UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO

COSPECT: Comprehensive Substances

characterization via advanced sPECTrometry

Spettrometria di Massa

MALDI Imaging:

principi, metodi ed applicazioni

Enrico Caneva

(23-06-2017)

COSPECT: MALDI Imaging (E. Caneva: 23/6/2017)

MALDI Tof-Tof Autoflex III (Bruker Daltonics):

TargetCID cell(Helium or Argon)

Bruker Daltonics S.r.l.: slide descrittive Autoflex III

REFLECTRON

MALDI source

‘’MALDI Imaging procedure on a tissue slice’’: 1st Experiment

Figure 1: Conceptual representation of the MALDI MS imaging procedure on a tissue slice. The tissue in the example contains two defined areas, A (Anterior) and P (Posterior) containing specific localized proteins A’ and P’, respectively.

From the data array of a raster of laser spots, each containing a complete mass spectrum, selected ion images can be created in which molecules can be localized in the tissue.

Summing all the ions in each spectrum would produce a total ion image.

Richard M. Caprioli at al: Anal. Chem. 1997, 69, 4751-4760.

Imaging Mass Spectrometry applications overview

Animals (rats, mice, …):Organs and whole body sections.

Spatial localization, contribution to disease diagnosis, ….

predictions.

Humans: organs, skin, tumours …

Targets: proteins, peptides, lipids, drugs, xenobiotics,

neuropeptides, drug metabolites, … , clinical biomarkers

Plant Biology

Forensics(latent fingenmarks)

Microbiology(2D & 3D Cell Culture Models)

(1) Sample removal: preservation of integrity and morphology

Long (-80 °C), or medium(-20 °C) time conservation (fresh tissue).Inclusion into a polymer (OCT, Carboxymethylcellulose CMC, …), or with FFPE protocol for medium-long time conservation.

… or direct cutting

Animal sacrifice Hospital (mouse, …) surgery, biopsy

Direct immersion (critical), or indirect immersion (cryovials, floating plastic boats , Al-plates, …):

Dry ice/isopentane (-40 to - 80 °C): several seconds of submersion time (depending on sample type).

Dry ice/hexane (-75 °C): “ “ “ “ “ “

Liquid Nitrogen (-168 °C): few seconds submersion time (slow plunging in, to avoid cracking)

Cooling down

Conservation

(2) Tissues preparation and conservation protocols

Preliminar freezing(vessels, cardiac regions need additional treatments)

Inclusion in polymerresins (OCT, CMC, …) => storing at -80 C.

Formalin Fixation :- Ethanol baths => dehydratation- formalin (Tris-HCL buffer).

(A)

Paraffin Embedding:

FFPE samples => Long time T. ambient storing

Surgical organ removal or biopsy collection => fresh tissues)

Direct cut in the Cryostat:immobilization onto a sample holder using an

embedding medium

Cut in the Cryostat (-15 to -20 °C)

Tissue slice on ITO surface

(thickness from 10 to 25 um)

(B) (C)

(3) Tissue pre-treatment: washing protocols

Tissue slice on ITO surface

(thickness from 10 to 25 um)

EtOH (gently washing): EtOH 70% (30 sec) => EtOH 70% (30 sec)

EtOH (strong washing): 70% (2 min) => fresh EtOH 70% (2 min) => EtOH 100% (2 min)

Acetone: 30 sec => dry at room temperature

Chloroform, H 2O, Xilene, …

Progressive removal of salts, lipids, endogenous peptides, cell debris, blood, … (EtOH); Additional removal of lipids (Chloroform), or OCT residuals (H2O);Fixation of proteins and peptides: superficial (EtOH, Acetone), or structural (formaline, …);Denaturation and precipitation of protein (and peptides) in their original location.

Improvement in sensitivity and resolution in MS Imaging spectra

(4) Matrix deposition: methods overview

Droplet deposition Matrix coating

TLC glass reagent sprayer:acoustic wave ejection.

Artist’s airbrush:Airspray with controlled pressure.

Areosol automated dispenser-Vibrational vaporization under controlled conditions;- medium droplets size = 20 um.

Electrospray apparatus-Classic electrospray horizontal needle;- matrix crystals < 1um .

Chemical Ink-jet Printer-Use of piezoelectric pulsing;- volume of droplets: 87 pl;- printer head: 55um .

Robotic device- acoustic wave ejection;- volume of droplets: 170 pl;- cristal size = 30 up to 5 um.

Low volume automatic pipette- Spot droplets volume = 200 to 500 nl.

Finely pulled capillary glass attached to a Hamilton-type syringe

- Spot droplets volume = 5 to 50 nl;- cristal coverage of 50% area;- crystal diameter = 20 to 200 um;- spot quite precise in x,y coordinates.

Rapid Spotter:- Imaging Resolution up to 100 um.

“ImagePrep”Bruker Daltonics

Bruker “ImagePrep” coating unit technology

Distribuzione media diametro microgocce Sensore ottico (valutazione scattering)

Interno ImagePrep: fase di ventilazione N2 Fase di attivazione dello Spray

Matrix deposition: differentiations

CaratteristicheBassa risoluzione spaziale.

Rapidità di esecuzione.

Maggiore sensibilità.

Confronti tra :

- diversi tessuti;

- regioni ben separate;

- patologico vs normale;

- trattato vs non trattato;

CaratteristicheAlta risoluzione spaziale.

Distribuzione molecolare

accurata di m/z definite.

Sensibilità modulabile.

Analisi di :- aree adiacenti;

- bordi tra le diverse aree

(patologico vs normale, ..);

- biomarker di neoplasie;

- compartimentalizzazioni

di farmaci e altri composti.

MALDI Profiling MALDI Imaging

[Image: S. Francese at al., Comb. Chem. and High Throughput Screening, 2009, 12, 156-174]

Esperimenti in ‘‘Target o Discovery Mode’’

[Immagini tratte da brochure Bruker Daltonics S.r.l.: descrizione sorgente Autoflex III ]

Mix campione-matrice, sulla superfice del campione (o della fettina) in rapporto da

1:1000 a 1:10.000.

Irraggiamento della superficie con una serie di impulsi in

sequenza, della durata dell’ordine del ns.

Produzione di un plasma di ionizzazione

contenente molecole neutre e ioni.

MALDI: Molecular Desorption scheme

Laser: general overview

‘’Smartbeam Laser Nd: YAG (355 nm)’’: parameter set

SA matrix distribution Laser shots evidence after acquisition

Tissue slides on ITO surface

MALDI MS Imaging applications (I): Proteomic Field

Proteolitic deposition &in situ digestion (Trypsin, …).

Matrix deposition & MALDI Imaging

Acquisition on slices.

Spectra & peak list collection.

“PMF” online search.

Evaluation of PMF results &definition of MS2 experiments.

(A) Fettina trattata con Tripsina

Calibrante “Pepmix” in TA soluz (G9) e miscelato con la matrice HCCA (G14)

D9 D14

G9

E17

F17

E12

F12

G14

(B) Fettina non trattata con Tripsina

Protocolli di taglio, deposizione su vetrino, lavaggio, digestione e deposizione matrice.

Tracciamento delle coordinate sul vetrino per le fasi di acquisizione: - Imaging - High Resolution - MS/MS.

Carotide umana inclusa in OCT

Poster al 6th MS-Pharmaday: G.Beretta, D.Norata, G.Tibolla, E.Caneva, M.Pappini & R.M.Facino (ott ‘10)

MSI tissue preparation: teaching, ROI selection, calibration, …

MSI processing: MS spectra & ions distribution on tissue

MSI post processing: distribution of different ions on tissue

m/z = 578.8(contorni fettina)

m/z = 1199.3 (zona E)

m/z = 1792.0 (K)

m/z = 1275.6 (G)

m/z = 1007.8 (B)

m/z = 1227.3 (F)

Raggruppamento peptidi per zone omogenee

Zona “A”:

603,3*817,7* 969,0

1030,11158,01227,3*1302,8*1361,0*1466,01488,61503,31641,21687,31754,51953,5

Zona “B”:

1007.8 1093,0 1289,0 1375,8 1530,5 1552,8 1573,9 1569,0 1589,5 1835,4

Zona “E”:

1199,3*1275,6* 1792,0*

Zona “F”:

1227,3*1302,8*1361,0* 1451,01488,6*1708,7*1725,11776,8* 1953,5 2236,1

Zona “H”:

1857,0* 2082,5*

Zona “G”:

1275,6* 1792,0*

Zona “K”:

1792,0*

Le masse in verde sono quelle caratteristiche della zona indicata;

Le masse in rossosono quelle distribuite in piu’ zone diverse;

L’asterisco “*” indica le masse che sono state frammentate.

Ricerca PMF online (MASCOT software): peptidi zona “E”

Risultato ricerca PMF in MASCOT: (peptidi zona “E”)

(Sequence coverage)

MSI MS/MS (MS2) acquisition: frammentazioni mirate di ioni

Frammentazione MS/MS ione: m/z = 1275,6 (zona “G”)

Individuazione dei punti (pixel) di massima concentrazione dello ione da frammentare

Spettro MS/MS ione: m/z = 1275,6 => 1274,85 (zona G)

Risultati MASCOT (MS/MS) ione: m/z = 1274,85 (zona G)

Distribuzione massa 1275,6 ± 1 Da (Zona “G”): “Hemoglobin subunit Beta”

“Coregistrazione” di immagine istologica & MS MALDI Imaging:

immagini a confronto

Coregistrazione immagine istologica & MS MALDI Imaging:

Distribuzione massa 1275,6 ± 1 Da (Zona “G”): “Hemoglobin subunit Beta”

MALDI MS Imaging applications (II): Metabolomic Field

Small molecules (metabolites < 500 Da) => optimizations

1) Sovrapposizione con i segnali provenienti dai cluster della matrice;

2) ampia gamma di matrici proposte in letteratura ;

Individuazione della matrice

ottimale

3) Rischio di delocalizzazione degli analiti:

nella fase preparativa e/o nella fase della

deposizione della matrice);

4) lavaggio dei tessuti sconsigliato=> soppressione ionica elevata;

5) degradazione rapida di alcuni metaboliti.

Ottimizzazione deiprotocolli di

deposizione della matrice

Accelerazione delle procedure =>

riproducibilità

Confronto segnali matrici vs. resto dello spettro di massa

Riscontro segnali metaboliti => selezione matrice ottimale

L-Valin eL-Cysteine L-Arginine Glucose

Processo di co-cristallizzazione matrice-campione: valutazione di omogeneità e riproducibilità deposizioni

Metabol. mix con SA (7.5 mg/ml) Metabol. mix con HCCA (19 mg/ml)

Metabol. mix con:7-Mercapto-4-methylcoumarin (10 mg/ml)

Metabol. Mix con:6,7-Dihydroxycoumarin (10 mg/ml)

HCCA 0.1 Mol (19 mg/ml)

HCCA 0.1 Mol + CTAB 0.5 mMol

HCCA 0.1 Mol + CTAB 1 mMol

HCCA 0.1 Mol + CTAB 0.1 mMol

Omogeneità di distribuzione e dimensione dei cristalli ottimale!

[Immagini tratte da brochure Bruker Daltonics S.r.l.: descrizione sorgente Autoflex III ]

MALDI MS Imaging applications (III):

Imageprep spray optimization and delocalization reduction

Fettina di tessuto con distribuzione superficiale

ben definita delle molecole di interesse diagnostico.Deposizione grossolana della matrice

Migrazione molecolare in seguito ad estrazione e solubilizzazione

Perdita della localizzazione originale.

“ImagePrep”: power modulation and spray dinamic shape

Nebulize Incubation Time Drying

Durata deposizione: 80’; HCCA depositata: 2.0 mg(circa 2,2 ml di soluz. 5 mg/ml)

Imaging di metaboliti in Cervello di topo C57/BL6

Vetrino con 5 fettine da 15 um: teaching & posizioni dei calibranti.

Imaging di metaboliti in Cervello di topo C57/BL6:

distribuzione GABA ([M+H]+ : m/z = 104.07);

evidenzia effetto inerzia dello spray da F1 a F5.

Imaging di metaboliti in Cervello di topo C57/BL6:

distribuzione GABA ([M+H]+ : m/z = 104.07);

evidenzia effetto inerzia spray (dettaglio F1 vs. F5).

Fettina n. 1 Fettina n. 4

D11

Vetrino con fettine “muscolo di ratto”; teaching & posizioni dei calibranti.

“Carn Mix 6 1-2-3”

(333 nMol/ml) - (33 nMol/ml) - (3 nMol/ml)

E7E18

D14

Lavaggio con EtOH

al 100% (45’’)

45’’

lavaggio

“Carn Mix 6 1-2-3”

(3 nMol/ml) - (33 nMol/ml) - (333 nMol/ml)

45’’

lavaggio

Lavaggio con EtOH

al 100% (45’’)

MALDI MS Imaging applications (IV):

small peptides (endogenous):localization and identification

Ottimizzazione della matrice su mix di peptidi:matrice a tre componenti vs. HCCA

Alanine [M+H]+

Carnosinol [M+H]+

Carnosine [M+H]+ Anserine

[M+H]+

N-Acetil-Carnosine

[M+H]+HCCA[M+H]+

HCCA[M+Na]+

Carnosinol [M+Na]+

Matrice ternaria

Distribuzione [M+H]+ L-Carnosine (m/z = 227.11): limiti di rilevabilità!

Distribuzione [M+H]+ Anserine (m/z = 241.1)

lavaggio NO lavaggiolavaggioNO lavaggio

Conferma attribuzione peptide mediante frammentazione:

ms/ms [M+H]+ Anserina (m/z = 241.1)

[M+H-CO2]+

[M+H-NH3]+

Sovrapposizione distribuzioni di due diversi peptidi:

distribuzione [M+H]+ Anserine (m/z = 241.1) e Isolucine (m/z = 132.1)

Vetrino con fettine di “cervello di ratto”; teaching & posizioni dei calibranti.

45’’

Fettina n. 1

Fettina n. 4

D11

“Pep Mix”

D7

E18

D14

Fettina n. 2

Fettina n. 3

“Pep Mix”

“Pep Mix”

Matrice “Binaria”

(HCCA + DHB + piperidine) Matrice “TRIS”

MALDI MS Imaging applications (V):

lipids distribution in brain

Lipids:A heterogeneous class of naturally occurring organic compounds classified together on the basis of common solubility properties.

Fahy et al 2005, Journal of Lipid Research 46: 839-861

Vetrino con fettine di “cervello di ratto”

Immagine del vetrino prima e dopo la deposizione della “Matrice TRIS”.

Ioni negativi:

distribuzione dello ione

ST ([M-H]- = 888.7)

e confronto con la zona dei

calibranti (Cd_neg)

e della matrice (Md_neg)

Distribuzione ioni:

PI ([M-H]- = 885.7)

ST ([M-H]- = 888.7)

Vetrino con fettine di “cervello di ratto”:

altri risultati analisi in Ioni Negativi

Distribuzione ioni:

ST ([M-H]- = 890.7)

& [M-H]- : 803.1, 887.1,

901.1, 903.3 e 875.1.

Distribuzione ione:

X ([M-H]- = 882.1)

Vetrino con fettine di “cervello di ratto”Immagine del vetrino prima e dopo la deposizione della “Matrice TRIS”.

Ioni positivi:

distribuzione dello ione

PC/PE/PS/Cer ([M+H]+ = 882.1)

e confronto con la zona dei

calibranti (Cd)

e della matrice (Md)

Distribuzione ione [M+H]+ :

882.1 (PC/PE/PS/Cer )

Vetrino con fettine di “cervello di ratto”

Risultato analisi in Ioni Positivi

Distribuzione ione [M+H]+ :

760.6 (PC 34:1 )

Distribuzione ioni [M+H]+ :

734.6 (PC 32:0 ), 734.3 (PC),

782.3 e 724.3 (PE/PC)

Distribuzioni ioni [M+H]+ :

798.2 + 826.3

Vetrino con fettine di “cervello di ratto”

Sovrapposizione risultati in Ioni Positivi

Fettina grezzaFettina

dopo deposizione

della matrice

Imaging Mass Spectrometry: principal Ion Sources

MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)

� Wide Ion mass range(mass windows needed).

� Easy data interpretation: mainly [M+H]+ ions.

� High sensitivity and spatial resolution (10-50 um).

� Excellent results with large proteins and peptides.

� Use of Matrix (wide selection available).

� High Vacuum Technique

SIMS(Secondary Ion emission Mass

Spectrometry)

� Higher spatial resolution: spot diameter ≤ 1 um (subcellular localization).

� No use of matrix.

� Optimized for small analytes.

� High Vacuum Technique.

� Hard Ionization method: damage of the sample surface and fragmentation.

� Low upper mass limit:(around 12 Kda)

DESI(Desorption Electrosray

Ionisation)

� Ambient conditions.

� No use of matrix.

� Wide range of analytes.

� Different solvent spray combinations.

� Soft Ionization tecnique.

� Lower Spatial Resolution.

� Lower Sensitivity.

Imaging Mass Spectrometry features summary

Advantages

� It is a label-free tecnique(unlikeimmunological techniques, H&E stains in molecular istology).

� Ability to discern the distribution of previously unknown molecular species.

� MS/MS fragmentation can be used to identify unknown biological macromolecules.

� TOF Analyzer: wide mass range (over 100.000 m/z).

� MALDI source: Easy data interpretation (mainly peaksrepresenting [M+H]+ ions.

Critical Points

� Peculiarity of different samples and anatomical areas.

� Conservation/preservationof tissues/analites and preparation of tissue slices.

� Washing up procedure: focusedmethods and execution times.

� Matrix deposition: coatingprotocols and optimal matrixchoice.

� Acquisition times: in case of high spatial resolution needing.

Ringraziamenti !!!

… e tutti voi!!!

DISFARM

Prof.ssa Marina Carini

Prof. Giancarlo Aldini

Prof.ssa Marica Orioli

Dr. Giacomo Beretta

Prof. Roberto Maffei Facino

Dip. Scienze

FARMACOLOGICHE

Dr. Danilo Norata

Dr. Gianpaolo Tibolla

Osp. San Paolo

Prof. Antonio Colombi

Dr. Federico Maria Rubino

Dr. Marco Pitton

CIGA/COSPECT

Prof.ssa Rita Annunziata

Sig. Marco Pappini

Osp. San Raffaele

Dr. Erica Butti

Bruker Daltonics

Dr. Simone Rubini

Dr.ssa Elisa Basso

Sig. Giuseppe De Filippis

Sheffield University (UK)

Prof.ssa Simona Francese

Dip. Scienze Biomediche

Prof.ssa Elena Donetti

Dr.ssa Francesca Arnaboldi

Dr.ssa Laura Cornaghi

Dip. Biotecnologie Mediche

Dr. Giuseppe Rossoni

ISTM CNR

Sig. Pietro Colombo

COSPECT: MALDI Imaging (E. Caneva: 23/6/2017)