Test Rapido su Card Leishmania IgG/ IgM Combo (Siero/Plasma/Sangue intero) Pagina 1 di 2

vitroUSO PREVISTO

Il Test Rapido Leishmania IgG/IgM Combo è un test immunocromatografico a flusso lateraleper la determinazione e differenziazione degli anticorpi IgG e IgM anti-Leishmania donovani(L. donovani), il protozoo che causa la leishmaniosi viscerale, nel siero,nel plasma e nelsangue intero umani. Il test è utile come screening e come aiuto nella diagnosi dell’infezioneda leishmaniosi viscerale. Come per ogni test diagnostico, tutti i campioni che risultino positivicon questo test devono essere confermati con altri metodi alternativi.

SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL TEST

La leishmaniosi viscerale o Kala-azar, è un'infezione diffusa causata da numerose sottospeciedi L. donovani. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha stimato che la malattiainfetta circa 12 milioni di persone in 88 paesi1. E trasmessa all'uomo dalle punture deiflebotomi Phlebotomus, che acquisiscono l'infezione da alimenti o da animali infetti. Anche seè una malattia dei paesi poveri, nel Sud Europa, è diventata l'infezione opportunistica leader inpazienti affetti da AIDS2-3.

L’identificazione dell'organismo L. donovani dal sangue, midollo osseo, fegato, linfonodi o dellamilza fornisce un mezzo definito di diagnosi. Il rilevamento sierologico di IgM anti-L. donovaniè un eccellente marcatore per la leishmaniosi viscerale acuta. I test utilizzati in clinica sonoquelli ELISA, immunofluorescenza o il test di agglutinazione diretta. 4-5 Recentemente, l'utilizzonel test di proteine specifiche L. donovani ha migliorato la sensibilità e la specificità6-7.

Il Test Rapido Leishmania IgG/IgM Combo è un test serologico basato sul ricombinante rK39,che rileva contemporaneamente gli anticorpi IgG e IgM di L. donovani. Il testfornisce un risultato affidabile in 15 minuti senza strumenti.

PRINCIPIO

Il Test Rapido Leishmania IgG/IgM Combo è un test immunocromatografico a flusso laterale.La card è composto da: 1) un coniugato color Borgogna contenente l’antigene ricombinanterK39 coniugato con oro colloidale (coniugato Leishmania) e IgG di coniglio coniugate con orocolloidale; 2) una striscia di membrana di nitrocellulosa contenente due bande del test (bande Ge M ) e una banda di controllo (banda C). La banda M è pre-rivestita con anticorpo monoclonaleanti-IgM umane per la rilevazione di IgM anti-L. donovani, la banda G è pre-rivestita con reagentiper la determinazione di anticorpi IgG anti- L. donovani, e la banda C è pre-rivestita con anticorpidi capra anti IgG di coniglio.

Quando un adeguato volume di campione è erogato nel pozzetto del dispositivo, il campionemigra per azione capillare attraverso la card. Gli anticorpi IgM se presenti nel campione delpaziente si legano al coniugato Leishmania. L’immunocomplesso allora è catturato sullamembrana pre-coattata con anticorpi anti-IgM umane, formando una banda M di colorebordeaux , indicando risultato del test positivo per L. donovani.

Gli anticorpi IgG se presenti nel campione del paziente si legano ai coniugato Leishmania.L’immunocomplesso allora è catturato sulla membrana pre-coattata con anticorpi anti-IgGumane, formando una banda G di colore bordeaux , indicando risultato del test positivo L.donovani.

L’assenza delle bande T (M e G) suggerisce un risultato negativo. Il test contiene un controllointerno (banda C) che dovrebbe esibire una banda colorata Borgogna dell’ immunocomplesso diIgG di capra anti-coniglio/ coniugato IgG-oro di coniglio, senza sviluppo di colore sulla banda T.Altrimenti, il risultato della prova non è valido e il campione deve essere riprovato con un altrodispositivo.

REAGENTI E MATERIALE FORNITO

1. Ogni kit contiene: 25 o 30 cards, ciascuna delle quali sigillata in un sacchetto con all’interno tre articoli:a)una card,b)un contagocce di plastica ec)un essiccante2.Diluente campione (1 flacone,5 ml).3.Una metodica (istruzione per l’uso).

MATERIALE CHE POTREBBE ESSERE RICHIESTO MA NON FORNITO

1. Controllo positivo2. Controllo negativo

MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO

1. Orologio o Timer2. Pungidito per il test su sangue intero.3. Pipetta in grado di erogare 20 microlitri con una precisione migliore del 1,5%.

PRECAUZIONI

Per uso diagnostico in vitro1. Questa metodica deve essere letta completamente prima dell'esecuzione del test. L'omissione di parte della metodica può dare risultati del test inesatti.2. Aprire il sacchetto sigillato solo prima di eseguire il test.3. Non utilizzare card scadute.4. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (15-30°C) prima dell'uso.5. Non usare componenti appartenenti ad altri kit per eseguire il test con questo kit.6. Non usare campioni di sangue emolizzati.

7. Indossare abbigliamento protettivo e guanti monouso mentre si maneggiano i reagentidel kit e i campioni. Lavare accuratamente le mani dopo aver eseguito il test.

8. Gli utilizzatori di questo test dovrebbero seguire le precauzioni universali di CDC degliStati Uniti per la prevenzione della trasmissione del HIV, di HBV e di altri agentipatogeni.

9. Non fumare, non bere, o non mangiare nelle zone dove si maneggiano i campioni o ireagenti.

10. Disporre tutti i campioni e i materiali utilizzati in un contenitore di rifiuti bio-pericolosi.11. Maneggiare il controllo negativo e positivo come i campioni.12. I risultati del test dovrebbero essere letti entro 15 minuti dopo che il campione è

stato deposto nel pozzetto. Il risultato della lettura eseguito dopo 15 minuti, puòfornire risultati errati.

13. Non effettuare il test in una stanza con corrente d'aria forte, in presenza di ventilatorielettrici o di aria condizionata forte.

CONSERVAZIONE E PREPARAZIONE DEI REAGENTI

Tutti i reagenti sono pronti all’uso. Conservare le card inutilizzate, non aperte a 2-30°C.I controlli positivi e negativi dovrebbero essere mantenuti a 2°C-8°C. Se conservate a 2-8°C,accertarsi che le card siano portate alla temperatura ambiente prima dell'apertura. Il kit è stabilefino alla data di scadenza stampata sul sacchetto sigillato. Non congelare il kit o non esporlo atemperature superiori ai 30°C.

PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI REAGENTI

Tutti i campioni devono essere considerati potenzialmente pericolosi e, pertanto, vannomanipolati con le precauzioni d’uso relative ai prodotti potenzialmente infettivi.Plasma1. Raccogliere il campione di sangue nelle provette di raccolta blu o verde, (Vacutainer® che contiene rispettivamente EDTA, citrato o eparina) tramite prelievo.2. Separare il plasma tramite centrifugazione.3. Rimuovere con attenzione il plasma e metterlo in un nuovo tubo .Siero1. Raccogliere il campione di sangue nelle provette di raccolta con il tappo blu(Vacutainer® che non contiene anticoagulanti) tramite prelievo.2. Permettere la coagulazione del sangue.3. Separare il plasma tramite centrifugazione.4. Rimuovere con attenzione il siero e metterlo in un nuovo tubo .

Testare appena possibile i campioni dopo la raccolta. Conservare i campioni a 2-8°C se nonesaminati immediatamente. Conservare i campioni a 2-8°C fino a 5 giorni. Per unaconservazione di lunga durata,i campioni dovrebbero essere congelati a -20°C. Evitare ripetuticicli di congelamento e scongelamento. Prima del test, portare lentamente i campioni congelatia temperatura ambiente e mescolare delicatamente. I campioni, che contengono particolativisibili, dovrebbero essere centrifugati prima del test. Per evitare interferenze,non usarecampioni che mostrano una forte lipemia, torbidità o che sono emolizzati.

Sangue interoGocce di sangue possono essere ottenute tramite puntura del dito o provetta capillare. Nonutilizzare sangue emolizzato. I campioni di sangue intero, se non testati immediatamente,devono essere conservati a una temperatura di 2-8°C. I campioni devono essere testati entrole 24 ore dal prelievo.

PROCEDURA

Step 1 : Portare i componenti del kit e i campioni a temperatura ambiente, se refrigeratio congelati. Mescolare bene il campione,dopo averlo scongelato,primadell'analisi.

Step 2: Estrarre la card dall’involucro e utilizzarla il prima possibile. Appoggiare la card su unasuperficie piana e pulita.

Step 3 Assicurarsi che alla card corrisponda il numero di identificazione del campione.

Step 4: Test su sangue intero:Erogare una goccia di sangue intero (circa 40-50 µl) . Poi addizionare una goccia didiluente campione (circa 35-50 µl).

or

1 goccia di sangue intero 1 goccia di diluente campione

Diagnostico in

ADRT0121

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Test su siero o plasma:Dispensare 20 µl di campione nel pozzetto campione . Poi addizionare 2 gocce didiluente campione ( circa 70- 100 µl).

Risultati

20 µL di siero/plasma 2 gocce di diluente campione 15 minuti

5): Far partire il timer.

6): I risultati devono essere letti in 15 minuti. I risultati positivi possono essere visibili in 1minuto

Non leggere il risultato dopo 15 minuti . Per evitare dei malintesi, gettare il dispositivodopo l’interpretazione del test.

CONTROLLO DI QUALITA’

Utilizzando la Card per Test Rapido Leishmania IgG/IgM come descritto nella procedura deltest di cui sopra, eseguire 1 controllo positivo e 1 controllo negativo (fornito su richiesta) nelleseguenti circostanze per monitorare le prestazioni del test:1. Un nuovo operatore utilizza il kit, prima di eseguire l'analisi di campioni.2. Un kit nuovo viene utilizzato.3. Un nuovo lotto del kit viene utilizzato.4. La temperatura usata durante la conservazione del kit cade al di fuori di 2-30 ° C.5. La temperatura della zona del non rientra di 15 -30 ° C.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Se solo la banda C si sviluppa, l’assenza delle bande M e G indica che non sonorilevabili anticorpi anti-L. donovani. il risultato è negativo.

2. RISULTATO POSITIVO:2.1 Oltre alla presenza della banda C, se si sviluppa soltanto la banda M,il test indica lapresenza di anticorpi IgM anti- L. donovani. Il risultato è positivo.

.

2.2 Oltre alla presenza della banda C, se si sviluppa soltanto la banda G, il test indica lapresenza di anticorpi IgG anti- L. donovani.Il risultato è positivo.

2.3 Oltre alla presenza della banda C, si sviluppano le bande G e M, il test indica la presenzadi entrambi gli anticorpi IgG e IgM anti- L. donovani. Il risultato è positivo.

Prima di una diagnosi,i risultati clinici dei campioni con risultati reattivi, devono essereconfermati con metodi di sperimentazione alternativi.

3. NON VALIDO: Se la banda C non si sviluppa,la prova non è valida anche se si sviluppano lebande T. Ripetere la prova.

PERFORMANCE

1. Performance cliniche per il test IgMUn totale di 234 campioni di soggetti suscettibili sono stati esaminati con il test LeishmaniaIgG/IgM Combo e confrontati con un kit commerciale EIA. Il confronto di tutti i pazienti è indicatonella seguente tabella:

Leishmania IgG/IgM ComboIgM EIA Positivo Negativo TotalePositivo 31 3 34Negativo 1 199 200

Totale 32 202 234Sensibilità: 91.2% Specificità: 99.5%. Intervallo di confidenza: 98.3%

2. Performance cliniche per il test IgGUn totale di 214 campioni di soggetti suscettibili sono stati esaminati con il test LeishmaniaIgG/IgM Combo e confrontati con un kit commerciale EIA. Il confronto di tutti i pazienti è indicatonella seguente tabella:

Leishmania IgG/IgM ComboIgG EIA Positivo Negativo TotalePositivo 13 1 14Negativo 2 198 200

Totale 15 199 214Sensibilità: 92.9% Specificità: 99.0%. Intervallo di confidenza: 98.6%

LIMITI DEL TEST1. La procedura di analisi e l'interpretazione dei risultati di analisi devono essere seguite moltoattentamente quando si verifica la presenza di anticorpi anti- Leishmania typhi e paratyphi nelsiero o plasma o sangue intero di diversi soggetti. L'omissione di parte della procedura puòfornire risultati inesatti.2. Il test rapido Leishmania IgG/ IgM Combo si limita alla rilevazione qualitativa di anticorpianti-Leishmania nel siero, plasma o sangue intero umano. L'intensità della banda del test nonè correlato con il titolo dell'anticorpo nel campione.3. Un risultato negativo indica l'assenza di rilevazione di anticorpi anti- Leishmania. Tuttavia, unrisultato del test negativo non preclude la possibilità di esposizione e/o di infezione conLeishmania.4. Un risultato negativo si può ottenere se la quantità di anticorpi anti- Leishmania presentinel campione è sotto i limiti di rilevazione dell'analisi, o gli anticorpi che sono rilevati non sonopresenti durante la fase della malattia in cui il campione è raccolto.5. Alcuni campioni contenenti un titolo insolitamente alto di anticorpi eterofili o di fattorereumatoide possono influenzare i risultati attesi.6. Se il sintomo persiste, mentre il risultato del Il test rapido Leishmania IgG/ IgM Combo èrisultato non reattivo, si consiglia di ri-testare il campione del paziente dopo qualche giorno o ditestare con metodi alternativi, come il test ELISA.7. I risultati ottenuti con questo test dovrebbero essere interpretati solo in combinazione conaltre procedure diagnostiche e altri risultati clinici.

BIBLIOGRAFIA

1. WHO. Control of the Leishmaniasis. World Health Organization. Technical ReportSeries 1990. No. 793.

2. Rosenthal E, Marty P. Visceral leishmaniases. Rev Prat. 2004;54(20):2211-6.3. Molina R, Gradoni L, Alvar J. HIV and the transmission of Leishmania. Ann Trop Med

Parasitol. 2003 ;97 Suppl 1:29-45.4. Allain DS, Kagan IG. A direct agglutination test for leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg.

1975 ;24(2):232-6.5. Badaro R, Reed SG, Carvalho EM. Immunofluorescent antibody test in American

visceral leishmaniasis: sensitivity and specificity of different morphological Am J TropMed Hyg. 1983;32(3):480-4.

6. Maalej IA, Chenik M, Louzir H, Ben Salah A, et, al. Comparative evaluation of ELISAsbased on ten recombinant or purified Leishmania antigens for the serodiagnosis ofMediterranean visceral leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg. 2003 68(3):312-20.

7. Burns JM Jr, Shreffler WG, Benson DR, Ghalib HW, Badaro R, Reed SG. Molecularcharacterization of a kinesin-related antigen of Leishmania chagasi that detects specificantibody in African and American visceral leishmaniasis. Proc Natl Acad Sci U S A.1993 Jan 15;90(2):775-9.

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