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Influencia del regulador Fur2 en la osmoadaptación y la homeostasis del

hierro en la bacteria halófila Chromohalobacter salexigens

Conference Paper · June 2014

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System biology of the osmotress response of the broad salt growing bacterium Chromohalobacter salexigens: biotechnological applications View project

Metal tolerance in halophilic bacteria and archaea View project

Joaquin J Nieto

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icrobiología

olecular

X Reunión

Segovia

9‐11 de junio de 2014

  

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S3-12

Influencia del regulador Fur2 en la osmoadaptación y la homeostasis del hierro en la bacteria halófila Chromohalobacter

salexigens

Emilia Naranjo, Montserrat Argandoña, Joaquín J. Nieto y Carmen Vargas Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla eminaranjo@us.es Introducción: Chromohalobacter salexigens es una bacteria halófila moderada utilizada como modelo en estudios de osmoadaptación. Además produce ectoínas frente al estrés osmótico y térmico, por lo que posee un interés biotecnológico añadido. Se ha comprobado que la homeostasis del hierro en esta bacteria está directamente relacionada con su capacidad de adaptación al estrés osmótico y por lo tanto, con la síntesis de ectoinas, a través del regulador global Fur. En el genoma de C. salexigens se han encontrado dos parálogos pertenecientes a la superfamilia Fur, Fur1, descrito anteriormente como activador de los genes de síntesis de ectoínas (1), y un segundo regulador denominado Fur2, siendo éste objeto del presente estudio. Métodos: Caracterización molecular del regulador Fur2 mediante la obtención de un mutante fur2 y un doble mutante fur1fur2 y su posterior estudio fenotípico en diferentes condiciones de salinidad y concentración de hierro. Resultados: En este estudio, se ha comprobado que Fur1 y Fur2 intervienen tanto en la regulación de la homeostasis del hierro como en la osmoadaptación de C. salexigens, actuando como represores de la síntesis de sideróforos a baja salinidad y como activadores a elevada salinidad. Los resultados indican que su relevancia en ambos procesos es diferente, ya que Fur2 tiene un papel más importante en la regulación de la síntesis de sideróforos, y también que dicha relevancia es dependiente de la salinidad, ya que la pérdida de Fur1 afecta en mayor medida al crecimiento a baja salinidad. También se ha comprobado que ambos regulan la expresión de los genes de síntesis de ectoínas pero de forma diferente en función de la salinidad y/o de la presencia de hierro. Conclusiones: Tanto Fur1 como Fur2 intervienen en la regulación de la homeostasis del hierro y de la osmoadaptación pero de forma diferente en función de las condiciones, destacando el doble papel de ambos reguladores como activadores o inhibidores en función de las mismas. Referencias: (1) Argandoña y col., (2010). Appl. Environ. Microbiol. 76:3575-3589. Este estudio ha sido subvencionado por los proyectos BIO2011-22833 (Ministerio de Economía y Competitividad), Fondos FEDER y P11-CVI-7293 MO 724 (Junta de Andalucía).

  

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S3-13

El factor transcripcional Rim101 protege las células de Saccharomyces cerevisiae frente al estrés por selenito

Maria Pérez-Sampietro y Enrique Herrero Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de Lleida, Lleida mariaperez@cmb.udl.cat Introducción: Rim101, factor transcripcional de la familia PacC, regula la respuesta de células de levadura a estrés por pH alcalino, toxicidad por Na+ y Li+, entre otros. Dicho regulador actúa como represor de genes como NRG1 en estrés por pH alcalino y homeostasis del hierro [1]. La activación de Rim101 requiere la proteólisis de su dominio C-terminal por la proteasa Rim13 en colaboración con señalizadores como Rim8 o Rim20 [2]. Esta activación está conectada con las vesículas endocíticas con la participación de los complejos ESCRT-I, II y III [3]. En respuesta a pH alcalino, Rim101 regula la inducción de genes que, a la vez, están bajo control positivo por el factor Aft1 en déficit de hierro [4,5]. Aproximaciones genéticas mostraron interacciones entre la vía regulada por Rim101 y el regulón Aft1 [6]. Por otra parte, el selenio, en forma de selenito, es tóxico en levadura. Su detoxificación tiene lugar en la vacuola. Así, mutantes en subunidades de la ATPasa vacuolar son hipersensibles al selenito [7], señalando un rol esencial de la acidificación vacuolar en la detoxificación de dicho elemento. Estudios transcriptómicos revelaron la inducción de algunos genes del regulón Aft1 en condiciones de estrés por selenito [8]. Métodos: Análisis de la expresión génica por Northern blot, estudios fenotípicos mediante determinación de sensibilidad de crecimiento, inmunodetección de proteínas por Western blot y observación de la acidificación vacuolar mediante tinción con quinacrina. Resultados: La hipersensibilidad del mutante _aft1 al selenito es rescatada por la adición de hierro, fenotipo que no se observa en el caso del mutante _rim101, el cual también es sensible al agente. La deleción de NRG1 en un mutante _rim101 rescata la sensibilidad de este último al selenito. El complejo Rim8 y Rim13 participa en respuesta frente a selenito mediante la proteólisis de Rim101, aunque estas proteínas también tienen roles independientes de Rim101 frente al agente. La función aditiva también se observa cuando Rim101 protege a las células frente a estrés por NaCl. Aun así, ni el selenito ni tampoco el NaCl causan proteólisis adicional de Rim101 por encima de la constitutiva. Mutantes en componentes de los complejos ESCRT-0, I, II y III son hipersensibles a selenito, y la ausencia a la vez de Rim101 revela un fenotipo de sensibilidad adicional. Además, la supresión de NRG1 en el doble mutante _rim101_snf7 rescata parcialmente su sensibilidad al agente. También, la expresión constitutiva de Rim101 en mutantes en ESCRT-0 y I rescata parcialmente el fenotipo de sensibilidad. Finalmente, la acidificación vacuolar en un doble mutante _rim101_snf7 se restaura cuando Rim101 se expresa constitutivamente durante un tratamiento con selenito. Conclusiones: Rim101 protege frente a la toxicidad por selenito, involucrando componentes de la vía de respuesta frente pH alcalino. La maquinaria ESCRT también participa en dicha protección, de manera parcialmente independiente de Rim101 e implicando la funcionalidad vacuolar. Referencias: [1] Lamb, T.M., Mitchell, A.P. (2003) Mol. Cell. Biol. 23, 677-686. [2] Peñalva, M.A. et al. (2008) Trends Microbiol. 16, 291-300. [3] Subramanian, S. et al. (2012) Eukaryot. Cell 11, 1201-1209. [4] Viladevall, L. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 43614-43624. [5] Kaplan, C.D., Kaplan, J. (2009) Chem. Rev. 109, 4536-4552. [6] Berthelet, S. et al. (2010) Genetics 185, 1111-1128. [7] Mániková, D. et al. (2012) Chem. Res. Toxicol. 25, 1598-1608. [8] Salin, H. et al. (2008) BMC Genomics 9, 333.

  

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S3-14

Building up a high quality genome-based metabolic model to optimize ectoines production in Chromohalobacter salexigens

Francine Piubeli, Montserrat Argandoña, Manuel Salvador, Carmen Vargas y Joaquín J. Nieto Department of Microbiology y Parasitology, Faculty of Pharmacy, University of Sevilla, piubeli@us.es

Introduction: The broad salt-growing C. salexigens is a natural producer of ectoines, compatible solutes with promising biotechnological applications in biomedicine, molecular biology, dermopharmacy, etc. (1). However, the exploitation of this bacterium in industrial biotechnology requires a comprehensive understanding of its physiology and genetics. The availability of its genome sequence, and the development of high-throughput data, will allow us to gain this understanding at the systems level. Genome-scale metabolic models are constructed by using a combination of genome sequence- and detailed biochemical- information and they can be used for analyzing and simulating the behavior of metabolism in response to different stimuli, or to design rational metabolic engineering strategies to obtain improved strains. Additionally, genome-scale metabolic models provide a platform on which high-throughput computational analysis of metabolic networks can beperformed. In this work, we describe the development of an iterative process to build up a robust metabolic model of C. salexigens with a high prediction power. Methods: First, a robust core metabolic model was constructed including heat- and/or salinity- dependent central- and ectoine(s)- metabolic pathways (transport, synthesis and degradation) and other relevant pathways revealed from previous proteomics and metabolic analysis. These routes were manually refined, gaps were filled and new pathways or new associations of genes-enzymes-pathways not found in KEGG, EcoCyc or Pathway-tools, were included. Biomass component synthesis pathways were also incorporated and preliminary FBA analysis was performed to assure connectivity of the network. The second step was to scale-up this core model to a genome-based one by manual refinement of the most relevant pathways involved in stress-related metabolism. Results: This workflow allowed us to curate and re-annotate more than 250 wrong associated gene-reactions, included in a previous genome-based metabolic model, and to add more than 200 reactions not present in that metabolic reconstruction, resulting in a high quality genome-based metabolic model. Conclusions: The high quality genome-based metabolic model developed will be used for reliable prediction of improved ectoines production phenotypes. References: (1) Pastor et al. Biotechnol. Adv. 28: 782-821 (2010). Research co-financially supported by BIO2011-22833 (Ministerio de Economía y Competitividad) and P11-CVI-7293 MO (Junta de Andalucía) projects and FEDER grants.

  

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S3-15

Glutaredoxinas de retículo endoplasmático/Golgi de Saccharomyces cerevisiae: relación con la homeostasis del calcio

y la maquinaria de secreción proteica

Judit Puigpinós, Fernando Santamaría, Celia Casas y Enrique Herrero Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de Lleida, Lleida. juditpuigpinos@cmb.udl.cat Introducción: Grx6 i Grx7 son dos glutaredoxinas (GRXs) localizadas en los compartimentos de retículo endoplasmático (RE) y Golgi de la vía secretora1, responsables de la reducción de los puentes disulfuro mixtos entre el glutatión y las proteínas. En estos compartimentos tiene lugar el plegamiento y maduración de proteínas, un hecho estrechamente ligado al ambiente redox oxidante del RE, donde participan las proteínas esenciales Ero1 y Pdi12,3. En este contexto, la actividad de las GRXs podría contribuir a regular esa homeostasis redox. La alteración de la homeostasis del Ca2+ en la vía secretora es una de las principales causas del estrés de RE4. En presencia de este estrés, la célula induce la respuesta UPR (Unfolded Protein Response) y una vía de señalización que promueve la entrada de Ca2+ en el citosol a través del canal HACS de la membrana plasmática, activando proteínas como la calcineurina5. Ambas vías operan en paralelo para restablecer la homeostasis iónica y favorecer la supervivencia celular. Métodos: Métodos estándar para analizar el crecimiento de las células de levadura. Análisis de la expresión génica por Northern blot. Determinación de actividad β-galactosidasa. Determinación de los niveles de Ca2+ intracelular. Purificación de fracción vacuolar. Análisis del estado redox del RE a través de una sonda sensible a redox (GFP*). Análisis de la secreción proteica por pulso y caza. Resultados: El mutante ∆grx6 muestra una inducción constitutiva de la vía Crz1-calcineurina que se corresponde con un incremento de los niveles de Ca2+ citosólicos y con alteraciones en la sensibilidad frente a una deficiencia o exceso de Ca2+ extracelular. En condiciones de estrés, tanto la falta de GRX6 como de GRX7 provocan cambios en la inducción de la UPR. La ausencia de GRX6 o GRX7 contrarresta los fenotipos, tanto de defectos en el crecimiento como de secreción de la carboxipeptidasa Y (CPY), de un mutante condicional con bajos niveles de expresión de Ero1, como sucede en presencia del oxidante diamida, creando unas condiciones en el RE que compensan la ausencia de la oxidasa Ero1. La alteración del estado redox del RE hacia un ambiente más oxidante en ausencia de GRX6 o GRX7 se ha confirmado mediante una variante GFP* sensible al estado redox. Conclusiones: La ausencia de Grx6 causa una alteración de la homeostasis del Ca2+. La ausencia de Grx6 o Grx7 crea unas condiciones oxidantes en el RE que contrarresta parcialmente la deficiencia de Ero1. Referencias: 1) Izquierdo et al., (2008). Eukaryot Cell, 7:1415-1426. 2) Kim et al., (2012). J Cell Biol, 196:713-725. 3) Frand, A. R., i Kaiser, C. A. (1998). Mol Cell, 1:161-170. 4) Cunningham, K. W. (2011). Cell Calcium, 50:129-138. 5)Yoshimoto et al., (2002). J Biol Chem, 277:31079-31088.

  

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S3-16

La heterogeneidad fenotípica limita la eficacia del tratamiento con antibióticos

María Antonia Sánchez-Romero & Josep Casadesús Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, 41080, España  

mtsanchez@us.es La coevolución de las bacterias con compuestos naturales antibacterianos promueve la evolución de mecanismos de resistencia, tradicionalmente clasificados en tres tipos: resistencia innata, resistencia adquirida (por mutación o por transferencia horizontal) y resistencia adaptativa. Hemos estudiado los mecanismos de resistencia a tres antibióticos bactericidas con diferentes mecanismos de acción, kanamicina, ácido nalidíxico y rifampicina, en células de Salmonella enterica serovar Typhimurium (estirpe SL1344). Para ello, hemos seleccionado colonias resistentes a concentraciones letales del antibiótico y analizado la estabilidad del fenotipo resistente después de un crecimiento no-selectivo. Las colonias resistentes a rifampicina mostraron una resistencia estable, sugiriendo que el mecanismo implicado podría ser mutacional. Por el contrario, un porcentaje de colonias resistentes a kanamicina y ácido nalidíxico mostraron una resistencia reducida, sugiriendo que otro mecanismo, además del mutacional, habría contribuido a la supervivencia bacteriana bajo una selección letal. El análisis de células individuales mediante citometría de flujo revela heterogeneidad en la expresión del gen de la porina OmpC y proporciona evidencias de que una reducida expresión de ompC confiere resistencia adaptativa a kanamicina. En el caso de las colonias resistentes a ácido nalidíxico, las mutaciones en el gen gyrA estaban presentes en todos los aislados. Sin embargo, el inhibidor de bombas PAβN reduce el nivel de resistencia a ácido nalídixico de los mutantes, indicando que un flujo activo de salida de las bombas contribuye a aumentar la resistencia a este antibiótico. La actividad de las bombas era heterogénea y se encontró una correlación entre la alta actividad de las bombas y el aumento de la resistencia a ácido nalídixico. Tradicionalmente, la resistencia adaptativa implica cambios de expresión inducidos por respuestas a señales ambientales. Este estudio proporciona evidencias de que fluctuaciones en la expresión de células individuales y la actividad de ciertas funciones celulares críticas pueden inducir resistencia adaptativa en ausencia de estímulos ambientales conocidos. Las diferencias fisiológicas preadaptan a determinas células dentro de un cultivo isogénico a sobrevivir a una selección letal. Por lo tanto, la heterogeneidad fenotípica debería ser tenida en cuenta a la hora de definir los factores que limitan la eficacia del tratamiento con antibióticos.

  

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S3-17

Operones solapantes: un nuevo mecanismo de coordinación de la expresión de genes adyacentes.

Sonia Saenz, Nerea Bitarte, Begoña García, Maite Villanueva, Igor Ruiz de los Mozos, Alejandro Toledo-Arana, Iñigo Lasa Instituto de Agrobiotecnología. Universidad Pública de Navarra-Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Pamplona-31006, SPAIN  

sonia.saenz@unavarra.es En un estudio previo caracterizamos el transcriptoma de Staphylococcus aureus combinando las

técnicas de tilling arrays y de RNA-seq (1). Nuestro análisis reveló que el genoma de S. aureus se

transcribe desde ambas cadenas generando RNAs solapantes en más del 50% de los genes. Este

solapamiento de RNAs se produce por la presencia de RNAs antisentidos no codificantes que

hibridan con los mRNAs, pero además un alto porcentaje ocurre entre las regiones 5’ de mRNAs de

genes adyacentes que se transcriben de forma divergente, entre las regiones 3’ de mRNAs de

genes adyacentes que se transcriben convergentemente, y por la presencia de operones

solapantes. Este último caso corresponde a genes, que encontrándose en la mitad de un operón, se

transcriben en dirección contraria. En todas estas situaciones los RNAs solapantes generan RNAs

de cadena doble (dsRNA) que son digeridos por la actividad de la endoribonuclesa RNasa III, tanto

en S. aureus como en otras bacterias Gram-positivas (1). Un estudio reciente realizado en

Escherichia coli, ha confirmado la existencia de un proceso similar de digestión de RNAs solapantes

mediado por la misma RNasa (2). En base a estos resultados, nuestra hipótesis de trabajo es que

este mecanismo de digestión de RNAs solapantes tiene una función reguladora que permite

coordinar la expresión de los genes adyacentes. Para explorar esta hipótesis, hemos elegido como

modelo al operon SA_01912-SA_01913-menCE cuya expresión solapa con la del gen

SAOUHSC_01914. Para estudiar la posible función de esta arquitectura de transcripción, se han

construido una serie de mutantes en los que los promotores de ambos mRNAs han sido, o mutados,

o sustituidos por promotores constitutivos. El efecto que la ausencia o la sobreexpresión de uno de

los RNA solapantes tiene sobre el otro se ha analizado por Northern y Western-blots. Los resultados

demuestran que la sobreexpresión o la ausencia de uno de los transcritos es capaz de modular los

niveles del otro transcrito solapante, coordinando la expresión de los mismos. Este trabajo pone en

evidencia la importancia que tiene la organización génica en el cromosoma que permite crear

mecanismos de regulación post-transcripcional a través de genes adyacentes.

1.Lasa I, et al. (2011) Genome-wide antisense transcription drives mRNA processing in bacteria. PNAS 108: 20172–20177. 2. Lybecker M, et al (2014) The double-stranded transcriptome of Escherichia coli. PNAS 111: 3134–3139.

  

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S3-18

La proteína Hha: sola o acompañada?

Carla Solórzano, Sònia Paytubi, Cristina Madrid Departament de Microbiologia, Universitat de Barcelona  

carla.solorzano@gmail.com Introducción: Las proteínas de la familia Hha/YmoA regulan, junto con la proteína H-NS, la expresión de genes adquiridos horizontalmente en Enterobacterias. Estudios previos han determinado que el residuo D48 de la proteína Hha es fundamental para su interacción con H-NS y mutaciones sobre este residuo impiden la interacción entre ambas proteínas (1). Se ha determinado que la proteína Hha D48N se une a StpA, parálogo de H-NS, incluso con mayor afinidad que la proteína Hha. El empleo de un mutante en éste residuo (D48N) constituye una estrategia clave para determinar el grupo de genes que son regulados por la proteína Hha de manera independiente a su interacción con H-NS.

Métodos: Para este estudio se utilizó la cepa S. Typhimurium SV5015. Se han obtenido los mutantes hha, hhaD48N, stpA y hhaD48N stpA. Se han realizado estudios transcripcionales de las cinco cepas en cultivos en fase exponencial (OD600 0.6) y a 37ºC.

Resultados: Del conjunto de genes que presentaron distinta expresión en la cepa mutante hha respecto a la cepa salvaje, solo 126 fueron considerados como genes presuntamente regulados por Hha de manera independiente a H-NS o StpA. Este grupo se determinó considerando aquellos genes desregulados en el mutante hha respecto a la cepa salvaje, y no se vieron afectados en la cepa hhaD48N respecto la cepa salvaje. En este grupo se encuentran genes relacionados con la síntesis de sideróforos, la motilidad, y la formación de biofilm. Se ha determinado el fenotipo de las distintas cepas en relación a estas características. La cepa hha presenta una menor expresión de sideróforos, así como una capacidad muy disminuida de formar biofilm. Respecto a la motilidad, la mutación hha causa una disminución de la motilidad, que se complementa con el gen hha en trans, mientras que la recuperación del fenotipo es mucho menor cuando se complementa con el gen hhaD48N

Conclusiones: El conjunto de genes cuya expresión es regulada por la proteína Hha de forma independiente a H-NS incluye genes que participan en procesos básicos para la célula, así como genes asociados a la virulencia, lo que confirma la importancia de ésta proteína como regulador transcripcional.

Referencias:

(1) Fernández de Alba C, et al. (2011) FEBS Letters 585: 1765-1770.

  

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A study of the central carbon metabolism pathways of slow and fast growing brucellae

Amaia Zúñiga-Ripa, Thibault Barbier, Estrella Martínez-Gómez, Raquel Conde-Álvarez, María Jesús Grilló, Jean Jacques Letesson, Maite Iriarte and Ignacio Moriyón. Institute for Tropical Health and Microbiology Department; University of Navarra, Pamplona, Spain; Research Unit in Biology of Microorganisms – URBM, NARILIS, UNAmur, B-5000 Namur, Belgium; Instituto de Agrobiotecnología, CSIC-UPNA-Gobierno de Navarra, Pamplona, Spain.  

azuniga@unav.es Introducción: The brucellae are the agents of brucellosis, a worldwide-distributed zoonosis, that behave as facultative intracellular parasites able to adjust their metabolism to extra and intracellular environments. Brucella metabolism is imperfectly known and most work has been conducted with B. abortus and B. melitensis that, like most brucellae, grow slowly. B. microti and the closely related B. suis biovar 5 are fast growing, suggesting species differences in metabolic abilities.

Métodos: To analyze the glyoxylate and gluconeogenic pathways in fast and slow growing brucellae, we constructed non-polar mutants in key enzymes of B. abortus and B. suis 5. We tested the mutants in two minimal media (glutamate-lactate-glycerol and erythritol) and in a rich medium. Finally, we studied their multiplication in macrophages and/or mice.

Resultados: Disruption of the hypothetical isocitrate lyase in either strain had no effect suggesting that the glyoxylate cycle is not essential. In vitro, the B. suis 5 but not the B. abortus double Fbp-GlpX mutant grew under gluconeogenic conditions, suggesting a third fructose-1,6-bisphosphatase or an unknown gluconeogenic pathway. Fbp and GlpX were not essential in vivo even for B. abortus. With regards to phosphoenolpyruvate synthesis, there were differences in PckA between these strains but only PpdK was critical in both species in vivo. Although it is accepted that erythritol (a Brucella preferred carbon source) is converted into dihydroxyacetone-phosphate, the B. abortus double Fbp-GlpX mutant grew normally on this substrate. Finally, the B. abortus but not the B. suis 5 ppdK mutant was impaired on erythritol, suggesting that whereas B. suis 5 depends on Pyk to grow on erythritol, this enzyme may not be active in B. abortus.

Conclusiones: The results suggest that: (i), whereas the upper gluconeogenic steps and the glyoxylate cycle are not necessary in vivo, phosphoenolpyruvate synthesis is required; (ii), erythritol is metabolized directly through the pentose cycle rather than through the accepted pathway; and (iii), there is an evolutionary tendency towards reduction of metabolic activities from fast to slow growing brucellae, consistent with the hypothesis that fast growing brucellae are closer to the ancestor. Although B. abortus in commonly used, research focused on this species offers only a partial view of the metabolism of Brucella.

 

   

  

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S4-1

Study of the effect of the new tuberculosis vaccine candidate MTBVAC on bladder cancer cells

Samuel Álvarez-Arguedas, Carlos Martín, Nacho Aguiló Grupo de Genética de Micobacterias, Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Zaragoza, Spain salvarez@unizar.es

Introduction: The use of Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) as treatment of superficial bladder cancer is one of the most successful immunotherapy for cancer (1). In the development of a new vaccine candidate for replacing the actual BCG (2), we studied the effect of our genetically attenuated strain of Mycobacterium tuberculosis MTBVAC on the viability of bladder cancer cell lines. Methods: The T24, J82 (both from human) and MB49 (from mouse) bladder tumour cell lines (3) were cultured at different multiplicities of infection (MOI) with BCG Pasteur-GFP or MTBVAC-GFP (these strains express the GFP constitutively). Percentage of infection and cell death at different time points were measured by Flow Cytometry. Additionally, we studied the localization and the basic characteristics of the organelles that contain the BCG or MTBVAC by the use of Confocal microscopy. Results: The study of percentage of infection shows a very significant increase in the case of MTBVAC vaccine at 96 hours and 7 days in contrast of the low percentages in BCG Pasteur-GFP. Moreover, the study of cell death by Flow Cytometry is in accordance with the observed results of infection. Finally, we have obtained images in which MTBVAC-GFP shows clearly their localization in the acid compartments ofthe cell inside while the BCG Pasteur-GFP are in not acidic organelles in the inner of the cell. The number of bacilli of MTBVAC-GFP in the inner of the any cell line of bladder cancer is significantly higher than BCG Pasteur-GFP and the integrity of the cells is worse, mainly at 7 days of infection. Conclusions: We show that our vaccine candidate MTBVAC is a promising potentially alternative to BCG in treatment of bladder cancer. References: 1. Brandau S, Suttmann H. Thirty years of BCG immunotherapy for non-muscle invasive bladder cancer: a success story with room for improvement. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie. 2007;61(6):299-305. 2. Arbues A, Aguilo JI, Gonzalo-Asensio J, Marinova D, Uranga S, Puentes E, et al. Construction, characterization and preclinical evaluation of MTBVAC, the first live-attenuated M. tuberculosis-based vaccine to enter clinical trials. Vaccine. 2013;31(42):4867-73. 3. Secanella-Fandos S, Luquin M, Julian E. Connaught and Russian strains showed the highest direct antitumor effects of different Bacillus Calmette-Guerin substrains. The Journal of urology. 2013;189(2):711-8. * Samuel Álvarez-Arguedas es beneficiario de una beca predoctoral del Gobierno de Aragón (Referencia B023/13).

  

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S4-2

Genomic engineering for the generation of an attenuated enteropathogenic E. coli E2348/69 strain lacking all known

effectors of the type III secretion system

Massiel Cepeda and Luis Ángel Fernández Department of Microbial Biotechnology. Centro Nacional de Biotecnología, CNB-CSIC. Darwin 3, Campus UAM, Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain massiel.cepeda@cnb.csic.es

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is an enteric pathogen whose ability to cause disease in humans is linked with its capacity to deliver a set of bacterial effector proteins into host epithelia, subverting host-cell signaling pathways to promote infection. EPEC is endowed of an injection system to deliver these effector proteins called type III secretion system (T3SS). All genes necessary for the assembly of the T3SS are encoded in the Locus of Enterocyte Effacement (LEE). EPEC effector genes are spread around the chromosome of EPEC, 6 of them (espF,map, tir, espG, espH, espZ) are encoded in the LEE whereas 22 effectors are located outside the LEE, which are called non-LEE effector (Nle) genes [1, 2]. EPEC effector proteins frequently have multiple functions during infection, having the ability to act in redundant, synergic or antagonistic functions. Hence, to study the biological role of individual effectors in pathogenesis, it would be of interest to have an EPEC-derived bacterial strain with a functional T3SS devoid of all natural effectors. We have constructed a collection of suicide and thermo-sensitive vectors for the deletion of all known LEE and non-LEE effectors encoded in the genome of EPEC strain E2348/69. The deletion strategy is based on their integration by homologous recombination and the marker-less resolution of co-integrants after I-SceI digestion in vivo [3]. Using this strategy we have deleted all known effector genes found in the genome of EPEC testing in every step the functionality of the T3SS. This attenuated strain may also have application as a vaccine for EPEC infection.

References

1. Iguchi, A., et al., 2009. 191(1): p. 347-54. 2. Deng, W., et al., 2012. 11(9): p. 692-709. 3. Posfai, G., et al., 1999. 27(22): p. 4409-15.

  

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S4-2

Terapia fágica: el caso de la lisozima Cpl-7 y su poder bactericida

Díez-Martínez R., de Paz HD., Bustamante N., García E., Menéndez M., García P. Departamento de Microbiología Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Ramiro de Maeztu, Madrid / Departamento de Química-física Biológica, Instituto de Química-Física Rocasolano (CSIC), Madrid. rdiez@cib.csic.es Introducción: Streptococcus pneumoniae es uno de los principales patógenos causantes de enfermedades como neumonía, otitis o meningitis, entre otras, siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en niños y adultos en el mundo. La terapia fágica, es decir el uso de viriones o de sus productos fágicos, es hoy en día una importante alternativa para combatir bacterias multirresistentes a los antibióticos. Entre los productos fágicos más prometedores están las mureín-hidrolasas, reconocidas como agentes antibacterianos específicos cuando se añaden exógenamente. Estas enzimas se han denominado “enzibióticos”. En el sistema de neumococo, todas las mureín-hidrolasas (bacterianas y fágicas) descritas hasta la fecha dependen de la presencia de colina en la pared celular para su actividad exceptuando la lisozima Cpl-7, codificada por el bacteriófago Cp-7. Métodos: Se ha diseñado un nuevo gen sintético, denominado cpl-7S, que codifica una versión modificada en 15 aminoácidos del módulo de unión al sustrato. Las enzimas se han ensayado in vitro con paredes purificadas de neumococo o in vivo con bacterias resuspendidas en PBS pH 6.0, para evaluar su efecto bacteriolítico y bactericida. Además, se han utilizado embriones de pez cebra infectados con S. pneumoniae o Streptococcus pyogenes por inmersión en el medio E3. Resultados: Se ha mejorado la actividad bactericida de la lisozima Cpl-7 al introducir 15 mutaciones que han invertido el signo de la carga neta de la proteína (de ‒ 29.77 a ‒ 11.84). La variante sintética, Cpl-7S, presenta una gran capacidad bactericida (con 5 μg ml─1) no solo frente a S. pneumoniae (incluyendo cepas multirresistentes) sino frente a S. pyogenes y otros patógenos. Además, Cpl-7S resultó eficaz frente a bacterias Gram-negativas tales como Escherichia coli y Pseudomonas putida, en combinación con 0.01% de carvacrol (un aceite esencial). Por otra parte, se han validado estos resultados en un modelo de embriones de pez cebra infectados con S. pneumoniae o S. pyogenes. Así, una dosis única de 25 μg de Cpl-7S aumenta significativamente la tasa de supervivencia de dichos embriones, confirmando el efecto letal de Cpl-7S in vivo. Conclusiones: Los resultados apuntan una estrategia general para mejorar la actividad lítica de las mureínhidrolasas fágicas, cuando se añaden exógenamente, basada en modificar su carga neta y facilitar su interacción con el sustrato, es decir el peptidoglicano de la pared bacteriana. Referencias: [1] López R, García E (2004). Recent trends on the molecular biology of pneumococcal capsules, lytic enzymes, and bacteriophage. FEMS Microbiol. Rev. 28(5), 553–580. [2] Bustamante N, Campillo NE, García E, Gallego C, Pera B, Diakun GP, Sáiz JL, García P, Díaz JF, Menéndez M (2010). Cpl-7. a Lysozyme Encoded by a Pneumococcal Bacteriophage with a Novel Cell Wall-binding Motif. J Biol Chem. 285(43), 33184–33196 [3] Fischetti VA (2010). Bacteriophage endolysins: a novel anti-infective to control Gram-positive pathogens. Int J Med Microbiol. 300(6):357-62

  

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Enzibióticos a la carta: nuevas terapias contra las infecciones bacterianas

García-Fernández E.1, Díez-Martínez R.1, de Paz H.D.1, García G.2, Menéndez M.2, García P1. 1Departamento de Microbiología Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC) 2Departamento de Química-física Biológica, Instituto de Química-Física Rocasolano (CSIC) esthergf@cib.csic.es Introducción: Streptococcus pneumoniae constituye un importante patógeno humano causante de algunas infecciones invasivas (meningitis y sepsis) así como enfermedades que afectan al tracto respiratorio (otitis media, sinusitis y neumonía). El creciente aumento de cepas de S. pneumoniae resistentes a los tratamientos antibióticos clásicos ha propiciado el empleo en los últimos años de mureín-hidrolasas fágicas como “enzibióticos”para un tratamiento más eficaz contra esta bacteria (1).La lisozima Cpl-1, codificada por el bacteriófago Cp-1, es hasta la fecha el enzibiótico que ha demostrado presentar una mayor actividad bacteriolítica. Por otro lado, la lisozima Cpl-7 se caracteriza por presentar un dominio de unión a sustrato independiente de colina, lo que le permite reconocer un mayor rango de bacterias (2). Recientemente se ha demostrado que la variante Cpl-7S, con una menor carga negativa que Cpl-7, presenta una mayor actividad bactericida que su enzima parental (3). Métodos: Con el objetivo de obtener nuevos enzibióticos con una mayor actividad lítica, se sintetizaron genes codificantes de nuevas enzimas quiméricas a partir de la combinación de los tres elementos estructurales (módulo catalítico, linker y módulo de unión) de las lisozimas Cpl-1 y Cpl-7S. La actividad enzimática de estas nuevas proteínas se analizó tanto in vitro, sobre paredes de neumococo marcadas radiactivamente con 3H-colina, como in vivo, sobre cultivos de S. pneumoniae. Resultados:Los experimentos de lisis realizados sobre cultivos de la cepa de S. pneumoniae R6 demostraron que la actividad bactericida de las quimeras está estrechamente relacionada con la naturaleza del módulo de unión a sustrato que presenta. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que el efecto bactericida de Cpl-711 y Cpl-771, que presentan un dominio de unión a colina, es superior al observado con la proteína parental Cpl-1, siendo Cpl-711 la mejor enzima quimérica, provocando una reducción de 2-3 unidades logarítmicas en el número de células viables. Por el contrario, tanto Cpl-117S como Cpl-177S, ambas portadoras del dominio de unión a la pared celular de Cpl-7S, presentaron una peor actividad bactericida comparable a la de la proteína Cpl-7S. Conclusiones:La quimera Cpl-711, una combinación de diferentes módulos entre las proteínas Cpl-1 y Cpl-7S, es capaz de mejorar la actividad lítica de Cpl-1, constituyendo una prometedora alternativa para el tratamiento de las infecciones neumocócicas. Esto sugiere la posibilidad de sintetizar nuevas y potentes enzimas líticas de pared frente a una variedad de patógenos bacterianos. Referencias: (1). Hermoso, J.A., García, J.L., García P. (2007). Curr Opin Microbiol 10(5):461-72.; (2). Bustamante, N., Campillo, N.E., García, E., Gallego, C., Pera, B., Diakun, G.P., Sáiz, J.L., García, P., DíazJ.F., Menéndez, M. (2010) J Biol Chem 285(43):33184-96. (3). Díez-Martínez, R., de Paz, H.D., Bustamante, N., García, E., Menéndez, M., García, P. (2013). Antimicrob Agents Chemother 57(11):5355-65.

  

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Efecto del flavonoide de la cerveza Xanthohumol en el microorganismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae

V. Mascaraque, J.M. Rodríguez-Peña, J. Arroyo y C. Nombela. Cátedra Extraordinaria de Bebidas Fermentadas. Departamento de Microbiología, II. Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid (UCM) e Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS). La cerveza es una de las bebidas fermentadas más consumidas a lo largo de la historia de la humanidad. En los últimos tiempos, ha aumentado el interés general que existe por los beneficios del consumo moderado de la misma. El xanthohumol (XN) es el principal prenil-flavonoide presente en las glándulas de lupulina de la planta femenina del lúpulo, componente de la cerveza e importante suministro de compuestos fenólicos. El XN posee una gran variedad de propiedades farmacológicas, principalmente relacionadas con efectos quimiopreventivos, antioxidantes y antiinflamatorios. Sin embargo, poco se conoce del mecanismo regulatorio implicado en dichas acciones biológicas. Por ello, nuestro principal objetivo es estudiar el efecto del XN sobre la viabilidad celular y los cambios que tienen lugar en el patrón de expresión génica, en el microorganismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae. Estudios realizados con la cepa silvestre S. cerevisiae BY4741 muestran que el efecto del XN sobre la viabilidad celular depende de la concentración del compuesto, el tiempo de exposición y la complejidad del medio de cultivo. En paralelo, para caracterizar el efecto del XN en la modulación de la expresión génica, hemos analizado la respuesta transcripcional del genoma completo mediante microarrays de DNA y validado los resultados mediante RT-qPCR. Los genes expresados diferencialmente incluyen genes de respuesta a estrés, metabolismo, transporte, transducción de señales, tráfico intracelular, plegamiento y degradación de proteínas. En base a herramientas bioinformáticas, los factores de transcripción de respuesta a estrés, Msn2/4, y el principal factor de transcripción relacionado con la respuesta dependiente de Ca2+/calcineurina, Crz1, se han propuesto como factores que regulan un elevado porcentaje de los genes inducidos en presencia de XN. La comparación del perfil transcripcional de los mutantes crz1∆ y msn2∆msn4∆ con el de la cepa silvestre, en presencia de XN, indica que la activación transcripcional del 69% y 65% de los genes, es dependiente de Crz1 y Msn2/4, respectivamente. Es de resaltar, además, que el 50% del total de genes inducidos, depende tanto de Crz1 como de Msn2/4. La extrapolación de estos datos, a organismos superiores, permitirá un mayor conocimiento de los efectos del flavonoide de la cerveza Xanthohumol, sobre la salud humana.

  

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S4-5

Detección de RNA de Mycobacterium tuberculosis en una población con elevada prevalencia de malaria

Menéndez M.C., Julca N., Martínez-Serna A., Garrido C., Marín-García P., Aguado M.C., Puyet A., Bautista J.M., De Mendoza C., García M.J., Díez A. Universidad Autónoma de Madrid. Universidad Complutense de Madrid. Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón. Hospital Puerta de Hierro, Majadahonda. Madrid, España carmen.menendez@uam.es, adiez@ucm.es

Introducción: La coinfección por varios patógenos en un mismo paciente puede ser relevante para determinar el curso clínico del proceso infeccioso. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es, junto a Plasmodium y Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), uno de los tres patógenos de relevancia mundial ligado a la pobreza (1). Su asociación con VIH está bastante documentada, pero la correspondiente con Plasmodium ha sido escasamente estudiada. Este trabajo tiene como objetivo determinar el nivel de detección de Mtb viable en una población con alta endemia de Plasmodium, así como evaluar la presencia de co-infección. Métodos: Las muestras (sueros y sangre fijada en filtro) fueron recolectadas de pacientes que acudian al Hospital de Asikuma (Ghana). El aislamiento de los ácidos nucleicos se realizó a partir de sangre. Mycobacterium y Plasmodium se detectaron mediante PCR en tiempo real (2), en el primer caso tanto DNA como RNA y en el segundo caso únicamente DNA (1). Las dianas se seleccionaron para detectar de forma específica el estado metabólico de la bacteria (2). Mediante ELISA, se detectaron anticuerpos de varios virus, incluido VIH, en suero de los mismos pacientes. Resultados: Se incluyeron de muestras de un total de 240 pacientes (66 hombres y 174 mujeres). El 67,5% entre 16-40 años de edad y 15,4% superaban los 40 años. Se detectó al menos 1 patogeno en el 48,3% de los casos. En la mayoría de ellos dicho patógeno correspondía a Mtb (52%), seguido por Plasmodium en menor nivel (34%). La co-infección más frecuente fue de Mtb únicamente con Plasmodium (59%). Hasta un 2,5% de los pacientes fueron positivos para tres patógenos Mtb, Plasmodium y VIH o VHB (Virus de la Hepatitis B). Conclusiones: La coinfección que implica M.tuberculosis y Plasmodium es la más frecuente en esta población. La coincidencia en el rango de la edad más prevalente, en ambas patologías, puede influir en este resultado. La detección de M.tuberculosis con actividad metabólica, en muestras de pacientes sin diagnóstico de enfermedad, puede deberse a la presencia de bacilos latentes. Referencias: 1. Rantala et al, 2010, Malaria Journal. 9:269. 2. Cubero N. et al., 2013, Clin. Microbiol. Infect. 19:273-78

  

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S4-6

Rapid analysis of antibiotic resistance patterns of multi-resistant Acinetobacter in gel microspheres with a CELLENA®

microencapsulator

A. Muñoz-Suano, F. Vilches, V. Venegas, G. Bou, M. McConnell, A. Cebolla, J.M. Cisneros Biomedal, S.L., Sevilla, Spain / Servicio de Microbiología-Instituto de Investigación Biomédica, Complexo Hospitalario Universitario A Coruña, A Coruña, Spain / Instituto de Biomedicina de Sevilla, Sevilla, Spain / Unidad Clínica de Enfermedades Infecciosas, Microbiología y Medicina Preventiva, Hospital Virgen del Rocío, Sevilla. alba.suano@biomedal.com

Introducción: The main goal of this work was the development of an innovative protocol for the fast determination of resistance patterns in Acinetobacter baumannii in gel microspheres by using a Cellena(R) microencapsulator. Métodos: The resistance patterns of clinical strains of A. baumannii were analyzed either by broth microdilution or by the microencapsulation technology. A Cellena® Flow Focusing microencapsulator was used to generate alginate gel microcapsules containing individual bacteria and then incubated in different conditions. The antibiotics tested in this work were colistin and meropenem due to their high interest in nosocomial infections. Cell proliferation, resulting in microcolony formation was monitored by flow cytometry. Analysis of microcolony size in each condition was conducted and comparison with the CMI determinations by broth microdilution was made. Resultados: The Cellena microencapsulator allowed rapid determination of the resistance profile of Acinetobacter baumannii with a good concordance with broth microdilution, 85% of concordance with colistin (due to detection of heteroresistance) and 90% with meropenem. It also allowed for clonal studies within a population allowing the identification of individual clones within a population with deviations in the resistance pattern. Conclusiones: The easiness and the speed of the process together with the traceability of the system make this technique a powerful tool for the study and determination of resistance profiles in multiresistant pathogens, and may provide the information for choosing the best antibiotic option in severe hospital infections. Furthermore, the Cellena microencapsulation technology could represent a robust tool for basic and applied research or monitoring in different fields of life science, including environmental microbiology. Referencias: Gómez-Herreros, F et al. Nucleic Acids Research, 2012, 1–12

  

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HOTDROPS: a new tool for high throughput screening of thermostable enzymes

Ana Luísa Ribeiro, Aurelio Hidalgo and José Berenguer Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa, Universidad Autónoma de Madrid, Calle Nicolás Cabrera 1, 28049 Madrid, Spain. ana.lopes@uam.es; jose.berenguer@ uam.es Thermostable enzymes (Thermozymes) have a wide number of industrial and biotechnological applications because of their overall inherent stability against chemical-physical insults. A higher operation temperature allows a greater bioavailability and solubility of organic compounds and thereby provides efficient bioremediation (1,2). Concomitantly, thermozymes are more stable in presence of different organic co-solvents used to increase the concentrations of substrates and products. The screening of large mutant libraries or metagenomic libraries for thermozymes with the desired functionality can be very complicated and time-consuming. This is mainly due to the low success of expression of thermostable enzymes from the genome of thermophiles in common mesophilic expression systems and technical and economical limitations of ultrahigh-throughput screening (HTS) methods that require complex and expensive equipment. The HOTDROPS project is a multidisciplinary effort funded by the EU that aims to develop an innovative HTS platform based on thermophilic expression systems and microfluidics to screen for naturally occurring thermostable enzymes in metagenomes and for the thermostabilization of industrial enzymes from mesophiles. In vitro compartmentalization (IVC) combined with microfluidic systems enable the HTS based on miniaturization of the reaction volume to microdroplets. Single bacterial cells or in vitro transcription/translation systems can be compartmentalized into these droplets, each expressing a different gene library variant. This nanotechnology approach makes it easier to control exactly the micro-reactor droplets' lifetime and allows for the addition of substrates and quenchers at a desired time point. An in vitro screening at high temperature based on folding interference with a thermostable fluorescent protein reporter is being developed for those proteins without an activity assay. This strategy requires a flow-cytometry-based screening to sort the droplets in which the fluorescent product is expressed from the rest of the emulsion. After the screening process, the candidate proteins will be biochemically characterized and their behavior will be evaluated in enzymatic and biological assays. With this data it will be possible to scale-up and optimize their production by fermentation techniques. The HOTDROPS initiative aims to create a cutting-edge and cost-effective platform to identify and improve enzymes with wide applicability and industrial relevance.

References:

1. Becker P (1997) Determination of the kinetic parameters during continuous cultivation of the lipase producing thermophile Bacillus sp. IHI-91 on olive oil. Appl. Microb. Biotechnol. 48, 184–190.

2. Demirijan D, Moris-Varas F, Cassidy C (2001) Enzymes from extremophiles. Curr. Opin. Chem. Boil. 5, 144–151.

  

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Controlled assembly of functional type III secretion system injectisomes in non-pathogenic E. coli K-12

David Ruano-Gallego, Beatriz Álvarez and Luis Ángel Fernández Centro Nacional de Biotecnología – CSIC. Madrid druano@cnb.csic.es Enteropathogenic E. coli (EPEC) carries a type III secretion system (T3SS) that injects a set of cytotoxic proteins, called effectors, into the cytoplasm of infected host cells to subvert the intestinal epithelial barrier. One of these effectors is Tir, which binds to the adhesin Intimin on the bacterial surface and triggers actin polymerization in the enterocyte forming a pedestal-like structure beneath the attached bacterium. A protein complex assembled in the bacterial envelope, called the injectisome, acts as a molecular syringe for the translocation of effectors. The genes responsible for its assembly are located in a 35 kb genomic island called the Locus of Enterocyte Effacement (LEE), which also encodes transcriptional regulators, some effectors and Intimin. These genes are organized in five major operons (LEE1-LEE5) and smaller transcriptional units under complex regulation responding to environmental signals.

In order to express functional injectisomes in a non-pathogenic E. coli strain (K-12), we reorganized the protein-coding genes into operons lacking effectors and the complex regulation found in EPEC. Five synthetic operons (sLEE1, sLEE2, sLEE3, sLEE4 and escD) have been integrated into different sites of the chromosome of E. coli K-12 under the control of an heterologous inducible promoter (Ptac) using a markerless strategy for genome edition. We demonstrate that the resulting strain, named Synthetic Injector E. coli (SIEC), assembles functional injectisomes upon induction with IPTG that secrete the translocator proteins (EspA, EspB, EspD) of the T3SS into the culture medium. Assembly of injectisomes by SIEC has been also confirmed by cell fractionation and electron microscopy. We tested the functionality of SIEC injectisomes to translocate proteins into mammalian cells using a SIEC strain carrying an additional operon (sLEE5) -encoding intimin, Tir and its chaperone CesT- to infect HeLa cells. Staining of actin filaments in the infected HeLa cells revealed the formation of actin-rich pedestals beneath the bound bacteria, thus demonstrating the translocation of Tir by SIEC injectisomes. These results open the possibility to specifically inject individual effectors and heterologous proteins, such as single-domain antibodies and toxins, into the cytoplasm of target mammalian cells using a non-pathogenic E. coli strain.

  

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Construction of new recombinant MTBVAC expressing tetanus, diphtheria or pertussis toxin.

Esther Broset, Carlos Martín, Jesús Gonzalo-Asensio Grupo de Genética de Micobacterias, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, Spain CIBER enfermedades respiratorias. Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain ebroset@unizar.es, carlos@unizar.es Introduction: BCG vaccine is effective in reducing the rate of severe forms of tuberculosis (TB) but confers variable protection against pulmonary TB in adults (1). For this reason, we have developed MTBVAC, a new live attenuated vaccine candidate which is actually finishing phase I of clinical trials (NCT02013245). For its adjuvant properties BCG has been previously proposed as a suitable vector to deliver viral, bacterial and parasite antigens (2). In this context, here we propose the use of MTBVAC as a multivalent recombinant vaccine against different infectious diseases including diphtheria, tetanus and whooping cough. Methods: Inactive toxins from Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani or Bordetella pertussis were cloned into a mycobacterial integrative vector and transformed into MTBVAC (and BCG as control). The amount of toxoid transcript was determinated by Real-Time PCR. Toxoid production in each recombinant strain was confirmed by western blot using specific antibodies. Results: Genetically inactivated diphtheria or pertussis toxoids (CRM197 or S1 respectively), or Fragment C of tetanus toxin were cloned under the control of three mycobacterial promoters (antigen 85A, antigen 85B and hsp60). To promote the export of these antigens two signal sequences (ss) were used: ssAntigen 85A and ssAntigen 85B. Finally 12 vectors were obtained, 12 rMTBVAC and 12 rBCG as control. Preliminary results suggest that rMTBVAC strains produce higher levels of toxoid mRNA than rBCG. In addition, our preliminary western blots show proper tetanus toxoid production. Conclusions: In order to analyze the potential use of MTBVAC as vehicle vaccine, four heterologous protein production systems have been explored. We combined three different promoters (antigen 85A, antigen 85B and the strong hsp60 promoter) with two different secretion sequences (ssAg85A and ssAg85B) with the aim to determining the best combination. Further, our system allows toxoid secretion to facilitate the immune system recognition. Most heterologous expression experiments in Mycobacterium have been carried out in Mycobacterium bovis BCG; a strain with significant less antigenic potential than the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Using MTBVAC -an attenuated M. tuberculosis strain- we expect to obtain a better immune response against multiple infections as a rationale to develop a multivalent vaccine. References: (1) Fine, P.E. (1995) Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet 346: 1339-1345. (2) Bastos et al. (2009). "Recombinant Mycobacterium bovis BCG." Vaccine 27(47): 6495-503. *Funded by: Secretaría de Estado de Investigación, Desarrollo e Innovación del Ministerio de Economía y Competitividad de España. Ref. BES-2012-052937.

  

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S5-1

La emergencia de genotipos resistentes a penicilina en el serotipo 11A de Streptococcus pneumoniae se correlaciona con la evasión

de la respuesta inmune del huésped

Leire Aguinagalde Salazar1, Arnau Domenech2, Irene Mata San Juan1, Bruno Corsini1, Mirian Domenech3, Carmen Ardanuy2, Josefina Liñares2, Ernesto García3, Asunción Fenoll1, Jose Yuste1 

1Centro nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda,2Servicio de Microbiología, Hospital Universitario de Bellvitge, Barcelona, 3Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid.

laguinagalde@isciii.es 

Introducción: Streptococcus pneumoniae también llamado neumococo es el principal agente etiológico de las neumonías adquiridas en la comunidad y una importante causa de enfermedad neumocócica invasiva (ENI) incluyendo sepsis y meningitis. Tras la implantación de la vacuna conjugada 13-valente (PCV13), han aumentado los casos de ENI producidos por serotipos no incluidos en la misma entre los que destaca el serotipo 11A. Las infecciones producidas por este serotipo han sido tradicionalmente debidas al genotipo 62 (sensible a antibióticos). Sin embargo, se ha observado recientemente un incremento de casos de ENI producidos por otros dos genotipos (838 y 6521) que presentan altos niveles de resistencia a antibióticos β-lactámicos.

Métodos: El objetivo del trabajo ha sido caracterizar la patogenicidad de los genotipos del serotipo 11A estudiando su capacidad para evadir la inmunidad mediada por el sistema del complemento y la fagocitosis mediada por neutrófilos humanos utilizando las técnicas de citometría de flujo y microscopía confocal.

Resultados: La caracterización molecular de este serotipo ha permitido identificar la presencia de tres genotipos con diferencias en su patrón de sensibilidad antibiótica a β-lactámicos, como son el genotipo 62 (sensible) y los genotipos 838 y 6521 (resistentes). En este trabajo se ha confirmado que el genotipo 838 es reconocido de un modo más eficiente por los mecanismos de defensa del huésped lo que explicaría por qué es el genotipo que menos casos de ENI produce. Además se ha observado que los aislados de los genotipos 62 y 6521 son capaces de reclutar reguladores negativos del complemento incrementando de este modo su patogenicidad. Esto es de especial relevancia para los aislados de genotipo 6521 ya que al presentar resistencia antibiótica suponen un importante riesgo para el tratamiento de la infección neumocócica producida por estas cepas.

Conclusiones: Nuestros resultados confirman que los aislados clínicos de genotipo 6521 evaden de un modo muy eficiente la inmunidad del complemento y la fagocitosis lo que explicaría por qué los casos de ENI producidos por este genotipo están aumentando dramáticamente en los últimos años. Esto es de especial relevancia ya que podrían suponer una seria amenaza en salud pública.

  

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S5-2

From Genomes to Nucleotides: Rethinking Virulence Networks in Mycobacterium tuberculosis

Jesús Gonzalo-Asensio1,2,*, Luis Solans1,2, Claudia Sala3, Stewart T. Cole3 and Carlos

Martín1,2

1 Grupo de Genética de Micobacterias, Facultad de Medicina, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, Spain. 2 CIBER de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain. 3 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Global Health Institute, Station 19, Lausanne, Switzerland

Presenting autor: jagonzal@unizar.es

Introducción:

Since the original genome annotation of Mycobacterium tuberculosis in 1998, many works have been focused on identifying regulatory networks of this intracellular pathogen. For over 15 years, we work to decipher the PhoP virulence network known to control several pathogenic determinants. Importantly, inactivation of the phoP gene substantially contributes to the attenuation of MTBVAC, an attenuated vaccine candidate which is currently under clinical evaluation.

Métodos:

In this work, we combine high-throughput sequencing techniques (ChIP-seq and RNA-seq) to get an unprecedented level of detail of the PhoP-related regulatory networks. Further, we report for the first time the whole transcriptome of this pathogen inside macrophages, a physiologically relevant intracellular niche.

Resultados:

Combining ChIP-seq and RNA-seq has allowed distinguishing between genes directly regulated by PhoP and genes controlled through intermediate regulators. Previous works demonstrated that PhoP regulates the 2% of the M. tuberculosis coding capacity. In this work, we demonstrate that most of these PhoP-regulated genes are the result of indirect regulation via well-known transcription factors (EspR, WhiB and DosR). It is well known that M. tuberculosis phoP mutants are unable to secrete ESAT6, the major pathogenic determinant in M. tuberculosis. However, the molecular mechanism responsible for this phenotype remained unanswered. Here, we establish EspR as an intermediate regulator, which control the espACD operon, whose expression is essential for ESAT6 secretion. Our results have also uncovered yet unknown regulatory mechanisms including a PhoP-regulated ncRNA, which controls secretion of key antigens in M. tuberculosis.

Conclusiones:

Our results serve to exemplify the complexity of virulence networks. We demonstrate that PhoP, EspR, WhiB, and DosR regulons are mutually interconnected and allow proposing a regulatory network to explain the M. tuberculosis transcriptional response to environmental stresses found inside macrophages. This network otherwise explain the attenuated phenotype of M. tuberculosis phoP mutants and help to understand the vaccine features of MTBVAC.

 

  

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S5-3

Evaluación de 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA reductasa y fosfodiesterasa 4B como dianas terapeúticas frente a la infección

por Haemophilus influenzae

Javier Moleres1, Begoña Euba1,2, Pau Morey3, Víctor Segura4, José Leiva5, Juan Pablo de Torres5, Junkal Garmendia1,2

1Instituto de Agrobiotecnología-CSIC-UPNA-Gob. Navarra, 2Centro Investigación Biomédica en Red Enfermedades Respiratorias (CIBERES), 3Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany, 4Centro Investigación Médica Aplicada (CIMA), 5Clínica Universidad de Navarra (CUN)  

Email: javier.moleres@unavarra.es 

Introducción: Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) es un patógeno oportunista, causante de infección respiratoria en pacientes con patología pulmonar crónica. HiNT invade y persiste en células alveolares en un nicho subcelular con características de endosoma tardío [1]. La infección persistente y recurrente a pesar del uso antibiótico manifiesta la necesidad de explorar opciones terapéuticas nuevas. Este trabajo, hemos caracterizado funciones celulares manipuladas por HiNT para invadir el epitelio respiratorio, para identificar dianas celulares que permitan la modulación terapéutica de funciones del sistema respiratorio esenciales en el control de la infección por HiNT.

Métodos: Hemos empleado neumocitos tipo II humanos A549 y el aislado clínico HiNT375 para analizar los cambios en el transcriptoma del epitelio respiratorio en respuesta a la infección, mediante microarray Affymetrix y análisis de categorías funcionales diferencialmente expresadas mediante Ingenuity. Hemos empleado inhibidores farmacológicos específicos de las dianas celulares identificadas mediante microarray, y analizado su efecto en la adhesión e invasión bacteriana, y en la inflamación epitelial en respuesta a la infección.

Resultados: HiNT invade el epitelio respiratorio a través de balsas lipídicas [2], plataformas para señalización celular dependiente de AMP cíclico (AMPc) mediada por adenilato ciclasas, fosfodiesterasas (PDE) y proteína quinasa A (PKA). La infección epitelial por HiNT activa la expresión de hmgcr, gen que codifica HMG-CoA reductasa, enzima implicada en la síntesis de colesterol, y de la cascada PKA, que incluye pde4b, gen que codifica la isoforma PDE4B mayoritaria en pulmón. Mediante los inhibidores específicos de uso clínico (fluva)statina y roflumilast, hemos determinado que la depleción de colesterol y el aumento de AMPc bloquean el acceso de HiNT al nicho intracelular en el que persiste.

Conclusiones: Las estatinas son fármacos inhibidores de HMG-CoA reductasa, administrados a pacientes con hipercolesterolemia. El inhibidor de PDE4 roflumilast es un fármaco antiinflamatorio, administrado a pacientes respiratorios graves. Los datos obtenidos en este trabajo sugieren el beneficio del bloqueo farmacológico de HMG-CoA reductasa y/o PDE4 frente a la infección por HiNT, lo que puede contribuir a ampliar el potencial terapéutico de estatinas y roflumilast.

Referencias: Morey et al. (2011) Microbiology 157: 234-250; López-Gómez et al. (2012) Microbiology 158: 2384-2398 

 

  

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S5-4

Explorando el transcriptoma (ciano) bacteriano. RNAs no codificantes.

Elvira Olmedo Verd1, Jan Mitschke2, Agustín Vioque1, Wolfgang R. Hess2 y Alicia M. Muro-Pastor1

1Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. Universidad de Sevilla-CSIC, Américo Vespucio 49, E-41092 Sevilla. 2Faculty of Biology, Genetics and Experimental Bioinformatics, University of Freiburg, Schänzlestrasse 1, D-79104 Freiburg

alicia@ibvf.csic.es 

Los mecanismos regulatorios orquestados por moléculas de RNA no codificantes están implicados en prácticamente todos los aspectos de la fisiología bacteriana, incluyendo procesos de adaptación a estrés o virulencia. Uno de los fenómenos de adaptación a estrés nutricional más llamativos dentro del ámbito de las bacterias es la diferenciación de los heterocistos, un tipo celular especializado en la fijación de nitrógeno atmosférico en cianobacterias filamentosas. En condiciones de deficiencia en nitrógeno combinado, el crecimiento de estas bacterias fotosintéticas depende del funcionamiento coordinado de dos tipos celulares interdependientes con funciones metabólicas complementarias. Este fenómeno de diferenciación depende del establecimiento de un patron transcripcional exclusivo de una pequeña proporción de las células del filamento (aproximadamente 5-10% del total).

En nuestro laboratorio estamos interesados en definir los procesos regulatorios que conducen al desarrollo de estas células especializadas y, en particular, nos interesan aquellos procesos que puedan estar regulados por RNAs no codificantes. Hemos llevado a cabo un análisis transcriptómico global de nuestro organismo modelo, Anabaena sp. PCC7120, mediante una metodología basada en secuenciación de RNA total (RNA-Seq). El protocolo empleado nos ha permitido asignar todas las posiciones en las que se inicia la transcripción, no sólo de RNAs codificantes (mRNAs) sino también de pequeños RNAs (small RNAs, sRNAs) y transcritos antisentido, que al igual que se ha descrito recientemente para otras bacterias, son extraordinariamente abundantes en Anabaena (1).

Estamos analizando la posible función de varios sRNAs cuya transcripción está fuertemente regulada por la disponibilidad de nitrógeno, lo que sugiere que podrían estar implicados en la adaptación al estrés de carencia de nitrógeno. Algunos de estos sRNAs se transcriben exclusivamente en las células que se diferencian como heterocistos (2) y sus regiones promotoras contienen secuencias conservadas que podrían ser responsables de la transcripción exclusiva en este tipo celular.

Referencias:

(1) Mitschke J., A. Vioque, F. Haas, W.R. Hess and A.M. Muro-Pastor (2011) Dynamics of transcriptional start site selection during nitrogen stress-induced cell differentiation in Anabaena sp. PCC 7120. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:20130-20135.

(2) Muro-Pastor A.M. (2014) The heterocyst-specific NsiR1 small RNA is an early marker of cell differentiation in cyanobacterial filaments. mBio 5(3):e01079-14. doi:10.1128/mBio.01079-14

  

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S5-5

Expresión y análisis funcional de proteínas de Brucella abortus en la levadura Saccharomyces cerevisiae

María Rodríguez-Escudero1, Thais Lacerda3, Jean-Pierre Gorvel2, Suzana P. Salcedo3, María Molina1, Víctor J. Cid1 e Isabel Rodríguez-Escudero1

Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid. IRYCIS1 Centre d´Immunologie de Marseille-Luminy, France2 Institute of Biology and Chemistry of Proteins, Lyon3

mariro06@ucm.es 

Introducción: Brucella spp., es una bacteria patógena intracelular, Gram-negativa, causante de infecciones en animales y en el hombre (Pappas et al., 2006). Posee un sistema de secreción especializado de tipo IV (T4SS) que inyecta factores de virulencia bacterianos al interior de la célula hospedadora, lo que favorece la supervivencia del patógeno (Celli et al., 2003).

Hemos utilizado la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo para el estudio de proteínas de Brucella, centrándonos en BnpA/B, dos proteínas de interés por su localización nuclear y BtpB, un factor de virulencia con un dominio Toll/interleukin-1 receptor (TIR) (Salcedo et al., 2008).

Métodos: Crecimiento de levaduras. Observación microscópica de las fusiones de las proteínas a GFP, DAPI, Cherry-Nop1, FM4-64 y faloidina. Inmunofluorescencia. Western-blotting. Mutagénesis dirigida y al azar.

Resultados: Hemos reproducido en S. cerevisiae la localización nuclear de BnpA/B, demostrando que depende de la importina α. Mediante mutagénesis dirigida de BnpA determinamos que la práctica integridad de su estructura primaria es necesaria para su translocación nuclear y que ésta no depende de una posible señal de localización nuclear detectada en su secuencia.

Por otra parte, la expresión de BtpB resulta muy tóxica para S. cerevisiae, causando una disminución de la activación de MAPKs, inhibición de la endocitosis y despolarización del citoesqueleto de actina. La expresión de su extensión N-terminal BtpB(N-139) no tiene efecto tóxico. Sin embargo, el dominio TIR per se, BtpB(140-C) se localiza en microtúbulos y es responsable de los efectos tóxicos e inhibitorios descritos. Además, hemos realizado mutaciones puntuales tanto de manera dirigida a residuos conservados como al azar afectando la región C-terminal de la proteína que implican una pérdida total o parcial de la función.

Conclusiones: Hemos definido regiones esenciales para la localización nuclear del posible efector BnpA, así como dominios importantes para la interferencia de BtpB con funciones de la célula eucariótica. Este trabajo demuestra la utilidad de la levadura para el estudio de dominios funcionales en efectores bacterianos.

Referencias:

Pappas, G. et al. Lancet Infect Dis 6, 91-9 (2006) Celli, J. et al. J. Exp Med 198, 545-56 (2003) Salcedo, S. P. et al. Front Cell Infect Microbiol 3:28 (2013)  

  

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S5-6

Estudio de proteínas VgrG de Klebsiella pneumoniae utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo

Isabel Rodríguez-Escudero1, Víctor J. Cid1, José Antonio Bengoechea2, María Molina1

1Dpto. de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. IRYCIS. 2School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences. Queen’s University. Belfast. isabelre@farm.ucm.es

Introducción:

Klebsiella pneumoniae es una bacteria gram-negativa con un importante papel en infecciones oportunistas, principalmente nosocomiales. Puede causar neumonías, infecciones del tracto urinario, sepsis, infección de heridas quirúrgicas, etc (Podschun and Ullmann. 1998). Esta bacteria parece poseer un sistema de secreción especializado de tipo VI (T6SS). Estos sistemas son utilizados por bacterias patógenas para insertar sus factores de virulencia al interior del citoplasma de la célula hospedadora. Se han descrito como componentes estructurales de este T6SS unas proteínas con repeticiones en valina y glicina (VgrG), que podrían ser secretadas al interior de la célula hospedadora (Silverman et al., 2012). En este trabajo describimos la expresión de cinco VgrGs de dos cepas de K. pneumoniae en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae. y sus implicaciones funcionales

Métodos:

Crecimiento de levaduras. Observación microscópica de fusiones de las proteínas a GFP y de Cherry-Ilv6. Western blotting.

Resultados:

De las VgrGs expresadas, solo VgrG4 inhibe drásticamente el crecimiento de las células de levadura y altera la morfología mitocondrial, residiendo este efecto en su región carboxi-terminal, en la que se encuentran algunos dominios conservados en esta familia de proteínas. Además, esta proteína se localiza en zonas que co-localizan con marcadores de retículo endoplásmico adyacentes a las mitocondrias.

Conclusiones: Este trabajo demuestra la utilidad de la levadura S. cerevisiae para el estudio funcional e identificación de dianas de proteínas efectoras de sistemas de secreción bacterianos de tipo VI.

Referencias:

Podschun, R. and Ullmann, U. Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors. (1998). Clin. Microb. Rev. 11: 589-603.

Silverman,J.M., Brunet, Y.R, Cascales, E., Mougous J.D. Structure and regulation of the type VI secretion system. (2012). Annu. Rev. Microbiol. 66: 453-72  

  

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S6‐1 

Mutagénesis inducida mediante el uso de antibióticos en Acinetobacter baumannii

Luis M. Jara, Pilar Cortés, Germán Bou, Jordi Barbé y Jesús Aranda

Departament de Genètica i Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona

Jesus.aranda@uab.cat 

Introducción: Acinetobacter baumannii es uno de los principales agentes causante de infecciones nosocomiales, produciendo brotes alrededor de todo el mundo [1]. Alarmantemente, muchos aislados clínicos son resistentes a casi todos los antibióticos de uso clínico, hecho que implica que algunas infecciones de A. baumannii sean intratables [2]. En la cepa de A. baumannii ATCC 17978, se han identificado 2 operones homólogos a umuDC (0636-7 y 1174-3) y un gen homólogo a umuD [3], todos ellos implicados en la mutagénesis inducida por daño en el DNA [4, 5]. El objetivo de este trabajo ha sido establecer la relación entre el tratamiento de este patógeno con distintos grupos de antibióticos y su capacidad de generar mutagénesis mediante la inducción de genes que codifican componentes de DNA polimerasas tendentes a error.

Métodos: La inducción de los genes que codifican componentes de DNA polimerasas tendentes a error mediante el tratamiento con antibióticos se estudió a través de RT-PCR en tiempo real. Los análisis de mutagénesis se realizaron determinando la frecuencia de aparición de clones resistentes a rifampicina.

Resultados: Los datos obtenidos muestran que todos los genes identificados en la cepa A. baumannii ATCC 17978 que codifican componentes de la DNA polimerasa V tendente a error (UmuDC) se inducen en presencia de varios antibióticos de uso clínico pertenecientes a los grupos de las quinolonas, los aminoglucósidos y las tetraciclinas. Sin embargo antibióticos pertenecientes a los grupos de los β-lactámicos y de las polimixinas no los inducen. Además, la inducción de estos genes se corresponde con un incremento de la tasa de mutagénesis en este patógeno.

Conclusiones: La utilización de carbapenemes o colistina frente a A. baumannii no comporta el aumento de la generación de clones resistentes por mutaciones en el genoma de esta especie bacteriana.

Referencias:

1. Antunes, L.C., P. Visca, and K.J. Towner, Acinetobacter baumannii: evolution of a global pathogen. 2014. Pathog Dis.

2. Gordon, N.C. and D.W. Wareham, Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii: mechanisms of virulence and resistance. 2010. Int J Antimicrob Agents. 35(3): p. 219-26.

3. Norton, M.D., A.J. Spilkia, and V.G. Godoy, Antibiotic resistance acquired through a DNA damage-inducible response in Acinetobacter baumannii. 2013. J Bacteriol. 195(6): p. 1335-45.

4. Aranda, J., et al., Identification of a DNA-damage-inducible regulon in Acinetobacter baumannii. 2013. J Bacteriol. 195(24): p. 5577-82.

5. Aranda, J., et al., Role of Acinetobacter baumannii UmuD homologs in antibiotic resistance acquired through DNA damage-induced mutagenesis. 2014. Antimicrob Agents Chemother. 58(3): p. 1771-3.

  

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S6‐2 

Bases de la adaptación de un plásmido ColE1 a su hospedador en un ensayo de evolución experimental

Bernabe-Balas C., Santos-Lopez A., Gutierrez B., Carrilero L., Martinez-Ovejero C., Thomas-Lopez D., Hoefer A., de la Cruz F., Gonzalez-Zorn B.

Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid

crisbernabe90@gmail.com 

Introducción: Los plásmidos tipo ColE1 son replicones de pequeño tamaño movilizables, descritos en las familias Enterobacteriaceae y Pasteurellaceae. Recientemente se ha puesto de manifiesto su importancia en la resistencia a antibióticos. Por ejemplo, pB1000 se ha encontrado en Haemophilus influenzae, H. parasuis, Pasteurella multocida y P. aerogenes (1,2), confiriendo fenotipo de resistencia a β-lactámicos. Pese a ser 100% estable en la familia Pasteurellaceae, pB1000 se pierde en menos de 30 generaciones en Escherichia coli.

En este trabajo, ponemos de manifiesto la adaptación de un plásmido ColE1 de Pasteurellaceae en Enterobacteriacea mediante la adquisición de una secuencia de inserción y de al menos una mutación en el origen de replicación (oriV).

Métodos: El plásmido pB1000 fue transformado en E. coli DH5α y seleccionado bajo presión antibiótica. Seis evoluciones experimentales independientes fueron llevadas a cabo con los transformantes. Durante 50 días, cada 24 horas, 106 UFCs fueron transferidas en medio líquido con 64 mg/l de ampicilina. La estabilidad de pB1000 fue medida en diferentes puntos de las evoluciones. Así mismo, se congelaron las poblaciones a lo largo de las evoluciones, y se obtuvieron extracciones plasmídicas, a partir de las cuales se realizaron mapeos del replicón y se secuenció el origen de replicación del mismo.

Resultados: Durante los ensayos de evolución experimental, la estabilidad de pB1000 aumentó de una tasa de pérdida del 60% cada 10 generaciones a ca. 4% cada 10 generaciones. La secuenciación y el mapeo del plásmido revelaron que este aumento de estabilidad era debido a la inserción de InsAB’ desde el cromosoma de E. coli, y la adquisición de entre una y dos mutaciones en el oriV del replicón, las cuales se mantuvieron durante la evolución.

Conclusiones: La contribución de mutaciones en el oriV y la adquisición de una secuencia de inserción amplían la estabilidad de pB1000 en E. coli, aumentando de este modo el rango de hospedador del replicón.

Referencias:

1. San Millan A, et al. Beta-lactam resistance in Haemophilus parasuis is mediated by plasmid pB1000 bearing blaROB-1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 51, 2260-4 (2007).

2. San Millan A, et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53, 3399-404 (2009).

 

 

 

  

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S6‐3 

MgrB inactivation is a common mechanism of colistin resistance in KPC carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae of

clinical origin

Antonio Cannatelli1§, Tommaso Giani1§, Marco Maria D’Andrea1, Vincenzo Di Pilato1, Fabio Arena1, Viola Conte1, Kyriaki Tryfinopoulou2, the COLGRIT Study Group3, Alkiviadis Vatopoulos2, 4 and Gian Maria Rossolini1,5,6* 1 Department of Medical Biotechnologies, University of Siena, Siena, Italy . 2 Central Public Health Laboratory, Hellenic Centre for Disease Control and Prevention (KEELPNO), Vari, Greece . 3 Members of the COLGRIT Study Group will list in the acknowledgement section . 4 Department of Microbiology, National School of Public Health, Athens, Greece . 5 Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, Florence, Italy. 6 Clinical Microbiology and Virology Unit, Florence Careggi University Hospital, Florence, Italy. § AC and TG equally contributed to this work *gianni.rossolini@gmail.com, gianmaria.rossolini@unisi.it Introducción: Klebsiella pneumoniae producing KPC-type carbapenemases (KPC-KP) are multidrug-resistant pathogens. Colistin is a key component for treatment of severe KPC-KP infections. The emergence of polymyxin-resistant KPC-KP, however, has been reported (1-3). We recently showed that inactivation of the mgrB gene, encoding a negative regulator of the PhoQ/PhoP can be responsible for acquired colistin resistance in KPC-KP by upregulating PhoQ/PhoP which, in turn, activates Pmr LPS modification system (4). In this work we investigated the occurrence of mgrB alterations as a mechanism of resistance in a collection of colistin-resistant clinical isolates of KPC-KP collected during the ongoing Greek and Italian epidemics. Methods: The strains studied in this work included 66 nonreplicate colistin-resistant KPC-KP clinical isolates obtained during the period 2010 – 2012 from 23 centers (19 in Italy and four in Greece). Susceptibility testing was performed by broth microdilution. mgrB genes were detected by PCR. For complementation experiments, a pACYC184 derivative was used (4). qRT-PCR was used to measure the expression of the phoQ and pmrK genes. Results: In 35 strains (53%) several different nonsilent alterations of the mgrB coding sequence were detected, including inactivation by an insertion sequence (IS), missense or nonsense point mutations, and small deletions. Four additional strains had a larger deletion of the mgrB locus, while the remaining 27 strains (41%) did not show mgrB alterations. Transcriptional upregulation of the phoQ and pmrK genes was observed in all strains with mgrB mutated. Complementation experiments with a wild-type mgrB gene, restored colistin susceptibility and basal expression levels of phoQ and pmrK genes, in strains carrying different types of mgrB alterations. Conclusions: The majority of colistin-resistant isolates (39 of 66, 59%) carried alterations of the mgrB gene. These data underscore the role of this genetic mechanism in acquired colistin resistance by KPC-KP. Altogether, insertional inactivation of mgrB by insertion sequences, and especially by IS5-like elements, appeared to be the most common mechanism of mgrB alteration. These findings reflect the occurrence of several independent mutational events, and suggest that genetic alteration of mgrB may occur at relatively high frequency and without major consequences on fitness and virulence of the KPC-KP strain. References: [1] Bogdanovich T, Adams-Haduch JM, Tian GB, Nguyen MH, Kwak EJ, Muto CA, Doi Y. 2011. Clin. Infect. Dis. 53:373–376. [2] Zagorianou A, Sianou E, Iosifidis E, Dimou V, Protonotariou E, Miyakis S, Roilides E, Sofianou D. 2012. . Euro Surveill. 17(7):pii=20088. http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=2008. [3] Mammina C, Bonura C, Di Bernardo F, Aleo A, Fasciana T, Sodano C, Saporito MA, Verde MS, Tetamo R, Palma DM. 2012. Euro Surveill 17:pii=20248. [4] Cannatelli A, D'Andrea MM, Giani T, Di Pilato V, Arena F, Ambretti S, Gaibani P, Rossolini GM. 2013. Antimicrob. Agents Chemother. 57:5521–5526.

  

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S6‐4 

Un mutante espontáneo de Enterococcus faecalis sensible a cefalosporinas: en el camino de la identificación de nuevas vías de

resistencia Carrilero L., Thomas-Lopez D., Matrat S., Kennedy S, Montero N., Gonzalez-Zorn, B. Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid laucarri@ucm.es

Introducción: Enterococcus faecalis es una bacteria habitual en la microbiota intestinal como comensal demultitud de animales, pero puede actuar como patógeno nosocomial dando lugar a infecciones dediversa gravedad. Complica su tratamiento la gran cantidad de resistencias a antibióticos quepresenta, como la resistencia intrínseca a las cefalosporinas, no estando del todo esclarecidos losmecanismos que la determinan. Al estudiar la antibiorresistencia de una librería de mutantes deinserción1, el mutante para el gen de la NADH peroxidasa, el gen EF1211, mostró un fenotipo desusceptibilidad a las metoximino cefalosporinas. Este gen participa en el estado redox de la bacteria, loque concuerda con la teoría del estrés oxidativo como último efector en el efecto letal de losantibióticos bactericidas. Resultados: Complementamos el mutante de inserción en el gen de la NADH peroxidasa mediante la pérdidadel plásmido que estaba interrumpiendo este gen. Una vez restablecido el genotipo silvestre para el gen de la NADH peroxidasa, la cepa continuaba mostrando sensibilidad frente a las metoximino cefalosporinas. Procedimos a la secuenciación del genoma de la cepa silvestre, del mutante de inserción para la NADH peroxidasa y del mutante complementado de la NADH peroxidasa. Estos dos últimos presentaban dos mutaciones puntuales que la cepa silvestre, resistente a cefalosporinas, no portaba. Las mutaciones eran con cambio de sentido y estaban en los genes EF0146 (relacionado con una proteína de exclusión) y EF2933 (regulador transcripcional Rex que reprime o no genes en función del estado redox de la célula). Estamos construyendo en la cepa WT mutantes individuales en el cromosoma para cada uno de los genes, y también introduciremos ambas mutaciones para ver si el fenotipo es fruto de la combinación de ambas. Conclusiones: El uso de bancos genómicos es adecuado para el estudio de diversas características, pero no debemos olvidar que se pueden dar otras mutaciones espontáneas que pueden generar fenotipo en el carácter de estudio. Además, la identificación y caracterización de determinantes intrínsecos de resistencia a cefalosporinas puede revertir en el descubrimiento de nuevas dianas en las lucha contra las infeccciones enterocócicas. Referencias: Rigottier-Gois L et al. Large-scale screening of a targeted Enterococcus faecalis mutant library identifies envelope fitness factors. PLoSOne. 2011;6(12):e29023. doi: 10.1371/journal.pone.0029023. Epub 2011 Dec 15

  

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S6‐5 

Explorando de la interacción entre cepas bacterianas cercanas mediante RNAseq

Pedro González-Torresa, Leszek Pryszczb, Fernando Santosa, Cristina Lópeza, Toni Gabaldónb y Josefa Antóna.

aDepartamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Universidad de Alicante, Apartado 99, 03080 Alicante, España.bBioinformatics and Genomics Programme. Center for Genomic Regulation (CRG). Dr Aiguader,88. Barcelona 08003, España.

Introducción: Numerosas especies procarioticas presentan una elevada diversidad intraespecífica, incluyendo en muchos casos cepas próximas que coexisten y presentan diferencias genómicas muy sutiles. Por si sólo, el contenido en genes no muestra una información precisa acerca del comportamiento bacteriano, ya que pequeñas variaciones en los mismos o en su contexto genómico pueden desencadenar diversas estrategias ecológicas [3]. Cepas genéticamente similares podrían presentar comportamientos diversos en respuesta a cambios ambientales.  

Los cristalizadores de las salinas solares son un ejemplo de ambiente con elevada microdiversidad. Entre su microbiota destaca Salinibacter ruber, bacteria halófila extrema que puede representar el 30% de la población. Actualmente disponemos de los genomas completos anotados de dos cepas coaisladas de S.ruber, M8 y M31 DSM13588, los cuales se compararon en un estudio microevolutivo previo [1].

Métodos: En este estudio empleamos RNAseq [2] (Illumina Genome Analizer) para analizar el transcriptoma de ambas cepas por separado y en cultivo mixto con el objetivo de discernir qué efecto tienen estas diferencias genómicas a nivel transcripcional y, por comparación de ambas condiciones, si la presencia de una cepa afecta a los patrones transcripcionales y al crecimiento de la otra. Para ello se crecieron triplicados de cultivos puros y mixtos de ambas cepas, monitorizando el crecimiento (qPCR, DAPI, DO600) y la composición iónica del medio (ICP-MS).

Resultados: Alrededor del 98% de los genes se expresaron en ambas cepas, pudiendo identificar nuevos genes y caracterizar los operones presentes en ambos genomas. Entre los genes no expresados, se apreció un enriquecimiento en genes especiíficos de cepa, muchos de reciente adquisición. Se observaron elevados niveles de expresión en la isla genómica II, en genes relacionados con la alta demanda en crecimiento exponencial como proteínas ribosomales o chaperonas, factores sigma alternativos y la xantorrodopsina. Tras comparar la expresión de ambas cepas en cultivo puro, 165 genes mostraron diferencias significativas, destacando la presencia de transportadores de membrana, sistemas de transducción de dos componentes y proteínas de flagelo.

Por otra parte un total de 354 y 446 genes modificaron su expresión significativamente en M8 y M31 en cultivo mixto. De estos, tan sólo 89 lo hicieron en ambas cepas lo cual refleja que la presencia de una cepa cercana estaría induciendo cambios transcripcionales diferentes en cada una de ellas. Las principales variaciones se observaron a nivel de sistemas de dos componentes y transportadores, sugieriendo un elevado control y regulación a nivel transcripcional. En el caso de M31, se apreció además un aumento de expresión de proteínas ribosómicas, factores de elongación, biosíntesis de diversos aminoácidos y maquinaria de replicación.

Conclusiones: Diferencias sutiles a nivel genómico afectan considerablemente a los perfiles de expresión de las cepas M8 y M31 así como a la interacción entre ellas. De este modo cepas muy cercanas que coexisten en la naturaleza podrían presentar diversas respuestas a cambios ambientales y estar respondiendo de modo distinto ante la presencia de otras.

Referencias:

[1] ISME J. 2010;4:882–895. [2] Sorek R, Cossart P. Prokaryotic transcriptomics: a new view on regulation, physiology and pathogenicity. Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):9-16. doi: 10.1038/nrg2695. Epub 2009 Nov 24. [3] Wilmes P, Simmons SL, Denef VJ, Banfield JF.(2009) The dynamic genetic repertoire of microbial communities. FEMS Microbiol. 2009. Rev 33: 109–132.  

  

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S6‐6 

Búsqueda de nuevos genes de resistencia a radiación UVB y UVC mediante técnicas metagenómicas en ambientes extremos

María Lamprecht Grandío, Salvador Mirete Castañeda, Verónica Morgante, José Eduardo González Pastor.

Centro de Astrobiología (INTA-CSIC)

gonzalezpje@cab.inta-csic.es 

Introducción: Los microorganismos que viven en la zona superficial de ecosistemas acuáticos se encuentran altamente expuestos a radiación ultravioleta (UV). Esta radiación puede producir daños en la estructura del ADN, afectando a procesos esenciales como la replicación y la traducción (1), por tanto, su supervivencia depende de una buena adaptación a la exposición continuada. El objetivo de este trabajo es buscar en bibliotecas metagénomicas de ambientes acuáticos extremos nuevos mecanismos de resistencia a radiación UVB y UVC.

Métodos: Para ello, se han utilizado bibliotecas de DNA extraído a partir de agua de Río Tinto (Huelva) y de salinas de Es Trenc (Mallorca), con un tamaño medio de inserto de 1,8 y 2,9 kb, respectivamente. (2) Usando el vector de alto número de copia, pBluescript SK II+ y la cepa Escherichia coli DH10B como hospedador.

Resultados: Se han identificado 23 clones a partir de la biblioteca metagenómica de las salinas de Es Trenc. Al analizar la secuencia del inserto, se ha determinado que todos los clones tienen el mismo inserto, con un tamaño de 1545 pb y 3 posibles ORFs que presentan homología con genes de origen bacteriano. Usando la biblioteca de agua de Río Tinto, se han identificado 6 clones con resistencia a UVB, de los cuales hemos determinado que dos insertos tienen secuencia distinta con una longitud de 2800 pb y 3200 pb aproximadamente. Finalmente, hemos identificado que estos clones también presentan una resistencia significativa a UVC.

Conclusiones: Se han identificado genes de resistencia a UV de los microorganismos de las salinas de Mallorca y del río Tinto que podrían constituir nuevos mecanismos de resistencia.

Referencias:

(1) The significance of the Dewar valence photoisomer as a UV radiation-induced DNA photoproduct in marine microbial communities. Meador J.A., Baldwin A.J., Pakulski J.D., Jeffrey W.H., Mitchell D.L., Douki T. 2014. Environmental microbiology. doi: 10.1111/1462-2920.12414

(2) Exploring the diversity of arsenic resistance genes from acid mine drainage microorganisms. Morgante V., Mirete S., de Figueras CG., Postigo CachoM., González-Pastor J.E. 2014. Environmental Microbiology. 10.1111/1462-2920.12505

 

   

  

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S6‐7 

Adquisición de metiltransferasas del ARNr 16S, interferencia con metilaciones intrínsecas y evolución hacia un ribosoma resistente

a aminoglucósidos

Belen GUTIERREZ 1, Cristina M OVEJERO 1, Andreas HOEFER 1, Laura CARRILERO 1, Alfonso SANTOS-LOPEZ1, Daniel THOMAS-LOPEZ 1, Natalia MONTERO 1, Cristina BERNABÉ-BALAS1 and Bruno GONZALEZ-ZORN1*.

1Departamento de Sanidad Animal y VISAVET, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid. belengutierrez@vet.ucm.es  Introducción: La metilación específica del ARNr 16S, previamente descrita en los actinomicetos productores de aminoglucósidos (1), ha emergido recientemente como mecanismo de resistencia a dichos antibióticos en patógenos Gram-negativos (2) expandiéndose rápidamente a nivel mundial. Métodos: Hemos consultado las bases de datos en GenBank, realizado alineamientos de proteínas mediante ClustalW y construido árboles filogenéticos mediante MEGA 5 con las diferentes metiltransferasas. A su vez, hemos reunido todos estos datos junto con los previamente obtenidos mediante espectrometría de masas MALDI y ensayos de competición. Resultados: La estructura global de las metilasas intrínsecas de los actinomicetos y de las metilasas adquiridas por bacterias patógenas que metilan en G1405 se encuentra altamente conservada. No obstante, el contenido en G+C tanto del genoma de los actinomicetos como el de sus metilasas intrínsecas de resistencia está comprendido entre 65-75%; mientras que el contenido en G+C de las metilasas adquiridas oscila entre el 30-67% al igual que el del genoma de sus patógenos portadores comprendido entre un 39% (A. baumanii y P. mirabillis) y un 66% (P. aeruginosa). Dichas especies,  ampliamente distribuidas y presentes en el suelo, podrían haber adquirido estas metilasas a través de los actinomicetos productores de aminoglucósidos, adaptado el contenido G+C al de su propio genoma, y diseminado entre las diferentes especies patógenas. Además, hemos identificado que la adquisición de una metiltransferasa cromosómica no supone un coste biológico adicional para la bacteria, incluso en ausencia de antibióticos, llegando a desplazar a metilaciones intrínsecas. Es el caso de RmtC, identificada en un clon epidémico del Reino Unido en Salmonella enterica Serovar Virchow (3), y que en nuestro modelo cromosómico de Escherichia coli metila la posición m7G1405 desplazando a la metilación fisiológica en m5C1407 mediada por RsmF (4). Además, dicho desplazamiento potencia la resistencia a aminoglucósidos. Resulta aún más sorprendente el desplazamiento de una de las metilaciones intrínsecas en la posición C1402, más conservadas que la metilación en C1407, mediado por RmtD en Pseudomonas aeruginosa (5). Conclusiones: El hecho de que las metilasas de resistencia adquiridas se antepongan a metilaciones endógenas conservadas del ribosoma nos lleva a plantearnos la evolución del ribosoma bacteriano hacia uno resistente a aminoglucósidos.  Referencias: (1) Cundliffe, E. Annu Rev Microbiol 43, 207-233 (1989). (2) Wachino, J. & Arakawa, Y. Drug Resist Updat 15, 133-148 (2012). (3) Hopkins, K. L., Escudero, J. A., Hidalgo, L. & Gonzalez-Zorn, B. Emerg Infect Dis 16, 712-715 (2010). (4) Gutierrez B, Douthwaite S & Gonzalez-Zorn B. RNA biology 10:8, 1324-1332 (2013) (5) Gutierrez, B. et al. Antimicrob Agents Chemother 56:2335-41. (2012)    

  

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S6‐8 

Estudio del mecanismo de transporte del DNA extracelular en Bacillus subtilis.

Alejandra López Ibáñez de Aldecoa, J. Eduardo González-Pastor. Centro de Astrobiología, Madrid. lopezima@cab.inta-csic.es 

Introducción: Bacillus subtilis es una bacteria gram-positiva que tiene la capacidad de liberar de forma controlada copias de su DNA al medio extracelular (DNAe) mediante un transporte activo y en respuesta a señales de quorum sensing (poblacionales) relacionadas con el fenómeno de competencia [4]. En este estudio nos centramos en la identificación de las proteínas implicadas en el transporte del DNAe a través de la membrana. Métodos: Se tomó el sobrenadante de un cultivo de Bacillus subtilis en medio mínimo en el momento correspondiente a la máxima producción de DNAe. Se precipitó el DNAe y se realizó el crosslinking con formaldehído (FA) [1]. Se dializaron las muestras y se revirtió el enlace del FA con calor (65º). Las muestras se trataron con DNAsa I para eliminar los agregados proteína-DNA y se analizaron por SDS-PAGE y tinción de plata. Finalmente se identificaron las proteínas presentes en las muestras por LC-MS/MS. Resultados: Las proteínas identificadas que aparecen en mayor abundancia son OppA y Hag. La primera es un transportador ABC de oligopéptidos implicado en el inicio de la esporulación, la competencia y en el transporte de péptidos de pequeño tamaño [3]. La segunda, flagelina o Hag, es una proteína que constituye el filamento del flagelo bacteriano [2]. Conclusiones: Dado que el tamaño de poro de OppA es demasiado pequeño para permitir el paso de DNA, planteamos la hipótesis de que el flagelo pueda estar implicado en el transporte del DNAe. Referencias: 1- Cascales E and Christie P.J. Definition of a bacterial type IV secretion pathway for a DNA substrate. Science. 2004. 304(5674):1170-3. 2- Courtney CR, et al. Molecular characterization of the flagellar hook in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 2012. 194(17):4619-4629. 3- Rudner DZ, et al. The spo0K locus of Bacillus subtilis is homologous to the oligopeptide permease locus and is required for sporulation and competence. J. Bacteriol.1991. 173(4):1388-1398. 4- Zafra O, et al. Extracellular DNA release by undomesticated Bacillus subtilis is regulated by early competence. PlosOne. 2012. 7(11):e48716 

   

  

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S6‐9 

Extrapolation based approach to decipher the molecular mechanisms of resistance to Colistin in Stenotrophomonas

maltophilia

Sònia Martínez-Servat1,2 , Daniel Yero1,2, Ferran Llanas, Pablo Rodríguez, Xavier Daura1,3, and Isidre Gibert1,2 1 Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 2 Departament de Genètica i de Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 3

Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), E-08010 Barcelona.

Sonia.Martinez.Servat@uab.cat // Isidre.Gibert@uab.cat

Introduction: Colistin (polymixin E) is a cationic antimicrobial peptide and is being used increasingly to treat infections by multiresistant Gram-negative isolates. Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia are opportunistic pathogens with similar recent reports of resistance to colistin. While in some cases the mechanisms of resistance to colistin in P. aeruginosa are known, for S. maltophilia this information is scarce. Our strategy is to extrapolate the predicted S. maltophilia colistin resistome to the background of an annotated P. aeruginosa mutant library. Additionally, a panel of clinical S. maltophilia isolates was screened for potential model strains to validate most promising targets.

Methods: A BLAST search strategy for P. aeruginosa PAO1 and S. maltophilia K279a genomes was applied to identify ortholog genes probably conferring resistance to colistin. P. aeruginosa mutants were obtained from the PAO1 transposon mutant library at the University of Washington (UW). A set of clinical isolates of S. maltophilia were obtained from diverse sources in Europe. Minimum inhibitory concentrations were determined using a microdilution test or Etest® (Biomerieux). Genotypic characterization was determined on the basis of PCR amplification and sequencing of the genes of the MLST scheme for S. maltophilia.

Results: A data-mining approach was used to identify potential genes conferring resistance to colistin in S. maltophilia. From this initial set of gene candidates, 58 orthologs were also present in the PAO1 genome with a mutant available at the UW library. Theses mutants were screened for their susceptibilities to colistin and 32 genes were selected for the extrapolation based strategy in S. maltophilia. To select S. maltophilia strains for mutational experiments a set of 81 clinical isolates were characterized phenotipically and genotypically. Among these S. maltophilia isolates there was a small fraction of colistin resistant strains and there was no a clear correlation between genotype and colistin resistance. However, an additional mechanism of adaptive resistance to colistin appears to be acting in almost all isolated.

Conclusions: This approach will certainly contribute to better understand the complex mechanism of resistance to colistin present in S. maltophilia. Selected colistin resistant S. maltophilia strains will be used to extrapolate the mutations previously validated in PAO1.

 

   

  

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S6‐10 

Caracterización de replicones prevalentes en clones multirresistentes en India.

Ovejero, C. M., Hidalgo, L., Goilo, D., Rahman, M., Gutiérrez, B., Carrilero, L., Santos-López, A., Thomas-Lopez, D., Hoefer, A., Bernabé, C., Prasad, K. N., Gonzalez-Zorn, B. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense Madrid cmovejero@vet.ucm.es 

Introducción: La metilación del sitio A del ARNr 16S bacteriano confiere altos niveles de resistencia a aminoglucósidos de relevancia clínica. Hasta la fecha han sido descritas en bacterias patógenas Gram negativas diez metiltransferasas del ARNr 16S (ArmA, RmtA-H, NpmA). Se ha observado frecuentemente la asociación de estas metiltransferasas con otros importantes genes de resistencia en diferentes tipos de plásmidos. La adquisición de estos plásmidos por parte de clones “exitosos” conduce a la emergencia de clones “de alto riesgo”, incrementando de una manera extremadamente efectiva la diseminación de estos elementos resistentes. El objetivo de este estudio fue la identificación y caracterización molecular de clones de “alto riesgo” obtenidos de 99 cepas clínicas con altos niveles de resistencia a aminoglucósidos, procedentes de la India. Métodos: Con el fin de identificar los clones más prevalentes realizamos la técnica de Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE) y analizamos los resultados con el programa informático Bionumerics. Llevamos a cabo la detección por PCR de todos los genes de las metiltransferasas del ARNr 16S junto con la detección de otros genes de resistencia que suelen asociarse a metiltransferasas (blaNDM, blaCTX-M y qnr). Determinamos la susceptibilidad antimicrobiana por medio de los métodos de difusión en disco y microdilución siguiendo la guía del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Estamos llevando a cabo la caracterización plasmídica de los clones más relevantes mediante las técnicas de replicon typing y S1-PFGE. Resultados: Todos los aislados presentaron un perfil de multirresistencia. De las 99 cepas analizadas, en 94 se detectó una o en algunos casos más de una metiltransferasa. El análisis del PFGE reveló la presencia de 16 clones (39 aislados), la mayoría portaban la metiltransferasa junto con blaNDM, y blaCTX-M (21 aislados, 53.8%), encontrándose distintas combinaciones en el resto de clones. Por el momento, la caracterización de los plásmidos de estos 21 aislados muestra que rmtC se encuentra junto a blaCTX-M en un plásmido IncA/C de un tamaño aproximado de 90kb. Conclusiones: Los índices de resistencia antibiótica en la India son alarmantes. Hemos detectado la presencia de un plásmido IncA/C diseminado entre diferentes clones multirresistentes que porta genes de resistencia antibióticos de gran importancia clínica. La adaptación evolutiva de este tipo de plásmido a su hospedador es de vital importancia, para conocer cómo se imponen estas bacterias multirresistentes en la naturaleza. Referencias:

Wachino J., et al. Exogenously acquired 16S rRNA methyltransferases found in aminoglycoside-resistant pathogenic Gram-negative bacteria: An update. 2012, Drug Resistance Updates, 15: 133-148. 

  

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S6‐11 

Resistance to aminoglycosides in clinical isolates of Corynebacterium striatum

Jesús Navas, Marta Fernández-Martínez, José Ramos-Vivas, Sana Alibi, Asma Ferjani, Jalel Boukadida, María Elicier Cano & Luis Martínez-Martínez Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria. Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Instituto de Investigación Marqués de Valdecilla (IDIVAL). Santander. Laboratoire de Microbiologie–Immunologie, Unité de Recherche « Caractérisation Génomique des Agents Infectieux UR12SP34, CHU F. Hached, Sousse, Tunisie. navasj@unican.es

Introduction: Corynebacterium striatum is an ubiquitous saprophyte of the human skin and mucous membranes, and an emerging nosocomial pathogen causing serious infections in patients with variant degrees of immuno-suppression or other underlying diseases. Several outbreaks of multidrug resistant C. striatum have been recently reported. The emergence of multi-resistant C.striatum is of particular concern, since therapeutic options are limited to vancomycin,oxazoidinones or lipopeptides. In this context, alternative compounds are needed. Aminoglycosides can be envisaged as a second-line or complementary antibiotics for the treatment of Corynebacterium infections. The aim of this study was to investigate the susceptibility to six aminoglycosides of two collections of C.striatum isolated at clinical centres in Santander and Sousse (Tunisia), respectively. The isolates were typed by means of PFGE to inquire about their clonal relatedness and possible spread of resistance mechanisms. The presence of genes related with the resistance phenotypes was investigated. Methods: Sensitivity assays: MIC’s of amikacin, gentamicin, kanamycin, netilmicin, streptomycin, and tobramycin, were determined using E-test strips and Mueller-Hinton agar. Plates were incubated at 37ºC for 16-20h. Results wereinterpreted according to breakpoints defined by either the CLSI or the EUCAST.Typing: The isolates were typed by means of PFGE using XbaI as a restriction enzyme. Detection of resistance genes: Search and mapping of aminoglycoside resistance genes was performed by sequencing the genomes of two C. striatum isolates and by PCR. Results: Susceptibility testing of C.striatum to six aminoglycosides: Netilmicin was active against all C. striatum. Gentamicin and amikacin showed good activity (1.6 and 4.7% resistant, respectively). Kanamycin and streptomycin were less active against our C. striatum (39% and 30% resistant, respectively). Molecular epidemiology of the C. striatum isolates: 46 major PFGE types were identified in the 64 C. striatum isolates. On these, PFGE types 3, 8, 34 and 46 could be further classified in 2 subtypes. Aminoglycoside resistance genes in the 64 C. striatum: The genes aphA1, aad5 (both encoding for kanamycin resistance) and strA-strB (streptomycin resistance) were found in the C. striatum CS5703 genome and detected by PCR in most of C. striatum isolates. Conclusions: - Netilmicin was the more active compound, followed by amikacin and gentamicin. - Our 64 C.striatum isolates were mostly not clonal. - Although use of aminoglycosides to treat infections caused by corynebacteria is circumstantial, a significant number of C. striatum included in this study were resistant, mainly to kanamycin and streptomycin. References:

Campanile F, Carretto E, Barbarini D, Grigis A, Falcone M, Goglio A, Venditti M, Stefani S. 2009. Clonal multidrug-resistant Corynebacterium striatum strains, Italy. Emerg. Infect. Dis. 15:75-78.

  

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S6‐12 

El comportamiento de plásmidos ColE1 durante la cohabitación Alfonso Santos-Lopez, Cristina Bernabe-Balas, Alvaro San Millan, Rafael Ortega-Huedo, Belen Gutierrez, Laura Carrilero, Cristina Martinez Ovejero, Daniel Thomas-Lopez, Andreas Hoefer, Bruno Gonzalez Zorn. Departamento de Sanidad Animal y VISAVET, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid alfonso.santos@vet.ucm.es Introducción: En 2009 se identificó por primera vez en la familia Pasteurellaceae la capacidad de los plásmidos ColE1 para conferir fenotipo de multirresistencia a antibióticos mediante la cohabitación (1). Recientemente, numerosos estudios están poniendo de manifiesto la importancia de los plásmidos ColE1 en la resistencia a antibióticos (2, 3). Sin embargo, hasta el momento no se conoce bien el comportamiento de estos replicones cuando cohabitan en una misma bacteria. Para ello, en este trabajo transformamos los plásmidos pB1000, pB1005 y pB1006, que portan blaROB-1, strA y tet(O) respectivamente, en Haemohilus influenzae RdKW20 combinándolos de todas las maneras posibles, y analizamos el número de copias, el nivel de resistencia y la carga biológica que suponen los plásmidos para la bacteria portadora. Métodos: Se realizaron ensayos de Concentración Mínima Inhibitoria, análisis del número de copias plasmídicas mediante PCR cuantitativa y se determinó el fitness de las cepas portadoras de plásmidos mediante ensayos de competición directa. Resultados: La resistencia a antibióticos mostrada por los replicones resultó independiente de la cohabitación. No existen, por tanto, interferencias en la expresión de los genes portados por los plásmidos ColE1 cuando estos cohabitan en una misma célula. Del mismo modo, el número de copias plasmídica se mantuvo independientemente de si los plásmidos cohabitaban o no. El hecho de que existan diferencias en los RNAs que regulan la expresión de los plásmidos, permite a los replicones mantener su número de copias de manera independiente. Finalmente los ensayos de competición determinaron que el coste biológico asociado a estos replicones viene determinado por el número total de copias de plásmidos que se encuentren en la bacteria. Conclusiones: La expresión y replicación de los plásmidos ColE1 no depende del resto de los plásmidos ColE1 con los que cohabita. El número total de plásmidos ColE1 presentes en la bacteria determinan el coste biológico asociado a estos replicones. Referencias:

1. San Millán, A. et al. 2009. Multiresistance in Pasteurella multocida Is Mediated by Coexistence of Small Plasmids. Antimicrob. Agents Chemother. 53: 339-404. 2. Pallechi, L. et al. 2011. Characterization Of Small ColE-like Plasmids Mediating Widespread Dissemination of the qnrB19 Gene In Commensal enterobacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 54:678-682 3. Kehrenberg C, et al. 2007. Complete nucleotide sequence of a small qnrS1-carrying plasmid from Salmonella enterica subsp. enterica Typhimurium DT193. J Antimicrob Chemother 60: 903-5

 

 

 

  

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S6‐13 

Metagenómica de ambientes hipersalinos: nuevos microorganismos abundantes en salinas

Ana B. Fernández, María José León, Cristina Sánchez-Porro, Antonio Ventosa Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla 41012 ventosa@us.es 

Introducción: Una salina consiste de una serie de estanques poco profundos unidos entre sí, de manera que el agua del mar va gradualmente concentrándose hasta precipitar el cloruro sódico principalmente y otras sales. En los estanques a medida que va aumentando la salinidad va disminuyendo la diversidad procariota y solo unas pocas especies microbianas presentes son abundantes, convirtiendo a las salinas en un modelo excelente para el estudio de las comunidades microbianas. Las salinas de Santa Pola, Alicante, han sido ampliamente estudiadas desde el punto de vista microbiológico a través de técnicas tanto dependientes de cultivo como de técnicas moleculares independientes de cultivo. Recientemente, hemos utilizado una aproximación metagenómica para obtener más información sobre la biodiversidad procariótica tanto filogenómica como metabólica presente a lo largo del gradiente de salinidad de esta salina. Métodos: Se han estudiado muestras de agua de estanques con concentraciones salinas de 13, 19, 33 y 37% procedentes de las salinas de Santa Pola, Alicante, y de un estanque de la salina de Isla Cristina con 21% de sales totales, a partir de las cuales se obtuvo el ADN metagenómico de la comunidad procariota y se secuenció mediante pirosecuenciación 454. Resultados: Nuestros resultados confirman el predominio de la arquea cuadrada Haloquadratum walsbyi y de la bacteria halófila Salinibacter ruber en los estanques con mayor concentración de sales en la salina de Santa Pola, mientras que en los estanques concentradores intermedios de ambas salinas existe una mayor diversidad de especies pertenecientes a nueve taxones superiores. El ensamblamiento de contigs a partir de las secuencias metagenómicas nos ha permitido detectar la abundante presencia de nuevos representantes de Archaea y Bacteria en estanques concentradores intermedios, como la nanohaloarquea “Candidatus Haloredivivus” y una nueva Gammaproteobacteria relacionada filogenéticamente con el género Alkalilimnicola, que podría constituir un nuevo género y especie.

Conclusiones: El análisis metagenómico llevado a cabo en ambas salinas nos ha permitido desarrollar distintas estrategias y medios de cultivo enfocados al aislamiento de nuevos representantes abundantes en las salinas, como la nueva bacteria halófila moderada perteneciente a las clase Gammaproteobacteria a la que hemos designado como Spiribacter salinus. 

 

 

   

  

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S7‐1 

The two faces of cyanobacterial FurA: a global regulator and a novel redox sensor

Laura Botello-Morte1, M. Teresa Bes1, Begoña Heras2, M. Luisa Peleato1 and María F. Fillat1 1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Sciences, and Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, Zaragoza, Spain 2 Department of Biochemistry, La Trobe University, Melbourne, Australia.

lbotello@unizar.es 

Introducción: The global regulator FurA (ferric uptake regulator) from the filamentous, nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena PCC 7120 links iron homeostasis to nitrogen metabolism and the oxidative stress response, among other processes. FurA contains five conserved cysteine residues, whose redox state is critical for the protein to be transcriptionally active. Four cysteines are arranged in two redox CXXC motifs (C101VKC104 and C141PKC144), which indeed constitute an essential, canonical signature present in the active site of many thiol-disulfide oxidoreductases. Métodos: Biochemical and microbiological approaches were used to analyze the putative contribution of both CXXC motifs to redox properties and functionality of FurA. Resultados: For the first time for a Fur family member, Anabaena FurA was described to exhibit disulfide reductase activity, contrary to other Fur homologs from heterotrophic bacteria evaluated. The presence of several redox states of FurA in vivo, together with the disulfide reductase activity of the protein and the redox potential values of its CXXC motifs which were similar to that of bacterial cytoplasm, lead us to propose FurA as a novel CXXC-based redox sensor in Anabaena. Additionally, some potential FurA-interacting partners were identified by GST-pull down experiments and confirmed in vivo by bacterial two-hybrid assays, namely the putative amidase All1140, the histone-like HU and another FurA molecule. Interestingly, FurA was able to interact with the photosynthetic electron carriers ferredoxin and flavodoxin as well. Conclusiones: Overall, these data evidence that FurA plays a dual role in cyanobacteria, since it takes part in the redox-signalling networks in Anabaena, in addition to working as a global regulator. Referencias: Botello-Morte et al. 2014. Antioxidants and Redox Signaling, 20(9):1396-406.  

   

  

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S7‐2 

Caracterización funcional de las quinasas AbrC1 y AbrC2 del sistema atípico de dos componentes AbrC de Streptomyces

coelicolor Héctor Rodríguez, Sergio Rico, Elsa Franco, Ana Yepes, Ramón I. Santamaría y Margarita Díaz Instituto de Biología Funcional y Genómica (IBFG)/Departamento de Microbiología y Genética. Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)/Universidad de Salamanca. mardi@usal.es

Introducción: Los sistemas de dos componentes (SDC) constituyen mecanismos de respuesta a estímulos ambientales ycontrolan la expresión de genes pueden afectar a la síntesis de antibióticos en Streptomyces. En el trabajopresentado se estudió el papel de dos histidína quinasas: AbrC1 (codificada por el gen SCO4598) y AbrC2(codificada por el gen SCO4597) que junto con el regulador de respuesta AbrC3 (codificado por el genSCO4596) constituyen un SDC atípico que interviene en la regulación de la síntesis de antibióticos [1, 2]. Estosgenes están codificados en la cadena negativa del genoma y entre cada gen existe una región intergénica contamaño suficiente para contener un promotor independiente para cada uno de ellos. Métodos: Con el fin de estudiar la participación de ambas quinasas en la regulación de la producción de antibióticos sehan obtenido mutantes individuales de cada quinasa así como un mutante de deleción de ambas y se hanestudiado sus fenotipos en diferentes medios. Además, se han realizado estudios de expresión de ambosgenes en diferentes condiciones mediante q-RT-PCR. Las capacidades fosforilativas de ambas proteínas seha estudiado indirectamente sobreexpresando el regulador en diferentes cepas (la toxicidad producida por elregulador depende de su nivel de fosforilación) y también fosforilaciones in vitro utilizando para ello fósforomarcado radiactivamente. Resultados: La deleción ∆abrC1 genera una cepa que superproduce actinorhodina (ACT) en los medios NB, NMMP y LB y de CDA en medio NA en relación a la cepa silvestre. Sin embargo el mutante de deleción ∆abrC2 y el doble mutante ∆abrC1/C2 mostraron niveles de producción de antibióticos similares a los de esta cepa parental. Los estudios de expresión indican que ambas quinasas se expresan y lo hacen a niveles similares y que son cotranscritas compartiendo un mismo promotor. En cuanto a las capacidades fosforilativas de las quinasas, su capacidad para autofosforilarse ha sido confirmada utilizando fósforo marcado radiactivamente. Además, se observó (indirectamente) que el regulador se encuentra más fosforilado en el mutante simple ∆abrC1. Conclusiones: Se ha observado que ambas quinasas son funcionales a nivel transcripcional y capaces de fosforilar al regulador. La eficiencia de la quinasa AbrC2 para fosforilar el regulador es mayor que la de la quinasa AbrC1 (inferida a partir de la producción de antibióticos de los mutantes individuales de las quinasas y la toxicidad derivada de la sobreexpresión del regulador) y ambas son capaces de autofosforilarse, habiéndose identificadoen ambas el residuo fosforilable. Referencias:

1. Rico S, Santamaría RI, Yepes A, Rodríguez H, Laing E, Bucca G, Smith CP, Díaz M. Appl Environ Microbiol 2014. 2. Yepes A, Rico S, Rodríguez-García A, Santamaría RI, Díaz M. PLOS ONE 2011, 6:e19980.

  

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S7‐3 

Mapa funcional de la proteína GreA en Escherichia coli.

Llorenç Fernàndez-Coll, Tania Gaviria & Carlos Balsalobre Departament de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Avda. Diagonal 643, 08028 Barcelona llfernandezcoll@ub.edu Introducción: Se ha descrito que la alarmona ppGpp, así como su cofactor DksA o los factores Gre (GreA/B) influyen en la regulación génica mediante la interacción con el canal secundario de la ARN polimerasa (espacio definido entre la subunidad y ’ del holoenzima). Debido al papel de ppGpp en la respuesta estricta, mutantes incapaces de producir ppGppº, así como para su cofactor DksA, son cepas auxotróficas en medio mínimo M9. Vinella et al (2012), describieron que la sobreexpresión de GreA, si bien tiene un efecto tóxico en LB, permite rescatar a la bacteria de esta auxotrofía. En nuestro grupo de investigación hemos descrito (Aberg et al 2009) que en mutantes ∆dksA se produce una inducción en la expresión de fliC -subunidad principal del flagelo- dependiente de GreA. Esto nos permitió sugerir que existe una posible competencia entre DksA y los factores Gre para interaccionar con la RNApol. Métodos y Resultados: Para discernir que aminoácidos son necesarios para la actividad y/o capacidad de unión a la ARNpol de GreA, hemos obtenido, mediante Error-prone PCR, una colección de alelos de greA. Se seleccionaron aquellos que su sobreexpresión no produce un efecto toxico en el crecimiento bacteriano. Hemos obtenido una colección de 20 mutantes puntuales que cumplen este requisito repartidos por los distintos dominios de GreA. Posteriormente, hemos determinado la actividad de los mutantes GreA mediante el efecto que tienen sobre el gen fliC, así como su capacidad de revertir la auxotrofia en M9 de los mutantes ∆dksA o ppGppº. Conclusiones: Estos experimentos nos han permitido inferir un mapa funcional de la proteína GreA, identificando dominios importantes para su actividad catalítica, función regulatoria y unión a la ARN polimerasa. Referencias:

Vinella, Potrykus, Murphy, Cashel. Effects on growth by changes of the balance between GreA, GreB, and DksA suggest mutual competition and functional redundancy in Escherichia coli. J Bacteriol. 194(2):261-73. (2012)

Aberg, Fernández-Vázquez, Cabrer-Panes, Sánchez, Balsalobre. Similar and divergent effects of ppGpp and DksA deficiencies on transcription on Escherichia coli. J Bacteriol. 191(10):3226 -36. (2009)   

  

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S7‐4 

Caracterización de la interacción entre las proteínas RecA y CheW de Salmonella enterica

Oihane Irazoki, Andrés Magán, Montserrat Llagostera, Jordi Barbé y Susana Campoy

Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

Oihane.Irazoki@uab.cat

La proteína RecA es una ATPasa dependiente de DNA que está presente en la mayoría de los miembros del dominio Bacteria. Dicha proteína, aparte de ser la recombinasa principal en bacterias, involucrada en la recombinación homóloga y en los mecanismos de reparación por recombinación1, es también la proteína encargada de activar el sistema SOS, una respuesta génica global frente a lesiones en el DNA2. Incrementando su catálogo de funciones, se ha asociado a dicha proteína con el movimiento en enjambre3,4, también conocido como swarming, un movimiento poblacional especializado y altamente coordinado que muchas especies bacterianas llevan a cabo sobre las superficies semisólidas. Nuestro grupo de investigación ha demostrado que el movimiento en enjambre de Salmonella enterica está estrechamente relacionado con la concentración existente de la proteína RecA y que es necesario que dicha concentración esté en equilibrio con la de CheW, una proteína que acopla los receptores de quimotaxis con la cadena de fosforilación responsable de los cambios de giro del flagelo4.

En el presente trabajo, se ha determinado de forma inequívoca, y mediante ensayos de co-inmunoprecipitación, la interacción directa entre las proteínas RecA y CheW. Además, partiendo de las estructuras tridimensionales resueltas existentes en las bases de datos para ambas proteínas, se han realizado estudios de modelaje, identificando los posibles residuos que estarían involucrados en dicha interacción. Finalmente, se han realizado ensayos in vivo para determinar la implicación real en la interacción de los residuos identificados y corroborar así los modelos generados.

Los resultados obtenidos no sólo han permitido determinar las características de la interacción entre las proteínas RecA y CheW, sino que también permiten hipotetizar sobre el posible encaje de dicha interacción en la estructuración de los receptores de quimiotaxis de S. enterica, en los que no sólo CheW sinó también RecA tienen un papel crucial.

Referencias 1 Lusetti, S.L,, and Cox, M.M.,. 2002.  Annu Rev Biochem 71: 71-100 2 Sassanfar, M. and Roberts, J.W.1990.  J Mol Biol 212: 79-96 3 Gomez-Gomez, J.M., et al. 2007.  BMC Biol 5: 14 4 Medina-Ruiz, M., et al. 2010. Infect Immun 78: 3217-3225   

  

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Vías de toxicidad del prionoide RepA-WH1 en Escherichia coli Laura Molina-García, María Moreno-del Álamo y Rafael Giraldo Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC) laumolina@cib.csic.es, mmoreno@cib.csic.es, rgiraldo@cib.csic.es

Introducción: Las amiloidosis son enfermedades degenerativas (Parkinson, Alzheimer y proteinopatíasespongiformes transmisibles, entre otras) resultado de la agregación de proteínas anormalmente plegadas en oligómeros y fibras amiloides proteotóxicos. Se basan en el cambio conformacional de proteínas que pasan desde un estado soluble a otro agregado incrementando su estructura β-laminar. Los agregados actúan posteriormente como moldes promoviendo dicha transición en moléculas adicionales de proteína nativa. La proteína RepA-WH1 experimenta un cambio conformacional tras unirse a secuencias específicas de DNA que permite controlar alostéricamente su amiloidogénesis invitro (1). Además, la expresión de una variante hiperamiloidogénica de WH1 (A31V), induce una proteinopatía amiloide en E. coli: la proteína se acumula en las células a modo de inclusiones citoplásmicas transmisibles verticalmente de naturaleza amiloide que causan una reducción de la viabilidad celular (2). Nuestros resultados ponen de manifiesto que DnaK, la chaperona Hsp70 de E. coli, contribuye al proceso de amiloidogénesis in vivo, mientras que ClpB (Hsp104), no parece contribuir a la transmisión de propagones durante la división celular (3). Métodos: Se han realizado estudios transcriptómicos, proteómicos y fisiológicos de la respuesta diferencial de E.coli a la expresión de variantes de RepA-WH1 con distinta toxicidad. Resultados: Se han desarrollado análisis genómicos mediante microarrays de Affimetrix para estudiar la respuesta diferencial de toxicidad entre la variante hiperamiloidogénica RepA-WH1(A31V) y unavariante menos tóxica que tiende a formar cuerpos de inclusión RepA-WH1(∆N37). Además se han realizado estudios proteómicos para valorar la coagregación diferencial de proteínas con ambas variantes de RepA. Los resultados obtenidos apuntan a que los procesos implicados son: daño a la membrana, producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que llevan a la depleción de los centros ferro-sulfurosos y a un estrés oxidativo generalizado. Asímismo, se ha realizado una validación fisiológica de estos estudios “ómicos” en los que se han estudiado la integridad de la membrana (resistencia a gentamicina), la respiración celular, los niveles de hierro intra y extracelulares y la hipersensibilidad a peróxido de hidrógeno, confirmando todos ellos la ruta de toxicidad arriba indicada. Conclusiones: El prionoide sintético RepA-WH1 es un sistema minimalista potencialmente útil para estudiar los distintos factores implicados en los procesos genéricos de amiloidogénesis y para la búsqueda de posibles inhibidores de proteinopatías de interés clínico. Referencias:

1. Giraldo R (2007). Proc Natl Acad Sci USA 104: 17388-17393. 2. Fernández-Tresguerres ME, et al., (2010). Mol Microbiol 77: 1456-1469. 3. Gasset-Rosa F, et al., (2014). Mol Microbiol 91(6):1070-87

   

  

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S7‐6 

Importancia de los mutantes individuales del sistema de dos componentes AbrA1/A2 de Streptomyces coelicolor en la

producción de antibióticos y diferenciación Antoraz S., Rico S., Rodríguez H., Díaz M., Santamaría R.I. Instituto de Biología Funcional y Genómica (CSIC / USAL) C/ Zacarías González 2, 37007 Salamanca. Spain. santa@usal.es Introducción: El género Streptomyces es el mayor productor de antibióticos conocido. Dicha producción se encuentra altamente regulada a diferentes niveles, lo cual le permite responder rápidamente a las variables condiciones nutricionales y físico-químicas que encuentra en su hábitat natural, el suelo. Los Sistemas de Dos Componentes (SDC), constituyen la principal vía de señalización en bacterias y están formados por una Histidina Quinasa (HK) y un Regulador de Respuesta (RR). Previamente en nuestro laboratorio se identificó el sistema AbrA1/A2 en Streptomyces coelicolor, un SDC que forma parte de un operón junto a otros dos genes que codifican un sistema de transporte ABC. La deleción del sistema AbrA1/A2 produce un aumento de la producción de los antibióticos actinorrodina (ACT), undecilprodigiosina (RED) y antibiótico dependiente de calcio (CDA), así como acelera la diferenciación morfológica (1). En este trabajo se estudió la importancia de la HK AbrA1 y del RR AbrA2 por separado en la producción de antibióticos en S.coelicolor. Métodos: Los mutantes ∆abrA1 y ∆abrA2 se obtuvieron reemplazando dichos genes por un cassette de resistencia a apramicina y fueron comprobados por Southern Blot. El análisis morfológico de los mutantes se realizó en diferentes medios tanto sólidos como líquidos. Resultados: El fenotipo de los mutantes individuales resultó altamente dependiente del medio. Aunque en algún caso ambos presentaban fenotipos similares al mutante doble ∆abrA1/A2, mayor producción de ACT, RED y CDA, en otros el mutante de la HK era parecido a la cepa silvestre, o ambos mutantes presentaban un fenotipo intermedio entre la cepa silvestre y el mutante de todo el sistema. Durante este estudio también se observó un retraso en la germinación de los mutantes ∆abrA1/A2 y ∆abrA2. Sin embargo, no presentaban diferencias en las curvas de crecimiento obtenidas durante varios días. Conclusiones: La eliminación de tan sólo uno de los componentes del sistema en la mayoría de los casos no conlleva un fenotipo como el del mutante doble, por lo que en esos casos podría estar dándose una regulación cruzada con otras HK o RR ajenos al sistema AbrA1/A2. La red reguladora de Streptomyces adquiere por lo tanto un mayor nivel de complejidad si tenemos en cuenta las posibles interacciones entre los componentes de distintos sistemas. Referencias:

(1) Yepes et al. PLOS ONE 6(5): e19980. doi:10.1371/journal.pone.0019980 

  

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Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids

A. San Millan, R. Peña-Miller, M. Toll-Riera, Z.V. Halbert, A.R. McLean, B.S. Cooper and R.C. MacLean.

Department of Zoology, University of Oxford, Oxford, United Kingdom.

Plasmids are catalysts of bacterial evolution that permit adaptation to novel selective pressures, such as antibiotics. However, it remains challenging to understand how plasmids can persist over the long term as a result of fitness costs associated with plasmid carriage. Classical models predict that horizontal transfer is necessary for plasmids to persist [1,2], but whole genome sequencing has recently revealed that almost half of plasmids are non-transmissible [3]. Here we use a combination of mathematical modelling and experimental evolution coupled to whole genome sequencing to investigate how a simple, non-transmissible plasmid, pNUK73, can be maintained in populations of the pathogenic bacterium P. aeruginosa. We find that positive selection for plasmid-encoded antibiotic resistance and compensatory adaptation allow pNUK73 to become rapidly stabilized. Compensatory adaptation by Pseudomonas aeruginosa recovers the cost associated with plasmid carriage, but compensation alone is not sufficient to maintain the plasmid as a result of segregational loss of plasmids. Positive selection mediated by exposure to antibiotics is necessary to increase plasmid frequency and offset the effects of segregational loss. Crucially, we find that feedback occurs between these processes. Positive selection increases the efficacy of selection for compensatory adaptation by increasing the population size of plasmid-bearing lineages. Compensatory adaptation, in turn, increases the effect of positive selection on plasmid stability by slowing the rate at which the plasmid is lost between episodes of positive selection. Our study provides a new understanding of how plasmids can persist in bacterial populations, and it helps to explain why plasmid-mediated resistance can be maintained in bacterial populations after antibiotic use is stopped.

References:

1. Stewart FM, Levin BR (1977) The Population Biology of Bacterial Plasmids: A PRIORI Conditions for the Existence of Conjugationally Transmitted Factors. Genetics 87: 209-228.

2. Bergstrom CT, Lipsitch M, Levin BR (2000) Natural selection, infectious transfer and the existence conditions for bacterial plasmids. Genetics 155: 1505-1519.

3. Smillie C, Garcillán-Barcia MP, Francia MV, Rocha EP, de la Cruz F (2010) Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev 74: 434-452.

   

  

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Disruption of a phospholipid transporter affects the intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa to antimicrobial agents

targeting bacterial membranes

Daniel Yero1,2, Sònia Martinez-Servat1,2, Lionel Costanero1, Oscar Conchillo1, Mario Ferrer-Navarro1, Xavier Daura1,3, and Isidre Gibert1,2 1 Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 2 Departament de Genètica i de Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 3 Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), E-08010 Barcelona. Daniel.Yero@uab.cat; Isidre.Gibert@uab.cat Introduction The emergence of multidrug-resistant Gram-negative bacteria that cause nosocomial infections is a growing problem worldwide. Particularly, P. aeruginosa displays high intrinsic resistance to disinfectants, organic solvents and a wide variety of antibiotics. We have previously identified a set of upregulated genes in a clinical persistent strain that shows resistance to multiple antibiotics. One of these genes encodes for the periplasmic component (Ttg2D) of an ABC transporter probably involved in maintaining phospholipids asymmetry in the outer membrane by homology with the ortholog system in Escherichia coli. Methods Mutants were obtained from the PAO1 transposon mutant library at the University of Washington. For complementation the entire ttg2 operon (ttg2ABCD) was cloned into the cloning vector pBBR1MCS-5. Antimicrobial susceptibility was tested by using Etest (Biomerieux) and the method to assess solvent tolerance involved overlaying solvent onto agar plates. Biofilm production was measured by staining with crystal violet in polystyrene plates. Slow killing assay of Caenorhabditis elegans by P. aeruginosa was used as a criterion for strain virulence. Recombinant Ttg2D was produced in E. coli using the pET28b vector and 3D structure determined by X-ray crystallographic techniques. Results As expected, P. aeruginosa mutants in the ttg2 operon were more sensitive to organic solvents and the combined action of SDS and EDTA. Moreover low concentration of EDTA significantly affected biofilm formation of all the ttg2 mutants. Additionally, mutations in individual components of ttg2 operon increased the sensitivity to the antibiotic colistin. All these phenotypes could be successfully reverted by complementation with the cloned full operon ttg2. Despite the Ttg2D sequence variation among Gram-negative species, 3D structural studies corroborated this protein participates in the phospholipids transport across the membranes in P. aeruginosa. Mutants in each ttg2 component killed C. elegans faster than the parent strain, probably indicating a different membrane composition could increase their virulence potentials. Conclusions Obtaining data indicates that the P. aeruginosa ttg2 operon products are involved in a resistance mechanism probably taking part in maintaining the permeability of the outer membrane. Interestingly, this mechanism could be involved in the intrinsic resistance to Colistin, a re-emerging antibiotic for multidrug-resistant Gram-negative bacterial infections.

   

  

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CONFERENCIA INAUGURAL

Why Study Nitrogenase?

Luis M. Rubio Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid, Campus de Montegancedo, E-28223-Pozuelo de Alarcón (Madrid), Spain Biological N2 fixation, catalyzed by nitrogenase enzymes, is an essential part of the N cycle that accounts for about two-thirds of the total fixed N2 (most of the remainder is due to the Haber–Bosch process) and can be split into a natural component of the biosphere and an anthropogenic component promoted for agricultural purposes. Nitrogenase is one of the most heavily studied proteins. This is not only due to its enormous ecological and agronomical importance but also because it serves as model to study metalloprotein biosynthesis and catalysis.1,2 This talk reviews some of the most important contributions that nitrogenase studies have made to basic science, from establishing the existence of universal cellular machineries for the assembly of iron-sulfur clusters,3 to finding biologically unprecedented carbon-iron coordination chemistry or a new role for iron-sulfur clusters in metal trafficking.4 The awareness that biological nitrogen fixation could be used as alternative to the synthetic N fertilizers in the implementation of modern sustainable agricultural practices is another underlying driving force of nitrogenase studies. The extensive use of synthetic N fertilizers in developed countries poses enormous environmental threats that must be addressed. In contrast, N fertilization is scarcely used in Sub-Saharan Africa deriving in very low crop yields, poverty and hunger. An ambitious challenge of plant biotechnology is to increase cereal crop productivity by engineering plants to fix their own nitrogen, i.e. by functional expression of bacterial N2 fixation (nif) genes in the plant. The apparent complexity of nitrogenase biosynthesis and its sensitivity to O2 and are the main barriers identified so far.5 However, recent advances in our understanding of nitrogenase biosynthesis6 offer a new perspective over this ambitious agronomical objective. Finally, nitrogenase is also regarded as a promising source of bio-H2. A new strategy to improve nitrogenase H2 production by implementing high throughput selection of randomly generated variants with altered catalytic properties will be discussed. References: 1. Rubio and Ludden (2008), Annu. Rev. Microbiol. 62: 93-111. 2. Hoffman BM et al. (2013), Acc. Chem. Res. 46: 587-595. 3. Johnson DC et al. (2005). Annu. Rev. Biochem. 74: 247-281. 4. Dos Santos PC and Dean DR (2008). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105: 11589-11590. 5. Curatti L and Rubio (2014) Plant Science. In Press. 6. Curatti L et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104: 17626-17631.  

 

  

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NOMBRE COMUNICACIÓN PÁGINA(s) Acebo País, Paloma S1-1, S2-10 10, 25 Aguinagalde, Leire S5-1, S2-2 17, 55 Ainsa Claver, Jose Antonio Aires Maria, José Carlos S3-10 35 Álvarez Arguedas, Samuel S4-1 45 Amblar Esteban, Mónica S1-1, S2-10 10, 25 Aragón Fernández, Virginia Aranda Rodríguez, Jesús S6-1 61 Argandoña Bertrán, Montserrat S3-1, S3-8, S3-12,S3-14 26, 33, 38, 39 Berenguer, José S3-2, S4-7 27, 52 Bernabé Balas, Cristina S3-9, S3-2, S6-7, S6-10, S6-12 34, 62, 67, 70, 72 Blázquez Gómez, Jesús S2-8 23 Blesa Esteban, Alba S3-2 27 Botello Morte, Laura S7-1 74 Broset Blasco, Esther S4-9 54 Caballero, Carlos S3-3 28 Camino Gutiérrez, Eliazar Organización Campoy Sánchez, Susana S7-4 71 Cannatelli, Antonio S6-3 63 Carrillero, Laura S3-9, S6-2, S6-4, S6-7, S6-10,

S6-12 34, 62, 64, 67, 70, 72

Cepeda Molero, Massiel S4-2 46 Cervera Alamar, Mercedes S1-2, S2-7, S3-4 11, 22, 29 Conde Alvarez, Raquel S2-1, S3-19 16, 44 Corsini, Bruno S2-2, S5-1 17, 55 Costas Romero Coloma S2-8 23 Crespo Puig, Anna S3-5 30 Díaz Martínez,Margarita S7-2, S7-6 75, 79 Díez Martínez, Roberto S4-2, S4-3 47, 48 Echeverz Sarasua, Maite S1-3 12 Escolano, Marisol S2-2, S2-5 17, 20 Fernández Coll, Llorenc S2-6, S7-3 21, 76 Fernández Herrero, Luis Angel S4-2, S4-8 46, 53 Ferrándiz Avellano, María José S2-10, S3-6, S3-7 25, 31, 32 García Fernández, Esther S4-3 48 García García, María Jesús S4-5 50 García Valero, Rosa S3-8 33 Gaviria Cantin, Tania S2-6, S7-3 21, 76 Gibert González, Isidre S1-4, S6-9, S7-8 13, 69, 81 Giraldo Suárez, Rafael S7-5 18 González de la Campa,Adela S2-3, S2-5, S2-10, S3-6, S3-7 18, 20, 25, 31, 32 González Torres, Pedro Iñaki S6-5 65 González Pastor, Jose Eduardo S6-6, S6-8 66, 68 González-Zorn, Bruno S3-9, S6-2, S6-4, S6-7, S6-10,

S6-12 34, 62, 64, 67, 70, 72

Gonzalo Asensio, Jesús S4-9, S5-2 54, 56 Gutiérrez Soriano, Belén S1-2, S3-9, S6-2, S6-7, S6-10,

S6-12 11, 34, 62, 67, 70, 72

Guzmán, Katerina S2-7, S3-4 22, 29 Hoefer, Andreas S3-9, S6-2, S6-7, S6-10, S6-12 34, 62, 67, 70, 72 Huedo Moreno, Pol S1-4 13 Irazoki Sánchez, Oihane S7-4 77 Jara Salazar, Luis S6-1 61 Jiménez Cid, Victor S5-5, S5-6 59, 60 Julca Paz, Natalia Irene S4-5 50

  

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Lasa Uzcudum, Iñigo S1-3, S1-6, S2-7, S3-3, S3-17 12, 15, 22, 28, 42 Lopes Ribeiro, Ana Luisa de Jesus S4-7 52 Lopez Ibañez, Alejandra S6-8 68 Martín Brieva, Humberto Martín Galiano, Antonio Javier S2-3, S2-5, S3-6 18, 20, 31 Martín Moldes, Zaira S3-11 36 Martínez Gómez, Estrella S3-19 44 Martínez Ovejero, Cristina S6-2, S6-7, S6-10, S6-12 62, 67, 70, 72 Martínez Servat, Sonia S1-4, S6-9, S7-8 13, 69, 81 Mascaraque Martín, Victoria S4-4 49 Moleres Apilluelo, Javier S5-3 57 Molina García, Laura Moyano Ortega, Gabriel S7-5 78 Munóz Suano, Alba S4-6 51 Muro Pastor, Alicia María S5-4 58 Naranjo Fernández, Emilia S3-12 37 Nieto Gutiérrez, Joaquin J. S3-1, S3-8, S3-12, S3-14 26, 33, 37, 39 Navas Méndez, Jesús S6-11 71 Pérez Sampietro, María S3-13 38 Piubeli, Francine Amaral S3-14 39 Puigpinós Roig, Judit S3-15 40 Rivas Pérez, Elena Rodríguez Beltrán, Jerónimo S2-8 23 Rodríguez Escudero, Isabel S5-5, S5-6 59, 60 Rodríguez Escudero, María S5-5 59 Ruano Gallego, David S4-8 53 Rubio, Luis M. Conferencia Inaugural 82 Sáenz Lahoya, Sonia S3-17 42 Salvador Bescós, Miriam S2-1 16 Salvador Russo, Joan Organización San Martín Fernández de Heredia, Manuel

Organización

San Millan Cruz,Alvaro S6-12, S7-7 72, 80 Sánchez Romero, María Antonia S3-16 41 Sangari García, Felix Javier S2-9 24 Santamaría Martos, Fernando S3-15 40 Santamaría, Ramón S7-2, S7-6 75, 79 Santos López, Alfonso S3-9, S6-2, S6-7, S6-10, S6-12 34, 62, 67, 70, 72 Solórzano, Carla Daniela S3-18 43 Suárez, Mónica Taglialegna, Agustina S1-6 15 Thomas López, Daniel S3-9, S6-2, S6-4, S6-7, S6-10,

S6-12 34, 62, 64, 67, 70, 72

Toledo-Arana, Alejandro S1-6, S2-7, S3-3 15, 22, 28 Tormo Mas, María Angeles S1-2, S2-7 10, 22 Torrents Serra, Eduard S1-5, S2-4, S3-5 14, 19, 30 Valencia, Astrid Secretaría técnica Vallés Rapp, Cristina Comité organizador Ventosa Ucero, Antonio S6-13 73 Wilton Pereira, Joanna S2-10 25 Yero Corona, Daniel S1-4, S6-9, S7-8 13, 69, 81 Yuste, José Enrique S2-2, S2-5, S5-1 17, 20, 55 Zúñiga Ripa, Amaia S3-19 44  

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