S1  

Supporting Information for: 

Polyarginine Interacts more Strongly and Cooperatively than Polylysine  

With Phospholipid Bilayers 

 

Aaron D. Robison1, Simou Sun3, Matthew F. Poyton3, Gregory A. Johnson2, Jean‐Philippe Pellois1,2, Pavel 

Jungwirth5,6*, Mario Vazdar7,6*, Paul S. Cremer3,4*  

 

June 3, 2016 

 

1Department  of  Chemistry,  2Department  of  Biochemistry  and  Biophysics,  Texas  A&M  University, 

College Station, TX, 77843 

3Department of Chemistry, 4Department of Biochemistry and Molecular Cell Biology, The Pennsylvania 

State University, University Park, Pennsylvania 16802, United States 

5Institute  of  Organic  Chemistry  and  Biochemistry,  Academy  of  Sciences  of  the  Czech  Republic, 

Flemingovo nám. 2, 16610 Prague 6, Czech Republic  

6Department of Physics, Tampere University of Technology, P.O. Box 692, FI‐33101 Tampere, Finland 

7Division  of  Organic  Chemistry  and  Biochemistry,  Rudjer  Bošković  Institute,  P.O.B.  180,  HR‐10002 

Zagreb, Croatia 

 

*E‐mail: pavel.jungwirth@uochb.cas.cz, mario.vazdar@irb.hr, and psc11@psu.edu  

 

 

 

S2  

Separation of rhodamine‐B isomers. Mixed isomers of rhodamine B POPE were separated into the pH‐

sensitive,  ortho‐,  and  insensitive,  para‐isomers  via  thin  layer  chromatography  (TLC).  To  do  this,  the 

mixed  isomers were dissolved  in chloroform and spotted onto a TLC plate  (EMD, 5715‐7, silica gel 60 

F254) and developed with a mixture of ammonium hydroxide solution and n‐propanol in a volume ratio 

of 35:65. 

Peptide synthesis. The amino acids, Fmoc‐Lys(Boc)‐OH and Fmoc‐Arg(Pbf)‐OH, were used to synthesize 

H2N‐KKKKKKKKK‐NH2 (Lys9)  and  H2N‐RRRRRRRRR‐NH2 (Arg9)  by  traditional  Fmoc  solid  phase  synthesis 

methods. Rink amide MBHA resin was used to obtain a C‐terminal amide. Amino acid coupling reactions 

were performed  in glass synthesis vessels with N2 bubbling  for agitation. Deprotection of the resin by 

removal of  the  Fmoc  group was performed by addition of 20% piperidine  in DMF. This  reaction was 

performed a first time for 5 min, followed by a DMF wash, then a second time for 15 min, also followed 

by a DMF wash. Subsequent additions of amino acids were carried out in sequential coupling reactions. 

Each  coupling  reaction  consisted of  the Fmoc‐amino acid, HBTU, and DIEA  (4, 3.9, and 10‐fold molar 

equivalent to resin amino groups, respectively) in DMF for 4 hrs. After each coupling reaction, the resin 

was washed with DMF, followed by Fmoc deprotection (same as above) for the next coupling reaction. 

After  completion  of  the  peptide  sequences,  the  N‐terminal  Fmoc  group  was  deprotected  and  the 

peptide was cleaved from the resin. The peptide cleavage reaction was performed with TFA containing 

2.5% H2O and 1% triisopropylsilane for 2 hr  in order to remove all side chain protecting groups and to 

cleave  the peptide  from  the  resin. Crude peptide  in  the  resulting TFA solution was  then washed with 

cold anhydrous ethyl ether to induce peptide precipitation. After three washes of ethyl ether, the ether 

was poured off and the crude peptides were dissolved in acetonitrile and lyophilized. Lys9 and Arg9 were 

purified by reversed phase C18 HPLC and their masses were confirmed by MALDI‐TOF. The Lys9 expected 

mass was 1170.58 amu and  its observed mass was 1170.96 amu, while Arg9 has an expected mass of 

1422.70 amu and the observed mass was 1422.74 amu. 

 

pH  Titration  Curves.  Supported  lipid  bilayers  containing  0.5  mol%  ortho‐rhodamine  B  and  varying 

amounts of POPC and POPG were  formed within  flow  cell devices. Excess vesicles were  then  flushed 

away with  10 mM  PBS with  150 mM NaCl  at  different  pH  values.  The  fluorescence  signal  from  the 

bilayers was monitored  and measured  after  stabilization.  A  sample  fluorescence micrograph  and  its 

corresponding linescan are shown in Figure S1. These measurements were used to form titration curves 

of  the pH sensitive dye as a  function of  the POPG concentration  in  the bilayer. The data points were 

 

normalize

apparent 

B dye shif

text). This

concentra

specific p

the  pH  v

interactio

Figure  S1

rhodamin

fibrinogen

the  bilaye

right show

micrograp

 

ed  to  the  hig

pKa values w

fted to highe

s indicated th

ations of neg

H range for e

value  (Figure 

ons. 

1.  (Left)  A  flu

ne B POPE, 20

n‐passivated 

ers,  and  fluo

ws the fluores

ph. 

ghest  intensi

were extracte

er value as th

at an increas

gatively  charg

each bilayer w

S2).  It  is  th

uorescence m

0 mol% POPG

regions. Solu

rescence  inte

scence intens

ity  value  (low

d (Figure S2)

he percentage

ingly basic so

ged  lipids we

where the cha

his  range  tha

micrograph  o

G and 79.5 m

utions contain

ensity measu

sity correspon

west  pH)  an

. As expected

e of POPG  in 

olution was re

ere embedded

ange in fluore

at  is  exploite

of  supported 

ol% POPC pa

ning different

urements we

nding to the 

nd  fit  with  a

d, the appare

the bilayer w

equired to de

d  in  the mem

escence inten

ed  below  fo

  lipid  bilayer

atterned on a

t peptide con

re made  acc

region marke

  sigmoidal  c

ent pKa of the

was  increase

protonate th

mbranes. Mo

nsity varies ro

r  studying  p

rs  containing

a planar glass

ncentrations 

ordingly.  The

ed by the das

curve,  from  w

e ortho‐rhoda

d (Table 1  in

e dye when h

oreover,  ther

oughly linearly

peptide‐mem

g  0.5 mol%  o

s support bet

were  flowed

e  line  scan o

hed red line 

S3 

which 

amine 

 main 

higher 

e  is a 

y with 

brane 

 

ortho‐

tween 

d over 

on  the 

in the 

 

Figure S2

POPE in P

 

2. Titration cu

POPC. All titra

urves for 5, 10

tion curves w

 

0, 20, and 30

were taken wi

0 mol% POPG

ith 10 mM PB

G bilayers wit

BS containing 

h 0.5 mol% o

150 mM NaC

 

ortho‐rhodam

Cl. 

S4 

mine B 

 

 

Figure S3

rhodamin

introduce

 

Effect of o

the  disso

concentra

Abstractin

dye in the

tightens b

is fit to th

3. Normalized

ne B POPE, 30

ed. The buffer

ortho‐rhodam

ociation  con

ations  from  0

ng the dissoci

e bilayer tight

binding in mu

e data points

d fluorescence

0 mol% POPG 

r used was 10

mine B on pe

nstant  of  Ar

0.05 mol%  to

iation consta

tens the bind

uch the same 

s in S4b and t

e  intensity m

and 69.5 mo

0 mM PBS wit

eptide bindin

rg9  from  PO

o  1.0 mol%  i

nts from the 

ing of Arg9 (S

fashion as PO

he fit is extra

measurements

ol% POPC as in

th 150 mM Na

ng. The effect

OPC  bilayers

n  POPC.  Figu

curves indica

4b). It would 

OPG (i.e. on e

polated to 0 

s for bilayers

ncreasing con

aCl at pH 6.8.

t of ortho‐rho

s  was  inves

ure  S4a  show

ates that incre

 appear that 

electrostatic g

mol% dye, w

s composed o

ncentrations o

. 

odamine B dy

stigated  with

ws  the  result

easing the co

the negative

grounds). A h

hich yields KD

 

of 0.5 mol% o

of Lys9 peptid

ye in the bilay

h  increasing

ts  of  these  a

oncentration o

 charge on th

hyperbolic fun

D = 60 µM. 

S5 

ortho‐

de are 

yer on 

g  dye 

ssays. 

of the 

he dye 

nction 

 

Figure  S4

rhodamin

NaCl at pH

is the fit o

 

Total  int

microfluid

no residua

varying c

continuou

conducted

well as pe

to a linea

linear con

POPC lip

PDMS on

Figure S5

subtractio

Performin

fluorescen

4.  a)  Hill  plo

ne B dye prese

H 6.4. b) Plot

of a hyperboli

ernal  reflect

dic channels.

al fluorophore

concentration

usly until the

d under ident

eptides in the

ar change in

ntribution to t

pid bilayers. T

ne of the best

5a plots the

on of the lin

ng the same e

nce response j

ts  for  Arg9  p

ent  in the bil

t of the extrac

ic curve to the

tion  fluoresc

No TIRF sig

e in either the

s (from 10

overall TIRF

tical condition

near surface

fluorescence

the signal, ex

The hydropho

inert substra

data for TA

near contribu

experiments w

just changed

peptide  bindi

ayer. The ass

cted KD value

e data. 

cence  micro

gnal was obse

e device or th

µM to 150

F signal rema

ns. The meas

bulk solution

intensity wi

xperiments w

obic nature o

te for correct

AMRA-labele

ution. The K

with TAMRA

linearly with

ing  to  POPC 

says were per

es from (a) vs

scopy.  100%

erved with th

e lipid sampl

µM) were

ained unchan

sured TIRF s

n. Peptide mol

th increasing

were run using

f PDMS and

ting the bulk

ed Arg9 pep

KD value abst

A-labeled Lys

peptide conc

bilayers  wit

rformed in 10

. mol% of ort

% POPC bila

hese bilayers,

les. Solutions

introduced i

nged. Both Ly

signal arose f

lecules in the

g peptide con

g a spin-coat

d similar diele

effect from u

ptides binding

tracted from

9 led to no bi

centration (Fig

th  different  a

0 mM PBS bu

tho‐rhodamin

ayers were fi

which indica

of TAMRA-

into each ch

ys9 and Arg9

from surface

e near surface

ncentration. T

ted PDMS lay

ectric constan

unbound dye

g to POPC

this data w

inding behavi

gure S5b).

amounts  of  o

uffer with 150

ne B. The red 

first formed i

ated that ther

-labeled pepti

hannel and fl

experiments

bound peptid

bulk just gav

To subtract o

yer in place o

nt with glass

labeled pepti

bilayers afte

was 70 ± 19

ior, but instea

S6 

 

ortho‐

0 mM 

curve 

in the

re was

ides at

flowed

s were

des as

ve rise

off the

of the

make

des.1,2

er the

9 µM.

ad the

 

Figure S5

bilayers. T

of 70 ± 1

POPC bila

 

  (12009.   (2 

 

. a) Hill plot f

The assay was

9 µM was ex

ayers. 

1)  Mark, 

2)  Tan, C

fitting with n 

s performed i

xtracted; b)  L

J. E. Polymer

. A., J. J. Non‐

= 0.75 for TIR

in 10 mM PBS

Linear  fitting

r data handbo

‐cryst. Solids.

RF signal chan

S buffer with 

  for TIRF  sign

ook; 2nd ed.; 

1994, 169, 14

nge of TAMR

150 mM NaC

nal  change o

Oxford Unive

43. 

RA‐labeled Arg

Cl at pH 6.4, a

of TAMRA‐lab

ersity Press: O

 

g9 binding to 

and an appare

beled  Lys9 on

Oxford ; New

S7 

POPC 

ent KD 

n pure 

w York,