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Tests biologiques KRL/RESEDA de mesure du potentiel global de défenses antiradicalaires : Outils d’évaluation des effets écotoxicologiques directs et indirects des nanoparticules sur la santé Atelier thématique nano-environnement – Paris - 19 novembre 2013

Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral – 21560 Couternon

Dr Michel Prost PDG Laboratoires Spiral (Couternon, France)

1

Un Laboratoire d’Analyses basé sur la Lune !

Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral – 21560 Couternon 2

SOMMAIRE


oLe Test biologique KRL

o Le Test biologique RESEDA

o KRL / RESEDA et la logique du vivant

o Stress oxydatif et nanoparticules

3

Introduction du Test Biologique KRL

Il s’agit d’un test biologique simple permettant de mesurer la résistance globale chez l’homme vis-à-vis de l’agression des radicaux libres.

Il existe, de nos jours, un intérêt croissant vis-à-vis de la biologie des radicaux libres. Ce n’est pas seulement dû à leur rôle dans des phénomènes aigus tels que traumatisme ou ischémie, mais aussi à leur implication dans de nombreuses pathologies chroniques.

Il est donc très important de pouvoir définir avec précision l’état de défense des individus contre l’agression des radicaux libres.

Cet état, oxydatif (ou anti-oxydatif) peut aisément être apprécié d’un point de vue dynamique par un test global simple (brevet SPIRAL).

Les radicaux libres constituent des espèces chimiques activées, produites in vivo dans des conditions biologiques normales, mais des agressions diverses et notamment les rayonnements U.V., le stress, la pollution, l’alcoolisme, le tabagisme, etc. accroissent leur formation, conduisant à des états pathologiques. En effet, bien que l’organisme soit naturellement protégé contre ces radicaux libres par des systèmes de détoxification enzymatiques ou chimiques, ces systèmes peuvent être débordés, ce débordement étant lié directement aux facteurs génétiques, environnement, mode de vie, pathologie…, bref “à la capacité de défense de l’individu ”.

….

Il s’agit d’un test biologique simple permettant de mesurer la résistance globale chez l’homme vis-à-vis de l’agression des radicaux libres.

Test global simple : Brevet M.Prost/Spiral

capacité de défense de l’individu

Les radicaux libres constituent des espèces chimiques activées, produites in vivo dans des conditions biologiques normales, mais des agressions diverses et notamment les rayonnements U.V., le stress, la pollution, l’alcoolisme, le tabagisme, etc. accroissent leur formation, conduisant à des états pathologiques


Ces molécules très réactives exercent leurs effets nuisibles :

* au niveau cellulaire : peroxydation des acides gras polyinsaturés des membranes phospholipidiques d’où formation de peroxydes cytotoxiques entraînant phénomènes inflammatoires et mort cellulaire. De plus, les intermédiaires radicalaires oxygénés représentent de véritables activateurs de la carcinogenèse, des maladies cardiovasculaires, etc.

* au niveau extracellulaire : dégradation des principaux constituants d’où modification de la perméabilité et de la structure des tissus, notamment de la peau. Ces altérations contribuent à favoriser la sénescence cutanée et le vieillissement en général.

Les facteurs de protection de radicaux libres sont de deux catégories :

* Enzymatiques : la superoxyde dismutase (SOD), catalase et le sélénium glutathion peroxydase

* Chimiques : les scavengers qui bloquent les radicaux libres, les antioxydants qui limitent les effets des radicaux libres (vitamine C, vitamine A, vitamine E, vitamine K, Se, cystéine, méthionine, ubiquinone, ou coenzyme Q).

Compte tenu de l’ensemble des composés (vitamines, anti-oxydants, pro-oxydants…), des systèmes enzymatiques (glutathion peroxydase, catalase, superoxyde dismutase…) intervenant dans le système de défense anti-radicalaire, tout test spécifique ne peut apporter une appréciation globale de la capacité de résistance d’un individu vis-à-vis de l’agression des radicaux libres. Une approche globale est pourtant nécessaire car même si l’on multiplie le nombre de tests spécifiques, les résultats n’apporteront jamais une réponse tenant compte de l’ensemble des nombreuses variables mises en jeu simultanément chez l’être vivant pour sa défense anti-radicalaire.

au niveau cellulaire

au niveau extracellulaire

Enzymatiques

Chimiques

Ces molécules très réactives exercent leurs effets nuisibles

Une approche globale est pourtant nécessaire car même si l’on multiplie le nombre de tests spécifiques, les résultats n’apporteront jamais une réponse tenant compte de l’ensemble des nombreuses variables mises en jeu simultanément chez l’être vivant pour sa défense anti-radicalaire.

Les facteurs de protection de radicaux libres sont de deux catégories


Les sources cellulaires de radicaux libres

DNA

Noyau

Mitochondrie

Lysosome

Peroxysomes

Reticulum endoplasmique

Membranes lipidiques

Chaîne respiratoire

Peroxydation lipidique Métaux de transition

Lipoxygénase Peroxydase

Oxydases Flavoprotéines

Xanthine oxydase Hémoglobine

Cytochrome P450 et b5 "Oxygen burst "/ NADPH oxydase Myeloperoxydase

Adapté de LJ Machlin et al., FASEB J, 1987


Les protections cellulaires contre les radicaux libres

DNA

Adapté de LJ Machlin et al., FASEB J, 1987

Mitochondrie

Noyau

Peroxysomes

Membranes lipidiques

Lysosome Reticulum endoplasmique

Vitamine E

Glutathion réduit Thioredoxine

-carotène

Vitamine C

Vitamine C

Vitamine E

-carotène

Vitamine E -carotène Polyphénols

Polyphénols Ubiquinone

Superoxyde dismutase (Mn)

Superoxyde dismutase (Cu/Zn) Glutathion peroxydases (Se)

Catalase


Pathologies

Peroxydation des lipides. Oxydation des glucides et des protéines. Altération de l’ADN.

Stress

Production de radicaux libres

- Chaîne respiratoire - NADPH oxydase (Macrophages) - Système de détoxification hépatique : Cytochrome P450 - Autres systè mes redox : Oxydases et peroxydases …

Défenses antiradicalaires Enzymatiques : Superoxyde dismutases,

Catalase, Glutathion peroxydase Chimiques : Oligoéléments : Cu, Mn, Zn, Se Albumine, Acide urique, Bilirubine, Glutathion, Vitamines C, E, Caroténoïdes, Polyphénols

Protéines de réparation …

Déséquilibre entre la production et la destruction des radicaux libres


Principe du test KRL

Erythrocyte

0 50 100 1500

20

40

60

80

100

Temps (min)

Hém

oly

se (

%)

Cellule lysée

0% Hémolyse

100% Hémolyse

Flux lumineux

Attaque radicalaire 50% Hémolyse


RO · Vit C

ROH DHA

NADPH

6P-gluconate

NADP G6P

GRed

G6PDH

2 O 2

- · O 2

2 H + H 2 O 2

SOD

2 H 2 O +O 2

2 H 2 O 2

Catalase

GSSG

GSH

Glutaredoxine

RO · - , ROO · Vit E Vit C NADH

ROH, ROOH Vit E · Vit C NAD

Ubiquinone GSH

Ubiquinone Vit E

GSSH

oxydée

Ascorbate Réductase

Vit E radical Réductase

2 2 2

GSSG

2 H O H O

GPX Sélénium

Fer Cuivre Zinc

Manganèse

Défenses antioxydantes : Un Système complexe


·

10

11

Principales Cibles des Radicaux Libres & Pathologies associées

CERVEAU, SYSTEME NERVEUX Stress psychologique, Syndrome de Down, Parkinson, Alzheimer, scléroses multiples, SLA …

VISION Cataracte, rétinopathies, dégénérescence maculaire (DMLA) …

SYSTEME RESPIRATOIRE & CARDIOVASCULAIRE Asthme, cancers, emphysème, fibrose pulmonaire varices, syndrome de détresse respiratoire de l’adulte, athérosclérose, dommages de reperfusion, …

SYSTEME DIGESTIF Cancers, cirrhoses, colites, diabètes, maladie de Crohn

PEAU Rides, mélanomes, brûlures, eczéma, …

MUSCLES & ARTICULATION Arthrite rhumatoïde, inflammations locales musculaires, tendinites …

ORGANISME Cancers, maladies auto-immunes, Syndrome métabolique, …


Altérations des défenses antiradicalaires érythrocytaires chez les rats diabétiques

0 50 100 1500

20

40

60

80

100 Témoins

Diabétiques

Temps (min)

Hém

oly

se (

%)


Altérations des défenses antiradicalaires érythrocytaires chez des patients athéroscléreux

0 50 100 150 2000

20

40

60

80

100 Témoin

Patient 1

Patient 2

Patient 3

Temps (min)

Hém

oly

se (

%)

Blache, D. and M. Prost. Free radical attack: Biological test for human resistance capability. In Proceedings of the IX College Park Colloquium on Chemical Evolution (29-31 October 1989): A Lunar-Based Chemical Analysis Laboratory (LBCAL). C. Ponnamperuma and C. W. Gehrke, editors. NASA, Washington D.C., pp. 82-98.


100

110

120

130

140

150

SansexpositionN =26

ExpositionoccasionnelleN = 134

ExpositionrégulièreN = 24

Tem

ps d

ed

em

i-h

ém

oly

se (

min

)


Effet de l'exposition au soleil sur le potentiel de défense antiradicalaire

14

0 50 100 150 200 2500

20

40

60

80

100 Avant

Après

Temps (min)

Hém

oly

se (

%)

Bien que les sportifs réguliers semblent mieux

protégés, une diminution du potentiel de défense

antiradicalaire globale est mesurée après un effort

physique prolongé

100

110

120

130

140

150

P < 0.01Non-sportifs

Sportifs occasionnels

Sportifs réguliers

N = 46 N = 66 N = 72

Te

mp

s d

ed

em

i-h

ém

oly

se

(min

)


Influence de l’exercice physique sur le potentiel de défense antiradicalaire

15

Influence de la consommation de fruits et de compléments vitaminiques

100

110

120

130

140

150

160 Pas de prise decomplémentsvitaminiques

Prise de complémentsvitaminiques

< 1 fruit/jour

1 fruit/jour

> 1 fruit/jour

N = 165 N = 19 N = 53 N = 54N = 77

P < 0.01

P < 0.01 P < 0.01

Te

mp

s d

ed

em

i-h

ém

oly

se

(min

)

100

110

120

130

140

P < 0.001

N = 115 N = 25 N = 44

Non-fumeurs

Fumeurs occasionnels

Fumeurs réguliersTe

mp

s d

ed

em

i-h

ém

oly

se

(min

)


Effet du tabac sur le potentiel global de

défense antiradicalaire

16

Effet du stress psychologique sur le potentiel global de défense antiradicalaire

100

110

120

130

140

150Faible

Modéré

Elevé

Faible

Modéré

Elevé

P < 0.01P < 0.001

N = 77 N = 81 N = 26 N = 81N = 92 N = 11

Stress au travail Stress dans la vie

Te

mp

s d

ed

em

i-h

ém

oly

se

(min

)

Lesgards, JF., P. Durand, M. Lassare, P. Stocker, G. Lesgards, A. Lanteaume, M. Prost., and MP. Lehucher-Michel. 2002. Assessment of lifestyle effects on the overall antioxidant capacity of healthy subjects. Environ. Health Perspect. 110:479-487.


Test KRL marqué CE


SOMMAIRE


o Le Test biologique KRL

oLe Test biologique RESEDA



19

0

ST-SALCh

123456-07161527

07161527Graph-HB

Sang

total

Hématies

Temps de

demi-hémolyse

Latence

Temps de

demi-hémolyse

Latence

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

Temps (min)

Absorb

ance

Cinétique d'hémolyse

Hématies : zone "normale" Sang total :

zone "normale"

Résistance du sang total Résultats Valeurs 'normales' Commentaires

Temps de demi-lyse (min) : 95,7 84,0 101,0 T 1/2 normal

Temps de latence (min) 76,6 70,0 87,0 Latence normale

Vitesse max (mUA/min) -30,4

Résistance des hématies Résultats Valeurs 'normales' Commentaires

Temps de demi-lyse (min) : 69,5 66,0 75,0 T 1/2 normal

Temps de latence (min) 55,3 52,0 61,0 Latence normale

Vitesse max (mUA/min) -37,4


Test KRL : Valeurs “normales”

20

Evaluation du potentiel de défense antiradicalaire global d'un patient cancéreux avant et après une séance d'ICT

65

70

75

80

85

90

PS1 30/08 avt ICT

PS2 31/08 ap ICT

PS3 01/09 ap ICT

P < 0.001

T1/2 = 82.62 ± 0.33

T1/2 = 83.56 ± 0.30

T1/2 = 73.79 ± 0.67

T1/2 (min)

MOY ± SEM

(n = 12)

T1/2

(min

)

65

70

75

80

85

90

PS1 30/08 avt ICT

PS2 31/08 ap ICT

PS3 01/09 ap ICT

P < 0.001

T1/2 = 82.62 ± 0.33

T1/2 = 83.56 ± 0.30

T1/2 = 73.79 ± 0.67

T1/2 (min)

MOY ± SEM

(n = 12)

T1/2

(min

)


Effet d’un traitement antioxydant sur l’efficacité antiradicalaire de cochettes au cours du stress de la mise-bas

20

25

30

35

40

* *

*

Témoins Traités Témoins Traités Témoins Traités

Jour 0 Jour 19 Jour 29

#

**

Po

urc

en

tag

e d

e la

résis

tan

ce

an

tira

dic

ala

ire d

u s

an

g(%

)


Test RESEDA : Réserves de Défenses Antiradicalaires

RESEDA : Réserves de Défenses Antiradicalaires - Brevet M. PROST - Octobre 2003

Tapez une équation ici. +

Groupements antiradicalaires en réserve

Libération de réserves antiradicalaires

• Glucosidase (R1) • Sulfatase (R2) • Glucuronidase (R3)

+

R3 R2


KRL hématies

KRL sang total

RESEDA

R2

R1

R3


Test RESEDA : Réserves de Défenses Antiradicalaires

SOMMAIRE




oKRL / RESEDA et la logique du vivant


25

Domaines d’application du test KRL De nombreux nutriments au pouvoir antioxydant

reconnu sont apportés par l’alimentation et les

compléments alimentaires:

Vit. A, C, E, oligo-éléments, sélénium, caroténoïdes,

polyphénols, …

La connaissance de l’efficacité réelle d’aliments ou de

compléments contre l’agression des radicaux libres

leur apporte une valeur ajoutée considérable.

,

Les médicaments, leurs

métabolites et les

cosmétiques peuvent

avoir une action anti-

oxydante en aidant les

organismes à se défendre

contre l’agression

radicalaire ou au contraire

pro-oxydante en

favorisant la formation de

radicaux libres.

La mesure biologique du potentiel global de

défense antiradicalaire chez l’homme, l’animal ou

la plante peut être réalisée dans un cadre de

prévention ou de suivi de traitement.


Stress Oxydatif

Mécanismes

de Défense

Elevage et Stress Oxydatif

Sélection des espèces plus résistantes au stress

Optimisation des conditions d’élevage, amélioration de

l’alimentation, complémentation

Optimisation des conditions d’abattage, diminution du stress

Amélioration des propriétés organoleptiques de la viande

Amélioration de la conservation des viandes et dérivés

Agriculture et Stress Oxydatif


Diminution des traitements phytosanitaires

Optimisation des traitements : Conservation des oligo-éléments, des

vitamines, des polyphénols

Amélioration de la conservation des fruits et légumes

Amélioration de la conservation des produits à base de plante

Forêt & plantes naturelles et Stress Oxydatif


Impact de la pollution (air, eaux, sols)

Etude des défenses mises en œuvre par certaines plantes contre

les agressions diverses dont le stress oxydatif

Amélioration des défenses intrinsèques des plantes

Faune et Stress Oxydatif

Suivi de l’état de santé des animaux d’après leur potentiel global de

défense antiradicalaire

Comparaison inter-espèces

Impact de la pollution des villes et des campagnes

Sauvegarde des espèces en voie de disparition

Environnement

Forêts

Patrimoine

Elevage

Bovin, avicole,

porcin

Agriculture

céréales,

épices


SOMMAIRE





oStress oxydatif et nanoparticules

28

Problématique des nanoparticules en santé humaine et animale


Nanoparticules

Inhalation Ingestion

peau, oreille, œil Poumons Système digestif

foie, rein, rate, système cardiovasculaire, cerveau…

Inflammation

Stress oxydatif

Génotoxicité

29

Contact

RESEDA KRL

Nanoparticules et stress oxydatif


Nanoparticules d’oxyde métallique et nanotubes de carbone

?

Effet dépendant de la taille (surface spécifique), de la nature chimique, de la forme

cristalline des nanoparticules et de la présence d’impuretés

Les connaissances dans ce domaine sont encore très incomplètes

Activation des facteurs proinflammatoires

Production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO)

Stress oxydatif

Oxydation des biomolécules, altération du matériel génétique, apoptose…

? Différents

Mécanismes

30

RESEDA KRL

Effet de nanoparticules de TiO2 sur le Test KRL


Essais réalisés avec des nanoparticules confiées par le Pr Corinne Chanéac Chimie de la Matière Condensée de Paris UMR 7574 – Site Collège de France AC : TiO2 Anatase cube

RS : TiO2 Rutile standard bâtonnet

Effet de nanoparticules de TiO2 sur le Test RESEDA


Capacité antioxydante de nanocristaux de quercétine (Test KRL)


PCS : photon correlation spectroscopy E : 204 nm; A : 640 nm R. Chen, M. Prost, L. Greiner, R. H. Müller, C. M. Keck.

33

640 nm

204 nm

La capacité antioxydante de nanoparticules chargées en Coenzyme Q10


usNLC : ultra-small lipid nanocarriers < 100 nm; NLC : nanostructured lipid carriers ~225 nm; NE : nanoemulsion Baisaeng, N., Prost, M., Durand, P., Müller, R.H., Keck, C.M. "In vitro evaluation of antioxidant potential of coenzyme Q10-loaded ultra-small lipid nanocarriers"

34

< 100 nm

~225 nm

Hormesis effect

3 rue des Mardors F-21560 Couternon, France 33 3 80 32 01 10 33 3 80 32 01 11 [email protected] [email protected]


Nous vous remercions

de votre attention

Système KRL Test


tests biologiques krl/reseda de mesure du potentiel global ... · introduction du test biologique...

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