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Transport of bacteria and cell-type specific induction of signaling in the tracheal airway epithelium of mice
Saskia Bermbach1,2, Jan Rupp2,3, Peter König1
1Institut für Anatomie, Universität zu Lübeck, Germany
Mit jedem Atemzug ist dasEpithel in der Trachea einerVielzahl von Bakterien aus-gesetzt. Meist führt dies nichtzu einer Entzündung. Warumk t b d h l
2Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universität zu Lübeck, Germany3Medizinische Klinik III - Pneumologie/Infektiologie, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, Germany
EINLEITUNG METHODENUm die zellulären und molekularen Interaktionen zwischen Bakterien und Atemwegsepithel besser zu verstehen, wurdenmurine Tracheen entnommen und nach Entfernung des Mukus für die Dauer des jeweiligen Versuchs in Zellkultur gehalten.Mittels Hochgeschwindigkeitsmikroskopie wurde der Transport verschiedener Bakterien und Partikel unterschiedlicherGröße (4,5 & 0,2 µm) sowie deren Interaktion mit intaktem Atemwegsepithel untersucht. Um die aus dieser Interaktionresultierenden Folgen in den betroffenen Zellen identifizieren zu können, wurde Atemwegsepithel isoliert und darin dieV ä d d RNA E i l l i fl t i h C t ki itt l RT PCR D Ei tkommt es aber doch gele-
gentlich trotz der mukoziliärenBarriere zu einer Infektion?
ERGEBNISSEBakterien und Polystyrenpartikel werden auch ohne Mukus transportiert Bakterien und Polystyrenpartikel werden
auch durch eine Strömung transportiert
Veränderung der mRNA-Expressionslevel proinflammatorischer Cytokine mittels qRT-PCR gemessen. Der Einsatz vonImmunhistochemie in Verbindung mit Konfokalmikroskopie erlaubte die Ermittlung der nukleären Translokation desTranskriptionsfaktors NFκB p65, um zu erkennen, welche Zellen durch den Bakterienkontakt aktiviert wurden.
0 s 1 s0,25 sa)100
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a) Transport von Escherischia coli ( ) und 4,5 µm-Polystyrenpartikeln ( ) nach Entfernung derMukusschicht. Transport durch direkten Kontakt mit den Zilien und durch eine zilienvermittelteStrömung (siehe c). Bildmittelpunkt (x). Nachweis in n = 5 Tieren
x
40 µm
x
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40 µm0
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Abstand zum Epithel [µm]
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LPS und Haemophilus influenzae induzieren die Translokation von NFκB p65 in den Zellkern
Haemophilus influenzae, LPS und Pam3Cys induzieren die Produktion proinflammatorischer Cytokin-mRNA im Epithel, nicht
aber Staphylokokkus aureus
b) Vergleich der Transportgeschwindigkeiten von Bakterien, 4,5 µm- und 0,2 µm-Polystyren-partikeln. Nachweis in n = 5 Tieren. Wilcoxon-Test: ** = p < 0,001; o = p > 0,05. Angabe als Mittelwert ± Standardfehler.
c) Transportgeschwindigkeit: direkt ziliär und indirekt durch eine zilienvermittelte Strömung.Nachweis in n = 5 Tieren. Wilcoxon-Test: ** = p < 0,001. Angabe als Mittelwert ± Standardfehler.
0 min 60 min
- ng
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[%] 30 minc)
4,5 µm PolystyrenpartikelBakterien0,2 µm Polystyrenpartikel
4,5 µm Polystyrenpartikelohne ATPmit ATP (100 µM)
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100Staphylokokkus aureus
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Expression der mRNA proinflammatorischer Cytokine nach 2,5 h Stimulation mitStaphylokokkus aureus, Haemophilus influenzae (HIB), LPS bzw. Pam3Cys.Anschließend Epithelgewinnung, reverse Transkription und qRT-PCR.Nachweis in n = 6 - 10 Tieren. Wilcoxon-Test: ** = p < 0,001; * = p < 0,05; o = p > 0,05. Angabe alsMittelwert ± Standardfehler.
o o oo oo0
IL6-mRNA MIP-2-mRNA KC-mRNA CXCL5-mRNA MCP-1-mRNA
Stimulation einer ex-vivo Trachea mit LPS für 0 - 60 min (a und c) bzw.HIB für 0 - 120 min (b). Maximum nach 30 (LPS) bzw. 90 min (HIB).Zellkerne ohne ( ) bzw. mit ( ) Translokation von NFκB p65.Nachweis in n = 5 Tieren. Wilcoxon-Test: ** = p < 0,001. Angabe als Mittelwert ± Standardfehler.
20 µm20 µm20 µm
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0
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0 30 60 90 120
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Stimulationsdauer [Minuten]
Translokation von NFκB p65 in den Zellkern nach Haemophilus influenzae oder LPS ausschließlich in nicht-zilientragenden Zellen
MyD88-Inhibitor verhindert diese Translokation von NFκB p65 nach LPS-Stimulationg
HoechstAK gegen NFκB p65Hoechst &
AK gegen NFκB p65
20 µm20 µm 20 µm
Nachweis in n = 5 Tieren.
NFκB p65 nach LPS-Stimulation20 µm 20 µm20 µm
Nachweis in n = 5 Tieren.
Zellkernebene Zellkernebene Zellkernebene
AK gegen NFκB p65 Hoechst-KernfärbungHoechst &
AK gegen NFκB p65
● Zilientragende Zellen transportieren Bakterien ( ) und Polystyrenpartikel ( ) ohne Mukus:
direkt ziliär (a) bzw. indirekt durch zilienvermittelte Strömung (b).
● Direkter Kontakt mit zilientragenden Zellen führt nicht zu einer Translokation von NFκB.
● Induktion der NFκB-abhängigen Signalkaskade erfolgt nur in nicht-zilientragenden Zellen.
ZUSAMMENFASSUNGz.B. 100
[µm] b)
a)