induction of hepatitis a virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide

8/6/2019 Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide

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JOURNAL O F V I R O L O G Y , S e p t . 1 9 8 5 , p . 8 3 6 - 8 3 90 0 2 2 - 5 3 8 X / 8 5 / 0 9 0 8 3 6 - 0 4 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C ) 1 9 8 5 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yV o l . 5 5 , N o . 3

I n d u c t i o n o f H e p a t i t i s A V i r u s - N e u t r a l i z i n g A n t i b o d y b y a V i r u s -S p e c i f i c S y n t h e t i c P e p t i d eEMILIO A . E M I N I , 1 * JOSEPH V . H U G H E S , ' DEBRA S . PERLOW,2 A N D J O S H U A BOGER2

D e p a r t m e n t s o f V i r u s & C e l l B i o l o g y ' a n d M e d i c i n a l C h e m i s t r y , 2 Merck S h a r p & Dohme R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , W e s tP o i n t , P e n n s y l v a n i a 1 9 4 8 6R e c e i v e d 2 6 November 1 9 8 4 / A c c e p t e d 1 4 May 1 9 8 5

C o m p a r a t i v e s u r f a c e f e a t u r e a n a l y s e s o f t h e VP1 s e q u e n c e s o f h e p a t i t i s A v i r u s (HAV) a n d p o l i o v i r u s t y p e1 a l l o w e d a n a l i g n m e n t o f t h e t w o s e q u e n c e s a n d a n i d e n t i f i c a t i o n o f p r o b a b l e H A V n e u t r a l i z a t i o n a n t i g e n i cs i t e s . A s y n t h e t i c p e pt i d e c o nt a in i ng t h e H A V - s p e c i f i c a m i n o a c i d s e q u e n c e o f o n e o f t h e s e s i t e s i n d u c e da n t i - H A V - n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s . I t i s c o n c l u d e d t h a t a s t r u c t u r a l h o m o l o g y e x i s t s b e t w e e n t h e t w o v i r u s e s ,d e s p i t e m i ni m a l p r i m a r y s e q u e n c e c o n s e r v a t i o n .

H e p a t i t i s A v i r u s (HAV) h a s r e c e n t l y b e e n c l a s s i f i e d o nt h e b a s i s o f m o r p h o l o g y , e p i d e m i o l o g y , a n d b i o p h y s i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a s e n t e r o v i r u s t y p e 7 2 , a member o f t h ee n t e r o v i r u s g e n u s o f t h e P i c o r n a v i r i d a e f a m i l y ( 8 , 1 3 , 1 6 , 1 7 ,1 9 ) . As i s t h e c a s e f o r p o l i o v i r u s , t h e p r o t o t y p e member o ft h e e nt e r o vi r u s g e nu s , t h e h e p a t i t i s A v i r i o n i s a n a k e di c o s a h e d r o n w h o s e s u r f a c e i s c o m p o s e d o f t h r e e s t r u c t u r a lp r o t e i n s , i . e . , V P 1 , V P 2 , a n d VP3 ( 3 , 1 9 ) . VP1 i s t h ep r e d o m i n a n t l y e x p o s e d p r o t e i n ( 1 0 ) . S t u d i e s w i t h n e u t r a l i z -i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s h a v e s h o w n t h a t t h i s s t r u c t u r a lp r o t e i n c o n t a i n s a t l e a s t s o m e o f t h e v i r i o n n e u t r a l i z a t i o na n t i g e n i c s i t e s ( 1 0 ) .E m i n i e t a l . ( 5 , 6 ) i d e n t i f i e d s e v e r a l p o l i o v i r u s t y p e 1 -s p e c i f i c n e u t r a l i z a t i o n a n t i g e n i c s i t e s o n t h e p o l i o v i r i o n VP1p r o t e i n . S y nt h et i c p e p t i de s c on ta i n in g t h e a m i n o a c i d s e -q u e n c e s o f t h e s e s i t e s a r e c a p a b l e o f e i t h e r d i r e c t l y i n d u c i n ga v i r u s - n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y r e s p o n s e o r p r i m i n g s u ch a ni m m u n e r e s p o n s e u p o n i n o c u l a t i o n o f a s u b i m m u n o g e n i cd o s e o f i n t a c t v i r i o n ( 6 ) .cD N A o f t h e g e n o m i c HAV RNA h a s b e e n c l o n e d r e -c e n t l y , a n d p a r t i a l s e q u e n c e s o f t h e n o n s t r u c t u r a l ( 2 0 ) a n ds t r u c t u r a l ( 1 4 ) g e n e r e g i o n s h a v e b e e n o b t a i n e d . T h e a v a i l -a b i l i t y o f t h i s i n f o r m a t i o n p r o m p t e d a n e x a m i n a t i o n o f t h es t r u c t u r a l r e l a t e d n e s s b e t w e e n HAV a n d p o l i o v i r u s . I t wash o p e d t h a t t h e d e t a i l e d k n o w l e d g e o f t h e l a t t e r ' s a n t i g e n i cs t r u c t u r e w o u l d p r o v i d e i n s i g h t s i n t o t h e a n t i g e n i c s t r u c t u r eo f HAV.VP1 a m i n o a c i d s e q u e n c e c o m p a r i s o n s . T h e VP1 a m i n oa c i d s e q u e n c e s o f HAV a n d p o l i o v i r u s t y p e 1 ( M a h o n e ys t r a i n ) ( 1 2 , 1 8 ) w e r e c o m p a r e d f o r p r i m a r y s e q u e n c e h o m o l -o g y b y t h e ALIGN p r o g r a m o f D a y h o f f ( 4 ) ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e h o m o l o g y was s l i g h t , g i v i n g a n a l i g n m e n t s c o r e ( 4 ) o f1 . 9 3 , i n d i c a t i n g a p r o b a b i l i t y o f 2 . 5 % t h a t t h e a l i g n m e n t w i t hr a n d o m l y p e r m u t e d s e q u e n c e s w o u l d g i v e a b e t t e r s c o r e .T h i s d e g r e e o f h o m o l o g y i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d i n s u f f i c i e n tt o e s t a b l i s h a n e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o t e i n s o nt h e b a s i s o f p r i m a r y s e q u e n c e a l o n e . A l i g n m e n t s w i t h d i f -f e r e n t b r e a k p e n a l t i e s g a v e s i m i l a r a l i g n m e n t s c o r e s . N o n e -t h e l e s s , a p r o v i s i o n a l a l i g n m e n t o f t h e HAV a n d p o l i o v i r u sp r o t e i n s was m a d e .C o m p a r i s o n s o f t h e p r e d i c t e d s e c o n d a r y s t r u c t u r e s o f t h etwo V P 1 p r o t e i n s b y t h e m e t h o d s o f Chou a n d Fasman ( 2 )a n d G a r n i e r e t a l . ( 7 ) s h o w e d n o p r e d i c t e d s t r u c t u r a l s i m i -

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

l a r i t i e s ( d a t a n o t s h o w n ) . F o r e x a m p l e , b y t h e m e t h o d o fG a r n i e r e t a l . ( 7 ) , t h e p r e d i c t e d a l p h a h e l i c a l p o t e n t i a l s o fp o l i o v i r u s VP1 ( 1 t o 3 0 2 ) a n d HAV VP1 ( 5 t o 3 0 6 ) a l i g n e dp o o r l y , w i t h t h e a l i g nm e nt h a v i n g a c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t ( r )o f - 0 . 2 2 ( R 2 = 0 . 0 4 9 ) . T h e a l i g n m e n t o f h e l i c a l p o t e n t i a l s i nt h e f i r s t 1 1 0 r e s i d u e s was a c t u a l l y s i g n i f i c a n t l y n e g a t i v e , w i t hr = 0 . 5 1 ( r 2 = 0 . 2 6 ) i n d i c a t i n g a p o s s i b l e a n t i c o r r e l a t i o n .O t h e r p o s s i b l e a l i g n m e n t s w e r e s i m i l a r l y p o o r w i t h h e l i c a l ,e x t e n d e d s t r u c t u r e ( s h e e t ) , t u r n , o r c o i l p o t e n t i a l s o f G a r n i e re t a l . ( 7 ) o r c o m p a r a b l e p o t e n t i a l s d e s c r i b e d b y Chou a n dFasman ( 2 ) . T h e o v e r a l l p r e d i c t e d s t r u c t u r e s , b y e i t h e rm e t h o d , o f t h e s e q u e n c e s f o r VP1 o f p o l i o v i r u s a n d HAVs h o w e d n o a p p a r e n t s i m i l a r i t i e s a n d c o u l d n o t b e a l i g n e d o nt h e b a s i s o f p r e d i c t e d s e c o n d a r y s t r u c t u r e .H e n c e , i n a n a t t e m p t t o i n c r e a s e c o n f i d e n c e i n t h e p r o v i -s i o n a l a l i g n m e n t made b y t h e D a y h o f f p r o g r a m , a m e t h o dwas d e v e l o p e d f o r c o m p a r i n g t h e t w o s e q u e n c e s b y p r e -d i c t e d s u r f a c e f e a t u r e s , b a s e d u p o n i n d i c e s o f s u r f a c e p r o b -a b i l i t y . T h i s m e t h o d a s s u m e s t h e a b s e n c e o f s i g n i f i c a n ti n t e r n a l d e l e t i o n s o r i n s e r t i o n s . F o r a g i v e n a m i n o a c i ds e q u e n c e , a p o i n t f o r s e q u e n c e n u m b e r n i s a n o r m a l i z e dp r o d u c t o f t h e s u r f a c e p r o b a b i l i t i e s o f a m i n o a c i d s i n p o s i -t i o n s n - 2 t o n + 3 , u s i n g t h e e m p i r i c a l a m i n o a c i da c c e s s i b l e s u r f a c e p r o b a b i l i t i e s o f J a ni n e t a l . ( 1 1 ) w h i c h a r ef r a c t i o n a l p r o b a b i l i t i e s ( 0 . 2 6 t o 0 . 9 7 ) d e t e r m i n e d f o r a na m i n o a c i d f o u n d o n t h e s u r f a c e o f a p r o t e i n , b a s e d u p o ns t r u c t u r a l d a t a f r o m 2 8 p r o t e i n s . A s u r f a c e r e s i d u e i s d e f i n e da s o n e w i t h >20 A ' ( 2 . 0 n m ' ) o f w a t e r - a c c e s s i b l e s u r f a c e .W i t h t h e s e f r a c t i o n a l s u r f a c e p r o b a b i l i t i e s f o r a m i n o a c i d s , as u r f a c e p r o b a b i l i t y ( S ) a t s e q u e n c e p o s i t i o n n c a n b e d e f i n e da s f o l l o w s :

6S , = [ r I a n + 4 - i ] * ( 0 . 3 7 ) 6i = 1A , i s t h e f r a c t i o n a l s u r f a c e p r o b a b i l i t y f o r t h e a m i n o a c i d a tp o s i t i o n x . The 5 , , f o r a r a n d o m h e x a p e p t i d e s e q u e n c e = 1 . 0 ,w i t h p r o b a b i l i t i e s g r e a t e r t h a n 1 . 0 i n d i c a t i n g a n i n c r e a s e dp r o b a b i l i t y f o r b e i n g f o u n d o n t h e s u r f a c e .When t h e two s e q u e n c e s were c o m p a r e d b y t h i s s u r f a c ep r o b a b i l i t y m e t h o d , s t r i k i n g s i m i l a r i t i e s were n o t e d ( F i g . i j .T h e s e s i m i l a r i t i e s , i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e r e s u l t s o f t h eD a y h o f f p r o g r a m a n a l y s i s , a l l o w e d a n a l i g n m e n t o f t h e twoVP1 s e q u e n c e s a n d a n i d e n t i f i c a t i o n o f t h r e e HAV s i t e sw h i c h c o r r e s p o n d t o t he t h re e p r e v i o u s l y i d e n t i f i e d ( 6 )

8 3 6


2/4

N O T E S 8 3 7

1 0 20 3 0 40 50 60 7 0 80P O L I O S EQ UE NC E N U MBE RI NG 90 100 1 1 0F I G . 1 . S u r f a c e p r o b a b i l i t y p r o f i l e s c o m p a r i n g HAV VP1 ( 5 t o 1 1 4 ) w i t h p o l i o v i r u s t y p e 1 ( M a h o n e y s t r a i n ) VP1 ( 1 t o 1 1 0 ) ( 1 2 , 1 7 ) . Thec o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t ( r ) f o r t h e c o m p a r i s o n shown i s 0 . 6 8 ( r 2 =0 . 4 6 ) . C o m p a r i s o n s b e t w e e n t h e C - t e r m i n a l h a l v e s o f p o l i o v i r u s V P1 an dHAV VP1 s h o w a m a r k e d d e c r e a s e i n s u r f a c e p r o f i l e h o m o l o g y . R a n d o m l y r e l a t e d s e q u e n c e s show s u r f a c e p r o b a b i l i t y p r o f i l e s w i t h r c l o s et o zero. C o m p a r i s o n s o f s u r f a c e p r o f i l e s o f p o l i o v i r u s a n d HAV VP1 g e n e r a t e d b y t h e a m i n o a c i d h y d r o p h i l i c i t y - b a s e d method o f Hopp a n dWoods ( 9 ) g i v e r e s u l t s s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n ed w i t h t h e s u r f a c e p r o b a b i l i t y m e t h o d , t h o u g h v i s u a l l y n o t as s t r i k i n g a n d w i t h a s i g n i f i c a n t l yl o w e r c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t .

p o l i o v i r u s n e u t r a l i z a t i o n a n t i g e n i c s i t e s ( F i g . 2 ) . O n c ea l i g n e d , a d e g r e e o f a m i n o a c i d s e q u e n c e a n d c o n t e n ts i m i l a r i t y was e v i d e n t b e t w e e n t h e p o l i o v i r u s a n d HAVs i t e s .I n d u c t i o n o f an a n t i - H A V r e s po n s e b y an H A V - s p e c i f i cs y n t h e t i c p e p t i d e . A s y n t h e t i c p e p t i d e was p r e p a r e d , b y t h es o l i d - p h a s e m e t h o d ( 1 ) w i t h a Beckman m o d e l 9 9 0 B p e p t i d es y n t h e s i z e r , w h i c h c o n t a i n e d t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f

1 ) P o l i o v i r u s V P I

HA V V P I

2 ) P o l i o v i r u s VP I

HA V V P I

I 1 1 1 7-Asp-Asn-Thr - V a - A r g - 6 J M - T h r -

1 5 2 1- 6 1 u - f i n - A s n - I V a l i P r o - A " s - P r o -70 80- A r g S e r - A r g S e r - 6 1 u [ S e r S e r - l i e - 6 1 u F 9 S - P h e -- 6 1 u - H185

-61u 5er-Mrg H i s - T h r i l e r ~ j A s p - H i s - M t l t S e r i - lie-

on e o f t h e t h r e e t a r g e t e d HAV s i t e s ( F i g . 3 ) . A n t i b o d i e s i nh y p e r i m m u n e s e r u m r a i s e d a g a i n s t e i t h e r i n t a c t HAV ors o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - d i s r u p t e d HAV were f o u n d , b yi m m u n o s o r b e n t assay, t o b i n d t o t h e f r e e p e p t i d e ( d a t a n o ts h o w n ) . H e n c e , t h e p e p t i d e may expres s a c o n f o r m a t i o n ors e t o f c o n f o r m a t i o n s e q u i v a l e n t t o t h o s e f o u n d on t h e i n t a c tv i r i o n , a l t h o u g h t h e n a t u r e o f t h e c r o s s - r e a c t i v i t y i s n o te n t i r e l y c l e a r .T h e p e p t i d e was t h e n l i n k e d c o v a l e n t l y , i n d e p e n d e n t l y v i ae i t h e r e n d , t o a b o v i n e serum a l b u m i n c a r r i e r . New Z e a l a n dW h i t e r a b b i t s a n d H a r t l e y g u i n e a p i g s were e a c h i n o c u l a t e dw i t h 0 . 7 mg o f t h e r e s p e c t i v e c o n j u g a t e p e r i n o c u l a t i o n .Each a n i m a l r e c e i v e d t h r e e i n j e c t i o n s w i t h F r e u n d a d j u v a n to v e r a 2 - m o n t h p e r i o d . The r e s u l t a n t s e r a a l l c o n t a i n e da n t i p e p t i d e i m m u n o g l o b u l i n G a n t i b o d i e s . I n a d d i t i o n , e a c hserum a l s o c o n t a i n e d i m m u n o g l o b u l i n G a n t i b o d y c a p a b l e o f( i ) b i n d i n g d i r e c t l y t o p u r i f i e d h e p a t i t i s A v i r i o n s a n d ( i i )n e u t r a l i z i n g t h e i n f e c t i v i t y o f t h e v i r u s i n c e l l c u l t u r e ( T a b l e

93 1 0 33 ) P o l i o v i r u s VP 1 - A s p - A s n f - P r o - A l a - S e r - T h r - A s n - L y s - -Lys-97 10 7HA V VP I - T h r - P h e - T h r - P h e - A s n - S e r - A s n .jy- j i l u - T y r -

F I G . 2 . A l i g n m e n t o f t h e p o l i o v i r u s VP1 a n d HAV VP1 s e -q u e n c e s a t t h e t h r ee p o l i o v i r u s - s p e c i f i c n e u t r a l i z a t i o n s i t e s . T h ea l i g n m e n t i s b a s e d on t h e a l i g n m e n t o f s u r f a c e p r o b a b i l i t y p r o f i l e s( F i g . 1 ) . I d e n t i c a l a m i n o a c id r e s i d u es b e t w e e n p o l i o v i r u s a n d HAVr e v e a l e d b y t h e a l i g n m e n t ar e e n c l o s e d i n b o x e s . T h e a l i g n m e n t o ft h e s e c o n d s e q u e n c e , p o l i o v i r u s VP1 ( 7 0 t o 8 0 ) t o HAV VP1 ( 7 5 t o8 5 ) , was s h i f t e d b y on e a m i n o a c i d f r o m t h a t p r e v i o u s l y i m p l i e d ( F i g .1 ) t o m a x i m i z e t h e h o m o l o g y . A n u m b e r o f a d d i t i o n a l s i m i l a r i t i e s i nt h e a l i g n e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s ar e u n d e r l i n e d . F o r e x a m p l e , A s pa l i g n s w i t h G l u , Asn a l i g n s w i t h G l n , a n d T h r a l i g n s w i t h S e r . Aminoa c i d r e s i d u e s n u m b e r i n g i s f r o m t h e a m i n o t e r m i n u s o f e a c h p r o t e i n .

H A V V P I

o " t h e t i cP - p t i e

I 1 1 5T&_mW_a s . T 6 - 2 1_ n _ _ - 2 5

F I G . 3 . S y n t h e t i c HAV VP1 ( 1 1 t o 2 5 ) a n a l o g p e p t i d e s e q u e n c e .The s e q u e n c e c o n t a i n s t h e HAV VP1 ( 1 5 t o 2 1 ) segment w h i c h wasa l i g n e d b y t h e s u r fa ce p r o b a b i l i t y p r o f i l e a n a l y s i s w i t h t h e a n t i g e n i cp o l i o v i r u s VP1 ( 1 1 t o 1 7 ) d e t e r m i n a n t . The u n d e r l i n e d Tyr a n d C y sr e s i d u e s w e r e a d d e d f o r c o u p l i n g t o c a r r i e r s , a n d t h e N l e r e s i d u ef a c i l i t a t e d t h e q u a n t i t a t i o n o f c o u p l i n g e f f i c i e n c y . C o u p l i n g v i a t h eC y s r e s i d u e s was b y t h e method o f L i u e t a l . ( 1 4 ) , a n d t h e c o n j u g a t ec o n t a i n e d 1 0 , u g o f p e p t i d e pe r mg o f b o v i n e serum a l b u m i nc o n j u g a t e . C o u p l i n g v i a T y r was as d e s c r i b e d b y W a l t e r e t a l . ( 2 1 )w i t h 4 0 m o l o f p e p t i d e pe r m o l o f b o v i n e serum a l b u m i n .

ID -

mn0 ~w

: D( I ,

VO L. 5 5 , 1 9 8 5


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8 3 8 N O T E ST A B L E 1 . A n t i b o d y r e s p o n s e s a f t e r i m m u n i z a t i o n w i t h t h eH A V - s p e c i f i c s y n t h e t i c p e p t i d e a

R e a c t i o n s w i t h :P e p t i d e c HAV v i r i o n d H A VA n i m a l b n e u t r a l i -P r e - P o s t - P r e - P o s t - z a t i o n es e r u m s e r u m s e r u m s e r u m

R a b b i tN - 1 0 . 1 9 5 0 . 3 0 7 0 . 1 2 0 0 . 8 9 3 1 0 . 0N - 2 0 . 1 7 3 0 . 4 5 1 0 . 1 9 2 1 . 0 7 8 1 0 . 0C - i 0 . 2 5 0 0 . 4 2 1 0 . 2 0 7 0 . 2 7 1 1 0 . 0C - 2 0 . 2 1 2 0 . 2 8 9 0 . 1 9 5 1 . 1 9 1 1 0 . 0C o n t r o l 0 . 1 8 7 0 . 1 9 9 0 . 1 5 5 0 . 1 6 6 < 1 . 0G u i n e a p i gN - 1 0 . 9 4 4 1 . 2 6 7 0 . 8 1 7 0 . 9 5 2 1 0 . 0N - 2 0 . 8 8 9 2 . 2 0 0 0 . 9 8 7 1 . 4 5 2 1 0 . 0C - i 0 . 8 3 8 1 . 6 4 8 0 . 6 6 0 1 . 1 7 9 1 0 . 0C - 2 0 . 7 3 9 1 . 8 1 2 0 . 9 2 0 1 . 1 6 3 1 0 . 0C o n t r o l 0 . 7 9 1 0 . 8 1 7 0 . 7 7 1 0 . 7 8 0 < 1 . 0

a R ab bi t s a n d g u i n e a p i g s w e r e i n o c u l a t e d a s d e s c r i b e d . P o s t s e r a w e r ep r e p a r e d 2 w e e k s a f t e r t h e f i n a l i n o c u l a t i o n .I A n i m a l s N - 1 a n d N - 2 w e r e i n o c u l a t e d w i t h p e p t i d e c o n j u g a t e d t o b o v i n es e r u m a l b u mi n v i a t h e p e p t i d e a m i n o t e r m i n u s . A n i m a l s C -1 a nd C - 2 r e c e i v e dt h e p e p t i d e c a r b o x y - t e r m i n a l c o n j u g a t e . T h e c o n t r o l a n i m a l s w e r e i n o c u l a t e dw i t h u n c o nj u g a t e d b o v i n e s e r u m a l b u m i n .c A n t i b o d y - p e p t i d e i m m u n o g l o b u l i n G r e a c t i o n s w e r e m ea s u r e d b y e n -z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( 6 ) . T h e v a l u e s r e p r e s e n t o p t i c a l d e n s i t yr e a d i n g s a t 4 0 5 n m a f t e r t h e f i n a l e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y s t e pa n d a r e r e p r e s e n t a t i v e o f s e v e r a l e x p e r i m e n t s .d A n t i b o d y - v i r i o n i m m u n o g l o b u l i n G r e a c t i o n s w e r e m e a s u r e d b y e n z y m e -l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y . T h e s u b s t r a t e w a s p u r i f i e d h e p a t i t i s A v i r i o n sb o u n d t o t h e m i c r o t i t e r p l a t e w e l l s b y a n H A V - s p e c i f i c m o n o c l o n a l a n t i b o d y .T h e a n t i b o d y h ad b ee n d e t e r m i n e d n o t t o r e a c t w i t h t h e s y n t h e t i c p e p t i d eu n d e r s t u d y . T h e v a l u e s r e p r e s e n t o p t i c a l d e n s i t y r e a d i n g s a t 4 0 5 n m a f t e r t h ef i n a l e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y s t e p a n d a r e r e p r e s e n t a t i v e o fs e v e r a l e x p e r i m e n t s .e N e u t r a l i z a t i o n o f HAV g r o w t h i n c u l t u r e s o f n e w b o r n C y n o m o l g u sm o n k e y k i d n e y c e l l s w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 0 ) . T h en u m b e r s r e p r e s e n t t h e r e c i p r o c a l o f t h e h i g h e s t p o s t s e r u m d i l u t i o n c ap a b l e o fr e d u c i n g v i r u s g r o w t h b y 5 0 % . I n e a c h c a s e , p r e s e r u m e x h i b i t e d n o e f f e c t .H y p e r i m m u n e a n t i - H A V s e r u m y i e l d s v a l u e s i n t h i s a s s a y o f c a . 1 , 0 0 0 .

1 ) . T h e a n t i - H A V a n t i b o d y c o u l d b e r e m o v e d f r o m t h es e r u m b y e x p o s u r e t o f r e e p e p t i d e ( F i g . 4 ) .I t was o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p e p t i d e -i n d u c e d a n t i v i r i o n a n t i b o d y was a l s o c a p a b l e o f c o m p e t i n gw i t h a n t i b o d y f o u n d i n human HAV i m m u n e s e r u m . F o r t h i s

T A B L E 2 . C o m p e t i t i o n b e t w e e n human a n t i - H A V a n t i b o d i e sa n d a n t i - H A V p e p t i d e a n t i b o d i e S aC P M o f l a b e l e d h u m a n a n t i b o d i e sA n i m a l b P r e s e r u m P o s t s e r u m

R a b b i tN - 1 3 , 5 6 6 2 , 6 9 5N - 2 3 , 3 5 3 3 , 2 5 9C - 1 3 , 5 5 6 2 , 0 3 8C - 2 2 , 8 7 8 2 , 7 5 9C o n t r o l NDC 5 , 1 3 2

G u i n e a p i gN - 1 4 , 3 4 3 1 , 4 3 0N - 2 5 , 1 1 9 1 , 1 4 7C - 1 3 , 3 4 6 1 , 6 2 2C - 2 4 , 0 5 2 1 , 7 7 3C o n t r o l ND 4 , 5 3 8a E a c h s e r u m w a s t e s t e d f o r i t s a b i l i t y t o c o m p e t e w i t h a n t i b o d i e s f o u n d i nhuman a n t i - H A V i m m u n e s e r u m b y a m o d i f ie d c o m m e r c i a l HAVAB a s s a y .T h e a s s a y m e a s u r e s t h e p r es e nc e o f a n t i - H A V a n t i b o d y b y t h e d e g r e e t ow h i c h t h i s a n t i b o d y c o m p e t e s w i t h r a d i o a c t i v e l y l a b e l e d human a n t i - H A V f o rb i n d i n g t o i n t a c t h e p a t i t i s A v i r i o n s . T h e a s s a y w a s p e r f o r m e d a s s u g g e s t e d b yt h e s u p p l i e r ( A b b o t t L a b o r a t o r i e s ) , e x c e p t t h a t e q u a l v o l u m e s o f t e s t s e r u ma n d d i l u e n t w e r e u s e d . T h e r e p o r t e d v a l u e s r e p r e s e n t t h e c o u n t s p e r m i n u t e

( C P M ) o f l a b e l e d h u m a n a n t i b o d i e s b o u n d t o v i r i o n . W i t h n o c o m p e t i t i o n , t h ea s s a y y i e l d e d a v al ue o f 5 , 2 7 9 CPM. C o m p e t i t i o n w i t h u n l a b e l e d h o m o l o g o u shuman i m m u n e s e r u m l o w e r e d t h i s v a l u e t o 1 1 3 CPM.b S e e f o o t n o t e b t o T a b l e 1 f o r a n i m a l i d e n t i f i c a t i o n .c ND, N o t d o n e .

p u r p o s e , e a c h s e r u m was t e s t e d i n a m o d i f i e d c o m m e r i c a lHAVAB a s s a y w h i c h m e a s u r e s a n t i h e p a t i t i s A v i r i o n i m m u -n o g l o b u l i n G b y c o mp e t i t i o n w i t h a s t a n d a r d human immunes e r u m . T h e r e s u l t s ( T a b l e 2 ) s h o w e d t h a t a l l o f t h e g u i n e a p i ga n d 5 0% o f t h e r a b b i t s e r a c o n t a i n e d s u c h c o m p e t i t i v ea n t i b o d i e s . H e n c e , some o f t h e c r o s s - r e a c t i v e , p e p t i d e -s p e c i f i c v i r i o n e p i t o p e s a r e a l s o r e c o g n i z a b l e b y t h e humanimmune s y s t e m . I t i s n o t e w o r t h y , h o w e v e r , t h a t a t l e a s t o n ee p i t o p e w h i c h i s r e c o g n i z e d b y t h e r a b b i t immune s y s t e m i sn o t r e c o g n i z e d b y t h e h u m a n .F i n a l l y , t h e a n t i p e p t i d e a n t i b o d i e s w e r e f o u n d t o r e a c t , b yW e s t e r n i m m u n o b l o t t i n g , w i t h p u r i f i e d d e n a t u r e d HAV VP1( d a t a n o t s h o w n ) . T h i s r e s u l t e m p h a s i z e d t h e p o t e n t i a l l ys e q u en ti a l n at u r e o f t h e d e t e r m i n a n t r e p r e s e n t e d b y t h ep e p t i d e s e q u e n c e o n t h e v i r i o n s u r f a c e .

0 . 8 ~0 . 7 F0 . 6

c 5 0 . 5o 0 . 4

0 0 3 r0 . 20 . 1

2 4 8 1 6 3 2 6 4 1 2 8 2 5 6RECIPROCAL PEPTIDE DILUTIONS

5 1 2 1 0 2 4F I G . 4 . C o mp e t i t i o n b y f r e e p e p t i d e o f a n t i - h e p a t i t i s A v i r i o n a c t i v i t y i n a n t i p e p t i d e s e r u m . S e r i a l 1 : 2 d i l u t i o n s o f a 1 . 0 m g / m l p e p t i d es o l u t i o n w e r e m i x e d 1 : 1 w i t h a 1 : 1 0 d i l u t i o n o f t e s t s e r u m . T h e m i x t u r e s w e r e a l l o w e d t o i n c u b a t e o v e r n i g h t a t 4 0 C . E a c h w as t h e n a s s a y e df o r a n t i v i r i o n a c t i v i t y b y e nz y m e- l i nk ed i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( s e e f o o t n o t e s t o T a b l e 1 ) . T h e v a l u e s r e c o r d e d i n t h e g r a p h r e p r e s e n t o p t i c a ld e n s i t y r e a d i n g s a t 4 0 5 n m a f t e r t h e f i n a l e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y s t e p . T h e x a x i s i s l o g a r i t h m i c ( l o g l 0 ) i n s c a l e . T h e r e s u l t sr e p o r t e d h e r e a r e r e p r e s e n t a t i v e a n d w e r e o b t ai n ed w i t h s e r a f r o m r a b b i t N - 1 ( T a b l e 1 ) . S y m b o l s : 0 , p o s t s e r u m ; 0 , p r e s e r u m . The s m a l ld e g r e e o f p o s i t i v e r e a c t i v i t y s e e n a f t e r c o m p l e t e p e p t i d e a b s o r p t i o n o f t h e a n t i v i r i o n a c t i v i t y i s p r o b a b l y d u e t o b i n d i n g b e t w e e n a n t i b o d i e st o t h e c a r r i e r p r o t e i n a n d r e s i d u a l b o v i n e s e r u m a l b u m i n a s s o c i a t e d w i t h t h e p u r i f i e d v i r u s .

J . V I R O L .

0 0

0---0----O----O---.O-- -.0----O----O


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N O T E S 8 3 9I t i s o f i n t e r e s t t h a t , d e s p i t e a p p a r e n t l y m i n i m a l p r i m a r ys e q u e n c e a n d s e c o n d a r y s t r u c t u r e c o n s e r v a t i o n , t h e s u r f a c es t r u c t u r e h o m o l o g y b e t w e e n p o l i o v i r u s a n d HAV may b es i g n i f i c a n t . T h i s s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y may i n v o l v e t h e a n t i -g e n i c s i t e p r e s e n t a t i o n s o f t h e t w o v i r u s e s . I t w a s c l e a r l yp o s s i b l e t o i d e n t i f y a n H A V - s p e c i f i c n e u t r a l i z a t i o n a n t i g e n i cs i t e s o l e l y b y c o m p a r i s o n t o t h e known l o c a t i o n s o f s u c ha n t i g e n i c s i t e s o n t h e p o l i o v i r u s - s p e c i f i c V P 1 . T h e s y n t h e t i cp e p t i d e r e p o r t e d i n t h i s c o m m u n i c a t i o n h a s c o n s i d er a b l ep o t e n t i a l a s a c o m p o n e n t o f a s y n t h e t i c HAV v a c c i n e ,e s p e c i a l l y s i n c e i t w a s s h o w n t h a t a n t i p e p t i d e a n t i b o d i e sc o u l d c o m p e t e w i t h a n t i b o d i e s i n human HAV immunes e r u m . S y n th e t i c p e p ti d e s c o nt a i ni n g a m i n o a c i d s e q u e n c e so f t h e r e m a i n i n g t w o p r o b a b l e HAV n e u t r a l i z a t i o n a n t i g e n i cs i t e s a r e c u r r e n t l y u n d e r s t u d y .A l s o , i n c o n c l u s i o n , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e a l i g n m e n to f t h e HAV a n d p o l i o v i r u s VP1 s e q u e n c e s b y s u r f a c ep r o b a b i l i t y a n a l y s i s c o n f i r m s t h e c u r r e n t m a p p i n g o f t h eHAV VP1 o n t h e HAV g e n o m i c RNA s e q u e n c e . T h e m a p -p in g h as b e e n e s t a b l i s h e d b y c o m p a r i s o n o f t h e RNA s e -q u e n c e w i t h VP1 a m i n o a c i d s e q u e n c e d a t a ( 1 4 ) .W e a r e g r a t e f u l t o L i n d a S t a n t o n a n d W i l l i a m S c h l e i f f o r e x c e l l e n t

t e c h n i c a l a s s i s t a n c e , P h i l i p P r o v o s t , D a n i e l V e b e r , a n d E d w a r dS c o l n i c k f o r h e l p f u l d i s c u s s i o n s , a n d P a t N y c e a n d C a r o l G e t t y f o rp r e p a r a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t .L I T E R A T U R E CITED

1 . B a r a n y , G . , a n d R . B . M e r r i f i e l d . 1 9 8 0 . S o l i d p h a s e p e p t i d es y n t h e s i s , p . 1 - 2 8 4 . I n E . G r o s s a n d J . M e i e n h o f e r ( e d . ) , T h ep e p t i d e s , v o l . 2 . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Y o r k .2 . C h o u , P . Y . , a n d G . D . F a s m a n . 1 9 7 8 . P r e d i c t i o n o f t h es e c o n d a r y s t r u c t u r e o f p r o t e i n s f r o m t h e i r a m i n o a c i d s e q u e n c e .A d v . E n z y m o l . 4 7 : 4 5 - 1 4 8 .3 . C o u l e p i s , A . G . , S . A . L o c a r n i n i , E . G . W e s t a w a y , G . A .T a n n o c k , a n d I . D . G u s t . 1 9 8 2 . B i o p h y s i c a l a n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n o f h e p a t i t i s A v i r u s . I n t e r v i r o l o g y 1 8 : 1 0 7 - 1 2 7 .4 . D a y h o f f , M. 0 . 1 9 7 9 . S u r v e y o f n ew d a t a a n d c o m p u t e r m e t h o d so f a n a l y s i s , p . 1 - 8 . I n M. 0 . D a y h o f f ( e d . ) , A t l a s o f p r o t e i ns e q u e n c e a n d s t r u c t u r e , v o l . 5 , s u p p l . 3 . N a t i o n a l B i o m e d i c a lR e s e ar c h F o u n d a t io n , W a s h i n g t o n , D . C .5 . E m i n i , E . A . , B . A . J a m e s o n , A . J . L e w i s , G . R . L a r s e n , a n d E .Wimmer. 1 9 8 2 . P o l i o v i r u s n e u t r a l i z a t i o n e p i t o p e s : a n a l y s i s a n dl o c a l i z a t i o n w i t h n e u t r a l i z i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . J . V i r o l .4 3 : 9 9 7 - 1 0 0 5 .6 . E m i n i , E . A . , B . A . J a m e s o n , a n d E . W i m m e r . 1 9 8 3 . P r i m i n g f o ra n d i n d u c t i o n o f a n t i - p o l i o v i r u s n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s b y s y n -t h e t i c p e p t i d e s . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 4 : 6 9 9 - 7 0 3 .7 . G a r n i e r , J . , D . J . O s g u t h o r p e , a n d B . R o b s o n . 1 9 7 8 . A n a l y s i s o ft h e a c c u r a c y a n d i m p l i c a t i o n s o f s i m p l e m e t h o d s f o r p r e d i c t i n gt h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f g l o b u l a r p r o t e i n s . J . M o l . B i o l .

1 2 0 : 9 7 - 1 2 0 .8 . G u s t , I . D . , A . G . C o u l e p i s , S . M. F e i n s t o n e , S . A . L o c a r n i n i , Y .M o r i t s u g a , R . N a u e r a , a n d G . S i e g l . 1 9 8 3 . T a x o n o m i c c l a s s i f i -c a t i o n o f h e p a t i t i s A v i r u s . I n t e r v i r o l o g y 2 0 : 1 - 7 .9 . H o p p , T . P . , a n d K . R . W o o d s . 1 9 8 1 . P r e d i c t i o n o f p r o t e i na n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s f r o m a m i n o a c i d s e q u e n c e s . P r o c . N a t l .A c a d . S c i . U . S . A . 7 8 : 3 8 2 4 - 3 8 2 8 .1 0 . H u g h e s , J . V . , L . W. S t a n t o n , J . E . T o m a s s i n i , W. J . L o n g , a n dE . M. S c o l n i c k . 1 9 8 4 . N e u t r a l i z i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t oh e p a t i t i s A v i r u s : p a r t i a l l o c a l i z a t i o n o f a n e u t r a l i z i n g a n t i g e n i cs i t e . J . V i r o l . 5 2 : 4 6 5 - 4 7 3 .1 1 . J a n i n , J . , S . W o d a k , M. L e v i t t , a n d B . M a i g r e t . 1 9 7 8 . C o n f o r -m a t i o n o f a m i n o a c i d s i d e - c h a i n s i n p r o t e i n s . J . M o l . B i o l .1 2 5 : 3 5 7 - 3 8 6 .1 2 . K i t m u r a , N . , B . L . S e m l e r , P . G . R o t h b e r g , G . R . L a r s e n , C . J .A d l e r , A . J . D o r n e r , E . A . E m i n i , R . H a n e c a k , J . J . L e e , S .V a n d e r W e r f , C . W. A n d e r s o n , a n d E . Wimmer. 1 9 8 1 . P r i m a r ys t r u c t u r e , g e n e o r g a n i z a t i o n a n d p o l y p ep t id e e xp r es s i o n o fp o l i o v i r u s R N A . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 9 1 : 5 4 7 - 5 5 3 .1 3 . K r u g m a n , S . , J . P . G i l e s , a n d J . Hammond. 1 9 6 7 . I n f e c t i o u sh e p a t i t i s : e v i d e n c e f o r t w o d i s t i n c t c l i n i c a l , e p i d e m i o l o g i c a l a n di m m u n o l o g i c a l t y p e s o f i n f e c t i o n . J . A m. M e d . A s s o c .2 0 0 : 3 6 5 - 3 7 3 .1 4 . L i n e m e y e r , D . L . , J . G . M e n k e , A . M a r t i n - G a l l a r d o , J . V .H u g h e s , A . Y o u n g , a n d S . W. M i t r a . 1 9 8 5 . M o l e c u l a r c l o n i n ga n d p a r t i a l s e q u e n c i n g o f h e p a t i t i s A v i r a l cDNA. J . V i r o l .5 4 : 2 4 7 - 2 5 5 .1 5 . L i u , F . - T . , M. Z i n n e c k e r , T . H a m a o k a , a n d D . H . K a t z . 1 9 7 9 .N e w p r o c e d u r e s f o r p r e p a r a t i o n a n d i s o l a t i o n o f c o n j u g a t e s o fp r o t e i n s a n d a s y n t h e t i c c o p o l y m e r o f D - a m i n o a c i d s a n di m m u n o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f s u c h c o n j u g a t e s . B i o c h e m -i s t r y 1 8 : 6 9 0 - 6 9 7 .1 6 . M e l n i c k , J . L . 1 9 8 2 . C l a s s i f i c a t i o n o f h e p a t i t i s A v i r u s a se n t e r o v i r u s t y p e 7 2 a n d o f h e p a t i t i s B v i r u s a s h e p a d n a v i r u st y p e 1 . I n t e r v i r o l o g y 1 8 : 1 0 5 - 1 0 6 .1 7 . P r o v o s t , P . J . , B . S . W o l a n s k i , W. J . M i l l e r , 0 . L . I t t e n s o h n ,W. J . M c A l e e r , a n d M. R . H i l l e m a n . 1 9 7 5 . P h y s i c a l , c h e m i c a la n d m o r p h o l o g i c a l d i m e n s i o n s o f human h e p a t i t i s A v i r u s s t r a i nC R 3 2 6 ( 3 8 5 7 8 ) . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 4 8 : 5 3 2 - 5 3 9 .1 8 . R a c a n i e l l o , V . R . , a n d D . B a l t i m o r e . 1 9 8 1 . M o l e c u l a r c l o n i n g o fp o l i o v i r u s cD N A a n d d e t er m i na t i o n o f t h e c o m p l e t e n u c l e o t i d es e q u e n c e o f t h e v i r a l g e n o m e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A .7 8 : 4 8 8 7 - 4 8 9 1 .1 9 . S i e g i , G . , G . G . F r o s n e r , V . G a u s s - M u l l e r , J . D . T r a t s c h i n , a n dF . D e i n h a r d t . 1 9 8 1 . T h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f i n f e c -t i o u s h e p a t i t i s A v i r i o n s . J . G e n . V i r o l . 5 7 : 3 3 1 - 3 4 1 .2 0 . T i c e h u r s t , J . R . , V . R . R a c a n i e l l o , B . M. B a r o u d y , D . B a l t i m o r e ,R . H . P u r c e l l , a n d S . M. F e i n s t o n e . 1 9 8 3 . M o l e c u l a r c l o n i n g a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f h e p a t i t i s A v i r u s cDNA. P r o c . N a t l . A c a d .S c i . U . S . A . 8 0 : 5 8 8 5 - 5 8 8 9 .2 1 . W a l t e r , G . , K . H . S c h e i d t m a n n , A . C a r b o n e , A . P . L a u d a n o , a n dR . F . D o o l i t t l e . 1 9 8 0 . A n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r t h e c a r b o x y - a n da m i n o - t e r m i n a l r e g i o n s o f s i m i a n v i r u s 4 0 l a r g e t u m o r a n t i g e n s .P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 7 : 5 1 9 7 - 5 2 0 0 .

V O L . 5 5 , 1 9 8 5

induction of hepatitis a virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide

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