1  

microRNA Research Design: Strategies from the Experts  

[0:00:00] Sean Sanders:  Hello  and  welcome  to  the  Science/AAAS  webinar.  My  name  is  Sean 

Sanders and I’m the commercial editor at Science. Slide 1   The  topic  of  today’s  discussion  is,  “microRNA  Research  Design.” 

MicroRNAs are increasingly being accepted as playing a crucial regulatory role in normal and dysfunctional cellular processes and are thought to be involved  in almost every human pathology currently under  study. From tumor progression and viral host  interactions, to  immune response, and cell fate determination, microRNAs are quickly growing  in  importance as the  "master  regulators"  in  cell  cycle  processes.  In  this  webinar,  our experts will share their knowledge and expertise to help you determine the optimal path to a successful miRNA research project. 

   With me in the studio today, I have three fantastic panelists who will help 

us  understand  this  topic.  Just  to  my  left,  Dr.  Peter  Nelson  from  the University of Kentucky  in Lexington. Next to him, Dr. Kai Wang from the Institute for Systems Biology  in Seattle, Washington. And finally, Dr. Neil Kubica from Harvard Medical School in Boston, Massachusetts. 

   A warm welcome to all of you. Thanks for being here.  Dr. Kai Wang:  Thank you.  Dr. Peter Nelson:  Thank you very much for having us, Sean.  Sean Sanders:  A reminder to everybody watching that you can see an enlarged version 

of  any  of  the  slides  by  just  clicking  the  enlarge  slides  button  located underneath  the  slide  window  of  your  web  console.  You  can  also download  a  PDF  copy  of  all  the  slides  by  using  the  download  slides button. If you’re joining us live, you can submit a question to the panel at any  time by  typing  it  into  the ask‐a‐question box on  the bottom  left of your  viewing  console  below  the  video  screen  and  clicking  the  submit button. As always, please do keep your questions short and to the point. I’ll get to as many of them as possible  in the Q&A session  following the talks. 

   Last  but  not  least,  thank  you  Exiqon  for  their  sponsorship  of  today’s 

webinar. Slide 2 

2  

  Now,  I’d  like  to  introduce  our  first  speaker  for  this webinar, Dr.  Peter Nelson.  Dr.  Nelson  obtained  his  undergraduate  degree  in  biology  and economics  from  Rice University  in Houston,  Texas,  followed  by  a  joint M.D.  and  Ph.D.  at  the University  of  Chicago where  his  graduate work looked  at  animal models  of  Alzheimer’s  disease.  After  completing  his medical  residency  and  clinical  fellowship  training  at  the  University  of Pennsylvania, Dr. Nelson worked as a postdoctoral  fellow and  research associate studying miRNAs.  In 2006, Dr. Nelson moved to the University of  Kentucky,  where  he  is  currently  an  associate  professor  in  the Department of Pathology and Laboratory Medicine. He runs a laboratory in  the  Sanders‐Brown  Center  on  Aging  and  serves  as  an  attending physician  in  neuropathology.  Dr.  Nelson  invented  new  techniques  to analyze  and manipulate microRNAs,  and  his  current  research  interests involve  studying how microRNA biology  is altered  in neurodegenerative diseases, in order to better understand pathogenesis and to obtain clues relevant to potential therapies. 

   Dr. Nelson, welcome.  Dr. Peter Nelson:  Thank you very much, Sean, and thank you very much for having me here 

today. Slide 3   My discussion is going to focus on microRNA research design strategies in 

the context of in situ hybridization in the brain, and this is an overview of it.  I’ve been asked to give a  little bit of  introduction of what microRNAs are and what they do. And then I’m going to talk about the topic at hand very briefly. 

Slide 4   So,  the  things  that we’re  talking about are  these microRNAs, which are 

born in the nucleus. They are transcribed and exist first in this long stem loop  structures  that  are  serially  processed  and  exported  into  the cytoplasm, where  they  interact with  various  proteins  that  are  not  the really the topic of our conversation today. They are eventually cleaved to a  mature  form  about  22  nucleotides  in  length.  And  these  go  on  to regulate some of the translational processing of miRNAs and probably do other things as well. 

Slide 5   As  this  sort  of  cartoon  depiction  shows what  translation  is,  it  shows  a 

cartoon miRNA. And  translation  is  a process by which  a polypeptide  is formed  from  the  miRNA.  And  it’s  increasingly  clear  that  miRNA translation  is  a  key  focal  point  in  gene  expression  regulation.  One manifestation  of  that  is  the  fact  that  especially  in  humans  whenever they’ve used high throughput means to assess it, the correlation between levels of miRNAs and levels of protein is extremely weak. 

3  

Slide 6   One  of  the  reasons  for  that  presumably  is microRNAs, which  use  very 

ancient mechanisms of regulation at the  level of miRNA translation. The canonical manner  in which  this  occurs  is  that  the microRNA  pairs  in  a complementary  fashion  ‐‐  partial  complementary  to  the  3’ UTR  of  the miRNA and suppresses the translation of that particular miRNA. 

Slide 7   This  is a complicated  slide and  the point  really  is  just  to  say  it’s  from a 

review of which Guiliang Tang was the main author. And the main point is just  to  say  that  there  are  many  different  mechanisms  by  which microRNAs work. We only know some of them and particularly, the focus has  been  upon  how  the  microRNAs  inhibit  translation  from  cognate miRNAs. 

Slide 8 [0:04:58]   So, one of the important things that are to be learned about microRNAs is 

where  they’re  expressed  and  how  their  expression  changes  in  disease. And this cartoon shows one way that this is studied using microarrays or many other different platforms. On  the  left, you can see a brain where the  hippocampus  is  nice  and  robust  and  juicy,  and  that’s  a  normal control.  On  the  right,  you  can  see  a  brain  where  the  same  area  is shriveled  away  and  dying,  and  that  is  an  Alzheimer’s  disease hippocampus.  And  tissue  level  microRNA  profiling  can  show  the differences between these two conditions. 

Slide 9   However, it’s very important to note that tissue level microRNA profiling 

is confounded by all sorts of heterogeneity in the tissue. And this is very relevant  to  human  brain  studies  in  which  tissue  level  profiling  is performed. 

Slide 10   Just one  somewhat,  I guess,  trivial way  that you could  look at  it  is  that 

when people say that profiling of cortex is used and this has a change at profiling. Well, cortex comprises two very different types of cells. Those that are  in the gray matter and those that are  in the white matter. The cells that are  in the gray matter are totally different from those there  in the white matter. And we  found that the gray matter and white matter have  very  different microRNA  profiles  as  you might  expect. And  if  you don’t dissect out the gray matter and the white matter then you can be just  showing  differences  in  the  relative  ratios  of  gray matter  to white matter in your experiment. 

Slide 11   Another thing that’s very important is to compare apples to apples. These 

are quick photomicrographs  to show what can happen  in a disease. On the  left,  you  see  a  normal  cerebral  cortex. And  I  can’t  use my  pointer 

4  

here  to  show  it,  but  you  have  very  healthy  neurons  and  quiescent astrocytes, the normal constituents of the brain. 

   In Alzheimer’s disease and other diseases where they have a devastating 

impact,  they  can have a  complete  replacement  such as  the normal  cell constituents  are  not  there.  And  if  you  do  a  comparative  tissue  level profiling, all  you’re doing  is  really  showing  the difference between one group of cells and another group of cells that has nothing to do with the disease pathogenesis itself. 

Slide 12   So  one  of  the  theme  ‐‐  the main  theme,  if  I  can  just make  one  point 

during  this brief discussion,  is  that  it’s  important  to  complement  tissue level microRNA profiling with  cellular  and  subcellular profiling  that  you can do with in situ hybridization. 

Slide 13   So, in studying the human brain disease, there are some technical notes. 

It  is  important  to  compare apples  to apples, and  so you need  to  try  to make  it so you’re not having any massive switching  in the types of cells that are in your material. 

   You have to dissect carefully by people who understand some degree of 

the neural anatomy and the diseases at hand. And, I guess, it’s intrinsic to in  situ  hybridization  that  you’re  extending  tissue  level  profiling  to  the cellular  level. And, of course,  it’s very complex  in humans because there are agonal events that can, I think, be confounders. 

   But with all that being said, that human brain is a very important source 

both  for  testing hypotheses and generating new hypotheses, as  long as we acknowledge that there are huge gaps in our current understanding in this context. 

Slide 14   So, here are the people that make up most of the ‐‐ do most of the work 

in our lab. And I’d like to send a shout‐out to Jim Dimayuga, Willa Huang or Dada Huang, Wang‐Xia Wang. But  the person  that does most of  this work with  in situ hybridization  is shown here, Bernard Wilfred who has done a magnificent job and he gets great results. 

Slide 15   And so, I’m just going to give a quick technical overview of how we do in 

situ hybridization  in the brain. So, we have a rapid autopsy team so we get very short postmortem interval brain tissue. And it’s been shown that microRNAs  can  degrade  relatively  quickly  and  more  important  than quickly  is  that  they  do  differentially  such  that  different  microRNAs degrade at different rates. 

 

5  

  So,  we  fix  in  paraformaldehyde  and  we  cut  the  brain  sections  at  20 microns  on  a  freezing microtome,  which  still  enables  us  to  get  great results  in  terms of morphology. Then we  store  the  sections at  ‐80  in  a freezer until we’re ready to use them. 

Slide 23   So,  I will say after the  last slide, there’s another slide that anybody who 

wants to can look at some of the technical tips that Bernard has given us in  terms of  things you may not necessarily quickly  think of  that  I’m not including on this talk. But for those of you that are going back afterwards that want  to  look  at  the  slides,  you  can  look  at  the  very  last  slide  and there are some technical tips for brain in situ hybridization. 

Slide 16   What we do  is a  three‐day protocol. And on  the one hand, a  three‐day 

protocol  is kind of a slug.  It’s kind of a pain to go through all that much time. But on the other hand, we get just really, really nice, pretty results. And I can recommend not trying to take too many shortcuts. 

 [0:09:56]   Day 1  goes  from  the  freezer  to  the hyb  chamber. Hyb  chamber  to  the 

antibodies, day 2. And then antibody to the stain.  Slide 17   So,  I’m not being a show for anybody, but  I have to say that the Exiqon 

probes  that  we  use  have  given  us  really  very  nice  results.  And  then, there’s another product here from EM Sciences, this Hyb chamber, that is very effective in terms of allowing you to manipulate your slides and get good hyb results in a hyb chamber. And this is shown here on the right ‐‐ how it work on the actual physical slide. 

Slide 18 Slide 19   So,  here  are  some  of  the  steps  ‐‐  I’m  not  going  to  go  through  them 

exhaustively  ‐‐  that  you  do  on  your  first  day.  Then  you  get  into hybridization. You need  to humidify your hyb oven and you  then put  it into the antibody overnight. And then the next day, you develop  it with your  NBT/BCIP.  This  is  both  in  situ  hybridization  and  the  antibody reaction  because  you’re  doing  anti‐Dig,  and  these  are Dig‐labeled  LNA Exiqon probes. So, this is something like what ‐‐ some of the results that you might get. 

Slide 20   And  these  are  some  of  our  published  results.  I’m  not  going  to  go  into 

them  in any great detail, other than to say that they can really find very interesting  and  unexpected  results.  And  you  can  correlate  these  to pathology,  to  other  microRNAs.  And  we’re  working  with  Exiqon  to develop  a  technology  to  get  double‐labeled  fluorescent  probes  so  that 

6  

we can get double and triple labeled relationships of different markers in the brain. 

   Here, you can see the six  layers of cerebral cortex and you can see that 

one microRNA probe clearly labels different from another one. Slide 21   Here’s an In‐Press paper on the transentorhinal cortex relating the in situ 

hybridization to the pathology in this area. And we had some interesting results. 

   So,  I  don’t want  to  take  too much more  time.  I  just want  to  give  an 

overview of what we do, why you do it, and some of our results. Slide 22   I want  to say  thanks  to  the people  that enabled us  to do our  lab work. 

And  then  for anybody who’s  interested  in  technical  tips, we  can either talk about them later or you can look in the next slide after this one. But for now, I’ll pass it on over. 

 Sean Sanders:  Great. Thank you, Dr. Nelson. Slide 23   So, we’re  going  to put  that  slide up  for  you  right now.  You  can  take a 

quick  look  at  it.  And  also,  you  can  download  the  slides  using  the download slides button, and that’ll get you a PDF, which will include that slide. 

Slide 24   Great. So, we’re going to move right on to our next speaker and that  is 

Dr. Kai Wang. Dr. Wang completed his undergraduate training  in Taiwan before moving to the United States for the study of his Ph.D. at Oregon State University. Following an assistant professorship at the University of Washington  in  Seattle,  Dr. Wang moved  to  industry  and  in  2001  co‐founded PhenoGenomics Corporation. In 2008, he took a senior research scientist  position  at  the  Institute  for  Systems  Biology  in  Seattle, Washington, where he  currently  conducts  research  into  the application and  biological  function  of  microRNAs.  Besides  his  over  20  years  of experience as a molecular biologist in academia and industry, Dr. Wang is also a diplomate of  the American Board of Toxicology and  is named on three US patents. 

   Dr. Wang, welcome.  Dr. Kai Wang:  Thank  you,  Sean.  It’s  a  pleasure  to  be  here  to  share  some  of  our 

experience in microRNA with you. Slide 25 

7  

  So,  our  research  focus  is  using  systems  approach  to  study  various diseases, especially disease in lung, brain, and liver, so that we can get a better  understanding  of  the  biology  through  modeling  and  network analysis. 

Slide 26   But a fundamental of a systems approach is based on two. One is be able 

to accurately measure  the molecule of  interest. So,  in  this context, you have  to  ask  yourself,  do we  actually  know  how  to measure microRNA correctly. And the second is be able to integrate, interpret, and test those results you have. So, again, here you have to ask about yourself, do we actually understand how microRNA  is actually being expressed and how microarray  is being processed,  and  also, do we  know how  to  interpret and integrate the result from microRNA. 

Slide 27   So, let’s look at microRNA measurement. Currently, there are three major 

platforms  for  microRNA  measurement.  They  are  microarray  based  or qPCR based or sequencing. The sequencing here  is mainly talking about next generation sequencing based technology. 

   People  did  interplatform  and  intraplatform  comparisons.  The  result 

usually  is  between  platforms,  the  consistency  of  the  result  usually  are low.  Within  a  platform,  it  all  depends  on  the  technology  you  use. Sometimes the reproducibility also can be an issue. 

[0:14:56]   So, I think, all of this  is probably caused by  interesting property of some 

microRNAs. As Pete mentioned earlier,  the microRNAs are a very  short stretch  of  nucleotide  sequences.  They’re  usually  20  to  22  nucleotides long. So, that gives you a very small room to manipulate, to design good primer or probes for microRNA profiling. 

Slide 28   On  top  of  that,  a  lot  of microRNAs  actually  show  very  high  sequence 

similarities.  People  usually  use  the  let‐7  as  an  example  to  show  how similar  they are. But  that’s not  the only case. There are plenty of other cases. For instance in here, we show this family, 302 microRNA family. It has  four members,  a,  b,  c,  and  d.  This  particular  family  plays  a  very important  role  in  stem  cell  development  ‐‐  embryonic  stem  cell development. 

   And you can see the sequence conservation among these four members 

is  extremely  high.  There’s  only  one  nucleotide  difference  among  all  of them. And when you  look at the human models today, they are exactly the same sequence except 302c. So, that creates some problems on how we actually measure specific microRNA. 

Slide 29 

8  

  The  next  problem  is  when  we  look  at  result  from  next  generation sequencing, we  and many  other  people  actually  realized  that  a  lot  of microRNas actually posses end region diversity. 

   Here,  I’ll  just  show you one example, miR‐451. This particular example, 

they have  fairly  consistent  5’  end, but  at  their  3’  end  they  show  great variabilities. The one marked in red actually is the sequence to this in the database.  So,  this  end  region  diversity  can  also  contribute  to  issues associated  with  measurement  and  potentially  may  also  affect  the function of microRNAs. 

Slide 30   So,  if  you  compare different platforms, microarray  and qPCR platforms 

have  the  advantages  on  cost  as well  as  its  throughput. However,  next generation sequencing platform actually provides unprecedented depths of  coverage  on  microRNA  as  well  as  provides  you  an  opportunity  to identify  new microRNAs.  However,  next  generation  sequencing  suffers from high cost,  low  throughput,  lengthy sample preparation procedure, and also, you have to deal with huge data file. 

Slide 31   There  are  two  types of microRNAs based on  its  genomic  location. One 

type  of  them  actually  is  located  in  the  intronic  region  of  a messenger RNA. We  call  it  intronic microRNA.  The  other  type  is  located  between genes so we called it intergenic microRNAs. 

   So,  if you  look at  intronic microRNAs, you would expect  the expression 

profile  of  the  intronic microRNA  and  its  hosting  gene  should  be  very similar. And,  indeed,  in  the  case on  your  left‐hand  side,  these  two  are almost  identical.  But  in  the  same model  system, we  are  looking  at  on your  right‐hand  side,  this would  be miR‐30e,  they  are  totally  opposite from its hosting genes. 

Slide 32   For  intergenic microRNAs,  if  you  look  at  individual microRNAs  in  these 

microRNA  clusters,  again,  you  would  expect  their  expression  profile should be similar. And,  indeed,  in the same model system we  looked at, the miR‐144 and the miR‐451 on your left‐hand side, they show identical expression profile. The distance between these two microRNAs  is about 500 base pair. 

   But if you take the same example and look on the right‐hand side, these 

are  two  different  microRNA  in  the  same  model  system.  Again,  their distance is about 500 nucleotides. They show totally opposite expression profile. So, that tells us there is a complex regulatory mechanism involved in microRNA maturation process. 

Slide 33 

9  

  So, how to identify microRNA’s function? There are two major processes you  can  ‐‐  people  usually  do.  One  is  through  its  interacting  targets. People  can  clone  ‐‐  you  can  clone  your  gene of  interest, usually  the 3’ UTR region, into a reporter. So then, you can use the reporter’s activity to determine  or  as  a  measurement  of  microRNA  and  messenger  RNA interaction. 

   The problem  for  this  is  you  assume  that  a microRNA  and  a messenger 

RNA interaction happened at its 3’ end. The second problem is there are too many predicted targets to choose from. So, you have to just pick one or two or a bunch of them. You won’t be able to do all of them. 

[0:20:13]   The other approach is to use pull‐down. You can pull down microRNA and 

the messenger RNA to look at all possible interacting partners. But, again, here  you  will  get  a  huge  list  of  messenger  RNA  for  any  particular microRNA. 

   The second approach to assess microRNA function is through a functional 

screen. By manipulating specific microRNA levels, you can over express a particular microRNA or you can knock down a particular microRNA  in a biological system. The advantage for this is you have a very good readout and you can screen a particular phenotype. But, again, if you look at the gene  expression  level when  you manipulate  just  one  single microRNA, you’d  probably  find  many,  many  different  genes  being  affected  by  a particular microRNA. 

Slide 34   So, in summary, it’s very difficult for us to accurately measure the level of 

microRNA.  And  also,  it  is  a  challenge  to  integrate  microRNA  data  to existing  dataset.  But  nevertheless,  this  also  provides  us  a  great opportunity for us to understand biology. 

Slide 35   At  the end,  I want  to  thank people doing  the work, my collaborators at 

different places, and also generous  funding  from Battelle, University of Luxembourg, and Department of Defense. Thank you. 

 Sean Sanders:  Great. Thank you so much, Dr. Wang. Slide 36   Our  final  speaker  for  today  is Dr. Neil Kubica. Dr. Kubica completed his 

undergraduate degree in biology at James Madison University in Virginia. Next,  he  pursued  his  graduate  training  at  The  Pennsylvania  State University,  first  at  the  University  Park  main  campus  and  then  at  the College of Medicine in Hershey. Dr. Kubica then joined the Department of Cell Biology at Harvard Medical School where  the  focus of his  research program is on the reciprocal relationship between the mammalian target 

10  

of  rapamycin  complex  1  and  cell  signaling  pathway  and microRNAs  in models of human cancer. Dr. Kubica has co‐founded several organizations related to microRNA research including the New England RNA Data Club ‐‐  the  mission  of  which  is  to  allow  for  the  dissemination  of  recent developments  in  RNA  biology  and  facilitate  interactions  between academia and  industry  scientists  in  the  field. More  recently, Dr. Kubica co‐founded  the  miRNA  Screeners  Consortium,  a  group  of  academic laboratories  and  industry  partners,  which  has  established  high throughput miRNA  functional  screening  capabilities  at Harvard Medical School. 

   Welcome, Dr. Kubica.  Dr. Neil Kubica:  Thank  you  very  much,  Sean.  I’d  like  to  thank  Science  AAAS  and  our 

sponsor,  Exiqon  for  giving  us  the  opportunity  to  speak  about  our microRNA research programs. 

   Kai set me up very nicely and introduced the concept of high throughput 

microRNA  functional  screening,  and  that’s  what  I’ll  be  talking  about today. 

Slide 37   So,  I’m  actually  a  postdoctoral  fellow  in  John  Blenis’  Laboratory  at 

Harvard Medical  School.  In  the  Blenis  Lab, what we’re  interested  in  is understanding  how  oncogenic  cell  signaling  pathways  contribute  to malignancy. And the question that we want to answer with our screening is can microRNAs repress oncogenic cell signaling? 

   We can imagine at least two ways in which this might happen. First, you 

can  imagine  transfecting  a  microRNA  mimic  or  a  microRNA  gain‐of‐function  reagent  that  targets  positive  regulators  of  the  pathway, repressing  their expression, and  shutting  the pathway off. You can also imagine  a  scenario  in which  a microRNA  that’s highly expressed  in  the tumor  cell  is  targeting  negative  regulators  of  the  pathway.  So,  if  we inhibit  this microRNA,  again,  the  end  result would  be  a  repression  in tumorigenic signaling. 

Slide 38   We thought a functional screen would be a good way to identify some of 

these  candidates,  but  the  only  problem was  that we  didn’t  have  local access to these libraries. We didn’t know which libraries worked the best. And to purchase many of the libraries is quite expensive for an individual laboratory. 

   So,  to  overcome  some  of  these  barriers,  we  worked  with  our  local 

screening  facility,  The  Institute  of  Chemistry  and  Cell  Biology  at 

11  

Longwood,  or  the  ICCB‐L.  So,  the  ICCB‐L  does  small  molecule  siRNA screening  that  facilitated  many  high  throughput  genome‐wide  siRNA screens  both  for  members  of  the  Harvard  community  and  external laboratories. 

   So,  working  with  the  ICCB‐L  and  the  director  Caroline  Shamu,  we 

assembled  the  microRNA  Screeners  Consortium.  So,  the  ICCB  is  the central  player  here  providing  the  infrastructure  and  expertise  for screening,  but we  also  have  seven  independent  academic  laboratories. Each of these labs has their own biological interests, but we all share the common desire to screen microRNA gain‐of‐function and loss‐of‐function libraries. 

   So, as a group, we did a shared purchase of these  libraries, which made 

the  barrier  for  entry  low  for  every  individual  lab  relative  to  a  lab purchasing all of these libraries by themselves. 

[0:24:59] Slide 39   So,  we’re  currently  evaluating  several  libraries. We  have  two  gain‐of‐

function  libraries, one from Ambion and one from Qiagen. And we have two  loss‐of‐function  libraries,  one  from  our  sponsor  Exiqon  and  one that’s also  from Qiagen. All of these  libraries are based on the miRBase Release  13  that  came  out  in March  of  2009.  So, we’re  pretty  current; although, the database moves quickly. [Laughs] 

Slide 40   So, now that we had access to the libraries, we had to think about how to 

optimize our screen. And  I’ve  just  listed  in this slide a number of things that you might want to consider  in your optimization process and things that we considered in ours. 

   Because of the time constraints today, I’m only going to talk about a few 

of these things. And the first one  I’d  like to talk about  is assay endpoint validation. So, you may have an assay that works well for your biological question  of  interest,  but  you  really  need  to  scale  that  down  into  the screening platform,  in our case 384‐well plates, that performs the same way.  So,  I’ll  show  data  in  a  moment  where  we’ve  used  a  well‐characterized  small  molecule  inhibitor  of  our  pathway  of  interest  to validate our assay. 

   Secondly, to screen microRNA  libraries, we need to be able to transfect 

these  reagents  into  the cells. And so,  I’m going  to  talk a  little bit about transfection  reagent  optimization,  and  I’ll  show  you  some  data. We’ve used a panel of  ten  lipid and amine based  transfection  reagents  to  see what works best  in our cell  line. And,  I think, the main take‐home point 

12  

here  is  that  every  cell  line  is different  and  you  really have  to optimize both the endpoint assay and the transfection in your cell line of interest. 

   This  also  goes  for  the  selection  of  appropriate  positive  controls  and 

negative controls. I’m going to focus on positive controls on my talk today because we ran into a problem when we screened because there weren’t any known microRNAs  that affected  the pathway. And so,  to overcome this problem, what we did was we used siRNA reagents as surrogates for microRNA reagents  in our  library. And we think this  is a very reasonable strategy because  these  reagents have many similar properties  including their size and their chemical charge properties, etc. 

   Finally,  I’ll  show  you  some  data  where  we’ve  integrated  all  of  these 

optimization parameters and screened a couple of the plates from one of our libraries. 

Slide 41   Okay. So,  this  is a  typical workflow  for  that assay validation experiment 

that  I  referred  to  in  the  last  slide where we’ve  used  a  small molecule inhibitor of our pathway. So, typically, the way this works is we plate cells in  a  384‐well  plate  using  a  liquid  handling  robot  available  to  us  in  the ICCB‐L. We allowed the cells to bind to the plate overnight and then we treat them with either a vehicle control or this drug inhibitor that I have referred  to before. We  then  fixed, permeabilized, and blocked  the cells three hours after drug  treatment, and  this  is very  similar  to a  standard immunofluorescence assay except that  it occurs  in a 384‐well plate. We then  incubate with  a phospho‐specific primary  antibody  that  is  a bona fide biomarker of our pathway of interest. We incubate overnight with a primary  antibody  and  then  we  stain  with  an  Alexa‐488  fluorescently labeled  secondary  antibody.  In  the  final  wash  steps,  we  also counterstained the DNA with propidium iodide, and then we imaged and quantified the plates using the Acumen eX3 Microplate Cytometer  from TTP LabTech. 

Slide 42   Okay.  So,  this  is  an  example  of  the  results  of  these  experiments.  And 

what  the  Acumen  does  is  it  scans  the  entire  well.  And  then  using  a predetermined threshold, it scores each of the cells as active or inactive. So, the pseudocolor in green and the vehicle, well you can see a lot of the cells are active. And when we treat with a drug, you can see the cells  in red  and  those  are  below  the  threshold,  they’re  inactive. We  can  then express this is a percent of the number of cells in the well active and get a single value for each well. 

   Okay. So I’ve shown a heat map on the bottom left and a scatter plot on 

the  right.  And  what  we  did  to  validate  our  assay  was  calculate  a  Z 

13  

statistic. And so, this considers the difference in the mean between your positive  and  negative  control,  and  also  the  standard  deviations within those observations. 

   So,  for  those who are unfamiliar, a value of 1 would be a  theoretically 

perfect assay. And usually, something that has a value greater than 0.5 is used in high throughput screening and indicates a robust endpoint assay. 

   So, we’re  doing  pretty well  here with  our  small molecule, what  about 

with our siRNA and microRNA reagents? Slide 43   So, here the protocol is just a little different. We’ve performed a reverse 

transfection  of  the  cells.  Meaning  that  we  make  our  transfection complexes, put them into the 384‐well plates and then plate the cells on top  of  that  transfection  mix  so  that  the  siRNA  or  microRNA  reagent enters  the  cell. We  typically  change  out  the media  24  hours  later  to reduce  toxicity.  And  then,  typically  72  hours  after  transfection,  we perform our endpoint assay just as I have described it to you before. 

   So, what  I’m going to show you  is using this workflow, we have decided 

which lipid or amine transfection reagent works best for us by looking at a panel of 10 potential reagents. And  in these experiments, we’ve used, as  I  said,  an  siRNA  positive  control  that  knocks  down  the  kinase immediately upstream of our biomarker of interest. 

Slide 44   Okay. So, the first thing we wanted to look at was transfection efficiency 

and  there are many different ways  to  look at efficiency of  transfection. But  ultimately,  what  we  care  about  is  a  detectable  change  in  our endpoint assay of interest. So, I’m showing on the left‐hand, a graph, the percent  active  value  from  the  Acumen.  So,  as  this  goes  down,  our pathway  is  being  shut  off.  And  we  compared  a  non‐targeting  control negative  siRNA  to  the  positive  siRNA  control  that  I  described  to  you before. And I think what you can see right away is that the reagent 1 and reagent  2,  as  I’ve  listed  them  here  on  the  x  axis,  give  us  the  best knockdown in terms of turning off of our pathway of interest. 

 [0:30:16]   In  addition  to  looking  at  efficiency, we  also wanted  to  look  at  reagent 

toxicity. And even though reagent 2 gives us the best knockdown, we also see  that  it causes a great reduction  in cell viability on  the graph on  the right.  So,  here,  we’re  looking  at  cell  number.  We’re  looking  at  an untransfected versus a mock transfected well. So, reagent 2 is quite toxic and  so we  eliminated  that  from  further  consideration.  But  reagent  1, which  also  had  a  good  efficiency,  also  resulted  in  no  discernible  cell 

14  

toxicity and so we selected that for our screen and that just happened to be Lipofectamine RNAiMAX from Invitrogen. For your cell line of interest, you’ll have to see what works best for you. 

Slide 45   So,  next we wanted  to  consider  our  siRNA  positive  control  a  little  bit 

more  even  though  it was  a  nice  rational  strategy  to  knock  down  that kinase that was  immediately upstream of our biomarker. We wanted to ensure  that  that  was  the  best  out  of  a  large  number  of  potential possibilities.  And  so,  one  really  nice  thing  about  the  pathway  driven approach is we know many things about this pathway. 

   And  so, what  I’m  showing  here  is  non‐targeting  controls  and  negative 

versus  21  potential  positive  controls  targeting  knockdown  of  positive players  in the pathway. So, you can see that treatment P and U give us the  best  knockdown  both  in  serum‐containing  and  serum‐starved conditions. 

   Next, we went  on  to  do  a  follow‐up  experiment where we  played  at 

various  densities  of  cells  and  used  siRNA  treatment  U  alone,  siRNA treatment P alone, or  the combination of  those  reagents and created a matrix of Z  scores. And what we’ve  selected  is a plating density of 800 cells  per well.  And we’re  going  to  use  the  treatment  U, which  is  our immediate  upstream  kinase,  and  also  the  combination  of  the  two reagents as our positive controls on the plate. And you can see that very similar  to when we  used  the  small molecule  inhibitor, we’re  getting  Z scores  in  the  high  0.7  to  low  0.8  range, which  indicate  a  very  robust assay. 

Slide 46   So,  now  we’re  going  to  put  all  of  those  parameters  together  and  I 

thought it might be useful to show you how we lay out our library plates. The  first  thing you’ll notice  is  that  the outer  two rows and columns are completely  empty,  and  this  is  to  avoid  the  very  well  described  edge effects  that we  often  see  in  high  throughput  functional  screening.  The microRNA library elements that are in each library are in yellow here and in  columns  11  through  14,  we  show  our  various  siRNA  or  microRNA negative and positive controls. 

   And you see that we have an N of eight. So, we have a  lot of replication 

for our controls on these plates. And we can get away with that because there aren’t  so many microRNAs  relative  to  say a whole genome  siRNA screen. So, we have a lot of room on these plates. 

   So, we can screen an entire library in five 384‐well plates and with three 

libraries, we  can  do  that  in  triplicate  and  two  conditions, which we’re 

15  

going to use  in about 90 384‐well plates. And that’ll take us about eight weeks of screening, it’s not too bad. 

Slide 47   Okay. So, these are the real results from the first two library plates from 

one  of  our  gain‐of‐function  libraries. What  you  can  see  is  our  percent active ‐‐ the average percent active between the triplicates on the y axis. And you can see the plates and the well positions on the x axis. 

   So, in the dark blue, you have the non‐targeting siRNa. In the yellow, you 

have the mimic negative control. It doesn’t affect the assay very much. In red,  you  have  our  siRNA  positive  controls.  They  really  inhibit  the pathway. And in light blue, you see the various microRNA elements. And we’re  really  encouraged  in  this  first  run  to  see  that  there  are  four reagents here  that  give us  almost  as penetrant of  a  knockdown of  the pathway as our positive controls. So, it’s a good sign for the future. 

Slide 48   So,  just quickly, take‐home messages.  I think the Consortium Model  is a 

really  useful  one  for  academic  laboratories  to  gain  access  to  these reagents,  sharing  cost  and  expertise.  I’ve  given  you  a  couple  of optimization parameters  that you might want  to consider  for your own assays.  And  finally,  if  you’re  already  up  and  running  doing  high throughput siRNA screening, it’s a pretty easy transition to microRNAs. 

Slide 49   So,  just  very  quickly,  I  want  to  thank  my  mentor  John  Blenis  for 

supporting  these  projects, Greg Hoffman,  our  post  doc  in  the  lab,  and Janie  Zhang,  a  very  talented  undergraduate  student  from  Harvard University who  helped me  execute  the  projects.  Caroline  Shamu  who helped  assemble  the  microRNA  Screeners  Consortium.  Sean  Johnston who  did  all  the  library  reformatting  and  really  helps  us  with  every transfection. So, thanks to Sean and all of our industry partners. I want to point out Ben Schenker particularly because we actually don’t have  the Acumen instrument locally and Ben’s been a saint in letting us come and use his instrument over in Cambridge. So, thanks to him. 

   And that’s going to be all. Thanks, Sean.  Sean Sanders:  Great.  Thanks  Dr.  Kubica.  And  thank  you  all  for  the  excellent 

presentations. Slide 50   And we’re now going to move on to the Q&A portion of the webinar. Just 

a  reminder  to  everyone  that  you  can  submit  your  questions  by  simply typing them into the ask‐a‐question box and clicking the submit button. 

 

16  

  So,  our  first  question  ‐‐  actually,  I  had  one  all  lined  up  and Dr. Wang answered it for me so… 

 [Laughter]   So, I’m going to go on to the next one. I’ve actually had a lot of questions 

about  RNA  isolation  so  I’m  going  to  put  this  out  to  you.  One  of  the questions asked,  in your experience what  is the best total RNA  isolation method  or  protocol  for  retaining  the  small  RNA  fraction  and  also  for obtaining high  levels of purity  (without organic contamination). So, why don’t we start with Dr. Kubica at the end. 

[0:35:07] Dr. Neil Kubica:  Yeah, sure. Well,  I can  tell you what we use. There are obviously many 

available  strategies  on  the  market  and  I  think  many  of  them  are successful.  So,  there’s  no magic  here. We  use  Ambion’s mirVna  RNA isolation kit.  It does have a phenol step, but then there’s a column that we clean samples over, and we think it results in relatively high purity. 

   I think no matter what method you use, what you want to consider most 

carefully is that you’re actually precipitating a small RNA fraction. So, one thing that people may not be aware of is that using kind of a traditional, say TRIzol or phenol‐chloroform extraction, you’re typically using like 70% ethanol  concentration. And  those  ethanol  concentrations  are  great  for miRNAs and  larger RNAs, but  they  lose a  lot of  the  small RNA  fraction. And so, the solution is just to increase the concentration of ethanol to say 80%  or  more  percent  and  then  you  really  get  very  efficacious precipitation of  the  small RNAs. And you  can  see  that by  running a 1% agarose gel or some other QC tool. 

 Sean Sanders:  Great. Dr. Wang?  Dr. Kai Wang:  I  just  want  to  call  on  Neil’s  comment.  Most  of  the  commercial  kits 

actually works very well. The key  is  just follow the protocol. Don’t make any shortcuts. 

 [Laughter]  Sean Sanders:  Okay. Dr. Nelson?  Dr. Peter Nelson:  We’d looked at this in the brain comparing a number of different kits in a 

paper we  published  in  BBA  a  couple  of  years  ago. And we  found  that there actually were differences  that were  surprising  to us between  the different  kits  and  the  different methods.  And  the  one  that was most reproducible and  the one  that  seemed  to most correlate with  the  total 

17  

RNA was  the  TRIzol  LS  kit.  That was  the  one  that worked  best  in  our hands. 

   And  the  extra,  when  we  did  an  extra  overnight  freezing  ‘cause  we 

thought  that  that would  actually  enrich  our  ‐‐  there was  a mild  slight increased  yield  for  the  small RNAs,  but  it wasn’t  that much. But  it  did seem that there was one better and the one that was better in our hands was the TRIzol LS kit. 

 Dr. Neil Kubica:  I mean,  I  think  one  theme we’ll  see  in  a  lot  of  the  answers  to  these 

questions  is that you need a solution that works  for your model system and there isn’t one answer out there. 

 Dr. Peter Nelson:  That’s right.  Dr. Neil Kubica:  So,  you  know,  Peter works with  the  brain,  I work with  tumor  cells  in 

culture and those are very different systems. And, you know, there may be very different requirements in terms of what you need to do. So, you need to optimize everything that you do. We’d  love to give you a magic bullet, but it doesn’t exist just like in other areas of research. 

 Dr. Peter Nelson:  But it would be great if more people published this type of technical data 

because there needs to be more out there to give people an idea of what is  ‐‐ and  these are  things  that  ‐‐ particularly  the negative data does not get published. But we need  to  see  those data.  I  think  as  a  field,  there needs  to  be more  acknowledgement  of  both  the  pitfalls,  but  also  just how these different technical kits and methods work. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Okay. So, another  technical question  then, asking  for  the best 

method for both in vivo and in vitro transfection using microRNAs.  Dr. Neil Kubica:  Yes. So, maybe  I talked the most about that. And, you know, again, the 

answer  is maybe painfully disappointing  to  some  in our  audience. But, you know, the answer  is that  just  like  in siRNA or transfecting a plasmid or  any  other  reagent,  really  you  need  to  optimize  for  your  cell  line  of interest. 

   And,  you  know,  we’ve  done  these  transfection  panels  like  the  one  I 

showed you for high throughput screening. And  if we  look at say a HeLa cell  versus  the  cells  we’re  working  in,  we  get  completely  different answers. And  so, you  really need  to optimize  for your particular model system of interest. 

 

18  

Dr. Peter Nelson:  And  the  in vivo  system,  I  think,  is a very open and  interesting question that has been not addressed very much. 

 Dr. Kai Wang:  Well, people can follow siRNA model and people did  in vivo experiment 

with  that.  But  I  don’t  know  how much  of  that  can  be  translated  into microRNA directly. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Kai Wang:  That’s  still  an  open  question.  People  did  microRNA  knockdown,  for 

instance 122 knockdown in vivo.  Sean Sanders:  Right.  Dr. Kai Wang:  But  that’s  a  particular  case,  because  that’s  liver  and  the  most  of 

microRNA goes into liver in that case.  Dr. Neil Kubica:  Yes. It seems like the liver is the best model for in vivo transfection now, 

but when you want to work in other areas it becomes more difficult. And maybe some viral approaches that have been used in the brain before for siRNA may  also  be  useful  in  addressing  other  tissue  types  besides  the liver. 

 Sean Sanders:  Okay.    This question has  just come  in. Can you please address  the problem of 

microRNA  knockdown  experiments  that we were  just  talking  about  in vitro where a whole “family” of microRNAs might potentially need to be knocked down  to  see  a phenotype. How  are  investigators best dealing with this? [Laughs] 

 Dr. Neil Kubica:  That’s a great question. I don’t know. I mean, my opinion is that we don’t 

really have the degree of sophistication to partition between some of the microRNA  families,  in  some  cases,  I  think.  In  certain  instances, we  do better  than  others.  But  the  more  similar  the  sequence  is,  the  more crossovers there are going to be between reagents. 

   And  so,  this  kind of brings up  an  interesting point because,  you  know, 

many people have viewed these families as functionally redundant and I think  that  that’s not always  the case. And a  lot more work needs  to be done in the field. So, I think you’re ‐‐ you have a great potential research project there. 

 [Laughter] 

19  

 [0:40:05] Dr. Peter Nelson:  But  these  issues  pertain  both  to  knocking  in  and  knocking  out.  And 

basically, I think, you have to bite the bullet and do all the controls with regard  to  both  in  terms making  ‐‐  putting  all  the  pair  logs  in.  Because you’d be surprised, they sometimes do very different things and you may expect given  the  canonical  things  that we  think about how  the binding occurs. 

   But  let me make a special point about  the  inhibitors.  In our hands,  I’ve 

seen a lot of papers come through and they rarely have a lot of controls with  the  inhibitors.  And  we’ve  done  a  lot  of  controls  with  inhibitors. We’ve used from different companies. And I can say that the things that inhibitors do are different than that which is currently known and they’re not as clean. And not only are they not as specific ‐‐ you’d mentioned the point of specificity. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Peter Nelson:  But they don’t actually work all that well. And so, that is something that, I 

think, needs to be acknowledged at some point. It’s not something that is sexy  to put  in your paper or your grant or anything else, but  it’s a very important point that the microRNA  inhibitors from our functional assays when we do  the reporter constructs are much more disappointing. And I’m  sure  that  there  are many  that work  great,  but  there  are  definitely some that just basically don’t do the work at hand so… 

 Dr. Neil Kubica:  We  had  the  same  exact  experience  that  Peter has  had.  The mimics  or 

gain‐a‐function  reagents  seem  to  give  very  clean  results.  And  the inhibitors  give  very  different  results  based  on  the  inhibitor  that  you’re using and it’s a much noisier, more variable assay. 

 Sean Sanders:  Great.    I have a couple of questions  for you Dr. Nelson. One  is you mentioned 

microRNAs are degraded. What  is the half‐life  in the cell and… Actually, we’ll stay with that one for the moment and  I’ll move  into the next one once you’ve answered. 

 Dr. Peter Nelson:  Okay.  This  is  a  question  that  is  essentially  important  to many  types  of 

research. And  it’s one  that  surprisingly  little has been done considering how  important  it  is both to the  life of a microRNA, but also the function of a microRNA. A  function of anything  is  very  closely  related  to how  it 

20  

gets  made,  yes.  How  it  works,  yes.  But  also,  how  and  when  it  gets degraded. 

   And  so  that  is  ‐‐  and  for  terms of microRNAs,  this has been extremely 

minimally  studied. There’s a  really nice  study  recently  in  this year  from Walter  Lukiw’s group. He’s one of  the people who’s done  some of  the mostly,  I  think,  important work  both  in Alzheimer’s  disease  and  in  the brain  in general with microRNAs. He’s down  in Louisiana. And he  found that  important  to  note  that  different microRNAs  degrade  at  different rates in the brain after death. And that is based upon his studies looking at different PMI intervals. 

   And so,  it’s one thing to say that they degrade at this time,  it’s another 

thing  to say, hey,  this one degrades at  this  time,  this one degrades  ‐‐  it takes  a  different  time. Maybe  it’s  different  compartments, maybe  it’s different pathways they’re  involved  in, and maybe  it’s different types of cells that are being degraded at different rates in the brain. But the point is  that  ‐‐  like many of  these other things,  I  think,  it’s a recurrent  theme here. [Laughs] So, we’re in early days and we don’t know. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Peter Nelson:  It’s worse though to act like you know when you don’t know.  Sean Sanders:  Right.  Dr. Peter Nelson:  And I think that it’s important to recognize that, you know, it may happen 

in different rates.  Dr. Kai Wang:  Yeah. But  that’s different on  live cell. You know,  live cell how  they  turn 

over we actually don’t know.  Dr. Peter Nelson:  That’s right.  Dr. Kai Wang:  Yeah.  Dr. Neil Kubica:  It’s  a  very  open  area,  I  think,  in  terms  of  turnover  and  degradation  of 

microRNAs and living cells, I agree.  Sean Sanders:  Okay. So, the other question for you Dr. Nelson was how do you establish 

the  causative  mechanisms  in  the  pathogenesis  of  Alzheimer’s  using microRNA profiling? 

 

21  

Dr. Peter Nelson:  The  causative mechanisms  of  Alzheimer’s  disease  are  something  that everybody has given a lot of thought to and we still don’t know what are. So,  I don’t know. The  first thing you can do though  is you can say what microRNAs  are  perturbed  and  what  cell  types  at  what  stages  of  the disease and what parts of  the brain.  ‘Cause all of  those  things are very important  in  terms of understanding  the disease pathogenesis. And  so, we’re  in  early  days  and  we’re  describing  the  microRNAs  that  are perturbed in the various stages of the degeneration of the cell, and then trying  to  develop  testable  hypotheses  to  say  how  can  you manipulate those  microRNAs  to  possibly  help  attenuate  the  development  of  the pathology. And, I think, we’re coming along a little bit in that way. 

 Sean Sanders:  Okay. Excellent.    Next question,  is  it possible  that  the  same microRNA  can  regulate  two 

different mRNAs having opposite  function, or microRNA  target genes  in related pathways having the same function? 

 Dr. Neil Kubica:  So, I’m not sure  if I completely understand the question, but, you know, 

certainly, when we’ve  done  things  like  in  silico  predictions  of  targets, which are of course we don’t know for sure whether those are bona fide targets  in our model system of  interest. That  requires experimentation. But often what we’ll see is genes within a particular cellular process, let’s say, cell proliferation, we’ll see some things that get knocked down that are  positive  regulators  of  that  process  and  some  that  are  negative regulators. And the way we view  it  is that the  important outcome  is the net balance of those things. 

[0:45:15]   And so, maybe you’re knocking down eight positive regulators and only 

two  negative  regulators,  so  the  net  outcome  of  that  process  could potentially be repression of the cell cycle. So, that’s kind of a very simple way to think and we need to go  in and  interrogate those types of  ideas with experimentation so… 

 Dr. Kai Wang:  Yeah, I agree. It is possible, we just don’t know. [Laughs]  Sean Sanders:  At this stage, anything is possible.  Dr. Neil Kubica:  Well,  so  it’s  difficult.  I  mean,  microRNAs  are  targeting,  you  know, 

hundreds  of  transcripts  and  so  there’s  a  kind  of  systems  level  analysis that  has  to  occur.  And,  I  think,  Kai  is working  on  a  lot  of  that  out  in Washington. So, there are a  lot of people thinking about  it. [Laughs] But it’s challenging. 

 

22  

Sean Sanders:  Okay.  Dr. Peter Nelson:  I mean, all that  it has to have  is one system where  it happens that way 

and clearly just in different systems, they’d behave in different ways.  Sean Sanders:  Yeah.  Dr. Peter Nelson:  There’s no single dogmatic way that a microRNA can work.  It has a very 

flexible  versatile  system  perfecting  not  just  translation  but  probably transcription and other processes of the cell. 

 Sean Sanders:  Okay.    The  next  question  comes  back  to  controls  that  we  were  just  talking 

about. For miRNA experimental controls, we find scrambled sequences or irrelevant  siRNAs  just  sometimes  have  unexpected  results.  Would mutating the seed region by a couple of bases be a good solution? Maybe we’ll start with ‐‐ 

 Dr. Neil Kubica:  I  think  Peter  has  done  the most work with making  controls  for  these 

assays.  [Laughter]  Dr. Peter Nelson:  I like your control.  Sean Sanders:  Dr. Wang?  Dr. Kai Wang:  Well, I think, we can look at this at several different levels. If you look at 

control at measurement, then there isn’t any good control. If you look at cells,  doing  PCR  or  array,  people  will  use  housekeeping  genes  for messenger  RNA  sometimes  even  for  microRNAs.  But  a  lot  of  the housekeeping gene actually changes in the experimental conditions. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Kai Wang:  People use small non‐coding RNA for control also, but those also change. 

So, on  the measurement  side,  it’s  very difficult. People will do  spiking. Spiking won’t control  the biology.  It only controls  the  isolation process. So, on the measurement side, there isn’t any good control for microRNA. 

   For a  functional  side, yes,  I presume  the question probably more deals 

with functional side, when you change the seed region, what will happen. Yes,  you  can  try  that.  But  remember,  when  you  compare  all  the 

23  

microRNA  sequences,  sometimes  the  seed  region  only  changed endogenously.  They  have  different microRNA  species.  They  show  very similar sequences, but the seed region is slightly different. 

   So, you might want to  look  into those and also  look at different species. 

Because  the  seed  region  actually  is  not  conserved,  it’s  throughout evolution. So, that might give you some clue. So,  in summary,  I actually don’t know what’s the best control for both measurement as well as the functional side of microRNA. 

 Dr. Peter Nelson:  I can sort of take that  just  from the perspective of  in situ hybridization. 

It’s very  important  to have  some controls when you’re doing an  in  situ labeling reaction. That is pretty well worked out how you can do that for antibodies, immunohistochemistry. It’s okay in terms of mRNA related in situ  hybridization,  but  it’s  very,  very  difficult  for  microRNA  in  situ hybridization to have control sequences.  If you have a negative control, that doesn’t necessarily indicate that your sequence is actually real. And it’s biologically important what you’re seeing. 

   And so, my strategy is to basically try to get as many positive controls for 

each tissue type that stain different known cellular groups  in that tissue type.  So,  for  example,  you  have  microRNA  that  looks  at  neurons, microRNA b  that  looks at glial cells, or whatever. So,  that now you can maybe use your microRNA c probe to see what it recognizes in the same conditions that works for the other ones. It’s an imperfect system. I don’t think  there’s  any  way  you  can  make  it  so  that  you  know  that  your particular  microRNA  probe  is  localized  specifically  and  only  to  your particular target. You can try all sorts of ways of blocking it and absorbing it,  you’re  still  not  going  to  get  to  that  answer when  the  rubber meets road in your hyb chamber. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.    A  question  here  asking  if  you  could  please  talk  a  little  bit more  about 

microRNA libraries, for example, production and content. Dr. Kubica?  [0:49:55] Dr. Neil Kubica:  Right. So, you know, one of the reasons why we’ve kind of waited to this 

stage  of  the  game  to  purchase  libraries.  And we  purchased  all  of  our libraries commercially, we didn’t not fabricate them ourselves; although, in  principle,  you  could  synthesize  the  sequences  and make  your  own library.  One  of  the  reasons  why  we  waited  is  because  microRNA identification has been a very rapidly moving  field over the past several years. I hope you guys would agree. 

24  

   But, you know, the number of microRNAs in the human system has gone 

from  just a couple of hundred up  to about a  thousand now. And we’re starting  to  see  with  each  subsequent  release  of  miRbase  kind  of diminishing returns in terms of the number of new microRNAs that we’re getting back. And  so, we’re kind of getting  to a point where not much strange  happens  that  is  unexpected.  We  think  we’ve  identified  the majority of the common microRNAs. And so, purchasing a  library at this point, you can,  I think, be pretty comfortable that you’re going to get a lot of  the  content  that’s out  there. You may miss  some  things  that are very cell type or developmentally specific, but by and large, you’re going to get a lot of the common microRNAs. 

   And  so,  if  you’re  thinking  about  investing  in  a  library,  and  it’s  an 

expensive  investment,  I  think,  now  the  field  is  getting  to  a  state  of maturity  where  you  can  start  to  feel  more  comfortable  with  that investment. 

 Sean Sanders:  Okay.   Dr. Peter Nelson:  I’ll say that ‐‐ interpret it in terms of the brain, especially mature brain. If 

you’re talking about a very focused embryological stage, you may want to get  your own  library. But  in  terms of  the brain,  if  you  just  look  at  the intensity of hybridization, starting with the early miRs  let‐7 and miR‐124 down  to  the  last,  you  know,  hundreds  and  hundreds,  there’s  a hundredfold average greater expression of the earlier cloned ones simply because  those  really  are  the  ones  that  are most  represented  in  those tissues. 

 Sean Sanders:  Okay.    The  next  question  is  about  normalization  of  microRNA  expression  in 

microRNA qPCR arrays. Another  tough one. Dr. Wang, do  you  like  to a stab? 

 Dr. Kai Wang:  Yeah. We’ve been  struggling on  this  issue  for  almost  two  years.  In  the 

beginning, we thought, just like many people think, that U6 or one of the snoR would be a good  control. And  it  turns out,  they actually  changed from experimental condition to experimental conditions. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  

25  

Dr. Kai Wang:  So, I said this earlier, I want to say it again. We actually don’t know what is  the best control  for any biological  system  that we encountered. That including  some  in  vivo  model  as  well  as  in  vitro  cell  works.  But nevertheless, I believe there are possible controls for this. 

   A  couple of  years  ago,  I  think,  just  two  years ago, Ambion published  a 

paper.  They  surveyed  a  whole  bunch  of  tissue  looking  at  microRNA expressions. And  they  identified a subset of microRNAs  showing  similar expression  profile  among  all  different  tissues  and  also  on  several different conditions. 

   So,  those  could  be  potential  candidates  for  internal  control.  But  that 

remain to be ‐‐ more work need to worked on that.  Sean Sanders:  Okay. Dr. Kubica, anything to add?  Dr. Neil Kubica:  Yeah. And now  I  just want  to  reiterate everything  that Kai  said.  I  think 

that’s right. I mean  in our experiments, we’re only  looking at a small set of cell lines and a small set of treatment conditions. And so, we can find small nucleolar RNAs  that  serve  as  good normalization  controls  in  that very specific model system. But I’ve seen a  lot of people who have tried to  do  things  comparing  different  cell  line  subtypes  or  different  tissue subtypes and  they  tried  to  find one unifying normalization control, and that’s an uphill battle. 

 Dr. Peter Nelson:  I think it’s always an uphill battle. I think, you could have plenty of ‐‐ you 

just shouldn’t get married to anything. [Laughs] U6, 5S no matter what it is, I don’t care ‐‐ I promise you that those microRNAs change under some circumstances.  It’s  not  biological  sense  to  have  something  that’s  just expressed at the same rate in all tissues. 

   And  it’s not my experience at all that’s the way  it works. You  just ‐‐ you 

have to use some things, but you have to go in with your eyes wide open because  there’s definitely going  to be  changes and  ‐‐  I mean you were talking  earlier...  Off  camera,  we  were  talking  about  how  cancer  cells frequently have a low or suppressed overall microRNA. And there has to be a way of figuring that out in the cellular level that there’s a generalized suppression. 

   On  the other hand,  I  think  it  is very powerful  to  just normalize,  to  just 

make  everything  be  a  total  and  then  just  say  that  something  is  now disproportionately expressed. I think it’s an important thing to know even though  you’re  ignoring  the  overall  expression  differences  that  had 

26  

happened. ‘Cause I think that those are both independently important to know. 

 Dr. Kai Wang:  Yeah. I just want to make one last comment. Normalization actually is not 

very  important  in  certain  experiments.  So,  you probably don’t need  to bog down with how am I going to normalize and so on. Because you can look  at  sample  as  a  whole  by  itself.  So,  you  can  compare  different microRNAs in that sample, within that sample. So, you have a ratio of, for instance, two different microRNAs. Then you compare the same ratio on a different sample. So, that actually provides you in itself internal control. So, look at ratio instead of looking at the levels among different samples. 

[0:55:27] Sean Sanders:  Great.    We are almost at the hour, but we’re going to go a  little bit over  ‘cause 

we started late. So, I have a couple more questions I’m going to throw at you.  There  are  several  target prediction  algorithms  for microRNAs  that have  ‐‐ with very  little overlap among  their  results. How  can we  find a reliable source of target prediction? Okay, who’s going to take that one? [Laughs] 

 Dr. Peter Nelson:  I’ll start that.  Sean Sanders:  Okay.  Dr. Peter Nelson:  I don’t  ‐‐ and you, we all have experience with this regard. But anytime 

you have three things that are telling you something different, there’s a certain obvious  fact  that  they’re wrong.  I mean, one or all of  them are somewhat wrong. There’s overlap, which is good. But I think that a lot of the  assumptions  that  have  been  underlying  these  computational methods  are  going  to  be massively  revised  over  the  next  decade.  So, people  at  this  time,  I  think, would  not  be well  served  to  be  slavishly dependent upon them. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Okay. Dr. Wang?  Dr. Kai Wang:  Well, we tried to attack this question – well, two years ago, we thought 

this should be something simple. And we actually constructed a website called  miRPortal.  So,  if  you’re  interested,  you  can  take  a  look.  We combined different algorithms, tried to find common, trying to find union of all these prediction. But at the end, we basically gave up because there are so many inconsistency as the person mentioned. 

 

27  

  And also,  it’s very difficult because  if you  look at how many  targets we can predict, some of them, you have a couple of thousand and some of them you have zero. So, how to  justify that, we don’t know. And  if you are going to experiment, validate how it is, it is almost impossible. So, we basically gave up at this point on that. 

 Dr. Neil Kubica:  Yeah,  it’s very challenging.  I mean the one paper  I would ‐‐  is coming to 

my  mind  was  in  Nature  and  it  was  a  collaboration  between  Steve Gygi’sLab  from  our  department  and  Dave  Bartel’s  Lab  from  the Whitehead  Institute.  And  what  they  did  was  perform  a  proteomics approach  to  look  at  targeting  at  the  protein  level  and  then  they compared  that  back  to  the  predictions  that  came  out  of  these  various algorithms. And perhaps not surprisingly, although, certainly  the data  is real, TargetScan, which  is  the Bartel method, holds up quite well as do some of the other target prediction methodologies. 

   So,  I think,  there are kind of variability  in the quality of the output that 

you get from different algorithms, but no algorithm is perfect. And one of the things that Peter and I were talking about before the webinar is that there is a new paper that came out also from the Bartel Lab that showed in tumor cells for example, that you often have shortening of the 3’ UTR. And  so, even  though  the computer  is  spitting out  this predicted  target, that may not be experimentally relevant anymore in your model system. And so, we always think about target prediction as a tool that always has to be iterated with experimentation. 

 Dr. Peter Nelson:  I would  say  that  those  things worked with  the  proteomics  and  at  the 

miRNA  level,  but  there’s  ‐‐  certainly  30%  or  40%  of  the  variability  is explained by  this sort of dogma. And so, any dogma  that’s 30%  to 40% right, you naturally think also about what’s that 60% or 70% that’s off the camera. 

 Dr. Neil Kubica:  I totally agree. I mean even in the best case scenarios, we’re getting right 

20% to 30% agreement. And so,  it says that we’re not doing very good, yet. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Peter Nelson:  That’s not to say that they’re not good and valuable and  important.  It’s 

just  that  we  can’t  hang  our  hat  in  papers  that  solely  go  on  the computational method ‐‐ at this point are not state of the art. 

 

28  

Dr. Neil Kubica:  I think that we can’t stop thinking because there’s a tool available on the web to spit out some targets for us. We need to always be thinking about our experiments. 

 Sean Sanders:  Okay. Great.    So, we’re almost out of time, but briefly if I could ask you each where you 

think the future of microRNA research is headed. Maybe, you know, your favorite area, but where do  you  think  it’s going  in  the next  five  to  ten years? So, let’s start at the end with Dr. Kubica. 

 Dr. Neil Kubica:  Sure, start with me.  [Laughter]    That’s a big question, Sean. But actually, I think that ‐‐ the point that I’d 

like  to  emphasize, which  has  been  emphasized  throughout  the  entire webinar,  is  that  this  field  is  really  in  its  infancy.  I mean, we’re only  less than really a decade of a lot of research being put into this area. And so, I think that future is that there’s going to be a lot of surprises and there’s going to be a lot of changes in what we think of as the dogma, and Peter has pointed  it out a number of  times. You know,  I  think  that  this goes back to what we’re saying, as always be thinking. If you are a post doc or a graduate student out there, or a PI who’s moving  into this area, think about something outside of  the dogma. A  lot of people are working on kind of what  is obvious to be predicted, but there’s a  lot to  learn  in the area and I think the future will be a big surprise. [Laughs] 

 Sean Sanders:  Yeah. Dr. Wang?  Dr. Kai Wang:  Well,  I  think,  we  probably  will  see  three  different  things  happen  to 

microRNA. Of course,  I’m probably old around this. One  is you probably will see microRNA play a very  important role  in cell‐cell communication. So,  not  just within  the  cell,  it’s  between  cells.  Second  is  you will  see microRNA actually play a very important role in diagnostic, replace some of  the  current protein based diagnostic. Third  is you will  see microRNA become therapeutic targets or become therapeutic itself. So, that’s three things I envision you will have. 

 [1:00:31] Dr. Neil Kubica:  We hope so.  [Laughter]  

29  

Sean Sanders:  Dr. Nelson?  Dr. Peter Nelson:  So, I really agree with, I think, what are very trenchant points. Both of you 

‐‐ I think that they’re totally right around the money and you could stop right  there.  I  think,  that with  regard  to  the nervous system. The special geometric uniqueness of  the nervous  system,  I  think, will  lend  itself  to really interesting new possibilities in terms of localized translation control that will use non‐coding RNAs. And will expand our understanding of the machinery that we now associate with microRNAs working with a whole lot  of  other  different  types  of  non‐coding  RNAs,  in  the  context  of localized translational control in the nervous system. 

 Sean Sanders:  Yeah. Excellent.    Well, thank you all very much. And we’ve unfortunately reached the end 

of our broadcast once again. So, please join me in thanking our panelists for being with us today and for generously sharing their experience: Dr. Peter Nelson  from  the  University  of  Kentucky,  Dr.  Kai Wang  from  the Institute  for Systems Biology, and Dr. Neil Kubica  from Harvard Medical School. 

   Thank you also to our viewers for your questions that you submitted. As 

usual, there were significantly more than we could cover  in  just an hour so I’m sorry if we didn’t manage to answer yours. 

   Please go to the URL up in the bottom of your slide viewer now to learn 

more about products related to today’s discussion. And look out for more webinars  from  Science  available  at www.sciencemag.org/webinar.  This webinar will also be made available to view again as an on‐demand video within approximately 48 hours from now. 

   Please  share  your  thoughts  about  the webinar with  us  at  any  time  by 

sending  an  email  to  the  address  now  up  in  your  slide  viewer, webinar@aaas.org. 

   Again,  thank  you  to  our  panel  and  thank  you  to  Exiqon  for  their  kind 

sponsorship of today’s educational seminar. Thank you.    Great. Thank you very much.  Dr. Kai Wang:  Thank you.  Sean Sanders:  Thank you.  

30  

Dr. Neil Kubica:   Thanks, Sean.  [1:02:26]  End of Audio