 41
Tabla 3.Material extraño en semillas de linaza ................................................................. 43
Tabla 4. Porcentaje de grasa en semillas de linaza ........................................................... 44
Tabla 5. Resultados del control microbiológico de semillas de linaza tostadas y sin tostar
........................................................................................................................................... 44
Tabla 6. Volumen de aceite de linaza obtenido por prensado en frío. .............................. 46
Tabla 7. Cantidad de vitamina E en aceite de linaza ......................................................... 47
Tabla 8. Resultados de la cromatografía de aceite de linaza sin tostar ............................. 48
Tabla 9. Resultados de la cromatografía de aceite de linaza tostada ................................ 49
Tabla 10. Densidad relativa de aceite de linaza ................................................................ 50
Tabla 11. Índice de acidez de aceite de linaza .................................................................. 51
Tabla 12. Índice de esterificación de aceite de linaza ....................................................... 52
Tabla 13. Índice de yodo de aceite de linaza .................................................................... 52
Tabla 14. Índice de saponificación de aceite de linaza ..................................................... 53
Tabla 15. Índice de peróxido de aceite de linaza .............................................................. 53
Tabla 16. Resultados del análisis de varianza (ANDEVA) para el Laberinto Acuático de
Morris. ............................................................................................................................... 54
Tabla 17. Prueba de Duncan al 5 % para el factor grupo .................................................. 55
xii
Tabla 18. Resultados del análisis de varianza (ANDEVA) del tiempo de latencia para el
Laberinto radial de 8 brazos .............................................................................................. 58
Tabla 19. Prueba de Duncan al 5 % para el factor grupo .................................................. 59
Tabla 20. ANDEVA para el peso inicial de animales de experimentación. ..................... 63
Tabla 21. Peso inicial: Prueba de Duncan al 5 % para el factor sexo ............................... 63
Tabla 22. ANDEVA para la ganancia de peso de animales de experimentación. ............ 64
Tabla 23. Resultados de la necropsia de ratones hembra .................................................. 66
Tabla 24. Resultados de la necropsia de ratones macho ................................................... 67
Índice de Gráficos
Gráfico 1. Laberinto acuático de Morris: Tiempo de latencia en función de los días de
evaluación para cada grupo. .............................................................................................. 56
Gráfico 2. Laberinto radial: Tiempo de latencia en función de los días de evaluación para
cada tratamiento. ............................................................................................................... 60
Gráfico 3. Laberinto Radial: Número de desaciertos en función del día de evaluación
para cada grupo. ................................................................................................................ 61
Gráfico 4. Peso de ratones durante la experimentación. ................................................... 64
xiii
Lista de abreviaturas
ARCSA: Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria
UFC: Unidades formadoras de colonias
AAL: Ácido alfa linolénico
AL: Ácido linoleico
AO: Ácido Oleico
DHA: Ácido docosahexaenoico
D.B.C.A: Diseño de Bloques Completamente al Azar
EGb: Extracto de Ginkgo Biloba
ARCSA: Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria
TSA: Tryptic Soy Agar
SAB: Agar Sabouraud Dextrosa
BHT: Butil hidroxitolueno
xiv
Universidad Central del Ecuador
Facultad de Ciencias Químicas
Química Farmacéutica
Comparación del efecto nootrópico en base al contenido de vitamina E, omega 3,
omega 6 y omega 9, en aceite y polvo de linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum) en
ratones Mus musculus.
Autor: Chiguano Ibaza Mónica Alexandra
Tutora: Borja Espín Dayana Paulina
Resumen
El proceso de atención y memoria constituyen un elemento principal para el
aprendizaje, este es muy fluido en la niñez y juventud, pero a medida que pasan los
años disminuye produciendo distintas enfermedades, siendo predominantes las
neurodegenerativas. En base a esto la presente investigación se desarrolló con el
propósito de determinar si el polvo y aceite de linaza (Linum usitatissimum) cultivada
en Ecuador tienen el mismo efecto nootrópico en ratones (Mus musculus) que el
extracto de Ginkgo biloba usado como estándar. Para esta experimentación fueron
empleados 4 grupos de 6 ratones: 3 machos y 3 hembras, de 3 meses de edad, de los
cuales al grupo 1 se le administró agua destilada, al grupo 2 extracto de ginkgo biloba,
al grupo 3 aceite de linaza y al grupo 4 polvo de linaza. Posteriormente, para evaluar su
efecto se sometió a los 4 grupos al test de laberinto acuático de Morris y laberinto radial
de ocho brazos; Finalmente se hizo uso del programa estadístico SEDEX ejecutando un
análisis factorial A x B con diseño de bloques completamente al azar (DBCA),
obteniéndose como resultados para el laberinto acuático de Morris que permite hacer
inferencias respecto a la memoria de referencia, el polvo de linaza resultó ser más
efectivo que el aceite de linaza y que el ginkgo biloba. Sin embargo, en el laberinto
radial que permite hacer inferencias sobre la memoria de referencia y la memoria de
trabajo. Para la primera no hubo diferencia significativa entre polvo, aceite y ginkgo
biloba y para el caso de la memoria de trabajo no hubo diferencia significativa entre el
polvo y aceite de linaza, siendo ambos mejor que ginkgo biloba.
PALABRAS CLAVE: LINUM USITATISSIMUM, MUS MUSCULUS, GINKGO
BILOBA, EFECTO NOOTRÓPICO
xv
ABSTRACT
The process of attention and memory are a main element for learning, this is very fluid
in childhood and youth, but as the years pass decreases producing different diseases,
including neurodegenerative diseases. Based on this, the present investigation was
developed with the purpose of determining if the linseed powder and oil cultivated in
Ecuador (Linum usitatissimum), has the same nootropic effect in mice (Mus musculus)
as the extract of ginkgo biloba that has been used as standard. For this, four groups of
six mice were use: three males and three females of three months old. The first group
was given distilled water; to the second group ginkgo biloba extract; to the third group
linseed oil, and to the fourth group, linseed powder. Subsequently, to evaluate its effect,
the four groups were underwent Morris’s maze test and Radial maze. Finally the
SEDEX statistical program was use, executing a factorial analysis A x B with
completely random blocks design (D.B.C.R), In Morris's maze which allows us to make
inferences regarding reference memory, the following result was obtained: linseed
powder proved to be more effective than linseed oil and ginkgo biloba; However, in the
radial maze, which allows making inferences about reference memory and working
memory, there was no significant difference between powder, linseed oil and ginkgo
biloba, in the first case. But as for working memory, there was no difference significant
between powder and linseed oil, both being better than ginkgo biloba.
KEY WORDS: LINUM USITATISSIMUM, MUS MUSCULUS, GINKGO BILOBA,
NOOTROPIC EFFECT
1
Introducción
El presente proyecto presenta la comparación del efecto nootrópico de polvo y
aceite linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum,) debido a que sus semillas poseen gran
cantidad de omega 3, omega 6 y omega 9; los cuales tienen un efecto neuroprotector,
además posee cantidades significativas de vitamina E que actúan como antioxidante,
protegiendo las membranas biológicas de su oxidación, reduciendo de esta manera el
proceso neurodegenerativo. Para evaluar la actividad nootrópica los animales fueron
sometidos a 2 pruebas de aprendizaje espacial y de trabajo, usando el laberinto radial de
ocho brazos y laberinto acuático de Morris finalmente para interpretar los resultados se
ejecutó un análisis factorial A x B de bloques completamente al azar.
En el primer capítulo se expone el problema, el cual contiene los siguientes
elementos: su planteamiento y formulación, las preguntas directrices, los objetivos, la
justificación, y la importancia del proyecto de investigación.
En el segundo capítulo se aborda el marco teórico, donde se mencionarán los
antecedentes bibliográficos de la linaza (Linum usitatissimum), el fundamento teórico de
la investigación, y la conceptualización de variables.
El tercer capítulo presenta la metodología, que consta del diseño de la
investigación, los materiales y métodos que se utilizaron y aplicarán, la
operacionalización de las variables, las técnicas de análisis.
En el cuarto capítulo se detalla los resultados obtenidos durante la
experimentación con su respectivo análisis y las discusiones a las que se llegaron tras
realizar la investigación.
Finalmente en el quinto capítulo se presenta las conclusiones a las que se
llegaron luego de analizar los resultados obtenidos y las recomendaciones que se
siguieren para posteriores estudios.
2
Capítulo I
1. El problema
1.1. Planteamiento del problema
El proceso de atención y memoria constituyen un elemento principal para el
aprendizaje. Este es muy fluido en la niñez y juventud, pero a medida que pasan los
años disminuye produciendo distintas enfermedades, siendo predominantes las
neurodegenerativas. Cabe recalcar que la disminución de la capacidad cerebral conduce
a demencias primarias, produciendo un daño progresivo e irreversible del cerebro.
Siendo la más representativa la enfermedad de Alzheimer, responsable del 50 al 60 %
del total de casos (Guitierrez & Rodriguez, 2014). La ausencia de tratamientos curativos
ha incrementado el interés en identificar distintas intervenciones capaces de preservar la
cognición por lo que las personas han comenzado a buscar un sinnúmero de fármacos
que estimulen la capacidad cerebral, las llamadas sustancias nootrópicas, que son
suministradas por sus efectos estimulantes en la memoria y por elevar sus funciones
mentales como la atención y el aprendizaje. En el mercado existen varios medicamentos
sintéticos con actividad nootrópica, como el piracetam, que se ha convertido en uno de
los más consumidos, pero que presentan efectos adversos como trastornos del sistema
nervioso central y periférico como alucinaciones, pérdida de equilibrio, ataxia y
trastornos corporales globales como la astenia (Vademecum, 2014), lo que aumenta el
riesgo en la salud de la población.
En nuestro país existe actualmente 18,198 especies de plantas vasculares de las
cuales 17,748 son nativas (Ministerio del Ambiente para el Convenio sobre la
Diversidad Biológica, 2015). Al ser un país mega diverso, existe también una falta de
información sobre los múltiples usos y beneficios que se pueden obtener plantas de uso
tradicional y fácil acceso. Un ejemplo de lo anterior es la linaza la cual ha sido
empleada desde hace 5.000 años por su alto contenido de fibra soluble e insoluble,
siendo usada principalmente en malestares, como el estreñimiento (Cunnane &
Thompson, 1995), haciendo que las personas pierdan el interés en usarla en otro tipo de
patologías diferentes a su uso tradicional que ha pasado de generación en generación.
En la sociedad actual existen perjuicios hacia los productos naturales que posean
un efecto terapéutico ya que se los considera inferiores desde el punto de vista
farmacológico, debido a que en su mayoría requieren de una mayor dosis y sus
tratamientos requieren de su administración durante tiempos prolongados.
Por otro lado, la falta de recursos para este tipo de estudios ha influido en su
desarrollo, ya que las grandes empresas no invierten en este tipo de investigación por
3
dedicarse al desarrollo de medicamentos que posean efecto nootrópico en un menor
tiempo a base a moléculas sintéticas haciendo que no sean tomados en cuenta
metabolitos importantes presenten en las semillas de linaza como el omega 3, omega 6 y
omega 9, cuyas moléculas son utilizadas por las células del cerebro para construir sus
membranas celulares, y la vitamina E que protege de la oxidación a las membranas
celulares de todo el organismo, en especial, a las células del sistema nervioso (Martinez,
2017).
En la presente investigación se evidenció la importancia del estudio de plantas
de uso tradicional que se cultivan en el Ecuador, como la linaza permitiendo evaluar la
calidad de sus semillas enlazando los resultados obtenidos con los estudios taxonómicos
y etnobotánicos existentes de la linaza canadiense, además se aportó con la evidencia in
vivo usando ratones Mus musculus como sujetos de experimentación la actividad no se
evaluó la actividad nootrópica del aceite y polvo de linaza usando el test de laberinto
radial de ocho brazos y el laberinto acuático de Morris.
1.2. Formulación del problema.
¿El consumo de aceite o polvo de linaza (Linum usitatissimum) presenta igual efecto
nootrópico en ratones Mus musculus?
1.3. Preguntas de investigación.
¿Cuáles son las características botánicas y taxonómicas de la linaza ecuatoriana
(Linum usitatissimum)?
¿Qué método se utiliza para extraer el aceite fijo de semillas de linaza ecuatoriana
(Linum usitatissimum) y que controles de calidad se realizan a este aceite?
¿Qué contenido de vitamina E, omega 3, omega 6 y omega 9 se encuentra presente
en el aceite fijo de linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum)?
¿Cómo se determina el efecto nootrópico que produce el consumo del aceite y
polvo de linaza?
1.4. Objetivos de la investigación.
1.4.1. Objetivo general.
Comparar el efecto nootrópico en base al contenido de omega 3, omega 6,
omega 9 y vitamina E, de aceite y polvo de linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum) en
ratones Mus musculus.
4
1.4.2. Objetivos específicos.
Realizar la caracterización botánica e identificación taxonómica de las semillas de
linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum).
Realizar la extracción del aceite fijo de semillas de linaza ecuatoriana (Linum
usitatissimum) y su correspondiente control de calidad.
Determinar el contenido de vitamina E, omega 3, omega 6 y omega 9 en el aceite fijo de
linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum).
Comparar el efecto nootrópico de polvo y aceite de linaza ecuatoriana (Linum
usitatissimum) con extracto de Ginkgo biloba como estándar, en ratones al ser
sometidos al test de laberinto acuático de Morris y laberinto radial de ocho brazos.
1.5. Justificación e importancia
En los últimos años ha aumentado el interés de las empresas y de los
consumidores por la producción y consumo de productos nutracéuticos, que son
aquellos que además de aportar un considerable alimento nutricional pueden prevenir o
mejorar la salud humana. Dentro de estos se encuentra los que poseen omega 3, omega
6 y omega 9, que contrarrestan los efectos de las enfermedades neurodegenerativas, las
cuales ocurren por combinación de diversos factores ambientales, nutricionales y
genéticos.
En los factores nutricionales se ha comprobado la deficiencia de omega 3, ácido
graso que participa en los procesos de división celular, ocasiona una disminución
significativa del tamaño de las neuronas del hipocampo, el hipotálamo y la corteza. Pero
su ausencia también se asocia con la reducción de catecolaminas, que afectan el
transporte de la glucosa y la utilización de esta en el cerebro. Todas estas variables
repercuten en el aprendizaje y memoria de las personas (Portillo, 2012).
El omega 3 desempeña un papel importante en las funciones cerebrales, puesto
que mantienen en óptimas condiciones a las membranas neuronales, permitiendo la
fluidez de la membrana y ayudando a conservar su espesor. El ácido docohexaenoico
(DHA), formado a partir del grupo omega, es el ácido graso más abundante en el
cerebro, que se encuentra concentrado en las células nerviosas sinápticas, que suelen ser
las participantes de los procesos y señalización de las células neuronales. Por lo que una
dieta rica en omega (3, 6 y 9) podría favorecer las funciones neuronales (Sanhueza,
Nieto, & Velenzuela, 2004).
5
Según investigaciones químicas, existe una gran variedad de plantas que
contienen altas cantidades de omegas, como la chía (Cuyan, 2016), comprobándose su
efecto sobre la memoria y el aprendizaje. Sin embargo, en el presente estudio se evaluó
el efecto nootrópico de la linaza, puesto que en la Universidad de Chile se comprobó
que esta planta posee un 15,76% de ácido oleico (omega 9), mayor al de la chía (8,9%),
y un 55,3% de ácido linolénico (omega 3), mientras en la chía es de 51,8%. Con estos
resultados, se presume que la linaza, al tener mayor cantidad de estos componentes,
podría ejercer una mayor acción sobre la memoria y el aprendizaje. Otro de los
componentes que se analizará es la vitamina E, la que además de ayudar a prevenir el
estrés oxidativo del cuerpo, se convierte en un antioxidante favorable para la salud
neuronal, de acuerdo con un estudio realizado por la Universidad Estatal de Oregón
(EEUU) y recogido por la revista The Journal of Lipid Research (Jimenez, Masson, &
Quitral, 2013).
Basándonos en estos datos, se usó el aceite y polvo de semilla de linaza en la
alimentación de ratones Mus musculus para comparar su efecto nootrópico. Cabe
resaltar que el estudio citado fue realizado a partir de la linaza (Linum usitatissimum
canadiense), pero en la presente investigación se empleó linaza de origen ecuatoriano,
dado que no existen investigaciones previas.
Para poder comparar el comportamiento de los roedores se tomó como marcador
un extracto estandarizado de Ginkgo Biloba, cuya acción neuroprotectora y antioxidante
ha demostrado mejorar la sintomatología y la progresión de enfermedades neurológicas,
como el alzheimer, y mejorar ciertas funciones cognitivas en sujetos normales (Navarro,
2007).
De acuerdo con la Base de Datos y la revisión de la Colección del Herbario
Alfredo Paredes de la Universidad Central de la Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales de la Universidad Central del Ecuador, y de la Escuela de Ciencias Biológicas
de la (Pontificia Universidad Católica) PUCE, en el Ecuador continental se cultiva la
semilla de lino de la especie Linum usitassimun en algunas provincias de la Sierra:
Carchi, Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Chimborazo y Bolívar (Agricultura, 2013).
Finalmente, al ser una semilla cultivada en abundancia en el Ecuador, es
posible aumentar la producción de este alimento funcional para la alimentación humana;
dado que la linaza es una alternativa accesible para la industria y el mercado
consumidor, entre otros aspectos por su bajo costo.
6
Capítulo II
2. Marco teórico
2.1. Antecedentes.
Título: Ácidos grasos omega-3 (EPA Y DHA) y su aplicación en diversas
situaciones clínicas
Autor: Rodrigo Valenzuela Gladys Tapia, Marcela González, Alfonso Valenzuela
Año de publicación: septiembre 2011
Resumen: En este documento se revisan las posibles aplicaciones clínicas de
ácidos grasos omega-3 (EPA y DHA), tomando como referencia estudios realizados en
humanos, animales y en modelos celulares in vitro. Con esto, los autores consiguieron
revelar un efecto neuroprotector de omega-3, especialmente en lesiones inducidas por
isquemia y por excitotoxicidad, la cual es producida por neurotransmisores (el
glutamato principalmente). Por otro lado, se enfatizó en un estudio realizado en ratas
con lesión cerebral traumática y ratas alimentadas con una dieta pobre en DHA, las
cuales presentaron trastornos de aprendizaje y de la función cognitiva, efectos que se
revierten al aumentar DHA (Valenzuela, Tapia, González, & Valenzuela, 2011).
Conclusiones: La evidencia sugiere que el omega-3 posee aplicaciones
prometedoras en la prevención y/o tratamiento de diferentes patologías clínicas como
las neurodegenerativas, las cardiovasculares, las cancerígenas e las inflamatorias.
Título: Influencia de los ácidos grasos omega 3 de la linaza (Linum
usitatissimum) en el desarrollo del cerebro de ratas recién nacidas.
Autor: Lenzi Almeida, Teles Boaventura, Guzmán Silva
Año de publicación: mayo 2001
Resumen: La relación de omega-3 en el desarrollo del sistema nervioso ha sido
bien documentada, dado que la semilla de linaza posee una gran cantidad de ácidos
grasos omega-3. En este estudio se evaluó la influencia del omega-3 en el desarrollo del
cerebro de ratas recién nacidas, al alimentar a las que estaban preñadas con una dieta
basada en linaza con caseína modificada (suplementada con fibras y aceite de soja).
Finalizado el proceso de alimentación, las crías recién nacidas fueron pesadas y
sometidas al proceso de eutanasia para pesar sus cerebros. Estos datos fueron arrojados
7
en un perfil lipídico, a través de la cromatografía de gases (Almeida, Teles, & Silva,
2011).
Conclusiones: La alimentación materna a base de una dieta con linaza, durante
el embarazo, influye de manera significativa en la incorporación de ácidos grasos
omega-3 en el tejido cerebral, dando como resultado un gran desarrollo de este órgano
en ratas recién nacidas. Esto se comprobó con la verificación del aumento del peso
cerebral (39%) y el peso relativo del cerebro (37%). También existió un aumento en el
ácido docosahexaenoico (DHA) (38%), así como en el total de omega-3 (62%)
(Almeida, Teles, & Silva, 2011).
Título: Composición química de semillas de chía, linaza y rosa mosqueta y su
aporte en ácidos grasos omega-3
Autor: Paula Jiménez P, Lilia Masson, Vilma Quitral
Año de publicación: junio 2013
Resumen: El objetivo de este estudio fue caracterizar, según la composición
química y análisis de sus aceites, semillas de oleaginosas: chía (Salvia hispanica), linaza
(Linum usitatissimum) y rosa mosqueta (Rosa rubiginosa). Luego de realizar el análisis
químico proximal de las semillas, se determinó, en los aceites de estas materias primas,
la composición en ácidos grasos, contenido de tocoles y estabilidad oxidativa. La
composición química se caracterizó por un alto contenido de grasa (en chía y linaza),
proteína (en chía y linaza) y fibra dietética (en rosa mosqueta). Los ácidos grasos de
estos aceites fueron en mayor cantidad poliinsaturados: linolénico (omega 3) en chía y
linaza, y linoleico (omega 6) en rosa mosqueta. El contenido de tocoles y la estabilidad
oxidativa fue mayor en rosa mosqueta (Jiménez, Masson, & Quitral, 2013).
Conclusiones: En las semillas estudiadas, el contenido de ácidos grasos presenta
el siguiente orden decreciente: linaza > chía > rosa mosqueta. Esto demostraría que la
incorporación de aceites vegetales altos en ácido linolénico permite mejorar la relación
omega-6 / omega-3, y favorecer la conversión a EPA y DHA. Esto permitió especificar
que las semillas y aceites estudiados, especialmente la linaza por presentar mayor
cantidad de omega-3, podría ser utilizada como una fuente potencial de ingredientes
funcionales altos en ácidos grasos (Jiménez, Masson, & Quitral, 2013).
Título: Comparación de ácidos grasos omega 3, 6 y 9 en la semilla de lino
(Linum usitatissimum) ecuatoriana y canadiense por cromatografía de gases.
Autor: Jessica del Pilar Durán Córdova
8
Año de publicación: 2014
Resumen: En este proyecto de investigación se realizó la cuantificación de los
ácidos grasos alfa linolénico omega-3 (AAL), linoléico omega-6 (AL) y oléico omega-9
(AO) de la semilla de lino (Linum usitatissimum) canadiense y ecuatoriana por
cromatografía de gases, para comparar los resultados en la prueba t de Student. El
resultado que se obtuvo fue que la semilla de linaza canadiense posee: AAL (23,343%),
AL (5,609%) y AO (3,817%) y la semilla de lino ecuatoriana contiene: AAL
(22,777%), AL (6,270%) y AO (3,701%) (Durán, 2014).
Conclusiones: Al observar los resultados que se obtuvieron en la cromatografía
de gases, se determinó que la semilla de linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum)
también es de alta calidad, ya que su contenido de ácidos grasos es similar a la linaza
canadiense. De allí que ésta semilla podría ser utilizada en la evaluación del efecto
nootrópico en ratones Mus musculus (Durán, 2014).
2.2. Fundamento teórico
2.2.1. Semilla de linaza
La semilla de lino, mejor conocida como linaza, es una planta herbácea la cual
pertenece a la familia de las lináceas. El nombre Linum proviene de la palabra celta
“lin” que significa “hilo”, y el nombre usitatissimum proviene del latín que significa
“muy útil”. Se cree que esta planta proviene de las regiones del sudoeste de Asia,
incluyendo la India, Sur de Afganistán y las regiones adyacentes de Bokhara, Kasmir,
Persia y Asia menor. Esto quiere decir que, dicha zona habría dado origen a los linos de
flores y semillas pequeñas. Otra posible región donde se habría originado es la zona del
Mar Mediterráneo, donde se localizan linos de flores y de grandes semillas (Remussi,
1951).
Se sostiene que en los países templados o fríos, cerca de la orilla del mar, se dan
los productos más selectos: Inglaterra, Francia, Bélgica, Holanda y Livonia ; aunque el
mayor productor del mundo, de acuerdo a cifras de la Food and Agricultural
Organization of United Nations (FAO, 2008), es Canadá, con 791,000 toneladas de
producción anual. Existen varias especies de lino, y dentro de las más destacadas se
encuentran: Linum aquilinum: planta que se usa en Chile como estomática y aperitiva;
Linum catharticum: planta anual de Europa que posee propiedades purgantes débiles,
cultivada en Inglaterra, Suecia y Dinamarca; Linum perenne: crece en Siberia y produce
la variedad procumbens, conocida por producir una buena hilaza; Linum selaginoides:
crece como arbusto en Perú donde se le usa como aperitivo; y Linum usitatissimum: la
cual es utilizada por la gran cantidad de aceite que presenta y es mayormente cultivada
en Europa y América (Durán, 2014).
9
2.2.2. Descripción taxonómica.
Nombre Común: Linaza
Nombre Científico: Linum usitatissimum
Familia: Linaceae
Género: Linum
Parte utilizada: Semillas (Espinosa, 2009).
2.2.3. Descripción botánica.
La linaza es una planta herbácea anual con tallos simples de un metro de altura,
que posee hojas sésiles, alternas, lineales o lanceoladas, con flores que presentan un
color azul claro o blanco con anteras y pistilos azules. Las flores están reunidas en un
corimbo terminal, con un fruto en forma de cápsula y globuloso. Por último, posee
semillas de color café, ovaladas y agudas en el extremo brillante (Fonnegra & Jimenez,
2007).
2.2.4. Composición Química:
Dentro de la composición química de la semilla de linaza posee grasa, proteína y
fibra dietética. En promedio, la linaza canadiense contiene 41% de grasa, 20% de
proteína, 28% de fibra dietética total, 7.7% de humedad y 3.4% de ceniza, que es un
residuo rico en minerales que se quedan después de quemar las muestras. A demás, la
composición de la linaza puede variar dependiendo de la genética, el medio ambiente,
el procesamiento de la semilla y el método de análisis utilizado. Finalmente, el
contenido de proteína de la semilla se reduce en la medida que se incrementa el
contenido de aceite (Morris, 2007).
2.2.5. Otros componentes.
Fibra dietética
La fibra es una estructura material que se encuentra en las paredes celulares de
las plantas y tiene importantes beneficios para la salud de los humanos. Existen dos
tipos principales de fibras:
10
La fibra dietética consiste en carbohidratos vegetales no digeribles y otros
materiales que se encuentran intactos en las plantas. Las semillas enteras de linaza y la
linaza molida son fuentes de fibra dietética (Morris, 2007).
La fibra funcional consiste en carbohidratos no digeribles que han sido extraídos
de las plantas, purificados y agregados a los alimentos y otros productos. Como los
mucílagos extraídos de las semillas de linaza que han sido agregados a los laxantes ó
jarabes para la tos (Morris, 2007).
Fibra Soluble e Insoluble de la Linaza.
La linaza contiene tanto fibra dietética soluble como insoluble. La fibra dietética
actúa como un agente esponjante en el intestino incrementando el peso fecal y la
viscosidad del material digerido, mientras que reduce el tiempo de tránsito del material
a través del intestino. De esta manera, la fibra dietética ayuda a controlar el apetito y la
glucosa en la sangre, promoviendo la laxación y disminución de lípidos en la sangre.
Las dietas ricas en fibra dietética pueden ayudar a reducir el riesgo de enfermedades del
corazón, diabetes, el cáncer colorectal y la obesidad. El contenido de fibra dietética
soluble e insoluble de la linaza varía, dependiendo del método de extracción de fibra y
análisis químico (Morris, 2007).
La fibra total
Representa alrededor del 28% del peso de las semillas de linaza sin desgrasar.
Las mayores fracciones de fibra en la linaza son:
La celulosa:
Principal estructura material en las paredes celulares de las plantas (Morris,
2007).
Los mucílagos:
Son polisacáridos que se tornan viscosos una vez que son mezclados con agua u
otros líquidos. El mucílago de la linaza consiste en tres distintos tipos de arabinoxilanos
que forman grandes agregaciones en solución y contribuyen a sus cualidades de gel. La
composición química del mucilago (3 a 10%): polisacáridos neutros y ácidos
compuestos principalmente por arabino-ramnosa, galactosa, xilosa y ácidos
galacturónico y manurómico. Fibras insolubles (25%): celulosa. Aceite fijo (30 a 45%):
triglicéridos de ácido linolénico, linoleico y oleico. Lignanos:
secoisolariciresinoldiglucosido (0,2%). Heterósidos cianogenéticos (0,1 a 1,5%):
11
linustatina y neolinustatina. Otros: proteínas (25%), esteroles, triterpenos, sales
minerales, entre otros (Morris, 2007).
La lignina:
Una fibra altamente ramificada que se encuentra dentro de las paredes celulares
de plantas leñosas. Las ligninas están relacionadas con un componente similar
denominado: Lignanos. Ambos son partes de las paredes celulares de las plantas y están
asociados con los carbohidratos de las paredes celulares. Las ligninas contribuyen a la
fuerza y rigidez de las paredes celulares. Los lignanos son fitoquímicos (“fito” significa
“planta”), cuyo papel en la nutrición humana, particularmente en la prevención del
cáncer, es estudiada activamente (Morris, 2007).
2.2.6. Toxicidad de las semillas de linaza.
El contenido de glucósidos cianógenos en la semilla de lino varia con los pisos
ecológicos, las condiciones ambientales y la edad, reduciéndose el contenido de 5,0
g/100g en las semillas inmaduras a 0,1 g/100 g en las maduras. Para disminuir esta
sustancia tóxica se recomienda que la semilla sea consumida tostada, horneada o
expuesta a algún tratamiento con calor; ya que algunos estudios han comprobado que se
reduce la aparición de este compuesto en un 83-100 % (Figuerola, Muñoz, & Estévez,
2008).
De acuerdo con el estudio publicado por la revista peruana de Medicina
Experimental y Salud Pública, donde se evaluó la dosis letal media (DL50) de aceite de
linaza en ratones por vía oral, no se evidenciaron signos de toxicidad o muerte en los
roedores, sugiriendo una DL50 sobre los 37 g/kg. Considerándose una sustancia inocua
a los 60 días ya que las sustancias que presentan una DL50 por encima de los 5 g/kg por
vía oral son consideradas prácticamente no tóxicas. (Gorriti, y otros, 2010). Además, de
acuerdo con la clasificación de toxicidad aguda oral de las normas de la Comunidad
Europea, cuando se supera la dosis de 2000 mg/kg se considera como “no clasificado”
(no tóxico) (Gorriti, y otros, 2010).
2.2.7. Estabilidad de la linaza y recomendaciones para su almacenamiento.
Semillas de linaza:
Las semillas se pueden almacenar a temperatura ambiente por un período de
hasta un año. Estas cuentan con una gran resistencia a la oxidación, de acuerdo con
estudios en los que se almacenaron semillas enteras de linaza en tubos de vidrio por 280
días ó 9 meses (Morris, 2007).
12
Polvo de linaza:
El polvo puede ser almacenado a temperatura ambiente por al menos cuatro
meses y mantener su estabilidad. Estudios encontraron una buena estabilidad de la
linaza molida, cuando fue almacenada a temperatura ambiente durante un período de 9
meses y 20 meses. Esto demuestra que, los valores de peróxido fueron muy bajos y no
difirieron de aquellos reportados por las muestras frescas (Morris, 2007).
Aceite de linaza:
El aceite debe ser envasado en botellas opacas y una vez abierto el aceite debe
ser refrigerado para mantener su frescura, y se recomienda usarlo durante seis semanas
después de su apertura. (Morris, 2007)
2.2.8. Dosis diarias de consumo recomendadas de linaza.
Aceite de linaza:
El aceite constituye el componente principal de las semillas de linaza,
aproximadamente 35 a 43 g/100g base materia seca. Una cucharada de este aceite
proporciona 8 gramos de ácido alfa linolénico (omega 3). Es decir que con una dosis
diaria de aceite de linaza se obtienen 1.3 gramos de ácido alfa linolénico (omega 3), lo
cual es una cantidad suficiente para cubrir el consumo diario de este ácido graso en los
adultos. Por otro lado, esta cantidad es similar al utilizado en ciertos estudios clínicos,
donde las personas estudiadas consumieron de 1 a 2 cucharadas diarias de aceite de
linaza durante 4 y 12 semanas (Morris, 2007).
Linaza molida:
Una cucharada de linaza molida proporciona 1.8 gramos de ácido alfa linolénico
(omega 3). El consumo adecuado de este ácido graso para las mujeres es de 1.1 gramos
diarios y de 1.6 gramos diarios para los hombres. Por lo que un adulto puede alcanzar la
dosis diaria con una cucharada de linaza molida (Morris, 2007).
2.2.9. Control de calidad de drogas.
La calidad de todo producto alimentario es una medida del grado de adecuación
del mismo al uso esperado, puede definirse como el conjunto de aquellas características
de atributos individuales del mismo que son significativos para determinar el grado de
aceptación que aprecia, o debe apreciar el consumidor.
13
Alteración de las drogas.
Las drogas al ser arrancadas de su medio natural alteran su equilibrio metabólico
proliferando reacciones y fenómenos que degradan la droga vegetal recolectada. Las
causas de alteración pueden ser internas o externas. Las causas de alteración interna son
las reacciones enzimáticas por medio de las enzimas propias de la planta, que catalizan
reacciones que llevan a la degradación de la especie vegetal. Las causas de alteración
externa son el calor, las radiaciones, la humedad, el ataque de parásitos, los
microorganismos, los insectos, entre otros. Todas estas causas potenciales de alteración
deben ser tenidas en cuenta, sobre todo en el proceso de almacenamiento de la muestra.
Por otro lado, debido a las condiciones inadecuadas de recolección y almacenamiento
las drogas crudas pueden sufrir distintas alteraciones, que pueden afectar o no a los
principios activos que ejercen la acción farmacológica, por lo que toda evidencia de
ataque de roedores como pelos, heces, orina es inaceptable revelando un descuido en la
recolección. (Osorio, 2009)
Evaluación macroscópica de las drogas.
Las drogas se agrupan de acuerdo con su clasificación morfológica en órganos
subterráneos, corteza, leños, frutos, flores y semillas; estas últimas serán objeto de la
presente investigación.
Las características más relevantes que se debe considerar en la semilla son los
caracteres físicos, como la forma dimensión, la dureza, el peso, el color, el olor y las
peculiaridades propias de la droga a trabajar (Figuerola, Muñoz, & Estévez, 2008).
La semilla de linaza es de 4 a 6 mm de longitud, aplanada, de forma oval y con
un extremo aguzado. La cubierta de la semilla es de apariencia suave y brillante, y su
color puede variar entre marrón oscuro y amarillo claro. Existen variedades de semillas,
hay de color amarillo o dorado y de marrón. A pesar de la creencia de que el color
externo de la semilla es un indicador de la composición química de la linaza, no se han
encontrado variaciones que sustenten que haya una diferencia entre ellas, más allá de las
causadas por las condiciones de cultivo (Figuerola, Muñoz, & Estévez, 2008).
El tiempo de fructificación de la planta de linaza comienza a los 50 días, pero
aproximadamente a los 150 días desde la siembra. Cada planta puede producir entre 6-
12 frutos según el cultivar sembrado y cuando los granos están maduros empiezan a
variar de color de verde a marrón. Finalmente, para obtener las semillas se debe de
aplastar los frutos secos y ponerlos cerca de corrientes de aire para que las cáscaras y
pajas se separen de las semillas (Arias, 2013).
14
2.2.10. Control de calidad de aceites fijos.
Algunos análisis que se contemplan al momento de evaluar la calidad de los
aceite, se relacionan con aspectos físicos y químicos. Dentro de estos, se debe evaluar el
contenido de omega 3, omega 6, omega 9 y vitamina E, para lo cual se tomó como
referencia los datos bibliográficos, en 100% de grasa el rango de cantidad de omega 3
en la semilla de linaza oscila entre 53,5 – 85%, el rango de omega 6 es de 12,7 – 22,4%
y el de omega 9 es de 20,1 – 27,7% (Durán, 2014)
El control de calidad incluye:
Índice de acidez: Es indicativo del grado de acidez de la muestra y corresponde
a los mg. de KOH necesarios para neutralizar la acidez contenida en 1 g de producto
(Medina, 2000).
Índice de esterificación: Indica el contenido de ésteres de la muestra, y se define
como el número de mg de KOH necesarios para saponificar los ésteres contenidos en 1
g sustancia (Medina, 2000).
Índice de saponificación: Es la suma de los dos índices anteriores (índice de
acidez + índice de esterificación) (Medina, 2000).
Índice de yodo: Es la cifra que expresa en gramos la cantidad de halógeno,
calculada en iodo, susceptible de ser fijada, en unas condiciones determinadas, por 100
g de sustancia. Da idea de la presencia de instauraciones (Medina, 2000).
Índice de peróxidos: Es la cifra que expresa, en meq de oxígeno activo, la
cantidad de peróxido contenida en 1000 g de sustancia (Medina, 2000).
Análisis sensoriales
Olor: Característico, ligero no desagradable y peculiar a las semillas de las
cuales proceda el aceite, exento de olores extraños o rancios.
Sabor: Característico, ligero no desagradable y peculiar a las semillas de las
cuales proceda el aceite, exento de sabores extraños o rancios.
Apariencia: Líquido transparente y libre de cuerpos extraños a 293 K (20ºC).
(Medina, 2000)
15
2.2.11. Componentes determinados en el aceite y polvo de linaza.
Vitamina E
La vitamina E, es una vitamina soluble en grasa que se encuentra presente en las
semillas de linaza, principalmente como gamma-tocoferol. El gamma-tocoferol es un
antioxidante que protege a las proteínas celulares y a las grasas de la oxidación. El
contenido de tocoferol en la linaza dependerá de la variedad, madurez de la semilla,
región de producción, condiciones de producción y método de extracción. El contenido
de gammatocoferol puede variar desde 8,5 a 39,5 mg/100 g de semilla, 5 mg/100 g de
linaza molida y 55,2 mg/100g aceite. De esta manera, teniendo en cuenta que la OMS
recomienda un consumo de 30 mg de vitamina E por día, el consumir 100 gramos de
semillas de linaza sal día se estaría cubriendo la dosis esta vitamina (Martinez, 2017).
La Vitamina E tiene diversas funciones metabólicas, siendo la más importante y
mejor estudiado el papel protector de las membranas biológicas: evitando la oxidación
de sus componentes celulares esenciales, por un lado, y evitando la formación de
productos tóxicos de oxidación como los peróxidos de ácidos grasos no saturados, por
otro. Esto demostraría que actúa como estabilizador de la estructura lipídica de los
tejidos.
El término vitamina E describe una familia de ocho moléculas liposolubles
relacionadas dentro de los que se incluyen el alfatocoferol y los tocotrienoles de los
cuales el primero es el que tiene la mayor actividad biológica y es el más abundante en
el cuerpo humano. Una de las funciones más importantes atribuidas a la vitamina E es
su acción antioxidante, cuya reactividad con los radicales orgánicos peroxilos se asocia
con las propiedades rédox del anillo cromano y es la responsable de su capacidad
antioxidante (Porrota, Hernadez, Arguelles, & Proenza, 1992). Esta alta reactividad es
de gran importancia en las membranas, porque los tocoferoles, al reaccionar con los
radicales peroxilos lipídicos, generan hidroperóxidos lipídicos relativamente estables.
Los radicales tocoferilos interrumpen la reacción radicálica en cadena, por lo que la
protegen de la peroxidación lipídica. Además, la vitamina E es el principal antioxidante
liposoluble que protege los lípidos contra el daño oxidativo (Burton & Joyce, 1982).
Ácidos grasos (omega 3, omega 6, omega 9).
Los ácidos grasos poliinsaturados proporcionan energía en el cuerpo, no
obstante, el cerebro obtiene la energía a partir de glucosa y cuerpos cetónicos, estos
ácidos grasos poliinsaturados son más importantes como estructura de membrana, en
especial el omega 3 (Portillo, 2012). El cual ejerce una mayor influencia en la
concentración de ácidos grasos poliinsaturados. En el cerebro se encuentran presentes
dos tipos de Ácidos grasos poliinsaturados, el ácido linoleico y el ácido linolénico los
cuales son esenciales para su correcto desarrollo y mantenimiento. El omega-3 tiene
16
permite que se produzca una correcta fluidez en la membrana neuronal, contribuyendo a
que se lleve a cabo un adecuado intercambio en las células neuronales (Cuyan, 2016)
Estabilidad de ácidos grasos a la temperatura.
El omega 3 puede resistir condiciones de altas temperaturas. De acuerdo con
estudios realizados sobre su estabilidad se obtuvo que el calentamiento de linaza entera
y linaza molida a 100 ºC por una hora, tuvo un efecto muy bajo en la composición de
sus ácidos grasos o su oxidación. Tampoco se encontró evidencia de la formación de
nuevas formas trans de omega 3 u otros ácidos grasos derivados que fuesen no
deseables después de someter las muestras a estos tratamientos de alto estrés (Morris,
2007).
2.2.12. Relación de omega-3 con la neuroprotección.
Estudios llevados a cabo en humanos, animales y en modelos celulares in vitro,
han mostrado un efecto neuroprotector de los ácidos grasos omega 3, especialmente en
lesiones producidas por isquemia y por excitotoxicidad generada por neurotransmisores
(glutamato, principalmente). En animales con diabetes mellitus, la suplementación de
omega-3, permitió prevenir un deterioro en la anatomía funcional de las neuronas, este
cuadro es característico en la presencia de una neuropatía diabética, y también se
observó una reducción del daño oxidativo neuronal y los problemas de aprendizaje
(usando el laberinto de Morris) en ratas con lesión cerebral traumática. A su vez, ratas
alimentadas con una dieta pobre en omega 3, presentaron dificultad en el aprendizaje y
también en la función cognitiva, dichos efectos se revirtieron al suplementarlos con
omega 3 (Valenzuela, Tapia, González, & Valenzuela, 2011).
2.2.13. Fundamento de Ginkgo biloba como estándar.
El Ginkgo biloba fue desarrollado en Alemania en el año de 1964 por una
compañía farmacéutica, y a partir de esto innumerables estudios han permitido evaluar
sus efectos tanto en modelos animales como en humanos. El ginkgo biloba posee gran
número de compuestos poli fenólicos: 24% Glicósidos Flavonoides (ginkgetina,
kaempferol, bilobetina, etc); 6% lactonas terpénicas; trilactona sesquiterpénica,
bilobálido y ácido ginkgólico en cantidad menor a 5 ppm, de esta manera se evita que
presente un efecto neurotóxico, el que se ha observado a concentraciones más elevadas.
Algunas investigaciones han atribuido al EGb 761 el efecto de ser antagonistas de la
activación y agregación plaquetaria, también el de aumentar la circulación sanguínea y
reducir el daño causado por una isquemia cerebral. Como efecto más relevante posee
una actividad antioxidante, produciendo un efecto neuroprotector al disminuir la muerte
17
de las neuronas, rescatando radicales libres y posteriormente previniendo la oxidación
de lípidos (Navarro, 2007).
Por los mecanismos que se han mencionado anteriormente y la evidencia
disponible, el EGb 761 fue aprobado en el año 1998 por la Comisión de Alemania
(equivalente a la FDA en Norteamérica) para el tratamiento sintomatológico de déficit
de memoria, concentración y depresión, a partir de patologías orgánicas cerebrales
como la enfermedad de Alzheimer (Navarro, 2007).
2.2.13. Enfermedad de Alzheimer (EA).
Epidemiología
Tomando los datos de la literatura internacional en conjunto, puede afirmarse que
la prevalencia de la demencia establecida en individuos mayores de 65 años es del 8%
cifra que se duplica si incluimos sujetos con formas leves de demencia o con deterioro
cognitivo leve. La tasa de conversión de pacientes con deterioro cognitivo leve a
demencia se sitúa en un 10 a 12% anual. Existe unanimidad al considerar que la tasa de
demencia depende sustancialmente de la edad, doblándose cada 5 años desde el 1 a 2%
a los 65-70 años hasta el 30% o más después de los 85 años. La incidencia anual global
es de 0,085% para todas las edades y del 1% para sujetos mayores de 65 años. La
incidencia anual también se duplica cada 5 años a partir de los 65 años pasando de 1%
en el grupo de 65-70 años al 6-9% en los mayores de 62 a 85 años. Con respecto a la
distribución por sexos hay diferencias, sin embargo las mujeres tienden a una incidencia
mayor de EA a edades más avanzadas y los hombres presentan una incidencia mayor de
demencia vascular a edades más tempranas. Los países en vías de desarrollo tienen una
frecuencia más elevada en comparación con los países desarrollados. América Latina
ocupa el segundo lugar en frecuencia (López, 2015).
Tratamiento.
Intervenciones no farmacológicas.
Los estudios observacionales han indicado que el permanecer activo desde el
punto de vista cognoscitivo puede prevenir los síntomas de la EA. Tales estudios no
prueban que la actividad cognoscitiva pueda proteger contra el desarrollo de la
demencia, pero una falta de participación del paciente en actividades de conocimiento
puede contribuir a un temprano declive cognoscitivo; otra intervención es la terapia de
reminiscencias que consiste en traer a la memoria hechos ocurridos en la vida de una
persona. Se insita a los pacientes a que recuerden cosas de su familia, lejanos recuerdos,
transiciones, trabajos anteriores y otros recuerdos significativos. Sin embargo los
resultados de pruebas controladas aleatorizadas con terapias de reminiscencias no
reportaron mejoras significativas en los resultados cognoscitivos o de conducta, aunque
hubo tendencias hacia el mejoramiento en el grupo de intervención (López, 2015).
18
Intervenciones farmacológicas
Aunque no existe por el momento, ningún fármaco que pueda curar o estabilizar
en forma permanente la EA, existen dos grupos de fármacos cuyo uso está autorizado y
cuyo objetivo es disminuir la progresión de la enfermedad.
Anticolinesterásicos (inhibidores de la acetilcolinesterasa). han demostrado una
correlación directa entre el déficit colinérgico cerebral y el deterioro cognitivo y desde
entonces se utiliza fármacos potenciadores de la función colinérgica como el
Donepecilo, Rivastigmina y Galantamina, estos fármacos, al inhibir la
acetilcolinesterasa (ACE), aumentan la disponibilidad de acetilcolina en el cerebro, la
Galantamina además, tiene una acción agonista nicotínico presináptico y rivastigmina
inhibe a la butirilcolinesterasa (BuCE) (López, 2015).
Moduladores de la transmisión glutamatérgica (antagonistas de los receptores N-
metil-D-Aspartato) como el Piracetam, Selegilina y Pentoxifilina (López, 2015).
2.2.14. Fundamento para la determinación del efecto nootrópico.
El aprendizaje y memoria
En el proceso del aprendizaje interviene tanto factores internos como externos,
los que consisten en adquirir nuevos conocimientos a través de las experiencias que
permitan al individuo una mejor adaptación en el medio en el que se encuentra (Cuyan,
2016).
La memoria es la capacidad que le permite al individuo registrar, conservar y
recuperar la información o experiencias (ideas, imágenes, acontecimientos,
sentimientos, etc.); es decir, mantiene los conocimientos adquiridos para que puedan ser
recordados en un tiempo futuro. En consecuencia, el aprendizaje y la memoria son
procesos interrelacionados ya que sin aprendizaje no hay memoria; finalmente los
recuerdos son almacenados gracias a los cambios que se producen en la plasticidad
sináptica, que es la capacidad que poseen las neuronas para modificar su sinapsis
(Cuyan, 2016).
A través del estudio del aprendizaje se puede entender la conducta normal y
anormal que se produce en los humanos y los animales. El aprendizaje se evalúa
proporcionando a un individuo a experiencias de aprendizaje de manera repetida, de
esta manera se observan los cambios progresivos producidos; dando como resultado una
curva que permite evaluar la forma en que mejora el desempeño, en función del número
de repeticiones y el tiempo (Cuyan, 2016).
19
Fases de la memoria
La memoria depende de los procesos de aprendizaje es decir lo que se aprende
queda retenido en nuestra memoria. La formación de la memoria abarca 2 fases: la
memoria a corto plazo y la memoria a largo plazo. La memoria a corto plazo se refiere a
información que persiste en el cerebro unos cuantos segundos o minutos. Este tipo de
memoria está basada en respuestas eléctricas que son efímeras en las redes neurales
implicadas. Si la experiencia que se aprendió se vuelve a repetir, se producen cambios
que la alteran la morfología de las neuronas de forma permanente, aumentándose tanto
el número de receptores, la cantidad de neurotransmisor liberado y el número de
contactos sinápticos. A este fenómeno se le conoce como memoria a largo plazo
(Cuyan, 2016).
Consolidación memoria.
La memoria se consolida con la ayuda de procesos neurobiológicos que se
efectúan al iniciar al aprendizaje hasta que la información es almacenada; pero si por
alguna razón la actividad cerebral se llegara a interrumpir inmediatamente después de
una experiencia de aprendizaje, esta experiencia no quedará representada produciendo
lo que se conoce como amnesia retrógrada (Cuyan, 2016).
Aprendizaje en ratones.
Los roedores, principalmente los ratones y las ratas poseen capacidades y
destrezas como la de correr con gran velocidad, nadar, cavar y trepar sin dificultad;
estas habilidades les son útiles para encontrar su alimento y evitar la predación, por lo
que saber orientarse en su medio es primordial para su supervivencia. El aprendizaje y
memoria espacial les permite desenvolverse en el espacio adecuadamente mediante la
retención de asociaciones del medio (Guerrero, 2012).
2.2.15. Fundamento del test de aprendizaje.
Los animales de acuerdo al medio en el que se encuentren pueden desarrollar
estrategias durante su navegación, permitiéndoles localizar y además memorizar lugares
con comida y agua. Finalmente se construirán mapas cognitivos del medio para
finalmente interpretar la información sensorial obtenida durante la exploración (Barrera,
2015).
En los roedores de laboratorio como los ratones se puede investigar la memoria
espacial haciendo uso de test de aprendizaje lo que permite estudiar los mecanismos que
se producen al evaluar la memoria espacial. Los test más utilizados son: el laberinto en
T, el laberinto radial de ocho brazos, el laberinto acuático de Morris y el laberinto en
forma de Y (Barrera, 2015).
20
2.2.16. Laberinto acuático de Morris.
El laberinto acuático de Morris se estableció por primera vez por el
neurocientífico Richard G. Morris en 1981, con la finalidad de poner a prueba el
comportamiento dependiente del hipocampo aprendizaje y la memoria, incluyendo la
adquisición de memoria espacial a largo plazo (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003).
Este es un procedimiento relativamente simple que no tiene como incentivo comida,
sino que se coloca al roedor en una piscina redonda de diámetro específico (1m para
ratones y 2 m para ratas) con una plataforma escondida a pocos centímetros bajo la
superficie del agua, que el roedor debe encontrarla para apoyarse y pueda dejar de
nadar. A medida que se repitan sucesivamente este ensayo, el animal deberá aprender
donde está localizada la
plataforma y así nadar directamente hacia ella (Barrera, 2015). La principal ventaja del
LAM es que el roedor aprenderá la diferenciación entre el espacio (plataforma oculta) y
lo no espacial (visibilidad de la plataforma). También permite realizar diversas
alteraciones en el estudio para determinar el aprendizaje y es muy sensible a los efectos
del envejecimiento. Las condiciones del entorno de prueba reducen la interferencia
evitando que se usen claves no espaciales como el olor, haciéndolo muy útil en la
validación de modelos de roedores para los trastornos neurocognitivos como la
enfermedad de Alzheimer y para valorar el aprendizaje espacial y la memoria. De esta
manera se determina, de una manera más efectiva, el efecto de fármacos sobre los
procesos de aprendizaje y memoria que en otros laberintos de adquisición más lenta,
como en el laberinto radial, en el que resulta más difícil distinguir entre los efectos
agudos y crónicos (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003). Finalmente, la confiabilidad de
las pruebas realizadas en el LAM es adecuada, ya que, al comparar con otras pruebas
conductuales, la latencia de escape durante los entrenamientos no se modifica por
cambios en la reubicación de los aparatos, en los protocolos de entrenamiento, en las
condiciones de alojamiento o por la edad de los animales (Guerrero, 2012).
2.2.17. Laberinto radial de ocho brazos.
La tarea del laberinto radial clásico es útil para evaluar dos tipos de memoria:
memoria de referencia y memoria de trabajo. Siendo utilizado ampliamente en la
evaluación del aprendizaje espacial y la memoria. El aparato consiste en ocho o doce
brazos equiespaciados que irradian de una pequeña plataforma central circular. El
diseño asegura que después de la comprobación de comida en el extremo de un brazo el
animal es forzado a volver a la plataforma central antes de hacer otra elección (Vicens,
Redolat, & Carrasco, 2003).
21
2.3. Marco legal
El presente proyecto regirá sus principios éticos en función al Proyecto de ley
LOBA: Ley Orgánica de Bienestar Animal, para el manejo y experimentación con los
animales de experimentación como lo estipula en el Capítulo VIII: DE LOS
ANIMALES PARA EXPERIMENTACIÓN, INVESTIGACIÓN Y DOCENCIA.
Según el Art. 46. “Sobre el Comité de Bioética.- Todas las instituciones de
educación superior que cuenten con facultades e institutos de investigación y
experimentación en animales, crearán un Comité de Bioética que controlará y
reglamentará estas prácticas, cumpliendo con los protocolos internacionales de
bienestar animal establecidos por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE)”
(Proyecto de Ley Organica de Bienestar Animal, 2014).
Según el Art. 47 sección C. “Se prohíbe la captura de animales en las calles para
este tipo de prácticas. Los animales utilizados deberán provenir de criaderos
especializados en animales de experimentación, autorizados por la autoridad
competente” (Proyecto de Ley Organica de Bienestar Animal, 2014).
CONSTITUCION DE LA REPUBLICA DEL ECUADOR 2008
TÍTULO II
DERECHOS
Capítulo Segundo
Derechos del Buen Vivir
Sección séptima
Salud
Art. 32.- “La salud es un derecho que garantiza el Estado, cuya realización se
vincula al ejercicio de otros derechos, entre ellos el derecho al agua, la alimentación, la
educación, la cultura física, el trabajo, la seguridad social, los ambientes sanos y otros
que sustentan el buen vivir” (Constitución de la república del Ecuador, 2011).
“El Estado garantizará este derecho mediante políticas económicas, sociales,
culturales, educativas y ambientales; y el acceso permanente, oportuno y sin exclusión a
programas, acciones y servicios de promoción y atención integral de salud, salud sexual
y salud reproductiva. La prestación de los servicios de salud se regirá por los principios
de equidad, universalidad, solidaridad, interculturalidad, calidad, eficiencia, eficacia,
precaución y bioética, con enfoque de género y generacional” (Constitución de la
república del Ecuador, 2011).
22
Capítulo sexto
Trabajo y producción
Sección primera
Formas de organización de la producción y su gestión
Art. 322.- “Se reconoce la propiedad intelectual de acuerdo con las condiciones
que señale la ley. Se prohíbe toda forma de apropiación de conocimientos colectivos, en
el ámbito de las ciencias, tecnologías y saberes ancestrales. Se prohíbe también la
apropiación sobre los recursos genéticos que contienen la diversidad biológica y la
agrobiodiversidad” (Constitución de la república del Ecuador, 2011).
TÍTULO VII
RÉGIMEN DEL BUEN VIVIR
Capítulo Primero
Inclusión y Equidad
Sección segunda
Salud
Art. 358.- “El sistema nacional de salud tendrá por finalidad el desarrollo,
protección y recuperación de las capacidades y potencialidades para una vida saludable
e integral, tanto individual como colectiva, y reconocerá la diversidad social y cultural.
El sistema se guiará por los principios generales del sistema nacional de inclusión y
equidad social, y por los de bioética, suficiencia e interculturalidad, con enfoque de
género y generacional” (Constitución de la república del Ecuador, 2011).
Art. 359.- “El sistema nacional de salud comprenderá las instituciones,
programas, políticas, recursos, acciones y actores en salud; abarcará todas las
dimensiones del derecho a la salud; garantizará la promoción, prevención, recuperación
y rehabilitación en todos los niveles; y propiciará la participación ciudadana y el control
social” (Constitución de la república del Ecuador, 2011).
Art. 361.- “El Estado ejercerá la rectoría del sistema a través de la autoridad
sanitaria nacional, será responsable de formular la política nacional de salud, y normará,
regulará y controlará todas las actividades relacionadas con la salud, así como el
funcionamiento de las entidades del sector” (Constitución de la república del Ecuador,
2011).
23
Art. 363.- El Estado será responsable de:
“Formular políticas públicas que garanticen la promoción, prevención, curación,
rehabilitación y atención integral en salud y fomentar prácticas saludables en los
ámbitos familiar, laboral y comunitario” (Constitución de la república del Ecuador,
2011).
“Garantizar las prácticas de salud ancestral y alternativa mediante el
reconocimiento, respeto y promoción del uso de sus conocimientos, medicinas e
instrumentos” (Constitución de la república del Ecuador, 2011).
LA DIRECCIÓN EJECUTIVA DE LA AGENCIA NACIONAL DE
REGULACIÓN, CONTROL Y VIGILANCIA SANITARIA ARCSA 2016
NORMATIVA SANITARIA PARA LA OBTENCION DEL REGISTRO
SANITARIO
CAPITULO II
DE LAS DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
Estudios de Etnobotánica. – “Son estudios en los que se registra
sistemáticamente el conocimiento sobre los usos tradicionales de las plantas en una
determinada región y del manejo de estos recursos naturales en sus propios hábitats por
parte de las comunidades nativas. Detalla la interacción entre el hombre y las plantas”
(ARCSA, 2016).
Actividad terapéutica. “Se refiere a la prevención, el diagnóstico y el
tratamiento satisfactorio de enfermedades físicas y mentales, el alivio de los síntomas de
las enfermedades y la modificación o regulación beneficiosa del estado físico y mental
del organismo” (ARCSA, 2016).
Droga Cruda. “Material proveniente del recurso natural de uso medicinal, que no
ha sufrido transformaciones químicas; sólo procesos físicos como lavado, secado o
molienda” (ARCSA, 2016).
Extracto Estandarizado. “Producto que se obtiene del recurso natural de uso
medicinal por la acción de un disolvente de acuerdo a los métodos de extracción
24
reconocidos o estandarizados, y que expresan concentración definida del o los
principio/s activos o marcador/es” (ARCSA, 2016)
Recurso Natural. “Todo material proveniente de organismos vivos y minerales
que posee actividad terapéutica, sin riesgo para la salud cuando se utiliza de manera
adecuada, comprobada mediante estudios científicos y/o literatura científica que
respalden el uso medicinal” (ARCSA, 2016).
Medicina Tradicional. “Es todo el conjunto de conocimientos, aptitudes y
prácticas basados en teorías, creencias y experiencias indígenas de las diferentes
culturas, sean o no explicables, usados para el mantenimiento de la salud, así como para
la prevención, el diagnóstico, la mejora o el tratamiento de enfermedades físicas o
mentales” (ARCSA, 2016).
CÓDIGO CIVIL
TITULO I DE LAS VARIAS CLASES DE BIENES
Art. 587.- Las plantas son inmuebles, mientras adhieren al suelo por sus raíces, a
menos que estén en macetas o cajones, que puedan transportarse de un lugar a otro
(Código Civil, 2013).
2.4. Hipótesis.
2.4.1. Hi: hipótesis de trabajo
El consumo de aceite o polvo de linaza (Linum usitatissimum) presenta igual
efecto nootrópico en ratones Mus musculus.
2.4.2. H0: hipótesis nula
El consumo de aceite o polvo de linaza (Linum usitatissimum) no presenta igual
efecto nootrópico en ratones Mus musculus.
25
2.5. Conceptualización de variables.
2.5.1. Variables independientes
Aceite de linaza
Extracto obtenido de semillas de linaza por prensado en frío.
Polvo de linaza
Partículas que resulta de la molienda de semillas de linaza.
Semillas de linaza
Componente de la planta de linaza en forma de cápsula que alberga al embrión
2.5.2. Variables dependientes
Actividad Nootrópica
Capacidad de alterar las funciones cognitivas del cerebro mejorando o potenciando su
rendimiento.
26
Capítulo III
3. Marco metodológico
3.1. Diseño de la investigación.
Enfoque.
El enfoque de la presente investigación es cuantitativo ya que se probó una
hipótesis con base en la medición numérica y análisis estadístico de los datos que
fueron recolectados durante la fase experimental en el laberinto acuático de Morris y
laberinto radial de ocho brazos, además se planteó un problema totalmente específico e
incluyó variables que fueron sujetas a medición como lo fue el tiempo de latencia en
cada uno de los laberintos.
Nivel de investigación.
La investigación fue llevada a cabo hasta un nivel explicativo, ya que su
objetivo fue la explicación de los fenómenos ocurridos, permitiendo que se puedan
generar teorías, leyes o enunciados partiendo de una situación problema o conocimiento
presente para luego indagar posibles causas o factores asociados que permiten
interpretarla. (Carlessi & Reyes, 2006), en este caso con la investigación se determinó
el efecto que produce en los ratones el aceite y polvo de linaza al haber sido
administrados durante 41 días y además se establecieron las interrelaciones producidas
entre las variables dependientes e independientes (Hernandez, 1994).
Tipo de investigación.
Los tipos de investigación requeridos fueron la investigación experimental y
observacional en donde el investigador produjo las condiciones y observó la conducta
con un absoluto control de las variables e influyó activamente en algo para observar
sus consecuencias, en este caso se utilizó un grupo de ratones que sirvió como grupo de
control, mientras que otros fueron probados bajo las condiciones experimentales
permitiéndonos determinar si el efecto nootrópico es el mismo entre los grupos
experimentales (Cerón, 2006).
3.2. Población y muestra.
Método con diseño experimental con variables dependientes e independientes no
tiene población ni muestra.
3.3. Métodos y Materiales.
27
3.3.1. Métodos:
La investigación será dividió en tres etapas:
Etapa 1: búsqueda bibliográfica e identificación taxonómica.
Obtención de la materia vegetal.
Las semillas de linaza fueron adquiridas en plantaciones del cantón Sigchos
perteneciente a la Provincia de Cotopaxi, en el mes de agosto a 150 días de la siembra,
las semillas recolectadas fueron aquellas de color marrón lo que aseguró su estado de
madurez ya que la semilla inmadura tiene coloración verde.
Luego de ser adquirida la planta y las semillas se procedió a buscar información
etnofarmacológica y bibliográfica de la semilla de linaza, además la planta fue llevada
al Herbario Alfredo Paredes (QAP) de la Universidad Central para que se realizará la
identificación taxonómica de la planta.
Etapa 2: Análisis de control de calidad de las semillas y aceite de linaza.
Control de calidad de semillas de linaza.
Determinación de material extraño.
Se pesó 250 gramos de semillas de linaza y se quitó todo material ajeno como
pelos, hojas, piedras, semillas inmaduras o dañadas, dejando solo aquellas que
presentaban un aspecto aplanados, forma ovalada, con un extremo agudizado y de color
marrón (Figuerola, Muñoz, & Estévez, 2008). Luego se pesó el material ajeno y se
calculó el porcentaje de material extraño con la siguiente ecuación.
Ecuación N°1
% Material extraño =peso de material extraño
peso de la muestra× 100
Determinación de porcentaje de grasa cruda.
Se pesó aproximadamente 2 g de semillas de linaza molida directamente en un
pírex de 500 ml, luego se agregó 60 ml HCl © y 70 ml de agua destilada generando una
reacción de hidrólisis, después se dejó hervir por 30 minutos, se dejó enfriar y se filtró,
posteriormente se lavó el filtrado con agua caliente hasta que completar 500 ml y se
dejó reposar por 24 horas. Una vez transcurrido ese tiempo se procedió a extraer la
28
grasa presente en el papel filtro para lo cual se pesó un vaso propio del equipo extractor,
luego se colocó los papeles filtro con la muestra en cada uno de los capuchones de
cerámica y se colocó en el equipo extractor, una vez extraída la grasa se pesó el vaso
con la grasa y usando la siguiente ecuación se realizó el cálculo del porcentaje de grasa
cruda (AOAC, 2012).
Ecuación N°2
% Grasa Cruda =(B − C)
A× 100
Donde:
A: Peso en gramos muestra
B: Peso en gramos del vaso + grasa
C: Peso en gramos del vaso vacío
Control microbiológico
Se realizó el control microbiológico a las semillas tostadas y sin tostar siguiendo
el procedimiento detallado en la (USP 39 - NF34, 2016). Para lo que se realizó un
recuento de microrganismos aerobios totales, recuento de mohos y levaduras y la
presencia de Escherichia coli.
Para el recuento de microorganismos aerobios totales, se pesó un gramo de
linaza molida y se diluyó en una relación 1/10 en caldo Tryptone Soy Broth (TSB),
luego se sembró 0,1 ml por el método de extensión en cajas de estériles que contenían
medio Trypticase Soy Agar (TSA); después, se incubó a 37°C por 48 horas y se contó
el número de ufc/g. anotando sus características para finalmente realizar una tinción
Gram para la identificación de bacterias Gram positivas o Gram negativas. Este
procedimiento se realizó por duplicado.
Para el recuento total de mohos y levaduras: se tomó 0,1 ml de la muestra
diluida y se procedió a sembrar por extensión en cajas estériles que contenían medio
Sabouraud Dextrose Agar (SAB), luego se incubó a temperatura ambiente por 5- 7días,
para finalmente contar el número de ufc/g. anotando las características de las colonias.
Este procedimiento se realizó por duplicado.
Para la determinación del microrganismo específico Escherichia coli se
revitalizó la muestra por 24 horas después de haber realizado una dilución 1/10 de la
muestra en caldo (TSB), luego se tomó un 1 ml de muestra revitalizada y se colocó en
100 ml de caldo Mac Conkey, paralelamente se procedió a realizar un control positivo y
29
negativo finalmente se pasó agar Mac Conkey, se incubo a 37°C y finalmente se
observó si hubo crecimiento en este medio.
Determinación de Glucósidos Cianogénicos
Se realizó la determinación cualitativa de Glucósidos Cianogénicos en semillas
de linaza sin tostar y en semillas que fueron tostadas a 100°C por 1 hora. Realizando el
siguiente procedimiento para lo cual se pesó en una balanza analítica, 1g de semilla
molida y se colocó en un vaso de precipitación añadió agua destilada hasta humedecer
completamente la muestra. Luego se agregó 1 ml de cloroformo y se cubrió la parte
superior del vaso con papel filtro embebido en una solución de picrato de sodio,
posteriormente se dejó calentar por 5 minutos en una cocineta. Dicho ensayo es positivo
si se nota un cambio de color en el papel filtro que se encuentra cubriendo la parte
superior del vaso de precipitación.
Proceso de obtención de aceite y polvo de linaza.
Extracción de aceite fijo de linaza.
Para la obtención de aceite fijo de linaza se tomó porciones de 100g de las
semillas previamente tostadas y se colocó en bolsas de tela, después, mediante la
técnica de prensado en frío; usando una prensa hidráulica se obtuvo aceite, luego este
aceite fue almacenado en un frasco ámbar en refrigeración y se repitió el mismo
procedimiento para obtener aceite de semillas de linaza sin tostar.
Obtención de polvo de linaza.
Para su obtención se tomó 200 gramos de semillas previamente tostadas y frías
y se colocó en una licuadora y fueron trituradas hasta obtener un polvo fino, luego se
pasó por un tamiz hasta obtener un tamaño de partícula homogénea y finalmente fue
almacenado en un frasco ámbar y se mantuvo en refrigeración. Se siguió el mismo
procedimiento para la obtención de polvo de semillas de linaza sin tostar.
Control de calidad del aceite fijo de linaza.
Densidad relativa.
Para la determinación de la densidad se siguió el procedimiento detallado en la
(USP 39 - NF34, 2016), y se utilizó la siguiente ecuación.
30
Ecuación N°3
Densidad relativa =m2 − m
m1 − m
Donde:
m: picnómetro vacío
m1: picnómetro + agua destilada
m2: picnómetro + muestra aceite de linaza
Índice de acidez.
Para la determinación de este índice se siguió el procedimiento detallado en la
(USP 39 - NF34, 2016), y se utilizó la siguiente ecuación.
Ecuación N°4
Indice de acidez =Mx VxN
W
Donde:
M: Peso de molecular de NaOH
N: Normalidad de NaOH
V: Volumen de NaOH consumido por la muestra
W: Peso de muestra
Índice de esterificación.
Para la determinación de este índice se siguió el procedimiento detallado en la en
la pág 326 de la (USP 39 - NF34, 2016), y se utilizó la siguiente ecuación.
Ecuación N°5
Indice de esterificación = (Indice de saponificación − Indice de acidez)
Índice de yodo.
Para la determinación de este índice se realizó el método de Wijs cuyo
procedimiento se encuentra detallado en la pág 328 de la (USP 39 - NF34, 2016), y se
utilizó la siguiente ecuación.
31
Ecuación N°6
Indice de yodo = [Ar(VB − Vs)x N
10 x W]
Donde:
Ar: Peso atómico de yodo
VB: Volumen de tiosulfato consumido por el blanco
Vs: Volumen de tiosulfato consumido por la muestra
N: Normalidad de tiosulfato
W: Peso muestra
Índice de saponificación.
Para la determinación de este índice se siguió el procedimiento detallado en la
pág 328 de la (USP 39 - NF34, 2016), y se utilizó la siguiente ecuación.
Ecuación N°7
Indice de saponificación =(B − M)x N
M x 56,1
Donde:
VB: Volumen de HCl consumido por el blanco
Vm: Volumen de HCl consumido por la muestra
M: Peso de la muestra en gramos
N: Normalidad del HCl
56,1: equivalente del hidróxido de potasio
Índice de peróxido.
Para la determinación de este índice se siguió el procedimiento detallado en la
pág 328 de la (USP 39 - NF34, 2016), y se utilizó la siguiente ecuación.
Ecuación N°8
Indice de peróxido =VxNx1000
peso de la muestra
Donde:
V: volumen de tiosulfato consumido por la muestra.
N: Normalidad de tiosulfato
El índice de peróxido se expresa como mili equivalentes de peróxido/ Kg de grasa.
32
Determinación y cuantificación de ácidos grasos omega 3, 6 y 9.
El método se basó en la preparación de ésteres metílicos de la cadena de ácidos
grasos para posteriormente ser analizados utilizando el “método estandarizado para
análisis de metilesteres de ácidos grasos, por la técnica de cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas”, desarrollado por la Universidad Tecnológica de
Pereira (Lopez, Arrubla, & Guerrero, 2009), esta determinación fue realizada en la
facultad de Ingeniería Química.
Se realizaron dos métodos para la preparación de los ésteres metílicos de los
ácidos grasos: transesterificación en frío y metilación en caliente; para determinar con
cuál de estos dos métodos se podía observar una mejor separación en los picos
correspondientes a los compuestos a analizar.
Metilación en caliente.
Se introdujo 0,1 g de la grasa, se adicionó 5 ml de la solución NaOH-metanol, se
conectó a un equipo de destilación y se dejó en calentamiento de 5-10 minutos hasta
que los glóbulos de grasa se disolvieron, luego se adicionó 5 ml del reactivo BF3
metanol a través del condensador y se dejó hervir por 2 minutos. Al finalizar se removió
de la fuente de calor y del condensador para posteriormente adicionar 5 ml de hexano y
15ml de solución de cloruro de sodio saturada, para evitar emulsificación, finalmente se
dejó reposar en tubos de ensayo y se recogió aproximadamente 1 ml de la fase
sobrenadante en viales para ser leída en el equipo de cromatografía (AOAC, 2012).
Transesterificación en frío.
En un tubo de ensayo se pesó aproximadamente 0,1 g de grasa, se añadió 2 ml
de heptano y se agitó, luego se adicionó 0,2 ml de solución metanólica 2 N de hidróxido
potásico, se agitó enérgicamente durante 30 segundos, posteriormente se dejó reposar
hasta que la parte superior de la solución quedó clara, a continuación se decantó la capa
superior, que es la que contenía los ésteres metílicos, finalmente se inyecta la solución
de heptano en el cromatógrafo (Diario Oficial de las Comunidades Europeas, 2002).
Determinación y cuantificación de vitamina E.
La identificación y cuantificación de vitamina E en aceite de linaza a partir de
semillas tostadas y sin tostar, Fue llevada a cabo por el laboratorio QC Services.
33
Etapa 3: Proceso experimental.
Determinación del efecto nootrópico.
Los animales de experimentación fueron adquiridos en el (Instituto Nacional de
Investigación en Salud Pública) INSPI de la ciudad de Guayaquil, luego fueron pesados
una vez a la semana durante las siete semanas que duró la experimentación.
Para determinar la cantidad de polvo y aceite de linaza, que se administró a los
ratones se tomó en cuenta la dosis recomendada para adultos 900mg omega 3/kg, en la
cual la evidencia sugiere que la ingesta de dietas ricas en omega 3, puede proteger a los
adultos mayores del deterioro cognitivo y de la demencia (Waitzberg & Garla, 2014);
luego se realizó los respectivos cálculos tomando en cuenta la densidad del aceite
0,93277 y el rango de omega 3 en linaza 53,5 – 85% y de este tomando como
referencia el más bajo 53,5 %.
Tabla 1. Cantidad de ginkgo biloba, aceite y polvo de linaza administrados.
Sexo Dosis Aceite de
linaza
(microlitros)
Polvo de
linaza
(miligramos)
Ginkgo
biloba
(miligramos)
Macho 12,86 mg omega 3/kg
peso
24,43 2,059
Hembra 12,86 mg omega 3/kg
peso
20,26 1,701
Macho 3,43 mg/kg peso 0,123
Hembra 3,43 mg/kg peso 0,102
Realizado por Chiguano M., 2018
Formación de grupos.
Se utilizaron 24 ratones machos de 3 meses de edad y se los dividió en 4 grupos
con 6 ratones 3 hembras y 3 machos para cada grupo.
Grupo N°1 (blanco): Este grupo fue conformado por 6 ratones a los que se les
administró durante 4 semanas (28 días) por vía oral agua destilada usando una
micropipeta, y en la quinta semana se los sometió al laberinto acuático de Morris y en
la sexta semana al laberinto radial de ocho brazos.
Grupo N°2 (control positivo): Este grupo fue conformado por 6 ratones y
durante 4 semanas (28 días) se les administró por vía oral una cantidad de extracto de
Ginkgo biloba equivalente a 3,43 mg/Kg, usando una micropipeta, y en la quinta
34
semana se le sometió al laberinto acuático de Morris y en la sexta semana al laberinto
radial de ocho brazos.
Grupo N°3 (aceite de linaza): Este grupo fue conformado por 6 ratones y
durante 4 semanas (28 días) se les administró por vía oral una cantidad de aceite de
linaza equivalente a 12,86 mg de omega 3/Kg de peso, usando una micrpipeta y en la
quinta semana se los sometió al laberinto acuático de Morris y en la sexta semana al
laberinto radial de ocho brazos.
Grupo N°4 (polvo de linaza): Este grupo fue conformado por 6 ratones a los que
se les administró durante 4 semanas (28 días) una cantidad de polvo de linaza
equivalente a 12,86 mg de omega 3/Kg de peso, el polvo de linaza fue previamente
suspendido en aproximadamente 5ml de agua destilada y luego usando una sonda
nasogástrica para neonatos se administró por vía oral, y en la quinta semana se los
sometió al laberinto acuático de Morris y en la sexta semana al laberinto radial de ocho
brazos.
Cabe recalcar que los 4 grupos de ratones durante las 6 semanas que duró la
experimentación fueron alimentados con comida y agua suficiente, además machos y
hembras fueron mantenidos por separado.
Métodos utilizados para evaluar la memoria y aprendizaje de los animales de
experimentación.
Control de calidad de semillas de linaza.
Este laberinto consistió en un tanque circular lleno de agua de aproximadamente
100 cm de diámetro y de 30 cm de profundidad, este tanque fue dividido en cuatro
cuadrantes iguales. La temperatura del agua osciló entre 28 y 30 °C, haciendo que los
animales no se sientan estresados como para que se inhiba su conducta de búsqueda de
la plataforma. La plataforma de escape fue cuadrada, con un diámetro de 10 – 12 cm y
fue sumergida 1 cm por debajo de la superficie del agua en el cuadrante I (cuadrante
objetivo), esta plataforma fue lo suficientemente pesada como para permanecer en
posición vertical mientras estuvo sumergida (Wenk, 2004). Además, se ubicaron varias
señales distales alrededor del tanque para orientar al animal mientras navegaba dentro
de la piscina.
Con este test es posible valorar la memoria de referencia espacial, si la
plataforma permanece en el mismo lugar durante los ensayos.
35
Ilustración I. Laberinto acuático de Morris usado para la evaluación de memoria y
aprendizaje.
Fases del laberinto acuático de Morris:
Entrenamiento:
Los animales fueron entrenados durante siete días para encontrar la plataforma
sumergida, para esto se colocó la plataforma en el cuadrante I de la piscina con
aproximadamente 1,5 cm fuera del agua de manera que el animal pudiese ver el
objetivo, a continuación se ubicó al animal en el cuadrante III y se lo introdujo con el
hocico apuntando hacia las paredes de la piscina para que busque la plataforma dándole
un tiempo máximo de 120 segundos. En el caso de no encontrarla en el tiempo
establecido se le colocaba al ratón entre 20 o 30 segundos en la plataforma (Vicens,
Redolat, & Carrasco, 2003). El ensayo terminaba después de este tiempo o después de
que el animal llegaba a la plataforma. Se considera que un animal ha encontrado la
plataforma cuando permanece en ella 5 o 10 segundos (Vicens, Redolat, & Carrasco,
2003).
Después se retiró al animal de la plataforma y se le dejó descansar brevemente
antes de iniciar el siguiente ensayo. Cada ratón realizó 4 repeticiones diarias a lo largo
del entrenamiento (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003).
En el segundo día se realizó el mismo procedimiento que en el primer día pero
esta vez la plataforma quedo aproximadamente 1 cm fuera del agua, en los días
posteriores se repitió el procedimiento del primer día, pero sumergiendo cada vez más
la plataforma, hasta que en los 2 últimos días la plataforma estuvo totalmente sumergida
por lo que ya no era visible para el ratón.
36
Realización de los ensayos:
Los ensayos se realizaron durante 7 días en los que ubicó la plataforma y al
ratón en la misma posición que el primer día de entrenamiento, luego se liberó al ratón
en la piscina con el hocico apuntando hacia las paredes de la piscina, para que busque la
plataforma registrándose el tiempo que le tomó al ratón para encontrar la plataforma
(Wenk, 2004) dando a los ratones 4 ensayos al día con intervalos entre ensayos de 5
minutos, el tiempo de latencia se expresó como el tiempo que le tomó a cada ratón para
encontrar la plataforma sumergida, luego de este procedimiento se realizó el
correspondiente análisis de datos (Wenk, 2004).
Cabe recalcar que las sustancias en estudio (ginkgo biloba, aceite y polvo de
linaza) y blanco (agua destilada) fueron administradas aproximadamente una hora antes
del entrenamientos y de los ensayos.
Método 2: Laberinto Radial de 8 brazos
Este test consistió en un laberinto radial elevado a 1 m desde el suelo,
compuesto de ocho brazos idénticos de 35 cm de longitud x 5 cm de ancho distribuidos
radialmente, unidos a una plataforma central con un diámetro de 20 cm para acomodar
al animal y permitir que se movilice fácilmente entre los brazos. La plataforma central
estuvo rodeada de una pared de 25 cm de altura, con unas puertas tipo guillotina que
conectaban a cada brazo las cuales se podían abrir o cerrar para permitir o impedir la
entrada. Además, cada brazo tuvo un orificio de 5 mm de profundidad a 1 cm del
extremo, que se utilizó como recipiente para mantener la comida fuera de la vista del
ratón, y las paredes a lo largo del borde de los brazos del laberinto fueron cortas de
aproximadamente 2 cm de altura las cuales evitaron que el animal se caiga del laberinto
Ilustración II. Laberinto radial de ocho
brazos usado para la evaluación de
memoria y aprendizaje
37
durante la ejecución de la tarea (Wenk, 2004), además de esto se colocaron fomix con
colores brillantes como indicadores espaciales en la entrada y al final de cada brazo
para una mejor ubicación del ratón, además el laberinto fue ubicado en una sala de
experimentación con luz artificial.
Fases del laberinto.
Habituación:
A los ratones se les hizo un ensayo de habituación de 20 minutos el primer día
colocando a los ratones de dos en dos en el laberinto con acceso libre a todos los brazos,
uno de los cuales fue cebado con una recompensa de comida oculta. Durante el ensayo
de habituación, los ratones visitaron libremente cada brazo tantas veces como quisieron.
Esta habituación fue registrada.
Entrenamiento de los ratones:
Durante las pruebas y el entrenamiento, se disminuyó la cantidad de alimento
que se les daba a los ratones aproximadamente en un 50 % y al finalizar el
entrenamiento se les dió la recompensa del alimento en la jaula para aclimatar al ratón a
la recompensa en un ambiente familiar. Cabe mencionar que el laberinto fue colocado
en una habitación que contenía varias señales externas que eran visibles para el ratón
mientras este permanecía en el laberinto (Wenk, 2004).
Se colocaron dos ratones en el laberinto al mismo tiempo, debido a que el uso de
dos ratones reduce el tiempo que tarda cada uno en aclimatarse al laberinto y se
difundieron recompensas de alimentos alrededor de todo el laberinto para fomentar la
exploración. La aclimatación debe requirió 1 o 2 días. Finalmente se colocó al ratón
solo en el laberinto; y también se colocó el alimento en el recipiente de comida al final
de los brazos. La prueba terminó cuando el ratón visitó todos los brazos, se sintió
cómodo de ser recogido por el experimentador o este exploró sin vacilación (Wenk,
2004).
Realización de los ensayos:
En este procedimiento se colocó la recompensa de comida al final de cada brazo
antes de cada sesión de prueba, luego se colocó al ratón en la plataforma central con
todas las puertas tipo guillotina abiertas permitiendo que el ratón entre en el brazo que
desee a continuación se registró el tiempo que el ratón tardó en visitar los 8 brazos del
laberinto, además se registró en número de desaciertos es decir cuando el ratón entró
más de una vez a un mismo brazo.
38
El tiempo transcurrido desde el comienzo de la sesión se considera para
determinar qué tan rápido el ratón está tomando decisiones y encontrando las
recompensas alimenticias y la visita a un brazo previamente elegido se considera un
error de memoria de trabajo (Wenk, 2004).
En el entrenamiento y los ensayos los ratones recorrieron el laberinto una vez al
día durante 7 días incluidos los fines de semana (Wenk, 2004).
Necropsia de animales de experimentación.
Durante la experimentación se trabajó con 24 ratones divididos en 4 grupos:
(grupo blanco, grupo ginkgo biloba, grupo aceite y grupo polvo de linaza) cada grupo
estuvo conformado por 6 ratones; 3 hembras y 3 machos; para realizar la necropsia se
escogió a 2 ratones de cada tratamiento, eligiendo a aquellos que presentaban algún
signo de enfermedad o a los que habían realizado los test en el menor tiempo. Cada
animal fue pesado en una balanza para animales de laboratorio, determinándose su peso
vivo para ser sacrificado por dislocación cervical, luego fueron extraídos el bazo,
cerebro e hígado para posteriormente ser medidos y pesados en una balanza analítica
(±0,0001 g) y ser observados en el microscopio y se anotaron los datos en la tabla en el
cuaderno de laboratorio.
3.3.2. Materiales
Materiales biológicos
Ratones Mus musculus
Materiales de laboratorio
Bebedero y comedero de ratón
Semillas de linaza
Alimento de ratón
Jaulas
Viruta de madera
Matraces Erlenmeyer esmerilados 50 ml
Condensadores de 20-30 cm
Embudos de separación
Viales
Mortero
Bureta
Balones aforados 25, 50 100 ml
Cajas Petri
39
Vasos de precipitación 100 ml
Matraz Erlenmeyer 250, 500 ml
Embudo
Papel filtro
Frascos ámbar
Gradilla
Pera de succión
Perlas de ebullición
Mechero
Micropipeta
Jeringuilla insulínica
Sonda nasogástrica para neonatos
Tamiz
Tubos de ensayo
Tapón de vidrio
Picnómetro
Papel filtro
Equipos
Prensa de acero inoxidable
Cromatógrafo de gases
Balanza analítica (± 0,0001g). METTLER TOLEDO
Centrifugadora HETTICH ROTOFLIX
Cocineta eléctrica
Computadora
Refrigeradora ELTACHI
Licuadora Oster
Impresora
Laberinto radial de 8 brazos
Laberinto acuático de Morris
Microscopio
Insumos
Materiales de oficina
Reactivos
Agua destilada
Semillas de linaza
Aceite de linaza
40
Polvo de linaza
BF3 en metanol (12% a 15%)
Na OH (0,5 N en metanol)
Na Cl (solución saturada en agua)
Éter de petróleo, bp 30-60ºC
Hexano
Sulfato de sodio anhidro Na2SO4
indicador rojo de metilo 0,1 % en 60 % de etanol.
Gas nitrógeno de alta pureza
Alcohol
Éter
Fenolftaleína
KOH 0,1N
NaOH 0,1N
KOH alcohólico 0,5 N
Reactivo de piridina
Anhídrido acético
Alcohol butílico
Cloroformo
Yoduro de potasio
Ácido clorhídrico 0,5 N
Tiosulfato de sodio 0,1N
NaOH alcohólico 0,1 N
Almidón
Ácido acético
Acetona
Medio Agar Mac Conkey
Medio Manitol Salado (MSA)
Medio Sabouraud Dextrose Agar (SAB)
Medio Trypticase Soy Agar (TSA)
Cristal violeta
Lugol
Etanol al 96,6%
Safranina
3.4. Diseño experimental.
Se realizó la determinación del efecto nootrópico del aceite y polvo de linaza,
considerando como variables independientes al aceite y polvo de linaza y como
variable dependiente la actividad nootrópica tomando en consideración como
41
indicadores al tiempo de latencia para laberinto acuático de Morris, sin embargo para
el laberinto radial se consideró el tiempo de latencia y número de desaciertos.
Para el analizar los datos obtenidos se realizó un Análisis de Varianza
ANDEVA utilizando un análisis factorial A x B de bloques completamente al azar lo
que permitió determinar si hay diferencia significativa entre los grupos y sexo.
3.5. Operacionalización de variables.
Tabla 2. Dimensiones e indicadores de las variables.
Variables Dimensiones Indicadores
Sem
illa
s
de
lin
aza
Control de calidad Porcentaje de material extraño
Número de colonias por caja
Porcentaje de grasa cruda
Ácido cianhídrico
Polv
o
de
lin
aza
Control de calidad Omega 3, 6 y 9
Vitamina E
Ace
ite
de
lin
aza
Control de calidad Densidad relativa
Índice de acidez
Índice de esterificación
Índice de yodo
Índice de peróxido
Contenido de Omega 3, 6 y 9
Contenido de Vitamina E
Act
ivid
ad
Nootr
óp
ica
Nivel de aprendizaje
Tiempo de latencia
Nivel de Memoria Numero de desaciertos
Realizado por Chiguano M., 2018
3.6.Técnicas e instrumentos de recolección de datos.
Al ser una investigación experimental se utilizó un cuaderno de laboratorio en el
cual fueron registrados los datos obtenidos durante el control de calidad de las semillas
y aceite de linaza, además se recopilaron datos del tiempo de latencia y número de
42
desaciertos durante el entrenamiento y las pruebas definitivas en el laberinto acuático de
Morris y laberinto radial de ocho brazos.
3.7. Técnicas de procesamiento y análisis de datos.
Para analizar los resultados obtenidos se procedió a realizar un análisis de
varianzas (ANDEVA) bajo un Diseño de Bloques Completamente al Azar (D.B.C.A)
con un arreglo factorial A x B, el en el que A correspondió a los 4 grupos de ratones
(blanco, ginkgo biloba, aceite y polvo de linaza), B al tiempo de latencia de en los
diferentes días de evaluación y como bloque se usaron los tiempos de latencia de ambos
sexos.
Para analizar los resultados del ANDEVA y determinar si hubo o no diferencia
significativa entre los factores, tratamientos y la interacción se tomó como criterio de
significancia que el valor de F calculada debió ser mayor o igual que el F tabular al 5 %
ó 1 %.
A continuación, después de haber rechazado el criterio de igualdad de medias mediante
la ANDEVA, se realizó la prueba de Duncan al 5% para los grupos permitiendo
comparar las medias del tiempo de latencia de los grupos, tomando en cuenta que
aquellos que poseen la misma letra presentan igualdad, mientras que aquellas que
poseen letras diferentes presentan una diferencia significativa.
43
Capitulo IV
4. Análisis y discusión de resultados
4.1. Etapa1: búsqueda bibliográfica e identificación taxonómica.
Se obtuvo un certificado por parte de Herbario Alfredo Paredes de la
Universidad Central corroborando que la planta se trataba de la especie (Linum
usitatissimum). El que se puede observar en el anexo B.
La planta de linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum), presenta tallos simples
con hojas sésiles, alternas, lineales, con flores color azul claro estas están reunidas en
un corimbo terminal, con semillas de color café, ovaladas y agudas en uno de sus
extremos, estas características son similares a la planta y semillas de linaza (Linum
usitatissimum) canadiense descritas por Morris (2007)
4.2. Etapa 2: Control de calidad de semillas y aceite de linaza de linaza.
4.2.1. Control de calidad de semillas de linaza.
Determinación de porcentaje de material extraño en semillas de linaza.
Tabla 3.Material extraño en semillas de linaza
% Material extraño
Repetición 1 0,7619 Repetición 2 1,0022
Media 0,88
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Las semillas de linaza, al ser quitadas de su medio natural, son propensas a
sufrir alteraciones físicas como cambio de color o forma. Esto se debe a un inadecuado
almacenamiento con excesivo calor o humedad. Al ser un producto que se almacena en
grandes cantidades, posterior a su cosecha, queda expuesto a contaminación por heces,
pelos de roedores y de otros animales. De allí que, estos factores afecten a la
composición química de las semillas, alterando el efecto farmacológico que se desea
evaluar.
Para evaluar el estado de las semillas, se realizó un estudio macroscópico para lo
cual se pesó 250 g de semillas y encontrándose cáscaras, hojas secas, y semillas con una
coloración amarillo claro, secas y quebradizas. Este material ajeno fue retirado y
44
pesado, obteniendo un porcentaje de material extraño promedio de 0,88 %, mismo que
al compararlo con el porcentaje máximo que establece la farmacopea mexicana (2%),
cumple con dicha especificación. El material extraño encontrado se puede observar en
ilustración V y VI.
Determinación del porcentaje de grasa cruda presente en semillas de linaza.
Tabla 4. Porcentaje de grasa en semillas de linaza
Promedio % grasa
linaza sin tostar 40,70
linaza tostada 42,10
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
No existe un rango oficial establecido para el porcentaje de grasa en semillas de
linaza cultivadas en Ecuador, pero tomando como referencia datos bibliográficos de la
semilla de linaza canadiense, el porcentaje de grasa varia de 34,0% a 47,8 %
(McKevith, 2005). Al compararlo con el porcentaje obtenido en la semilla ecuatoriana
(40,70 %), esta se encuentra dentro de este rango.
Control microbiológico
Tabla 5. Resultados del control microbiológico de semillas de linaza tostadas y sin tostar
Límites establecidos por la OMS. C= Cumple; NC= No cumple
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Control Microbiológico
Especificación Resultado Cumplimiento
Microorganismos
mesófilos aerobios
totales
Linaza Sin
tostar
< 105ufc/g
de muestra
2x101 ufc/g
de muestra
C
Linaza
Tostada
< 105ufc/g
de muestra
Ausencia
C
Hongos y
Levaduras
Linaza Sin
tostar
< 103 ufc/g
de muestra
2x101ufc/g
de muestra
C
Linaza
Tostada
< 103 ufc/g
de muestra
Ausencia
C
Escherichia
coli
Linaza Sin
tostar
< 10 ufc/g
de muestra
Ausencia
C
Linaza
Tostada
< 10 ufc/g
de muestra
Ausencia C
45
El control microbiológico fue realizado por el método de extensión usando un
factor de dilución de 10, aunque para el control microbiológico se utilizó los
procedimientos descritos en la USP, para interpretar los resultados se compararon con
las especificaciones de la OMS ya que este organismo considera sus especificaciones
para material vegetal crudo como el que se utilizó en esta investigación.
Como resultado en Tryptic Soy Agar (TSA), se obtuvo 2x101 ufc/g en semillas
de linaza sin tostar, cuyo valor, al ser comparado con el límite aceptable de la OMS
(<105 ufc/g), cumple con lo dispuesto por este organismo. Este mismo procedimiento
fue realizado a las semillas de linaza tostadas, donde no se observó crecimiento,
presumiendo que al haber sido sometida al calor (100°C), durante 1 hora actuó como un
medio de desinfección. Las colonias encontradas se observan en la ilustración VII y
VIII.
Las colonias encontradas en medio Tryptic Soy Agar (TSA) para linaza sin
tostar, presentaron un aspecto de color blanco cremoso y con borde redondeado, por lo
que se realizó una tinción Gram, dando como resultado bacilos Gram positivos lo cual
se puede visualizar en la ilustración IX.
También se realizó recuento para hongos y levaduras en Agar Sabouraud
Dextrosa (SAB), arrojando 2x101 ufc/g, valor que al ser comparado con lo que
determina la OMS (<103ufc/g), cumple con esta especificación. Se realizó el mismo
procedimiento con las semillas de linaza tostada, sin embargo, en este caso no se
observó crecimiento. Las colonias encontradas se observan en la ilustración X y XI.
Las colonias encontradas en las placas de SAB se observaron en el microscopio
y se evidenció la presencia de levaduras lo cual se puede visualizar en la ilustración XII.
La presencia de enterobacterias como la Escherichia coli en las semillas puede
indicar la calidad de las prácticas de producción y cosecha, además su identificación es
importante debido a que las practicas actuales de recolección, manejo puede causar
contaminación adicional y crecimiento microbiano. Sin embargo en las semillas
analizadas se obtuvo como resultado la ausencia de este microorganismo patógeno.
Cabe recalcar que para asegurar la esterilidad de los medios utilizados, se
realizó una placa en blanco de cada uno, sin observar crecimiento garantizando la
confiabilidad del procedimiento desarrollado.
Determinación de la presencia de ácido cianhídrico (HCN) en semillas de linaza.
En las semillas de linaza se encuentra presente compuestos cianógenos como la
linamarina (Oomah, Mazza, & Kenaschuk, 1992), la toxicidad de estos compuestos se
46
debe fundamentalmente al ácido cianhídrico que se libera por la hidrolisis ácida
producida al entrar en contacto con enzimas en el estómago, dada la afinidad de estos
compuestos por el hierro (Fe+3) presente en la cadena respiratoria de la célula
(citocromo oxidasa), se unen a este elemento bloqueando dicha cadena y posteriormente
la respiración celular (Valladolid, 2014).
Para el cianuro libre, la dosis letal en humanos por ingestión o inhalación varía
entre 50 y 200 mg (1 a 3 mg de cianuro libre por kg. de masa corporal). La dosis letal
por absorción dérmica es considerablemente mayor, alrededor de 100 mg por kg de
peso corporal (Valladolid, 2014).
De acuerdo con Morris (2007) la aparición de este compuesto se reduce de un
83 % a 100 % al ser expuestas al calor. Por lo que las semillas fueron tostadas en
porciones de 100 gramos en una estufa a 100°C, durante 1 hora. Ver ilustración XIII
Para determinar la presencia o ausencia de compuestos cianógenos antes y
después del tostado, se utilizó la reacción de Grignard el cual es un método
colorimétrico que permite detectar concentraciones de 2ug/kg a 10 ug/kg de HCN
(Arrázola, 2002). Este proceso se realizó tomando como referencia a la cantidad de
HCN encontrada en la semilla de linaza canadiense (3,9 ug HCN/kg), y en la
venezolana (3,7 ug HCN/kg). Siguiendo datos de referencia, se comprueba que el
método puede ser aplicado en las semillas de linaza ecuatoriana.
Finalmente, se obtuvo como resultado una coloración naranja intensa en las
semillas de linaza sin tostar, resultado de la formación de isopurpurato alcalino
(Arrázola, 2002). Respecto a las semillas tostadas, se consiguió una coloración naranja
pálida; por lo que, al comparar los resultados cualitativos, se comprobó que al ser
sometidas al calor la cantidad de compuestos cianógenos disminuye. Ver ilustración
XIV y X
4.2.2. Extracción del aceite de semillas de linaza
Tabla 6. Volumen de aceite de linaza obtenido por prensado en frío.
Volumen
aceite
Rendimiento
Aceite de linaza sin
tostar
188 ml 7,70%
Aceite de linaza tostada 214 ml 8,80%
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
47
La obtención de aceite de semillas de linaza se realizó usando el método de
prensado en frío, para evitar la degradación de componentes sensibles como la vitamina
E y Omegas. Ver ilustración XVI y XVII
De esta manera, se obtuvo 188 ml de aceite de linaza sin tostar con rendimiento
de 7,70 %, y 210 ml de linaza tostada con rendimiento de 8,80 %, que al compararlo
con el rendimiento obtenido por Álvarez (2010) que fue de 8,83% los resultados
obtenidos son semejantes.
4.2.3. Control de calidad de aceite de linaza.
Cuantificación de vitamina E.
Tabla 7. Cantidad de vitamina E en aceite de linaza
Vitamina E (mg/100g)
Aceite de linaza sin tostar 5184,1
Aceite de linaza tostada 4990,9
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
La cuantificación de vitamina E fue realizada por el laboratorio QC Services,
empleando la técnica de HPLC acoplada a un detector de fluorescencia.
No existe una especificación para vitamina E en aceite de linaza ecuatoriana,
por lo que se tomó como referencia el valor de la linaza canadiense 55,2 mg vitamina
E/100 gr aceite, que al ser comparado con nuestros resultados (4990,9 mg/100g) para
aceite de linaza sin tostar y (5184,1 mg/100g), estos se encuentran sobreestimados
aproximadamente en un 90 % más que la referencia.
La vitamina E en el aceite de linaza se encuentra como tocoferoles los que se
pueden presentan en 8 formas diferentes α tocoferol, α tocotrienol, β tocoferol, γ
tocoferol, β tocotrienol, γ tocotrienol, δ tocoferol, δ tocotrienol, esto se descomponen
fácilmente en presencia de luz, oxigeno, temperaturas elevadas, pH alcalino y ciertas
trazas de minerales como fierro (Fe 3+) y cobre (Cu2+), generando productos de
degradación como la tocoferilquinona y la tocoferil hidroquinona (Sayago, Marín,
Aparicio, & Morales, 2007). Además la presencia de otros compuestos en elevadas
concentraciones y con propiedades químicas similares pueden producir interferencia;
como los lignanos presentes en el aceite de linaza que al igual que la vitamina E
presentan activad antioxidante (Begoña, Chicote, & Deulofeu, 2017).
48
Tanto los lignanos como los productos de degradación mencionados
anteriormente pudieron haber coeluido produciendo un error por reabsorción que ocurre
cuando otra molécula o parte de una macromolécula absorbe las longitudes de onda en
la que el fluoróforo emite radiación. Si este es el caso, una parte o la totalidad de los
fotones emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidos de nuevo dando como
resultado una mayor fluorescencia y por ende una mayor concentración. También la
fluorescencia puede presentarse en forma más intensa con compuestos que tienen
grupos funcionales aromáticos con bajas energías de transición (Skoog & West, 1994).
Por ultimo al ser un análisis tercerizado, hubo una falta de especificad del
método para este tipo de muestra.
Determinación de Omega 3, 6 y 9.
Una vez realizada la metilación en frío y caliente. Se obtuvo una mejor
separación y resolución en los picos de la cromatografía con la metilación en caliente.
Al realizar los análisis se identificó la presencia de omega 3, 6 y 9, con un
mayor porcentaje relativo de omega 3 en el aceite de linaza sin tostar (73,74 %) en
comparación del aceite de linaza tostada (68,88 %). Esto sugiere que, el proceso de
calentamiento al que estuvo expuesta la semilla tostada influyó en la cantidad de omega
3 el cual es un ácido graso primordial que forma parte de la estructura de membrana del
cerebro, necesario para su correcto desarrollo y mantenimiento.
Tabla 8. Resultados de la cromatografía de aceite de linaza sin tostar
Tiempo de
retención
Porcentaje
relativo
Ácido hexadecanoico, metil éster
Formula: C17H34O 2 (Acido Palmítico)
16,911 11,36 %
Acido 9,12,15-Octadecatrienoico, metil
éster, (Z,Z,Z)-
Formula: C19H32O (Omega 3)
19,435 73,74 %
Acido 9,12-Octadecadienoico (Z,Z)-
Formula: C18H 32O2 (Omega 6)
20,026 7,95 %
Ácido Eicosanoico, metil éster Formula:
C21H42O2 (Omega 9)
22,096 0,47 %
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
49
Ilustración III. Cromatografía de semilla de linaza sin tostar.
Tabla 9. Resultados de la cromatografía de aceite de linaza tostada
Tiempo
de
retención
Porcentaje
relativo
Ácido hexadecanoico, metil éster
Formula: C17H34O 2 (Acido Palmítico)
16,906 6,61 %
Acido 9,12,15-Octadecatrienoico, metil
éster, (Z,Z,Z)-
Formula: C19H32O (Omega 3)
19,416 68,88 %
Acido 9,12-Octadecadienoico (Z,Z)-
Formula: C18H 32O2 (Omega 6)
20,055 13,22 %
Ácido Eicosanoico, metil éster Formula:
C21H42O2 (Omega 9)
22,089 0,38 %
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
50
Ilustración IV. Cromatografía de semilla de linaza tostada.
Determinación de densidad relativa.
Tabla 10. Densidad relativa de aceite de linaza
Densidad
relativa (g/ml)
linaza sin tostar 0,933
linaza tostada 0,930
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
La densidad de un aceite permite determinar su origen y el estado en el que se
encuentra ya que esta se verá afectada por el estado de rancidez del aceite, también nos
permite identificar si existe algún tipo de adulteración o si existe mezcla con otros
aceites. Al realizar la determinación de la densidad del aceite de linaza tostada y sin
tostar se pudo observar que ambos valores fueron muy cercanos, de esta manera se
determinó que el proceso de calentamiento no influyó en la densidad relativa de dichos
aceites y al comparar con el rango referenciado en el Codex (1999) para aceite de linaza
(0,925 g/ml a 0,935 g/ml) se encuentra dentro de lo referenciado por dicho organismo.
Ver ilustración XIX.
51
Determinación del Índice de Acidez.
Tabla 11. Índice de acidez de aceite de linaza
Promedio
repeticiones
Promedio Índice de Acidez
(mg KOH/g aceite)
Linaza sin
tostar
0,7575
Linaza tostada 0,8160
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
El índice de acidez determinado constituye una medida del grado de hidrólisis
del aceite la que tiene lugar en la unión entre los ácidos grasos y la porción del glicerol
generando ácidos grasos libres. Este mecanismo puede acelerarse por las altas
temperaturas, presiones y una excesiva cantidad de agua (Ayala, 2011).
De acuerdo con la tabla 12, se obtuvo como resultado de índice de acidez un
valor de 0,7575 (mg KOH/g aceite) para el aceite de linaza sin tostar y 0,8160 (mg
KOH/g aceite) para aceite de linaza tostada observándose que el proceso de tostado
afectó aumentando dicho índice, pese a esto ambos valores son menores que 2 (mg
KOH/g aceite) cumpliendo con el valor que establecido por la USP para este tipo de
aceite. Ver Ilustración XX.
La presencia de ácidos grasos libres se debe a la actividad enzimática de las
lipasas presentes en todas las semillas y los frutos oleaginosos encontrándose tanto en el
embrión como en el mesocarpio del fruto. Durante el almacenamiento de aceites
comestibles se evidencia un incremento de ácidos grasos en una primera etapa, como
resultado de la actividad enzimática de las lipasas, hasta alcanzar un valor máximo, a
partir del cual comienza a disminuir. Esta disminución puede deberse al hecho que los
ácidos grasos libres comienzan a oxidarse a compuestos oxigenados, como
hidroperóxidos, por la acción de agentes químicos (oxígeno, temperatura, luz) o agentes
bioquímicos (microorganismos, enzimas lipoxidasas) (Zumbado, 2004). Debido a este
comportamiento la determinación del Índice de Acidez no es concluyente para
determinar el estado cualitativo del aceite. Así, un valor bajo pudiera indicar: o bien que
el producto está poco hidrolizado, o bien que el estado de deterioro es más avanzado y
que parte de los ácidos grasos libres han comenzado a oxidarse. De ahí la necesidad de
realizar otros análisis (Índice de Peróxido, Yodo, Saponificación y Esterificación), para
obtener información fidedigna del estado del aceite analizado (Zumbado, 2004).
52
Determinación del Índice de esterificación
Tabla 12. Índice de esterificación de aceite de linaza
Promedio
repeticiones
Promedio Índice de
esterificación (mg KOH/g
aceite)
Linaza sin tostar 182,52
Linaza tostada 182,65
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
El índice de esterificación permite determinar el número de miligramos de hidróxido de
potasio necesario para saponificar los esteres presentes en 1 g de aceite los valores
obtenidos de aceite de linaza tostada 182,65 (mg KOH/g aceite) y sin tostar 182,52 (mg
KOH/g aceite) son muy cercanos entre sí por lo que en este análisis no influyó el
proceso de tostado de la semilla.
Determinación de Índice de yodo
Tabla 13. Índice de yodo de aceite de linaza
Promedio de las
repeticiones
Promedio Índice de yodo
(cg I/g)
Linaza sin tostar 157,47
Linaza tostada 145,12
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
El índice de yodo es una medida del grado de saturación de los componentes de
una grasa o aceite por lo que este aumentará cuanto mayor sea el número de dobles
enlaces por unidad de grasa o aceite, estos dobles enlaces presentes en los ácidos grasos
no saturados reaccionan con el yodo, o algunos compuestos de yodo, formando
compuestos por adición.
Durante su almacenamiento, el aceite sufre procesos de oxidación,
disminuyendo el Índice de Yodo debido a que dichos procesos oxidativos tienen lugar
sobre los dobles enlaces, saturando la molécula (Zumbado, 2004).
Al comparar los valores obtenidos en el análisis se pudo observar que el valor de
índice de yodo para el aceite de linaza sin tostar es 157,47 (cg I/g) por lo que cumple
con el rango establecido por la USP para este aceite. Además se pudo determinar que el
proceso de tostado si influyó ya que en el aceite de linaza tostada el índice de yodo es
menor 145,12 (cg I/g) y además no entra en el rango establecido por la USP que es de
53
150 a 165 (cg I/g) de acuerdo con Zumbado, (2014), mientras más bajo es el índice de
yodo más alto es el grado de saturación de una grasa o aceite lo que nos permite
utilizarlo como medida de identidad y calidad del aceite analizado.
El hecho de que el aceite no cumpla con este índice, se puede deber a que a
diferencia del análisis de índice de acidez, el análisis de índice de yodo se realizó 20
días después de realizada su extracción, y los aceites son más susceptibles a la
oxidación que otras grasas por su estado líquido; provocando consecuentemente un
menor índice de yodo.
Determinación de Índice de saponificación
Tabla 14. Índice de saponificación de aceite de linaza
Promedio Índice de saponificación
(mg KOH/g aceite)
Linaza sin tostar 183,29
Linaza tostada 183,47
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Los ésteres de los ácidos grasos de bajo peso molecular, requieren más base para
la saponificación porque el número de moléculas presentes en 1g de muestra es mayor y
mayor el índice de saponificación que aquellos de más alto peso molecular (Zumbado,
2004), como en el caso del aceite de linaza, que está compuesto por ácidos grasos de
alto peso molecular obteniendo valores muy cercanos entre sí; 183,29 (mg KOH/g
aceite) para aceite de linaza sin tostar y 183,47 (mg KOH/g aceite) para aceite de linaza
tostada. Por lo que ambos valores se encuentran dentro del rango establecido por la
USP (180 a 190 (mg KOH/g aceite)
El comportamiento del Índice de Saponificación durante el tiempo de
almacenamiento experimenta una tendencia decreciente. Debido a la oxidación que
pueden sufrir los ácidos grasos, conduciendo a la transformación en otros compuestos
no saponificables como hidroperóxidos, peróxidos, aldehídos y cetonas (Zumbado,
2004).
Determinación de Índice de peróxido.
Tabla 15. Índice de peróxido de aceite de linaza
Promedio Índice de
peróxido (meq oxígeno
activo/kg de aceite)
Linaza sin tostar 20,79
Linaza tostada 21,27
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
54
Este índice indica el estado de oxidación inicial del aceite en miliequilaventes de
oxígeno activo por kilogramo de grasa (meq O/Kg aceite), por lo que a mayor índice de
peróxido menor será la capacidad antioxidante y de esta manera permite detectar la
oxidación antes de que se pueda percibir organolépticamente (Ayala, 2011).
Al comparar los valores obtenidos en el aceite de linaza tostada y sin tostar
20,79 y 21,27 (meq oxígeno activo/kg de aceite) respectivamente, se observa que son
valores muy cercanos y además se salen de lo establecido por el (Codex, 1999) para
aceites prensados en frío y vírgenes que es de 15 mili equivalentes de oxígeno activo/kg
de aceite debido a que los productos que contienen una proporción más elevada de
ácidos grasos insaturados como el aceite de linaza son más propensos a la oxidación
que los que contienen cantidades más bajas, debido a que estas instauraciones necesitan
menos tiempo para absorber la misma cantidad de oxígeno que los ácidos grasos con
menos instauraciones. Apareciendo los peróxidos cuando el aceite está expuesto a la luz
o al calor sufriendo el deterioro de componentes como la vitamina E que posee
actividad antioxidante (Ayala, 2011).
4.3 Etapa 3: Proceso Experimental.
4.3.1. Laberinto acuático de Morris.
Tabla 16. Resultados del análisis de varianza (ANDEVA) para el Laberinto Acuático de
Morris.
Fuente de
Variación
Suma
de
Cuadra
dos
Grados
de
Libertad
Promedi
o de los
Cuadrad
os
F.
calculad
a
Valor
crítico F.
Tab 5 %
Valor
crítico F.
Tab 1 %
Total 973,2 55
Bloque
(sexo)
5,01 1 5,01 0,62 ns 4,17 7,56
Tratamientos 750,94 27 27,81 3,45 ** 1,79 2,3
Factor A
(grupo)
232,8 3 77,6 9,64 ** 2,92 4,51
Factor B
(día)
333,9 6 55,65 6,91 ** 2,42 3,47
Interacción 184,24 18 10,24 1,27 ns 1,93 2,55
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Coeficiente de varianza: 26,52 %
Para realizar el análisis estadístico se realizó un Diseño de Bloques
Completamente al Azar (D.B.C.A), con un arreglo factorial A x B, en el que A
correspondió a los 4 grupos de ratones (blanco, ginkgo biloba, aceite y polvo de linaza),
B al tiempo de latencia de en los diferentes días de evaluación y como bloque se usaron
55
los tiempos de latencia de ambos sexos. Para analizar los resultados del ANDEVA y
determinar si hubo o no diferencia significativa entre los factores, tratamientos y en la
interacción se tomó como criterio de significancia que el valor de F calculada debía ser
mayor o igual que el F tabular al 5 % o 1 %, observándose diferencia significativa al 1
% para los tratamientos, factor grupo y factor día. Sin embargo no se observó diferencia
en la interacción y el bloque.
Esto quiere decir que el comportamiento de los ratones no es el mismo
conforme pasan los días, de igual manera se ve un comportamiento diferente con los
tratamientos y los grupos en estudio; en cuanto a la relación del sexo este no influyó en
el tiempo de latencia.
Los valores de tiempo de latencia que fueron usados para realizar la estadística
se pueden observar en el anexo E.
Tabla 17. Prueba de Duncan al 5 % para el factor grupo
Grupos Medias Duncan
Blanco 14,12 A
Ginkgo
biloba
10,34 B
Aceite de
linaza
9,39 B
Polvo de
linaza
8,94 B
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
A continuación, debido a que se encontró diferencia significativa en el factor
grupo se realizó la prueba de Duncan al 5 % , observándose 2 rangos bien definidos, de
los cuales el rango A corresponde al tiempo de latencia del grupo blanco siendo este
significativamente mayor a los grupos que comparten un mismo rango, por lo que se
podría decir que los grupos de aceite y polvo de linaza ocuparon un tiempo
estadísticamente menor para encontrar el objetivo y además son equivalentes al grupo
de ginkgo biloba en cuanto al efecto nootrópico que estos produjeron en los animales de
experimentación.
56
Gráfico 1. Laberinto acuático de Morris: Tiempo de latencia en función de los días de
evaluación para cada grupo. Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Debido a que en el ANDEVA de la tablas 16 no se halló diferencia significativa
en el sexo del ratón, para trazar el gráfico se tomaron los tiempos de latencia promedio
de machos y hembras en conjunto, tomando en cuenta que cada ratón de cada grupo fue
impulsado a realizar 4 repeticiones diarias durante 7 días seguidos; de manera que en el
eje Y se presenta el tiempo promedio de las repeticiones que realizaron los ratones hasta
alcanzar la plataforma sumergida, y en el eje X se muestran los días de evaluación.
Para los siguientes análisis se hizo uso del mismo gráfico para observar las
variaciones de cada grupo en función de los días, y del anexo I y J para determinar si
hay o no diferencia significativa entre estas variaciones.
Primero se analizó a partir de que día el tiempo realizado por cada grupo para
llegar al objetivo fue estadísticamente diferente al realizado el primer día de evaluación,
luego se analizó si hubo diferencia significativa entre los grupos en función de los días;
obteniendo los siguientes resultados:
El grupo blanco no presentó disminución estadística del tiempo latencia durante
los 7 días de evaluación, sin indicar un aprendizaje ni mejora en su memoria.
0,00
3,00
6,00
9,00
12,00
15,00
18,00
21,00
0 1 2 3 4 5 6 7
tiem
po
de
late
nci
a (s
egu
nd
os)
días de evaluación
Tiempo de latencia vs días de evaluación
BLANCO GINKGO BILOBA ACEITE DE LINAZA POLVO DE LINAZA
57
En el grupo al que se administró polvo de linaza se observó una disminución
significativa del tiempo de latencia con respecto al primer día a partir del tercer día; en
el cuarto día se siguió observando una disminución significativa y además fue
estadísticamente menor al grupo blanco, sin embargo presenta igualdad estadística con
los demás grupos, finalmente a partir del quinto hasta el séptimo día, a pesar de que
presenta diferencia estadística con el primer día de evaluación, no se halló diferencia
significativa con los otros grupos.
El grupo administrado ginkgo biloba mostró una diferencia significativa con
respecto al primer día en el cuarto día, a la vez se observó que fue estadísticamente
menor al grupo blanco, no obstante realizó tiempos estadísticamente iguales a los
grupos de aceite y polvo de linaza; en el quinto día aumentó el tiempo de latencia
haciendo que ya no sea estadísticamente diferente al primer día y finalmente en el sexto
y séptimo día vuelve a disminuir el tiempo de latencia volviendo a ser estadísticamente
diferente con respecto al primer día, mas no se observa diferencia estadística con los
demás grupos.
Por otro lado el grupo administrado aceite de linaza aunque mostró diferencia
significativa con respecto al primer día durante los 7 días de evaluación, de acuerdo con
la tabla 17 su tiempo de latencia fue estadísticamente menor al grupo blanco.
Debido a que a partir del quinto día se observó un comportamiento
contradictorio de los grupos, a la disminución de tiempo que se venía observando
durante los 4 primeros días, se tomará en consideración para las conclusiones solo los 4
primeros días de evaluación; pudiendo deberse este comportamiento contradictorio a
que los ratones se sentían aburridos o cansados de la monotonía de las pruebas,
observándose en estos últimos días de evaluación los ratones especialmente de los
grupos de ginkgo biloba y polvo de linaza se quedaban quietos por unos segundos,
mirando a su alrededor antes de comenzar a nadar, no obstante iban directamente al
objetivo; el comportamiento en otros ratones fue que una vez que llegaban a la
plataforma volvían a entrar en el agua prefiriendo explorar una vez más, otra fuente de
error pudo ser el experimentador u otros factores ambientes como el clima, ruido, o
estrés del ratón por las repeticiones de la prueba.
Cabe recalcar que al comenzar la evaluación en este laberinto los ratones tenían
28 días de tratamiento el que fue administrado diariamente, incluso durante los 7 días
de evaluación dando un total de 34 días de tratamiento al finalizar esta prueba.
Durante las evaluaciones realizadas se observó que los ratones especialmente las
hembras arañaban las paredes de la piscina tratando de escapar, esto se denomina
conducta tigmotáxica que a la vez es sexodimórfica la que aparece especialmente en los
ensayos iniciales y es más frecuente en las hembras, lo que reflejaría mayor nivel de
ansiedad (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003).
58
Durante el tiempo que duró el tratamiento y las evaluaciones en el test del
laberinto acuático, a un ratón macho del grupo de Ginkgo biloba se le aisló debido a
que se mostraba muy agresivo con los otros ratones de su jaula. Y en las evaluaciones
mostró el menor tiempo de latencia dentro de este grupo durante toda la prueba,
sugiriendo que el aislamiento social, aunque altera otras conductas, como la habituación
en campo abierto, no parece influir en la memoria de referencia espacial, sino que
incluso podría mejorar la adquisición de la memoria en el laberinto acuático de Morris
(Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003).
El laberinto acuático de Morris refleja la complejidad de la navegación espacial,
mostrando cómo los ratones se orientan eficientemente en el espacio mediante su
capacidad de establecer y retener asociaciones, frente a estímulos ambientales como las
figuras de colores que se colocaron cerca de la plataforma y a pesar de tratarse de una
tarea que causa cierto grado de estrés, la ejecución de este test resulta muy útil para
investigar los mecanismos implicados en el aprendizaje y la memoria espacial, además
permite evaluar la capacidad espacial de los animales pudiéndose obtener diferentes
medidas de su conducta espacial. Por otro lado en comparación con el laberinto radial,
el laberinto acuático posee ciertas ventajas como es el de la facilidad de detectar y
cuantificar las diferentes estrategias de búsqueda, así como su mayor sensibilidad a los
cambios que en estas estrategias producen las lesiones cerebrales o la administración de
fármacos (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003).
4.3.2. Laberinto radial de ocho brazos
Análisis estadístico del tiempo de latencia
Tabla 18. Resultados del análisis de varianza (ANDEVA) del tiempo de latencia para el
Laberinto radial de 8 brazos
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados
de
libertas
Promedio
de los
cuadrados
F.
calculada
Valor
crítico
F. Tab
5%
Valor
crítico
F. Tab
1%
Total 192980,88 55
Bloque (sexo) 1110,72 1 1110,72 0,89 ns 4,17 7,56
Tratamientos 158166,54 27 5858,02 4,69 ** 1,79 2,3
Factor A
(grupo)
98700,64 3 32900,21 26,36 ** 2,92 4,51
Factor B (días) 44193,14 6 7365,52 5,9 ** 2,42 3,47
Interacción 15272,76 18 848,49 0,68 ns 1,93 2,55
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Coeficiente de varianza: 19,07 %
59
Para realizar el análisis estadístico se realizó un Diseño de Bloques Completamente
al Azar (D.B.C.A), con un arreglo factorial A x B, en el que A correspondió a los 4
grupos de ratones (blanco, ginkgo biloba, aceite y polvo de linaza), B al tiempo de
latencia en los diferentes días de evaluación y como bloque se usaron los tiempos de
latencia de ambos sexos. Para analizar los resultados del ANDEVA y determinar si
hubo o no diferencia significativa entre los factores, tratamientos y en la interacción se
tomó como criterio de significancia que el valor de F calculada debió ser mayor o igual
que el F tabular al 5 % ó 1 %, observándose diferencia significativa al 1 % para los
tratamientos, factor grupo y factor día. Sin embargo no se observó diferencia en la
interacción y el bloque.
Esto quiere decir que el comportamiento de los ratones no es el mismo
conforme pasan los días, de igual manera se ve un comportamiento diferente con los
tratamientos y los grupos en estudio; en cuanto a la relación del sexo este no influyó en
el tiempo de latencia.
Los valores de tiempo de latencia que fueron usados para realizar la estadística
se pueden observar en el anexo F.
Tabla 19. Prueba de Duncan al 5 % para el factor grupo
Tratamientos Medias Duncan
Blanco 257,29 A
Ginkgo biloba 170,19 B
Aceite de
linaza
158,36 B
Polvo de
linaza
155,07 B
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
A continuación, se realizó la prueba de Duncan al 5 % para el factor grupo,
obteniendo que aquellos que fueron administrados: ginkgo biloba, aceite y polvo de
linaza emplearon un tiempo estadísticamente menor para visitar los 8 brazos que el
grupo usado como blanco, lo que se evidencia en los 2 rangos bien definidos que se
observan en esta tabla; por lo que se podría decir que los grupos de aceite y polvo de
linaza al compartir un mismo rango con el grupo de ginkgo biloba, son equivalentes a
este en cuanto al efecto nootrópico que estos produjeron en los animales de
experimentación.
60
Gráfico 2. Laberinto radial: Tiempo de latencia en función de los días de
evaluación para cada tratamiento.
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Debido a que en el ANDEVA no se halló diferencia significativa en el sexo del
ratón, para trazar el gráfico 2 se tomaron los tiempos de latencia promedio de machos y
hembras en conjunto, de manera que en el eje Y, se presenta el tiempo medio de
latencia que emplearon los ratones para visitar los 8 brazos del laberinto. Cada ratón de
cada grupo realizó este test por 7 días seguidos, lo que se muestra en el eje X como días
de evaluación. Cabe recalcar que al comenzar la evaluación en este laberinto los ratones
tenían 35 días de tratamiento el que fue administrado diariamente incluso durante los 7
días de evaluación dando un tratamiento total de 41 días.
Para los siguientes análisis se hizo uso del mismo gráfico para observar las
variaciones de cada grupo en función de los días, y del anexo K y L para determinar si
hay o no diferencia significativa entre estas variaciones.
Al analizar el gráfico 2 se observó que todos los grupos presentaron una
tendencia decreciente en el tiempo de latencia conforme aumentaban los días de
evaluación; no obstante esta disminución no fue significativa con respecto al primer día
en ninguno de los grupos, excepto en el grupo que fue administrado ginkgo biloba el
cual mostró una disminución significativa del tiempo de latencia en el cuarto día
evaluación.
Al comparar los tiempos de latencia entre grupos y días se observó que en el
primer día de evaluación el grupo de polvo y aceite de linaza realizaron la prueba en un
tiempo estadísticamente menor al grupo blanco, mostrando un mejor desempeño desde
el primer día y en el segundo día el tiempo de latencia del grupo administrado ginkgo
90,00
120,00
150,00
180,00
210,00
240,00
270,00
300,00
330,00
0 1 2 3 4 5 6 7
tiem
po
de
late
nci
a (s
egu
nd
os)
días de evaluación
Tiempo de latencia en función de los días de evaluación.
BLANCO GINKGO BILOBA ACEITE DE LINAZA POLVO DE LINAZA
61
biloba fue estadísticamente menor al del grupo blanco; en los días posteriores se
observa que todos los grupos realizan el test en tiempos estadísticamente menores con
respecto al blanco, pero sus tiempos de latencia son estadísticamente iguales entre sí,
excepto en el día 5 en el que solo el grupo de aceite de linaza es estadísticamente menor
al grupo blanco.
El hecho de que en unos días el tiempo de latencia haya sido estadísticamente
menor al grupo blanco y en otros no, podría deberse a que este test es afectado por el
ambiente en donde se desarrolla la prueba, siendo el ruido el factor más importante ya
que durante la prueba este causaba que los ratones no salgan a explorar pronto los
brazos del laberintos, aumentando de esta manera el tiempo de latencia, también puede
deberse a que este test fue realizado después de 14 días, en los que los ratones
realizaron 7 días de entrenamiento y 7 de prueba en el laberinto acuático, por lo que al
realizar el test de laberinto radial los ratones estaban cansados de ser sometidos a tantos
ensayos haciendo que su conducta sea variable.
Gráfico 3. Laberinto Radial: Número de desaciertos en función del día de evaluación
para cada grupo.
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Para el gráfico 3, en el eje Y se muestra el número de desaciertos totales que
cada grupo tuvo al visitar los 8 brazos del laberinto, es decir cuando el ratón visitó más
de una vez un mismo brazo, y en el eje X se muestran los días de evaluación.
En el anexo G se pueden observar los valores de número de desaciertos que
fueron utilizados para realizar el gráfico 3
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7
Núm
ero d
e d
esac
iett
os
días de evaluación
Número de desaciertos vs días de evaluación
BLANCO GINKGO BILOBA ACEITE DE LINAZA POLVO DE LINAZA
62
El número de desaciertos que tuvieron los ratones permitió evaluar la memoria
de trabajo ya que la visita a un brazo previamente elegido se considera un error de dicha
memoria. Además ésta corresponde a los aspectos cambiantes en cada ensayo y que el
sujeto debe recordar, para minimizar los errores en cada ensayo.
En la gráfico 3 se puede apreciar que los 4 grupos siguen una tendencia
decreciente, es decir a media que aumentan los días de evaluación el número de
desaciertos tiende a disminuir permitiendo evidenciar una mejora de la memoria de
trabajo. Así en el primer día de evaluación, el grupo blanco tuvo mayor número de
desaciertos (53) y el polvo de linaza fue el grupo que tuvo menor número de desaciertos
(18). Y al finalizar la prueba el séptimo día se observa que todos los grupos tuvieron
una cantidad de desaciertos semejantes; Sin embargo si te toma en cuenta la cantidad de
desaciertos totales durante los 7 días de evaluación, los grupos administrados polvo y
aceite de linaza tuvieron un número de desaciertos muy similares entre si 89 y 93
respectivamente, sin embargo estos fueron menores a lo del grupo administrado ginkgo
biloba (112) y a la vez estos menores a los del grupo blanco (184).
Durante los ensayos se observó en los ratones una alta tendencia a elegir los
brazos contiguos, disminuyendo esta tendencia según los brazos se alejan de aquél más
recientemente elegido, esta tendencia complicó el análisis de la memoria de trabajo, ya
que existe la posibilidad de que los animales, en lugar de recordar los lugares
previamente visitados, utilicen algún patrón de locomoción (visitar siempre el brazo
contiguo) que resulte en una alta tendencia de elegir lugares no visitados. Por lo que
para evitar esto se sugeriría regresar al ratón a la plaza central del laberinto después de
cada visita (Cabrera, 2009).
Las propiedades fijas de la estructura ambiental fueron determinantes para la
memoria de referencia, dado que estas propiedades ambientales controlan la conducta
consistentemente a través de los ensayos. Por otro lado, los aspectos transitorios y
cambiantes en el ambiente son los relevantes para la memoria de trabajo, dado que estos
aspectos controlan la conducta momento a momento dentro del ensayo, y pierden efecto
al término de cada ensayo (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003).
En el laberinto radial también se observó la conducta tigmotáxica descrita en el
laberinto de Morris, viéndose reflejada en un mayor nivel de ansiedad que presentaban
las hembras al ser las que más orinaban y aruñaban las paredes del laberinto.
63
4.3.3. Pesaje de animales de experimentación.
Tabla 20. ANDEVA para el peso inicial de animales de experimentación.
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados
de
libertas
Promedio
de los
cuadrados
F.
calculada
Valor
crítico
F. Tab
5%
Valor
crítico
F. Tab
1%
Total 358 23
Bloque 15,25 2 7,63 1,8 ns 3,74 6,51
Tratamientos 283,33 7 40,48 9,55 ** 2,76 4,28
Factor grupo 25 3 8,33 1,96 ns 3,34 5,56
Factor sexo 228,17 1 228,17 53,81 ** 4,6 8,86
IAB 30,16 3 10,05 2,37 ns 3,34 5,56
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Para realizar el análisis estadístico del peso de los animales de experimentación,
se realizó un Diseño de Bloques Completamente al Azar (D.B.C.A), con un arreglo
factorial A x B, en el que A correspondió a los 4 grupos de ratones (blanco, ginkgo
biloba, aceite y polvo de linaza), B el peso inicial de ambos sexos y como bloque el
peso inicial de cada ratón. Observándose en el ANDEVA, diferencia significativa al 1
% para los tratamientos y el sexo. Sin embargo no se observó diferencia para el bloque,
factor grupo y la interacción.
Tabla 21. Peso inicial: Prueba de Duncan al 5 % para el factor sexo
Sexo Medias Duncan
machos 36,08 A
hembras 29,92 B
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
A continuación, debido a que se encontró diferencia significativa en el factor
sexo, se realizó la prueba de Duncan al 5 %, obteniendo que los machos presentaban un
peso estadísticamente mayor al de las hembras al empezar la experimentación.
64
Tabla 22. ANDEVA para la ganancia de peso de animales de experimentación.
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Para determinar si las sustancias administradas durante la experimentación
influyeron, se procedió a realizar un ANDEVA con la ganancia de peso al final de la
experimentación. En la cual no se observó diferencia significativa para el bloque,
tratamiento, factor grupo, sexo ni en la interacción.
Gráfico 4. Peso de ratones durante la experimentación.
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
En el gráfico 4, se muestra el peso de los ratones de cada grupo en conjunto sin
hacer diferencia de sexo ya que de acuerdo con el ANDEVA de la tabla 22, el peso de
30,00
31,00
32,00
33,00
34,00
35,00
36,00
37,00
38,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
PES
O R
ATO
NES
SEMANAS
Peso de ratones vs Semana
BLANCO GINKGO BILOBA ACEITE DE LINAZA POLVO DE LINAZA
Fuente de
variación
Suma de
Cuadrados
Grados
de
libertas
Promedio de
los
cuadrados
F.
calculada
Valor
crítico
F. Tab
5%
Valor
crítico
F. Tab
1%
Total 0,0295 23
Bloque 0,0013 2 0,0007 0,4667 ns 3,74 6,51
Tratamiento 0,0075 7 0,0011 0,7333 ns 2,76 4,28
Factor
grupo
0,0029 3 0,001 0,6667 ns 3,34 5,56
Factor sexo 0,0002 1 0,0002 0,1333 ns 4,6 8,86
Interacción 0,0044 3 0,0015 1 ns 3,34 5,56
65
los ratones no se vio influenciado por la sustancia administrada ni por el sexo, además
se debe tomar en cuenta que los ratones fueron pesados una vez a la semana durante 7
semanas de manera que en el eje Y se encuentran las medias de los pesos para cada
grupo y en el eje X el número de semanas que duró la experimentación. Los valores de
los pesos usados para trazar el gráfico 4 se encuentran en el anexo H
Al analizar el gráfico 4 se observa que el primer pesaje que fue al iniciar la
administración de las sustancias de estudio, el grupo al que se le administró aceite de
linaza fue el que tuvo el mayor peso y el grupo administrado ginkgo biloba fue el que
comenzó la experimentación con menor peso con respecto a los demás grupos, sin
embargo de acuerdo con la tabla 20, estas diferencias de peso no fueron significativas,
por lo que todos los grupos iniciaron la experimentación en las mismas condiciones; no
obstante de acuerdo con la tabla 21 los machos iniciaron con un peso estadísticamente
mayor al de las hembras. A continuación se observó una tendencia creciente del peso de
todos los grupos hasta la cuarta semana siendo está más pronunciada en el grupo blanco
y en el grupo administrado polvo de linaza en menor proporción, luego en la quinta
semana el peso disminuye drásticamente; esto debido a que en esta semana se realizó el
entrenamiento de los ratones en los 2 laberintos en donde se redujo su porción de
alimento aproximadamente en un 50 %.
En el grupo administrado polvo de linaza tanto se observó que hubo no una
ganancia de peso brusca en las primeras cuatro semanas como sucedió con el grupo
blanco, pese a que en estas semanas se les se proporcionó la misma cantidad de comida
a todos los grupos, esta diferencia en la ganancia de peso, puede deberse a que la linaza
al ser administrada molida contiene restos de la cubierta o cáscara de la semilla la cual
posee un alto contenido de fibra dietética que incrementa el bulto intestinal y disminuye
el periodo de tránsito intestinal aumentando su funcionamiento en un 30% por semana.
(Morris, 2007), produciendo un efecto de laxación en los ratones evitando que estos
ganen peso rápidamente; además las diferencias genéticas y el ambiente juegan un
papel importante sobre el peso corporal de los animales de laboratorio, incluso dentro
de una de una misma cepa proveniente de un mismo bioterio, en el que los animales
hayan sido manejados bajo sistemas convencionales de producción, pero bajo
condiciones ambientales y de manipulación distinta (Fuentes, 2000).
Al analizar los pesos de cada grupo en la semana 7, se observó que el peso de
todos los grupos fueron mayores al que tenían al iniciar la experimentación, y de
acuerdo con la tabla 22 esta ganancia fue estadísticamente igual para todos los grupos y
para ambos sexos.
66
4.3.4. Necropsia de animales de experimentación
Tabla 23. Resultados de la necropsia de ratones hembra
HEMBRAS
BLANCO GINKGO
BILOBA
ACEITE DE
LINAZA
POLVO DE
LINAZA
Peso ratón 32,39 g 32,94 g 36,31 g 29,82 g
Híg
ad
o Peso
Peso en %
1815,9 mg
(5,61 %)
1810,0 mg
(5,50 %)
1782,2 mg
(4,90 %)
1368,3 mg
(4,6 %)
forma semiovoide Semiovoide semiovoide Semiovoide
Coloración rojo oscuro rojo oscuro rojo oscuro rojo oscuro
Bazo
forma aplanado,
oblongo
aplanado,
oblongo
aplanado,
oblongo
aplanado,
oblongo
Coloración rojizo
violáceo
rojizo
violáceo
rojizo
violáceo
rojizo
violáceo
Peso
Peso en %
99,1 mg
(0,31 %)
87,9 mg
(0,27 %)
115,7 mg
(0,32 %)
73,2 mg
(0,24 %)
Longitud 1,8 cm 1,9 cm 2,0 cm 1,8 cm
Anchura 0,4 cm 0,4cm 0,5 cm 0,3cm
Cer
ebro
Coloración blanquecina blanquecina blanquecina blanquecina
Peso
Peso en %
349,1 mg
(1,08 %)
383,6 mg
(1,16 %)
473,5 mg
(1,30 %)
433,2 mg
(1,45 %)
Elaborado por: Chiguano M., 2018
67
Tabla 24. Resultados de la necropsia de ratones macho
MACHOS
BLANCO GINKGO
BILOBA
ACEITE
DE
LINAZA
POLVO DE
LINAZA
Peso ratón 41,22 g 39,65 g 32,98 g 36,46 g
Híg
ad
o
Peso
Peso en %
2225,0 mg
(5,40 %)
2160,1 mg
(5,40 %)
1823,1 mg
(5,53 %)
1794,0 mg
(4,92 %)
forma semiovoide Semiovoide Semiovoide Semiovoide
Coloración rojo oscuro rojo oscuro rojo oscuro Rojizo
ligeramente
pálido
Bazo
forma aplanado,
oblongo
aplanado,
oblongo
aplanado,
oblongo
aplanado,
oblongo
Coloración
rojizo-
violáceo
Rojizo
violáceo
Rojizo
violáceo
Rojizo violáceo
Peso
Peso en %
94,9 mg
(0,23 %)
93,2 mg
(0,24 %)
176,3 mg
(0,53 %)
78,7 mg
(0,21 %)
Longitud 1,8 cm 1,8 cm 2,5 cm 1,8 cm
anchura 0,5 cm 0,4 cm 0,5 cm 0,4 cm
Cer
ebro
Coloración blanquecina blanquecina blanquecina Blanquecina
Peso
Peso en %
339,5 g
(0,82 %)
405,5 mg
(1,02 %)
346,5 mg
(1,05 %)
406,8 mg
(1,11 %)
Elaborado por: Chiguano M., 2018.
Se realizó la necropsia a 2 ratones de cada grupo, un macho y una hembra, luego
se procedió a pesar y medir el bazo, hígado y cerebro para luego calcular el peso de
cada órgano en relación al peso corporal expresado en porcentaje (%)
Se analizó el hígado ya que debido a que se administró un aceite, este pudo
haber producido hígado graso u otra anomalía, obteniendo como resultados que el
hígado de la hembras en cuanto a forma y coloración no presentaron anomalías; sin
embargo se observó que el hígado del ratón macho al que se le administró polvo de
linaza, presentó una coloración rojiza pálida en comparación con el blanco cuya
coloración era rojo oscuro y en cuanto al peso de este órgano en relación al peso
corporal presentó un 4,92 % siendo este menor a los otros grupos.
68
También se analizó el cerebro ya que la investigación estuvo enfocada en
obtener un efecto nootrópico el que actúa sobre el cerebro, por lo que se analizó su
coloración, la cual se observó homogénea en todos los ratones, y en cuanto al peso los 2
ratones que fueron administrados polvo de linaza presentaron un porcentaje de peso en
relación a su peso corporal mayor al de los otros grupos y el del grupo blanco presentó
menor peso que los demás grupos. No obstante el peso del cerebro de las hembras en
todos los grupos fue mayor al de los machos encontrándose en concordancia por la
investigación de Fuentes (2000), en donde se estudió el peso de los órganos de ratones
sometidos a las mismas condiciones se encontró que el cerebro de las hembras era
mayor al de los machos.
Finalmente se analizó el bazo, en el que no se halló ninguna anomalía en la
forma y coloración de ninguno de los grupos, no obstante se observó que el bazo del
ratón macho al que se le administró aceite de linaza fue más grande que el de los otros
ratones, presentando un porcentaje de peso con relación corporal de 0,53 % siendo este
el doble del porcentaje del bazo del ratón del grupo blanco, esto puede deberse a que el
bazo es un órgano linfoide que participa en la respuesta inmune primaria contra
microorganismos y proteínas extrañas, por lo que el bazo aumenta de tamaño en casos
de infección (Vargas, Hurtado, & Villalobos, 2013), como pudiera ser el caso de este
ratón, ya que antes de realizar la necropsia este presentaba decaimiento y obstrucción
nasal signos que pudieran pertenecer a una infección respiratoria, Sin embargo el peso
del ratón hembra no se observó esta anomalía.
La edad y el sexo, así como la constitución genética, factores nutricionales,
exposición al ambiente y manejo sanitario, producen cambios en el estado fisiológico
de los animales de laboratorio, que conducen a un incremento o pérdida de peso de
ciertas estructuras anatómicas (Fuentes, 2000).
De acuerdo con el laberinto acuático de Morris algunos estudios han demostrado
que el aprendizaje espacial puede verse afectado de manera severa en animales
estresados, enfermos, desnutridos o viejos (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003). Para
disminuir el factor del estrés se tuvo precaución en mantener el agua de la piscina a una
temperatura entre 28-30 °C, Sin embargo se pudo evidenciar como la enfermedad
afectó el aprendizaje del animal de experimentación, ya que uno de los ratones al que se
le realizó la necropsia perteneciente al grupo administrado aceite de linaza, mostraba
signos de decaimientos y obstrucción nasal encontrando en la necropsia que su bazo en
comparación de los otros ratones era casi el doble del peso además en la prueba de
laberinto acuático demoró un mayor tiempo en encontrar el objetivo.
De acuerdo con (Shively, 1983) indica que en el ratón en general existe un
dimorfismo sexual muy marcado en el bazo, siendo en los machos este órgano hasta un
50 % más grande que el de las hembras. Pero en esta experimentación esto no se
cumplió.
69
Para realizar la necropsia, los ratones fueron sacrificados por dislocación
cervical tomando en cuenta que un rápido sangrado, como lo que se produce en la
decapitación del animal, conlleva a un incremento del peso de los pulmones y un
descenso en el peso de los riñones; el empleo de Nembutal o Pentobarbital
(barbitúrico), genera un significativo aumento en el peso de los riñones, y en algunos
grupos de ratones, el éter puede incrementar el peso del bazo y descender el peso de los
riñones. (Fuentes, 2000)
Las diferencias encontradas en el peso de los órganos se pueden deber a que la
edad y el sexo, así como la constitución genética, factores nutricionales, exposición al
ambiente y manejo sanitario, producen cambios en el estado fisiológico de los animales
de laboratorio, que conducen a un incremento o pérdida de peso de ciertas estructuras
anatómicas como el hígado y bazo.
70
Capítulo V
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1. Conclusiones
5.1.1. Etapa 1: Búsqueda bibliográfica e identificación taxonómica.
El certificado emitido por el herbario Alfredo Paredes de la Universidad Central
corroboró que las semillas de linaza usadas en la presente investigación pertenecen a la
planta cuya especie es (Linum usitatissimum).
La planta de linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum), presentó tallos simples
con hojas sésiles, alternas, lineales o lanceoladas, con flores color azul claro estas están
reunidas en un corimbo terminal, con un semillas de color café, ovaladas y agudas en
uno de sus extremos.
5.1.2. Etapa 2: Control de calidad de semillas y aceite de linaza.
Las semillas de linaza cumplieron con el límite de material extraño permitido
por la farmacopea mexicana, por otro lado en el control microbiológico, aunque hubo
crecimiento, las semillas cumplieron con el límite establecido por la OMS para el
recuento de enterobacterias, aerobios totales y recuento de mohos y levaduras; no
obstante, al realizar este control a las semillas tostadas, además de cumplir con las
especificaciones se observó una reducción de la carga microbiana, convirtiéndose en
una buena opción para el consumo humano.
La técnica de prensado en frío resulta eficaz para la extracción de aceite de
linaza, sin embargo su rendimiento fue menor al 10%.
Observando los resultados expuestos en la tabla 10, se pone de manifiesto que la
semilla de linaza ecuatoriana (Linum usitatissimum) es de alta calidad, pues al analizar
su aceite se encontraron porcentajes relativos significativos de los siguientes
componentes: 73,74 % omega 3 (AAL); 7,95 % omega 6 (AL); 0,47 % omega 9 (AO);
Además Se comprobó que el proceso de tostado de las semillas de linaza disminuye la
cantidad de compuestos cianogénicos y a pesar de presentar menor porcentaje de
omegas, todavía presenta un porcentaje considerable de los mismos: 68,88 % omega 3
(AAL); 13,22 % omega 6 (AL); 0,38 % omega 9 (AO); por lo que esta fue elegida para
realizar la experimentación, permitiendo ser administrada con mayor seguridad a los
animales, para evaluar su efecto nootrópico.
Los parámetros de control de calidad analizados al aceite de linaza tostada y sin
tostar, cumplieron con algunos criterios de aceptación: densidad relativa, índice de
acidez, índice de esterificación, e índice de saponificación. Fuera de esto, ambos aceites
no cumplieron con el índice de peróxido, dando valores superiores al rango establecido,
71
y el de linaza tostada salió de especificación en el índice de yodo, arrojando un valor
por debajo del rango establecido. Mostrando que el aceite se encontraba en primeras
fases de oxidación ya que no hubo cambios apreciables en el contenido de ácidos grasos
en el Índice de acidez, esterificación, yodo e índice de saponificación por lo que el
índice de Peróxido indica en que extensión ha sufrido el aceite la auto oxidación.
5.1.3. Etapa 2: Fase experimental.
El laberinto acuático de Morris permite hacer inferencias respecto de la
memoria de referencia espacial. El en presente estudio el polvo de linaza resultó más
efectivo que el aceite de linaza y que el ginkgo biloba.
En el laberinto acuático de Morris se pudo evaluar de mejor manera el efecto
nootrópico que en el laberinto radial, ya que se pudo determinar que sustancia fue
mejor, debido a que posee ciertas ventajas como mayor sensibilidad a los cambios de
estrategias y además se reduce el error por las condiciones del entorno de prueba
evitando que se usen claves no espaciales.
El laberinto Radial de ocho brazos permite hacer inferencias sobre la memoria
de referencia y la memoria de trabajo. Para la primera no hubo diferencia significativa
entre polvo, aceite y ginkgo biloba, para el caso de la memoria de trabajo no hubo
diferencia entre el polvo y aceite de linaza, siendo ambos mejor que ginkgo biloba.
5.1.4. Pesaje de animales de experimentación.
En esta investigación el sexo del ratón y las sustancias administradas no
presentaron un efecto estadísticamente significativo sobre el peso de los ratones con un
95 % de nivel de confianza.
5.1.5. Necropsia.
No se encontraron anomalías en el cerebro e hígado durante la necropsia en
relación a su forma y coloración. El cerebro presentó mayor peso en hembras que en
machos, y entre los grupos los ratones administrados polvo de linaza presentaron mayor
peso; el hígado y bazo en los machos presentó mayor peso. Sin embargo el peso del
bazo del ratón macho administrado aceite de linaza presentó esplenomegalia,
aparentemente por causa de una infección respiratoria y en cuanto a las variaciones
halladas en los pesos de los órganos de machos y hembras pueden deberse al efecto de
diversas variables, tanto ambientales como genéticas, que deben considerarse al
momento de seleccionar los animales de laboratorio.
72
5.2. Recomendaciones
5.2.1. Control de calidad de semillas y aceite de linaza.
Se debe tomar en cuenta que los aceites, al estar en estado líquido, son más
propensos que otras grasas a la degradación, por lo que se debería hacer controles de
calidad inmediatamente después de su extracción y al finalizar su uso, para asegurar que
mantengan sus características durante la experimentación, también se podría agregar
Butil hidroxitolueno (BHA), hidroxibutilanisol (BHT) o galato de propilo para
aumentar su estabilidad.
Debe realizarse un tamizaje fitoquímico de la semilla de linaza, para identificar
y cuantificar otro tipo de compuestos que pudieran estar ejerciendo el efecto
farmacológico conjuntamente con los omegas y vitamina E, preferentemente la
presencia de compuestos fenólicos como los lignanos ya que poseen gran capacidad
antioxidante.
Realizar la cuantificación de los omegas 3, 6 y 9, ya que el análisis que se
realizó en el presente proyecto está basado en un porcentaje relativo de áreas; por lo que
no se determinaron sus cantidades exactas presentes en el aceite de linaza extraído.
Realizar la cuantificación de la vitamina E, validando un método específico para
aceite de linaza.
Proceso experimental.
5.2.2. Laberinto acuático de Morris.
Para posteriores estudios, se recomienda analizar los patrones de nado de los
animales, para determinar si el aprendizaje espacial tiene que ver con las estrategias
utilizadas por los ratones para cumplir con el objetivo de este test.
Mantener la temperatura de la piscina lo más constante posible para disminuir el
estrés en los ratones.
Establecer el orden en el que los ratones y los grupos fueron sometidos al test ya
que esto pudo haber influido en su comportamiento, además disminuir el número de
repeticiones y el número de días de prueba, recomendándose 4 días de prueba.
73
5.2.3. Laberinto radial de ocho brazos.
Se recomienda disminuir el número de días de entrenamiento en los test o
suprimirlos, de la misma manera disminuir el número de días de prueba ya que en
ambos test alteró el comportamiento de los ratones por la monotonía y repitencia de los
ensayos.
El ambiente en donde se realiza la experimentación en lo posible debe
mantenerse libre de ruido ya que pueden actuar como distracciones, además puede
generar estrés modificando su comportamiento.
5.2.4. Pesaje de animales de experimentación.
Es recomendable que al elegir los animales de experimentación, estos sean lo
más homogéneos en cuanto a sexo y edad, sugiriendo trabajar solo con ratones machos
para disminuir el error, además se debe considerar trabajar con una mayor cantidad de
individuos para que la estadística pueda ser más acertada.
5.2.5. Necropsia.
Realizar estudios enfocados en el desarrollo de los órganos de los ratones de
laboratorio, conforme a su edad y sexo para determinar si estas variables influyen o no
y de esta manera sirva al investigador al momento de elegir el sexo y edad de los
ratones que se va a utilizar en la experimentación, para evitar hacer conclusiones
incorrectas.
Investigar más a fondo los efectos adversos de aceite y polvo de linaza en
ratones machos y hembras, poniendo énfasis en la alopecia del hocico de las hembras, y
bazo en machos.
Buscar alternativas para la administración por vía oral en animales de
experimentación, como la que se hizo en esta investigación con el uso de micropipetas,
permitiendo de esta manera disminuir el estrés en el ratón y evitando el daño de órganos
internos como el que se produce la administración con cánula o sonda nasogástrica ya
que los periodos de administración generalmente suelen ser largos.
74
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misedMessage=
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79
Anexos
Anexo A. Árbol de problemas
desconocimiento de la equivalencia del efecto nootrópico del polvo y el aceite de linaza (linum
usitatissimum)
Gran cantidad de productos nootrópicos
sintéticos en el mercado
Incremento de riesgo en la
salud
Tratamientos con productos naturales
requieren mayor dosis y tiempos prolongados
Metabolitos de las semillas de linaza utiles
no usados
Desinformación de la población
plantas naturales se consideran inferiores
desde el punto de vista farmacológico
Falta de interes de la población
Falta de recursos económicos para
investigacion
80
Anexo B. Certificado de identificación taxonómica de la planta de linaza
81
Anexo C. Registro de calidad ficha de chequeo de entrega de biomodelos y fluidos
sanguíneos.
82
Anexo D. Certificado de análisis de cuantificación de vitamina E en linaza tostada y sin
tostar.
83
Anexo E. Laberinto Acuático de Morris: Resultados del tiempo de latencia.
Laberinto Acuático de Morris: tiempo de latencia (segundos)
BL
AN
CO
Ratón Día 1
Día 2
Día 3
Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
hem
bra
s
R1 21,47 7,33 11,52 14,23 14,16 12,96 4,11
R2 19,40 13,74 13,31 16,95 15,60 12,64 10,96
R3 8,76 8,29 6,96 15,98 13,73 11,83 16,11
media 16,54 9,79 10,59 15,72 14,50 12,48 10,39
mac
ho
s
R1 17,04 19,76 27,69 20,78 12,96 13,48 16,16
R2 21,69 24,59 11,46 20,58 12,64 13,69 9,78
R3 12,98 11,53 12,16 13,77 11,83 8,53 9,83
media 17,23 18,63 17,10 18,38 12,48 11,90 11,92
GIN
KG
O B
ILO
BA
h
embra
s
R1 13,24 4,08 4,58 7,23 7,94 4,77 6,43
R2 22,15 12,64 22,85 13,59 14,94 20,14 11,49
R3 13,40 6,07 15,58 4,58 6,14 4,57 3,77
16,27 7,59 14,33 8,46 9,67 9,82 7,23
mac
ho
s
R1 8,54 16,94 8,44 12,35 4,77 7,39 11,88
R2 9,27 4,22 7,49 6,38 20,14 2,64 3,73
R3 27,62 21,83 8,96 6,90 4,57 9,15 10,94
media 15,14 14,33 8,30 8,54 9,82 6,39 8,85
AC
EIT
E D
E L
INA
ZA
hem
bra
s
R1 9,52 16,95 22,33 11,20 11,36 15,54 12,82
R2 17,30 13,67 13,60 5,79 5,20 4,53 5,24
R3 5,22 4,03 4,24 3,91 3,18 3,34 3,64
media 10,68 11,55 13,39 6,97 6,58 7,80 7,24
mac
hos
R1 10,70 16,49 8,77 6,16 15,54 6,26 5,70
R2 8,27 5,82 5,48 7,12 4,53 4,41 4,40
R3 17,30 11,42 9,61 26,97 3,34 14,16 9,42
media 12,09 11,24 7,95 13,42 7,80 8,28 6,50
PO
LV
O D
E L
INA
ZA
hem
bra
s
R1 11,31 11,11 3,74 4,16 4,49 4,27 4,28
R2 12,35 22,69 3,58 4,97 2,09 4,51 6,81
R3 44,71 13,88 9,60 4,67 4,89 5,74 6,77
media 22,79 15,90 5,64 4,60 3,82 4,84 5,95
mac
hos
R1 7,86 10,84 15,17 6,61 4,27 3,50 3,76
R2 21,15 7,94 6,29 6,84 4,51 21,31 18,31
R3 17,62 8,46 4,82 3,75 5,74 3,03 3,02
media 15,54 9,08 8,76 5,73 4,84 9,28 8,36
84
Anexo F. Laberinto radial: resultados del tiempo de latencia.
Laberinto Radial :Tiempo de latencia (segundos)
Ratón Día 1
Día 2
Día 3
Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
BL
AN
CO
mac
ho
s r1 607,80 315,60 362,40 326,40 265,20 420,60 243,60
r2 192,00 306,60 189,00 202,80 258,00 247,80 240,00
r3 188,40 155,40 154,80 261,00 129,00 128,40 123,00
media 329,40 259,20 235,40 263,40 217,40 265,60 202,20
hem
bra
s
r1 372 482,4 549,6 393 330 389,4 492
r2 244,2 126 197,4 318 210 141 205,8
r3 262,8 140,4 133,2 139,8 149,4 127,2 84,6
media 293,00 249,60 293,40 283,60 229,80 219,20 260,80
GIN
KG
O B
ILO
BA
mac
ho
s r1 136,2 240 151,8 187,8 210 199,8 140,4
r2 210 132 144,6 82,8 85,8 75,6 153
r3 187,2 136,8 138 139,2 144 87,6 120
media 177,80 169,60 144,80 136,60 146,60 121,00 137,80
hem
bra
s
r1 392,4 186 135,6 144 144 143,4 156
r2 258 123 205,2 90 121,8 127,8 187,8
r3 210 184,8 127,8 123,6 122,4 144 82,8
media 286,80 164,60 156,20 119,20 129,40 138,40 142,20
AC
EIT
E D
E L
INA
ZA
mac
hos r1 246 255 210 214,8 180 154,2 82,8
r2 141 210,6 243 144,6 130,8 87 138
r3 247,2 334,2 130,2 84,6 135,6 134,4 154,8
media 211,40 266,60 194,40 148,00 148,80 125,20 125,20
hem
bra
s
r1 204 195 264 201 79,2 121,2 185,4
r2 207 141 196,8 72,6 143,4 129 90,6
r3 136,8 64,8 90 142,8 121,8 85,2 120,6
media 182,60 133,60 183,60 138,80 114,80 111,80 132,20
PO
LV
O D
E L
INA
ZA
mac
hos r1 143,4 148,2 199,2 143,4 139,2 149,4 201
r2 144 137,4 181,8 150 129 133,2 150
r3 124,8 257,4 198 126 84,6 87,6 78
media 137,40 181,00 193,00 139,80 117,60 123,40 143,00
hem
bra
s
r1 240 193,2 251,4 123,6 138 136,8 189
R2 210 243 261,6 252,6 243 94,2 90
R3 253,2 334,2 186 184,8 207 72,6 138
media 234,40 256,80 233,00 187,00 196,00 101,20 139,00
85
Anexo G. Laberinto Radial: Número de desaciertos
Laberinto radial: Número de desaciertos
Ratón Día
1
Día 2
Día 3
Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 B
LA
NC
O
mac
ho
s
R1 9 2 3 2 3 5 2
R2 8 12 3 5 3 6 1
R3 5 2 3 6 2 2 1
hem
bra
s
R1 8 8 6 6 2 2 4
R2 9 3 4 8 3 4 1
R3 14 3 5 2 4 1 2
sumatoria 53 30 24 29 17 20 11
(GIN
KG
O B
ILO
BA
)
mac
ho
s
R1 2 1 1 2 2 2 2
R2 8 4 3 3 2 0 1
R3 5 1 3 2 2 0 1
hem
bra
s
R1 8 3 1 1 2 2 2
R2 12 4 4 0 2 1 2
R3 10 3 2 1 3 1 1
sumatoria 45 16 14 9 13 6 9
AC
EIT
E D
E L
INA
ZA
mac
hos
R1 5 2 2 4 2 2 2
R2 3 1 4 4 2 1 1
R3 5 3 2 1 2 1 0
hem
bra
s
R1 6 2 1 2 0 1 2
R2 3 8 4 1 2 2 1
R3 2 0 2 3 2 0 0
sumatoria 24 16 15 15 10 7 6
PO
LV
O D
E L
INA
ZA
mac
hos
R1 2 2 4 1 1 3 1
R2 1 0 5 4 2 0 2
R3 2 0 4 1 2 0 0
hem
bra
s
R1 5 2 4 2 0 2 2
R2 2 4 1 2 2 3 3
R3 6 3 3 0 4 0 2
sumatoria 18 11 21 10 11 8 10
86
Anexo H. Peso de los ratones en gramos en función de las semanas de experimentación
Pesos ratones B
lan
co
Ratón Semana
1
Semana
2
Semana
3
Semana
4
Semana
5
Semana
6
Semana
7 m
ach
os
R1 40 39,26 41,12 43,35 38,25 42,75 43,46
R2 35 34,44 35,07 37,92 34,85 37,58 37,03
R3 38 38,53 39,06 38,96 36,85 39,55 41,22
hem
bra
s
R4 30 29,1 32,05 30,45 28,35 30,35 30,9
R5 26 27,26 27,84 31,15 29,86 31,42 31,55
R6 30 30,37 26,52 32,67 29,72 32,35 32,39
media 33,17 33,16 33,61 35,75 32,98 35,67 36,09
ma
chos
R1 35 35,4 35,65 36,14 34,27 35,71 36,22
R2 35 35,56 37,02 39,29 38,84 39,02 39,65
Gin
kg
o b
ilob
a
R3 33 35,37 35,56 38,62 37,59 36,71 37,84
hem
bra
s
R4 30 30,63 30,42 31,72 29,65 32,03 32,72
R5 30 29,63 29,75 34,13 28,32 30,52 32,94
R6 27 28,61 28,86 29,26 27,42 29,36 30,08
media 31,67 32,53 32,88 34,86 32,68 33,89 34,91
Ace
ite
de
linaz
a
mach
os
R1 39 38,46 39,06 40,48 37,56 38,03 38,72
R2 36 36,44 38,04 38,05 38,9 38,94 39,52
R3 33 31,43 27,05 30,85 30,92 30,75 32,98
hem
bra
s
R4 30 31,73 31,72 32,5 30,35 32,51 32,97
R5 35 33,85 34,73 35,29 33,27 35,84 36,31
R6 34 33,29 34,57 35,94 34,26 38,16 38,64
media 34,50 34,20 34,20 35,52 34,21 35,71 36,52
Polv
o d
e li
naz
a
mach
os
R1 38 34,57 36,62 36,7 35,69 37,56 38,84
R2 35 32,76 33,42 34,57 33,4 36,05 37,64
R3 36 34,2 35,2 35,72 34,49 35,53 36,46
hem
bra
s
R4 31 31,15 31,7 32,42 31,87 33,7 34,14
R5 28 27,85 27,47 28,84 28,33 28,82 29,63
R6 28 28,57 26,54 27,56 28,94 29,59 29,82
media 32,67 31,52 31,83 32,64 32,12 33,54 34,42
87
Anexo I. Laberinto acuático de Morris: Comparaciones de cada tratamiento con
respecto al primer día.
Día Grupo Operación Diferencia Duncan Significancia
día1-día2 BLANCO 16,88 - 14,21 2,67 6,11 ns
día1-día3 BLANCO 16,88 - 13,84 3,04 6,29 ns
día1-día4 BLANCO 17,05 - 16,88 0,17 5,83 ns
día1-día5 BLANCO 16,88 - 13,49 3,39 6,43 ns
día1-día6 BLANCO 16,88 - 12,19 4,69 6,63 ns
día1-día7 BLANCO 16,88 - 11,16 5,72 6,77 ns
día1-día2 GINKGO 15,70 - 10,96 4,74 6,77 ns
día1-día3 GINKGO 15,70 - 11,32 4,38 6,73 ns
día1-día4 GINKGO 15,70 - 8,50 7,2 6,93 *
día1-día5 GINKGO 15,70 - 9,75 5,95 6,89 ns
día1-día6 GINKGO 15,70 - 8,10 7,6 6,93 *
día1-día7 GINKGO 15,70 - 8,04 7,66 6,95 *
día1-día2 ACEITE 11,40 - 11,38 0,02 5,83 ns
día1-día3 ACEITE 11,38 - 10,67 0,71 6,43 ns
día1-día4 ACEITE 11,38 - 10,20 1,18 6,55 ns
día1-día5 ACEITE 11,38 - 7,19 4,19 6,89 ns
día1-día6 ACEITE 11,38 - 8,04 3,34 6,77 ns
día1-día7 ACEITE 11,38 - 6,87 4,51 6,93 ns
día1-día2 POLVO 19,16 - 12,49 6,67 6,69 ns
día1-día3 POLVO 19,16 - 7,20 11,96 5,83 *
día1-día4 POLVO 19,16 - 5,16 14 5,83 *
día1-día5 POLVO 19,16 - 4,33 14,83 5,83 *
día1-día6 POLVO 19,16 - 7,06 12,1 5,83 *
día1-día7 POLVO 19,16 - 7,15 12,01 5,83 *
(*= Significativo ns= significativo)
88
Anexo J. Laberinto acuático de Morris: comparaciones de cada tratamiento con
respecto al primer día.
día GRUPO Operación Diferencia Duncan Significancia
día1 BLANCO-POLVO 19,16 - 16,88 2,28 6,11 ns
día1 BLANCO-GINKGO 16,88 - 15,70 1,18 5,83 ns
día1 BLANCO-ACEITE 16,88 - 11,38 5,5 6,73 ns
día1 POLVO-GINKGO 19,16 - 15,70 3,46 6,29 ns
día1 POLVO-ACEITE 19,16 - 11,38 7,78 6,77 *
día1 GINKGO-ACEITE 15,70 - 11,38 4,32 6,69 ns
día2 BLANCO-POLVO 14,21 - 12,49 1,72 6,29 ns
día2 BLANCO-ACEITE 14,21 - 11,40 2,81 6,55 ns
día2 BLANCO-GINKGO 14,21 - 10,96 3,25 6,77 ns
día2 ACEITE -GINKGO 11,40 - 10,96 0,44 6,43 ns
día2 POLVO- ACEITE 12,49 - 11,40 1,09 6,11 ns
día2 POLVO-GINKGO 12,49 - 10,96 1,53 6,63 ns
día3 GINKGO-ACEITE 11,32 - 10,67 0,65 6,29 ns
día3 BLANCO-POLVO 13,84 - 7,20 6,64 6,95 ns
día3 BLANCO-GINKGO 13,84 - 11,32 2,52 6,63 ns
día3 BLANCO-ACEITE 13,84 - 10,67 3,17 6,77 ns
día3 ACEITE-POLVO 10,67 - 7,20 3,47 6,69 ns
día3 GINKGO-POLVO 11,32 - 7,20 4,12 6,77 ns
día4 GINKGO-POLVO 8,50 - 5,16 3,34 6,77 ns
día4 ACEITE-GINKGO 10,20 - 8,50 1,7 6,11 ns
día4 ACEITE-POLVO 10,20 - 5,16 5,04 6,83 ns
día4 BLANCO-ACEITE 17,05 - 10,20 6,85 6,93 ns
día4 BLANCO-GINKGO 17,05 - 8,50 8,55 6,95 *
día4 BLANCO-POLVO 17,05 - 5,16 11,89 5,83 *
día5 BLANCO-GINKGO 13,49 - 9,75 3,74 6,77 ns
día5 BLANCO-ACEITE 13,49 - 7,19 6,3 6,95 ns
día5 BLANCO-POLVO 13,49 - 4,33 9,16 5,83 *
día5 GINKGO-ACEITE 9,75 - 7,19 2,56 6,63 ns
día5 GINKGO-POLVO 9,75 - 4,33 5,42 6,83 ns
día5 ACEITE-POLVO 7,19 - 4,33 2,86 6,55 ns
día6 BLANCO-GINKGO 12,19 - 8,10 4,09 6,77 ns
día6 BLANCO-ACEITE 12,19 - 8,04 4,15 6,89 ns
día6 BLANCO-POLVO 12,19 - 7,06 5,13 6,95 ns
día6 GINKGO-ACEITE 8,10 - 8,04 0,06 6,11 ns
día6 GINKGO-POLVO 8,10 - 7,06 1,04 6,63 ns
día6 ACEITE-POLVO 8,04 - 7,06 0,98 6,43 ns
día7 GINKGO-POLVO 8,04 - 7,15 0,89 6,43 ns
día7 GINKGO-ACEITE 8,04 - 6,87 1,17 6,63 ns
día7 POLVO-ACEITE 7,15 - 6,87 0,28 6,11 ns
día7 BLANCO-GINKGO 11,16 - 8,04 3,12 6,69 ns
día7 BLANCO-POLVO 11,16 - 7,15 4,01 6,83 ns
día7 BLANCO-ACEITE 11,16 - 6,87 4,29 6,89 ns
89
Anexo K. Laberinto radial: Comparaciones de cada tratamiento con respecto al primer
día.
Día GRUPO Operación diferencia Duncan Significancia
día1- día2 BLANCO 311,20 - 254,40 56,8 78,19 ns
día1-día3 BLANCO 311,20 - 264,40 46,8 75,94 ns
día1-día4 BLANCO 311,20 - 273,50 37,7 72,44 ns
día1-día5 BLANCO 311,20 - 223,60 87,6 83,18 *
día1-día6 BLANCO 311,20 - 242,40 68,8 79,94 ns
día1-día7 BLANCO 311,20 - 231,50 79,7 82,43 ns
día1-día2 GINKGO 232,30 - 167,10 65,2 84,18 ns
día1-día3 GINKGO 232,30 - 150,50 81,8 85,68 ns
día1-día4 GINKGO 232,30 - 127,90 104,4 72,44 *
día1-día5 GINKGO 232,30 - 138,00 94,3 86,43 *
día1-día6 GINKGO 232,30 - 129,70 102,6 86,68 *
día1-día7 GINKGO 232,30 - 140,00 92,3 86,18 *
día1-día2 ACEITE 200,10 - 197,00 3,1 72,44 ns
día1-día3 ACEITE 197,00 - 189,00 8 72,44 ns
día1-día4 ACEITE 197,00 - 143,40 53,6 83,18 ns
día1-día5 ACEITE 197,00 - 131,80 65,2 84,93 ns
día1-día6 ACEITE 197,00 - 118,50 78,5 86,18 ns
día1-día7 ACEITE 197,00 - 128,70 68,3 85,68 ns
día1-día3 POLVO 213,00 - 185,90 27,1 79,94 ns
día1-día4 POLVO 185,90 - 163,40 22,5 75,94 ns
día1-día5 POLVO 185,90 - 156,80 29,1 78,19 ns
día1-día6 POLVO 185,90 - 112,30 73,6 86,18 ns
día1-día7 POLVO 185,90 - 141,00 44,9 82,43 ns
(*= Significativo ns= significativo)
90
Anexo L. Laberinto radial: Comparaciones de significancia entre tratamientos por días.
DIA GRUPO Operación diferencia Duncan Significancia
día1 BLANCO vs GINKGO 311,20 - 232,30 78,9 81,43 ns
día1 BLANCO vs ACEITE 311,20 - 197,00 114,2 84,93 *
día1 BLANCO vs POLVO 311,20 - 185,90 125,3 85,68 *
día1 GINKGO vs ACEITE 232,30 - 197,00 35,3 82,43 ns
día1 GIKNGO vs POLVO 232,30 - 185,90 46,4 83,68 ns
día1 ACEITE vs POLVO 197,00 - 185,90 11,1 75,94 ns
día2 BLANCO vs POLVO 254,40 - 218,90 35,5 81,43 ns
día2 BLANCO vs ACEITE 254,40 - 200,10 54,3 83,18 ns
día2 BLANCO vs GINKGO 254,40 - 167,10 87,3 84,93 *
día2 ACEITE vs GINKGO 200,10 - 167,10 33 79,94 ns
día2 POLVO vs ACEITE 218,90 - 200,10 18,8 75,94 ns
día2 POLVO vs GINKGO 218,90 - 167,10 51,8 82,43 ns
día3 BLANCO vs POLVO 264,40 - 213,00 51,4 83,18 ns
día3 BLANCO vs ACEITE 264,40 - 189,00 75,4 84,18 ns
día3 BLANCO vs GINKGO 264,40 - 150,50 113,9 86,18 *
día3 ACEITE vs GINKGO 189,00 - 150,50 38,5 81,43 ns
día3 POLVO vs ACEITE 213,00 - 189,00 24 78,19 ns
día3 POLVO vs GINKGO 213,00 - 150,50 62,5 83,68 ns
día4 BLANCO vs POLVO 273,50 - 163,40 110,1 86,18 *
día4 BLANCO vs ACEITE 273,50 - 143,40 130,1 86,43 *
día4 BLANCO vs GINKGO 273,50 - 127,90 145,6 72,44 *
día4 ACEITE vs GINKGO 143,40 - 127,90 15,5 83,18 ns
día4 POLVO vs ACEITE 163,40 - 143,40 20 78,19 ns
día4 POLVO vs GINKGO 163,40 - 127,90 35,5 84,18 ns
día5 BLANCO vs POLVO 223,60 - 156,80 66,8 84,18 ns
día5 BLANCO vs GINKGO 223,60 - 138,00 85,6 86,18 ns
día5 BLANCO vs ACEITE 223,60 - 131,80 91,8 86,18 *
día5 GINKGO vs ACEITE 138,00 - 131,80 6,2 72,44 ns
día5 POLVO vs GINKGO 156,80 - 138,00 18,8 81,43 ns
día5 POLVO vs ACEITE 156,80 - 131,80 25 82,43 ns
día6 BLANCO vs GINKGO 242,40 - 129,70 112,7 86,68 *
día6 BLANCO vs ACEITE 242,40 - 118,50 123,9 72,44 *
día6 BLANCO vs POLVO 242,40 - 112,30 130,1 72,44 *
día6 GINKGO vs ACEITE 129,70 - 118,50 11,2 78,19 ns
día6 GINKGO vs POLVO 129,70 - 112,30 17,4 79,94 ns
día6 ACEITE vs POLVO 118,50 - 112,30 6,2 72,44 ns
día7 BLANCO vs POLVO 231,50 - 141,00 90,5 85,68 *
día7 BLANCO vs GINKGO 231,50 - 140,00 91,5 86,18 *
día7 BLANCO vs ACEITE 231,50 - 128,70 102,8 86,68 *
día7 GINKGO vs ACEITE 140,00 - 128,70 11,3 79,94 ns
día7 POLVO vs GINKGO 141,00 - 140,00 1 72,44 ns
día7 POLVO vs ACEITE 141,00 - 128,70 12,3 81,43 ns
91
Ilustraciones.
Control de calidad de semillas de linaza.
Control microbiológico.
92
93
Determinación de presencia de ácido cianhídrico en semillas de linaza.
Extracción de aceite de semillas de linaza.
94
Control de calidad de aceite de linaza.
95
96
Fase experimental.
97
Necropsia de animales de experimentación.