the in vitro choice d ramos-2013
Upload: la-unidad-de-toxicologia-experimental-y-ecotoxicologia-utox-pcb
Post on 11-Jun-2015
163 views
TRANSCRIPT
[TOXin vitro] David Ramos Investigador CERETOX [email protected]
Jornada: The in vitro choice 29 de Noviembre de 2013
Parc Científic de Barcelona
REALIDAD
ACERCAMIENTO
IN SILICO
IN VITRO
IN VIVO
Perdida de información
HUMANOS
¿El modelo ideal?
¿Por qué In vitro?
1 Forma parte del avance tecnológico
2 Throughput (screening molecular)
3 Tiempo (días, semanas vs años)
4 Coste (- maquinaria + persona )
5 Menor gasto de molécula (µg vs g)
6 Moral/Ética (Refinamiento, reemplazo, reducción)
7 Obligaciones legales (pharma vs cosmética)
VALIDAN TÉCNICAS IN VITRO
Técnicas validadas
Toxicidad sistémica
Genotoxicidad
Reprotoxicidad
Carcinogénesis
Tolerancia local
OECD
ICCVAM
ECVAM
FDA
Toxicidad sistémica
Ensayo 3 Rs Mecanismo Endpoint Normativa
ACUTE SYSTEM TOXICITY
3T3 NRU - Acute oral Toxicity - Fixed Dose Procedure
Reducción, refinamiento Vibilidad celular Neutral red
uptake/IC50 ICCVAM
Normal human epidermal keratinocyte NHK - Acute oral Toxicity - Fixed Dose Procedure
Reducción, refinamiento Vibilidad celular Neutral red
uptake/IC50 ICCVAM
MTT Assay - Acute oral Toxicity Reducción, refinamiento Vibilidad celular MTT uptake/IC50 ECVAM 17
3T3 NRU Phototoxicity Test - Fototoxicidad
Reducción, refinamiento
Exposicion UVA - viabilidad
Neutral Red Uptake OECD 432
IC50
000 010 020 030 040 050 060 070 080 090 100
000 001 001 002 002 003 Ce
ll N
umbe
r (%
Via
ble)
Log Concentration (µM)
Compound 4
IC50 (µM) [LB, UB]
Compound 4 88.79 [76.12, 102.26]
Neutral red
MTT
Genotoxicidad
Ensayo 3 Rs Mecanismo Endpoint Normativa
GENOTOXICITY
Ames Test - Bacterial Reverse Mutation Test Reducción Mutagenicidad en
S. typhymurium Colonias revertintes
vs espontáneas. OECD 471
In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test Reducción Alternaciones
cromosómicas
Translocaciones y perdidas de cromosomas
OECD 473
In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test Reducción Mutagenicidad en
TK cell
Colonias mutantes en medio selectivo
vs colonias en medio no selectivo
OECD 476
MNT in vitro - In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test Reducción Alteración nuclear
post-mitosis MN generados en
celulas binculeadas OECD 487
DNA Single Strand Damage - Comet Assay Refinamiento Daño en el DNA,
electroforesis Tamaño cola Comet ASTM E2186
OTRAS
GENOTOXICITY
Ensayo 3 Rs Normativa In Vitro Sister Chromatid Exchange Assay in Mammalian Cells Reducción OECD 479
Saccharomyces cerevisiae, Gene Mutation Assay Reducción OECD 480
Saccharomyces cerevisiae, Mitotic Recombination Assay Reducción OECD 481
DNA Damage and Repair, Unscheduled DNA Synthesis in Mammalian Cells in vitro Reducción OECD 482
Escherichia coli, Reverse Assay Reducción OECD 472
Genotoxicidad
MN In vitro Ames Test Comet Assay Aberraciones cromosómicas
Ensayo 3 Rs Mecanismos Endpoint Directive
REPROTOX
EST Embryonic Stem Cell Test Reemplazo parcial Citotoxicidad
3T3/D3 + Gota pendiente D3
IC50 3T3, IC50 D3, ID50 ECVAM 113
MM Micromass Embryotoxicity Assay Refinamiento
Extremidades embriones +
citotoxicidad 5 dias + Alcian blue
IC50 para la inhibición y citotoxicidad
ECVAM 114
WEC Whole rat Embryo Embryotoxicity Test Refinamiento
Cultivo de embriones expuestos
IC50 ICMAX for malformations;
ICNOEC for Total Morphlogical score
ECVAM 123
FET Refinamiento Exposición embrión zebrafish
Alteraciones morfologicas embrion OECD 236
Toxicidad en la reproducción
EST Cultivo ES-D3 Día 0 Día 3-5 Día 10
MM Extracción miembros Tinción NR Tinción Alcian Blue
Test Method 3 Rs Mecanismo Endpoint Directive
CARCINOGÉNESIS CTA – Balb/c 3T3 Cell Transformation Assay Reemplazo
CFE citotoxicity + ½ Fase testado como inductor o
promotor
Focos Tipo III transformantes
OECD Draft 31 ECVAM
Recomendation
Carcinogénesis
CFE Citotoxicity Dia 46 estudio: contaje de focos Focos tipo III
Tolerancia local
Ensayo 3 Rs Mecanismo Endpoint OECD
SKIN CORROSION
In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Episkin, Epiderm)
Reemplazo Exposición producto sobre RHE Viabilidad por MTT OECD 431
CORROSITEX - In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion
Reemplazo Membrana sintética
Tiempo necesario para corroer membrana OECD 435
SKIN IRRITATION RHE Model Test (Episkin, Epiderm) Reemplazo Exposición producto
sobre RHE Viabilidad por MTT OECD 439
DERMAL PENETRATION
TESTING Skin absorption Refinamiento
Cámara Franz con fluido donador y
receptor % molécula recuperada OECD 428
HEMOLISIS Red Blood cell test Reemplazo Exposición de la
sustancia en eritrocitos aislados
Hemolisis 50% ECVAM 99
SENSIBILIZACIÓN LLNA /BrdU Refinamiento
Exposición en ratón, extracción nódulos
linfáticos
Cantidad de timidina tritiada recogida
OECD 429/442
hCLAT Reemplazo Exposición a células THP1
Detección de receptores CD86-54 Draft
Tolerancia local
Ensayo 3 Rs Mecanismo Endpoint Directiva
EYE IRRITATION
BCOP - Bovine Cornea Opacity Test Reemplazo parcial Exposición a corneas bovinas
Opacidad de la cornea TG 437
ICE - Isolated chicken eye test Reemplazo parcial Exposición a corneas
Opacidad y fluorescencia e hinchazón
TG 438
HET-CAM - Hen's egg test - chorio-allantoic membrane Reemplazo parcial
Huevos fertilizados post-10d
Hemorragia, lisis de los vasos, coagulación
ECVAM 047
Un futuro prometedor
Tenemos un mayor conocimiento de los mecanismos moleculares Estamos más cerca de sustituir el uso de animales Debemos avanzar hacia modelos que nos acerquen a la realidad Los ensayos in vitro representarán en un futuro próximo una parte muy importante en el desarrollo de un nuevo producto y en la fase regulatoria.
CERETOX Parc Científic de Barcelona - Edifici
Cluster c/Baldiri Reixac, 10-12
08028 Barcelona T. 93 403 71 83
www.pcb.ub.cat/ceretox [email protected]
http://goo.gl/VBsu7
http://goo.gl/BGLwt
En CERETOX tenemos una amplia experiencia en hacer
todas estas técnicas