signal trans duct ion in human platelets and inflammatory mediator

8/3/2019 Signal Trans Duct Ion in Human Platelets and Inflammatory Mediator

1/9

V o l . 5 8 , N o . 6N F E C T I O N AN D I M M U N I T Y , J u n e 1 9 9 0 , p . 1 5 9 1 - 1 5 9 90 0 1 9 - 9 5 6 7 / 9 0 / 0 6 1 5 9 1 - 0 9 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 0 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

S i g n a l T r a n s d u c t i o n i n Human P l a t e l e t s a n d I n f l a m m a t o r y M e d i a t o rR e l e a s e I n d u c e d b y G e n e t i c a l l y C l o n e d H e m o l y s i n - P o s i t i v ea n d - N e g a t i v e E s c h e r i c h i a c o l i S t r a i n sB . KONIG, W. SCHONFELD, J . SCHEFFER, AND W. KONIG*

L e h r s t u h l f u r M e d i z i n i s c h e M i k r o b i o l o g i e u n d I m m u n o l o g i e , A r b e i t s g r u p p e f u r I n f e k t a b w e h r m e c h a n i s m e n ,R u h r - U n i v e r s i t a t B o c h u m , 4 6 3 0 B o c h u m , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r m a n yR e c e i v e d 3 1 A u g u s t 1 9 8 9 / A c c e p t e d 2 2 F e b r u a r y 1 9 9 0

I n c u b a t i o n o f human p l a t e l e t s w i t h t h e h e m o l y s i n - p r o d u c i n g E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n K - 1 2 ( p A N N S 2 1 1 )i n d u c e d t h e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C , a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s , c a l c i u m i n f l u x , l o w a m o u n t s o f1 2 - h y d r o x y e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d ( 1 2 - H E T E ) , a n d r e l e a s e o f s e r o t o n i n f r o m d e n s e granules. N o n h e m o l y t i ci s o g e n i c s t r a i n s o f E . c o i l 5 3 6 / 2 1 w h i c h d i f f e r e d o n l y i n t h e i r t y p e s o f a d h e s i n s (MSH+ M S - F i m + ; S-MRH+S - F i m + ; P-MRH+ P - F i m + ) r e l e a s e d n e i t h e r s e r o t o n i n no r 12-HETE f r o m human p l a t e l e t s no r i n d u c e d p l a t e l e ta g g r e g a t i o n . A l l h e m o l y s i n - n e g a t i v e b a c t e r i a e x c e p t E . c o l i 5 3 6 / 2 1 , w i t h o u t any a d h e s i n s , were a b l e t o a c t i v a t ep r o t e i n k i n a s e C r e v e r s i b l y b u t d i d n o t i n d u c e c a l c i u m i n f l u x . A c t i v a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h f l u o r i d e , an a c t i v a t o ro f t h e G T P - b i n d i n g p r o t e i n , was a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n , c a l c i u m i n f l u x , p l a t e l e ta g g r e g a t i o n , s e r o t o n i n r e l e a s e , a n d 12-HETE f o r m a t i o n . T h e s i m u l t a n e o u s s t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h NaFa n d t h e n o n h e m o l y t i c E . c o l i s t r a i n s s u p p r e s s e d s e v e r a l o f t h e N a F - i n d u c e d p l a t e l e t responses. Membranep r e p a r a t i o n s i s o l a t e d f r o m s t i m u l a t e d p l a t e l e t s w i t h h e m o l y s i n- n e g a t i v e a n d h e m o l y s i n - p o s i t i v e E . c o l i s h o w e di n c r e a s e d b i n d i n g o f g u a n y l y l i m i d o d i p h o s p h a t e , a n o n h y d r o l y z a b l e G T P a n a l o g , a n d e n h a n c e d G T P a s ea c t i v i t y .

I n p r e v i o u s s t u d i e s w i t h h u m a n p o l y m o r p h o n u c l e a r g r a n -u l o c y t e s ( 1 9 ) , i t w a s s h o w n t h a t b a c t e r i a d i f f e r i n t h e i r a b i l i t yt o t r i g g e r r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r f r o m c e l l s d e -p e n d i n g o n t h e r e c e p t o r s t r u c t u r e o f t h e i r f i m b r i a e a s w e l l a st h e d i s t r i b u t i o n o f r e c e p t o r s o n t h e t a r g e t c e l l s . P a t h o g e n i cE s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s g e n e r a l l y e x h i b i t s e v e r a l c h a r a c t e r -i s t i c s w h i c h c o n t r i b u t e t o t h e i r v i r u l e n c e , i n c l u d i n g t h ea b i l i t y t o a d h e r e t o e p i t h e l i a l c e l l s ( 1 4 , 2 2 , 3 6 a , 3 9 ) , t ob e c o m e s e r u m r e s i s t a n t , a n d t o e x p r e s s h e m o l y s i n . T wog e n e r a l c l a s s e s o f b a c t e r i a l a d h e s i n s h a v e b e e n d e s c r i b e d .T y p e 1 f i m b r i a e d e m o n s t r a t e m a n n o s e - s e n s i t i v e a d h e r e n c ea n d m a n n o s e - r e s i s t a n t p i l i , w i t h c e l l a t t a c h m e n t u n a f f e c t e db y m a n n o s e . T h e m a n n o s e - r e s i s t a n t a d h e s i n s d e f i n e d b yt h e i r r e c e p t o r s p e c i f i c i t i e s i n c l u d e P - f i m b r i a e , w h i c h r e c o g -n i z e a g l y c o l i p i d r e c e p t o r c o n t a i n i n g a - g a l a c t o s y l - 1 , 4 - g a -l a c t o s e ( 2 9 , 3 8 ) ; S - f i m b r i a e , w h i c h b i n d t o a s i a l i c a c i d -c o n t a i n i n g r e c e p t o r ; a n d M - f i m b r i a e , w h i c h r e c o g n i z e ag l y c o p r o t e i n common t o M b l o o d g r o u p a n t i g e n s . H e m o l y s i nh a s b e e n s h o w n t o b e a p o t e n t v i r u l e n c e f a c t o r a n d as t i m u l u s f o r m e d i a t o r r e l e a s e f r o m a v a r i e t y o f c e l l s ( 3 , 8 ,3 4 ) .L i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e r o l e o f a d h e s i n s a n d t h e E . c o l ia - h e m o l y s i n i n human p l a t e l e t a c t i v a t i o n . P l a t e l e t s e x p o s e dt o c o l l a g e n , t h r o m b i n , o r t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7a g g r e g a t e a n d d i s c h a r g e t h e i r g r a n u l a r c o n t e n t s i n a s e c r e -t o r y p r o c e s s ( 4 , 2 3 ) . I n a d d i t i o n t o d e n s e g r a n u l e r e l e a s e , t h ef o r m a t i o n o f 1 2 - h y d r o x y e i c o s a t e t r a e n o i c a c i d ( 1 2 - H E T E )may h a v e a s i g n i f i c a n t r o l e i n m e d i a t i n g o r m o d u l a t i n gi n f l a m m a t o r y p r o c e s s e s . P l a t e l e t s a r e t h e m a j o r s o u r c e o f1 2 - H E T E , w h i c h i s a p o t e n t c h e m o k i n e t i c c o m p o u n d f o rn e u t r o p h i l s a n d may m e d i a t e l e u k o c y t e d i a p e d e s i s t h r o u g ht h e v a s c u l a r e n d o t h e l i u m . T h e r e i s a l s o i n c r e a s i n g e v i d e n c et h a t HETEs a r e i n v o l v e d i n p a t h o l o g i c a l p r o c e s s e s , i n c l u d -i n g a n u m b e r o f i n f l a m m a t o r y d i s e a s e s . I n p l a t e l e t s t h e

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

p r o t e i n k i n a s e C i s s u p p o s e d t o b e i n v o l v e d i n t h e c e l l u l a ra c t i v a t i o n p r o c e s s . P r o t e i n k i n a s e C i s a p r o t e i n - p h o s p h o r y -l a t i n g e n z y m e t h a t i s a c t i v a t e d b y e n d o g e n o u s d i a c y l g l y c e r o lo r e x o g e n o u s p h o r b o l e s t e r s ( 1 5 , 1 9 ) . Upon a c t i v a t i o n , t h ec y t o p l a s m i c e n z y m e a c t i v i t y i s t r a n s l o c a t e d t o t h e p l a s m am e m b r a n e ( 5 , 2 1 ) . I n p l a t e l e t s t h e t r a n s l o c a t i o n o f p r o t e i nk i n a s e C t o t h e p a r t i c u l a t e f r a c t i o n i s a c c o m p a n i e d b y t h ea d d i t i o n a l a p p e a r a n c e o f a p h o s p h o l i p i d - i n d e p e n d e n t p r o t e i nk i n a s e C , w h i c h h a s b e e n s u g g e s t e d t o b e a p r o t e o l y t i cp r o d u c t o f p r o t e i n k i n a s e C ( 2 5 , 3 6 ) . H o w e v e r , t h e p h y s i o -l o g i c a l r o l e o f m e m b r a n e - a s s o c i a t e d p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n ta n d - i n d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y i s u n k n o w n ( 5 ) . T h ed i s a p p e a r a n c e o f p r o t e i n k i n a s e C f r o m t h e c y t o s o l mayp r o v i d e i n d i r e c t e v i d e n c e f o r C - k i n a s e a c t i v a t i o n . I t i s s t i l ln o t c l e a r how p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y i s i n v o l v e d i n t h ep l a t e l e t a c t i v a t i o n p r o c e s s . R e c e n t l y , t h e r o l e o f G - p r o t e i n si n t h e a c t i v a t i o n o f c e l l s h a s b e e n s h o w n ( 2 8 , 3 5 ) . T h eg u a n i n e n u c l e o t i d e - b i n d i n g p r o t e i n s s e r v e a s m e m b r a n e -b o u n d t r a n s d u c e r s o f c h e m i c a l l y a n d p h y s i c a l l y e n c o d e di n f o r m a t i o n . Up t o n o w , G - p r o t e i n i n v o l v e m e n t i n t h e c e l -l u l a r r e s p o n s e s i n d u c e d b y b a c t e r i a h a s n o t b e e n s t u d i e d .R e c e n t l y we s h o w e d t h a t N a F , a d i r e c t G - p r o t e i n a c t i v a t o r ,i s a p o t e n t i n du c er o f m e d i a t o r r e l e a s e i n human p l a t e l e t s . I tw a s t h e p u r p o s e o f o u r p r e s e n t s t u d y t o a n a l y z e t h e s i g n a lt r a n s d u c t i o n p r o c e s s f o r p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n d u c e d b y a d -h e s i n - c a r r y i n g E . c o l i s t r a i n s ( m a n n o s e - r e s i s t a n t h e m a g g l u -t i n a t i o n [ M R H ] a n d m a n n o s e - s e n s i t i v e h e m a g g l u t i n a t i o n[ M S H ] ) a n d b y a n i s o g e n i c E . c o l i s t r a i n e x p r e s s i n g a -h e m o l y s i n .

MATERIALS AND M E T H O D SM a t e r i a l s . B r a i n - h e a r t i n f u s i o n was o b t a i n e d f r o m O x o i d ,B a s i n g s t o k e , H a m p s h i r e , E n g l a n d ) . [ _ y - 3 2 P ] A T P ( 5 C i / m m o l )a n d [ 3 H ] s e r o t o n i n ( h y d r o x y t r y p t a m i n e , c r e a t i n e s u l f a t e , 3 0 . 4C i / m m o l ) w e r e p u r c h a s e d f r o m Ne w E n g l a n d N u c l e a r C o r p .D E - 5 2 c e l l u l o s e was f r o m W h a t m a n . S y n t h e t i c l e u k o t r i e n e s

1 5 9 1


2/9

1 5 9 2 KONIG ET AL.TABLE 1 . S t r a i n s u s e d

E . c o l i s t r a i n R e l e v a n t c h a r a c t e r i s t i c s5 3 6 / 2 1 H l y - MSH- M S - F i m - MRH- MR-Fim-5 3 6 / 2 1 ( p G B 3 0 i n t ) H l y - MSH+ M S - F i m + MRH- MR-Fim-5 3 6 / 2 1 ( p A N N 8 0 1 - 4 ) H l y - MSH- M S - F i m - S-MRH+ S - F i m +5 3 6 / 2 1 ( p A N N 9 2 1 ) H l y - MSH- M S - F i m - P-MRH+ P - F i m +K - 1 2 H l y - MSH+ M S - F i m + MRH- MR-Fim-K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) H l y + MSH- M S - F i m - M R H - MR-Fim-

wer e a generous g i f t f r o m J. R o k a c h ( M e r c k - F r o s s t , P o i n t -C l a i r e , Q u e b e c , C a n a d a ) . A l l o t h e r c h e m i c a l s wer e pur-c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . , D e i s e n h o f e n , FRG.B u f f e r s o l u t i o n s . T h e medium u s e d f o r w a s h i n g t h e p e r i p h -e r a l l e u k o c y t e s a n d f o r m e d i a t o r r e l e a s e was p h o s p h a t e -b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ; 0 . 2 M p h o s p h a t e , 0 . 1 % N a C l , p H 7 . 4 ) .C a C l 2 ( 0 . 6 mM ) a n d M g C l 2 ( 1 mM ) wer e a d d e d s h o r t l yb e f o r e t h e c e l l s we r e s t i m u l a t e d . B u f f e r A c o n s i s t s o f 2 0 mMT r i s h y d r o c h l o r i d e ( T r i s - H C l , p H 7 . 5 ) , 0 . 5 mM EG T A ( e t h -y l e n e g l y c o l t e t r a a c e t i c a c i d ) , 0 . 5 mM EDTA, 1 mM d i t h i o -t h r e i t o l , a n d 1 mM p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e .B a c t e r i a l s t r a i n s . E . c o l i 5 3 6 , i s o l a t e d f r o m a p a t i e n t w i t h au r i n a r y t r a c t i n f e c t i o n , was t h e p a r e n t s t r a i n f o r t h e E . c o l i5 3 6 v a r i a n t s . S t r a i n 5 3 6 / 2 1 i s a s p o n t a n e o u s mutant o f s t r a i n5 3 6 t h a t h a s l o s t t h e a b i l i t y t o p r o d u c e h e m o l y s i n , t h e M rhp h e n o t y p e , a n d MSH. E . c o l i 5 3 6 / 2 1 was t r a n s f o r m e d w i t hr e c o m b i n a n t p l a s m i d s t o f o r m E . c o l i 5 3 6 / 2 1 v a r i a n t s ex -p r e s s i n g d i f f e r e n t t y p e s o f a d h e s i n s ( T a b l e 1 ) . C l o n i n g a n df u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p l a s m i d - e n c o d e d d e t e r m i -n a n t s wer e p e r f o r m e d a t t h e I n s t i t u t f u r G e n e t i k u n d M i k r o -b i o l o g i e , U n i v e r s i t a t W u r z b u r g , W u r z b u r g , FRG.B a c t e r i a l g r o w t h . B r a i n - h e a r t i n f u s i o n b r o t h ( 1 0 m l ) wasi n o c u l a t e d w i t h 1 0 0 , u l o f an o v e r n i g h t c u l t u r e ; b a c t e r i a lg r o w t h p r o c e e d e d f o r 3 . 5 h a t 3 7 C on a s h a k e r ( 1 5 0 r p m )( 3 4 ) .H e m o l y s i n a s s a y . T h e p r o d u c t i o n o f h e m o l y s i n was t e s t e don s h e e p b l o o d agar p l a t e s . A q u a n t i t a t i v e h e m o l y s i n assaywas p e r f o r m e d as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 8 ) .P r e p a r a t i o n o f c e l l s . P l a t e l e t s were p r e p a r e d f r o m f r e s h l yd r a w n b l o o d . B r i e f l y , E D T A - b l o o d was c e n t r i f u g e d a t 2 0 0 xg f o r 2 5 m i n t o o b t a i n p l a t e l e t - r i c h p l a s m a . P l a t e l e t s wereo b t a i n e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 , 2 0 0 rpm a t 4 C . The p l a t e l e t swer e w a s h e d i n PBS a n d r e s u s p e n d e d a t a b o u t 2 x 1 0 8 / m l .T h e p u r i t y o f t h e p l a t e l e t s was 9 8 % . V i a b i l i t y o f t h e c e l l s wasa s s a y e d b y l i g h t m i c r o s c o p y w i t h t r y p a n b l u e e x c l u s i o n asw e l l as b y t h e a n a l y s i s o f l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( L D H )r e l e a s e f r o m s t i m u l a t e d a n d n o n s t i m u l a t e d c e l l s . A n a l y s i s o fLDH was c a r r i e d o u t as d e s c r i be d p r e v io u s l y ( 1 7 ) .P l a t e l e t a g g r e g o m e t r y . A p l a t e l e t s u s p e n s i o n ( 1 0 8 p l a t e l e t sper m l ) was s t i r r e d a t 3 7 C i n an a g g r e g o m e t e r ( C h r o n o - l o gC o r p o r a t i o n ) . A g g r e g a t i o n was f o l l o w e d b y t u r b i d i m e t r i cmeasurement. T h e b a s e l i n e f o r m i n i m a l l i g h t t r a n s m i s s i o nwas a d j u s t e d t o t h e o p t i c a l d e n s i t y o f p l a t e l e t s s u s p e n d e d i nb u f f e r . M a x i m a l ( 1 0 0 % ) l i g h t t r a n s m i s s i o n was d e f i n e d as t h eo p t i c a l d e n s i t y o f t h e p l a t e l e t - f r e e medium ( b u f f e r ) . P l a t e l e ta g g r e g a t i o n was d e t e c t e d as an i n c r e a s e i n l i g h t t r a n s m i s -s i o n . T h e l a g p h a s e o f a g g r e g a t i o n was d e f i n e d as t h e t i m ei n t e r v a l b e t w e e n t h e a d d i t i o n o f b a c t e r i a t o t h e p l a t e l e ts u s p e n s i o n a n d t h e o n s e t o f a g g r e g a t i o n . Ca i o n o p h o r eA 2 3 1 8 7 , a r a c h i d o n i c a c i d , a n d t h r o m b i n s e r v e d as t h e con-t r o l a g o n i s t s f o r p l a t e l e t a g g r e g a t i o n .A s s a y f o r t h e t r a n s l o c a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a c t i v i t y .Human p l a t e l e t s ( 2 x 1 0 8 / m l ) wer e i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n a t3 7 C i n PBS c o n t a i n i n g c a l c i u m a n d m a g n e s i u m . T h e c e l l swer e s u b s e q u e n t l y a c t i v a t e d b y t h e a d d i t i o n o f Na F a n d

w a s h e d E . c o l i b a c t e r i a , a s i n d i c a t e d i n t h e f i g u r e l e g e n d s .A c t i v a t i o n o f t h e c e l l s w a s s t o p p e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 , 2 0 0r p m f o r 1 0 m i n ; t h e c e l l s w e r e t h e n r e s u s p e n d e d i n 1 m l o fb u f f e r A a n d s u b s e q u e n t l y s o n i c a t e d ( a m p l i t u d e , 5 0 p . m ,t w i c e f o r 1 0 s e a c h ; B r a n s o n S o n i f i e r 2 5 0 ) . T h e c r u d eh o m o g e n a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 3 , 0 0 0 r p m f o r 1 0 m i n i n a nE p p e n d o r f c e n t r i f u g e . T h e c y t o s o l i c f r a c t i o n s w e r e c h r o -m a t o g r a p h e d o n DEAE- c e l l u l o s e c o l u m n s ( 0 . 5 b y 3 c m )e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r A a n d w a s h e d w i t h 3 m l o f b u f f e r A .P r o t e i n k i n a s e C w a s e l u t e d w i t h 1 . 5 m l o f b u f f e r A c o n t a i n -i n g 1 0 0 mM N a C l .P r ot e i n k i n a s e C a s s a y . T h e r e a c t i o n m i x t u r e ( 1 9 0 , u d )c o n t a i n e d 2 0 mM T r i s - H C l ( p H 7 . 5 ) , 1 0 mM m a g n e s i u ma c e t a t e , 5 0 0 , u g o f h i s t o n e t y p e I I I S p e r m l , 1 0 , u M [ - y -3 2 P ) A T P ( 1 0 5 c p m / n m o l ) , 2 . 5 , u g o f d i o l e i n , 2 5 , u g o f p h o s -p h a t i d y l s e r i n e , 1 mM C a C l 2 , a n d t h e e n z y m e p r e p a r a t i o nu n d e r s t u d y . A l l r e a g e n t s w e r e d i s s o l v e d i n d i s t i l l e d w a t e r .T h e q u a n t i t a t i o n o f b a c k g r o u n d p h o s p h o t r a n s f e r a s e a c t i v i t yw a s p e r f o r m e d b y a n a l y z i n g h i s t o n e p h o s p h o r y l a t i o n i n t h ea b s e n c e o f c a l c i u m a n d p h o s p h o l i p i d . A f t e r 1 0 m i n a t 3 0 C ,t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 0 . 7 5 m l o f 2 5%t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . A c i d - p r e c i p i t a b l e m a t e r i a l s w e r e c o l -l e c t e d o n M i l l i p o r e m e m b r a n e f i l t e r s ( p o r e s i z e , 0 . 4 5 , u m ;M i l l i t i t e r HA f i l t r a t i o n p l a t e s ; M i l l i p o r e C o r p . , E s c h b o r n ,F R G ) . T h e f i l t e r s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h 1 m l o f 10%t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . T h e d r i e d f i l t e r s w e r e t r a n s f e r r e d i n t os c i n t i l l a t i o n v i a l s , d i s t i l l e d w a t e r was a d d e d , a n d t h e r a d i o -a c t i v i t y w a s m e a s u r e d b y C e r e n k o v r a d i a t i o n ( R a c k b e t a1 2 0 9 ; LKB, T u r k u , F i n l a n d ) . P r o t e i n k i n a s e C a c t i v i t y wasc a l c u l a t e d b y s u b t r a c t i n g b a c k g r o u n d a c t i v i t i e s , a n d v a l u e sa r e r e p o r t e d a s p e r c e n t c y t o s o l i c p r o t e i n k i n a s e C a c t i v i t y i nu n t r e a t e d c e l l s .L o a d i n g c e l l s w i t h f u r a - 2 . T h e a c e t o x y m e t h y l e s t e r o f f u r a -2 f u r a - 2 A M , w a s a d d e d t o 2 x 1 0 8 p l a t e l e t s i n HEPES b u f f e r( 1 4 5 mM N a C l , 5 mM K C I , 1 mM N a 2 H P O 4 , 1 mM C a C l 2 ,0 . 5 mM M g S O 4 , 5 mM g l u c o s e , a n d 1 0 mM HEPES [ N -2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N ' - 2 - e t h a n e s u l f o n i c a c i d ; pH7 . 4 ] ) a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 3 , u M . T h e c e l l s w e r ei n c u b a t e d a t 3 7 C w i t h i n t e r m i t t e n t m i x i n g t o a l l o w c o m p l e t eu p t a k e o f t h e d y e . A f t er 3 0 m i n , t h e c e l l s w e r e w a s h e d w i t hHEPES b u f f e r .F l u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t s . F r e s h l y l o a d e d p l a t e l e t s weres p u n d o w n a n d r e s u s p e n d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 2 x 1 0 7c e l l s p e r m l i n HEPES b u f f e r s u p p l e m e n t e d w i t h C a C l 2 ( 1mM ) a n d M g C l 2 ( 0 . 8 m M ) . A P e r k i n - E l m e r s p e c t r o f l u o r o m -e t e r w a s u s e d w i t h a n e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h s e t a t 3 4 0 nma n d e m i s s i o n m e a s u r e d a t 5 1 0 n m . S t i m u l i w e r e a d d e d a si n d i c a t e d i n t h e R e s u l t s . Maximum f l u o r e s c e n c e v a l u e s( F m a x ) w e r e o b t a i n e d b y a d d i n g d i g i t o n i n e u p t o a f i n a lc o n c e n t r a t i o n o f S , u g / m l , t h u s p e r m e a b i l i z i n g t h e c e l l s f o rc a l c i u m a n d e n s u r i n g t h a t e s s e n t i a l l y a l l f u r a - 2 was com-p l e x e d w i t h c a l c i u m . Minimum f l uo r es c e n ce v a l ue s ( F m i n )w e r e s u b s e q u e n t l y o b t a i n e d b y a d d i n g EG TA u p t o a f i n a lc o nc e n t r at i o n o f 6 . 6 mM , t o c h e l a t e f r e e c a l c i u m a n d t oe n s u r e t h a t e s s e n t i a l l y n o f u r a - 2 was c o m p l e x e d w i t h c a l -c i u m . I n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s w e r e c a l c u -l a t e d b y m e t h o d s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y b y T s i e n e t a l .12-HETE r e l e a s e f r o m human p l a t e l e t s . Human p l a t e l e t s( 1 0 8 ) w e r e s u s p e n d e d i n 0 . 5 m l o f PBS b u f f e r ( p H 7 . 4 ) w i t h0 . 8 mM M g C l 2 a n d 1 mM C a C l 2 . F o r s t i m u l a t i o n , 1 0 0 , u l o fb a c t e r i a l c e l l s u s p e n s i o n ( 5 x 1 0 8 b a c t e r i a ) w a s a d d e d t o t h ec e l l s a n d i n c u b a t e d a s d e s c r i b e d i n R e s u l t s . T h e s u p e r n a t a n to f s t i m u l a t e d c e l l s was a n a l y z e d f o r 12-HETE f o r m a t i o n b yh i g h - p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( 1 7 ) . T h e m o b i l e p h a s ew a s a m i x t u r e o f a K 2 H P O 4 s o l u t i o n ( 1 7 mM ) c o n t a i n i n g

I N F E C T . IMMUN.


3/9

HEMOLYSIN-POSITIVE AND -NE GA TI VE E . COLI 1 5 9 3

0 . 0 5 % EDTA, a c e t o n i t r i l e , a n d m e t h a n o l ( 1 : 0 . 7 5 : 0 . 7 5 , b yv o l u m e ) a d j u s t e d t o p H 5 . 0 w i t h p h o s p h o r i c a c i d .A s s a y f o r s e r o t o n i n r e l e a s e . Washed human p l a t e l e t s w e r er e s u s p e n d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 9 p l a t e l e t s p e r m l i n PBSc o n t a i n i n g [ 3 H ] s e r o t o n i n ( 5 - h y d r o x y [ 3 H ] t r y p t a m i n e ; 0 . 2p i C i / 1 0 8 c e l l s ) . T h e s u s p e n s i o n w a s i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t3 7 C , d u r i n g t h i s t i m e , 75% o f t h e 5 - h y d r o x y [ 3 H ] t r y p t a m i n ew a s i n c o r p o r a t e d . T h e l a b e l e d p l a t e l e t s w e r e w a s h e d t w i c ew i t h PBS a n d f i n a l l y s u s p e n d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 2 x 1 0 8p l a t e l e t s p e r m l . T h e r e l e a s e o f [ 3 H ] s e r o t o n i n w a s d e t e r -m i n e d a f t e r m i x i n g t h e p l a t e l e t s u s p e n s i o n w i t h 0 . 5 m l o f 3%p a r a f o r m a l d e h y d e i n P B S . T h e f o r m a l d e h y d e - t r e a t e d s a m -p l e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 , 2 0 0 x g f o r 1 0 m i n , a n d t h es u p e r n a t a n t w a s a n a l y z e d f o r 3 H r a d i o a c t i v i t y b y l i q u i ds c i n t i l l a t i o n s p e c t r o m e t r y . R e l e a s e d [ 3 H ] s e r o t o n i n i s e x -p r e s s e d a s a p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l p l a t e l e t - b o u n d[ 3 H ] s e r o t o n i n .B i n d i n g o f G p p ( N H ) p . C e l l s w e r e i n c u b a t e d i n t h e p r e s -e n c e o f NaF ( 2 5 m M ) , E . c o l i K - 1 2 ( 1 0 9 c e l l s ) , a n d E . c o l iK - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) ( 1 0 9 c e l l s ) o r i n t h e a b s e n c e o f a n y s t i m u -l u s ( b u f f e r c o n t r o l ) f o r 4 0 m i n a t 3 7 C . T h e c e l l s u s p e n s i o n sw e r e w a s h e d , s u s p e n d e d i n 0 . 5 M T r i s - 0 . 3 4 M s u c r o s e b u f f e r( p H 7 . 5 ) , a n d E G T A ( 1 mM), d i t h i o t h r e i t o l ( 1 mM), a n dl e u p e p t i n ( 1 0 0 , u g / m l ) w e r e a d d e d . C e l l d i s r u p t i o n w a s c a r -r i e d o u t b y s o n i c a t i o n ( B r a n s o n S o n i f i e r 2 5 0 ) . T h e s o n i c a t e sw e r e c e n t r i f u g e d a t 3 0 0 x g f o r 1 0 m i n , a n d t h e r e s u l t i n gp o s t n u c l e a r s u p e r n a t a n t w a s f u r t h e r d i f f e r e n t i a t e d b y c e n -t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n ( J 2 - 2 1 c e n t r i f u g e w i t h aJ A - 2 0 r o t o r ; Beckman I n s t r u m e n t s , P a l o A l t o , C a l i f . ) a n d a1 0 0 , 0 0 0 x g f o r 6 0 m i n ( L 8 - 7 0 U l t r a c e n t r i f u g e , SW 6 O T ir o t o r ; B e c k m a n ) . T h e 1 0 0 , 0 0 0 x g p e l l e t w a s s u s p e n d e d i nT r i s - s u c r o s e b u f f e r , a s s a y e d f o r p r o t e i n c o n t e n t b y t h em e t h o d o f B r a d f o r d ( 1 ) , a n d s t o r e d a t - 7 0 C . T h e b i n d i n g o f3 H - l a b e l e d g u a n y l y l i m i d o d i p h o s p h a t e ( [ 3 H ] - G p p ( N H ) p )w a s d e t e r m i n e d b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e p r o c e d u r e o fM a t s u m o t o e t a l . ( 2 3 a ) . T h e membrane f r a c t i o n ( 1 0 , u g o fp r o t e i n ) w a s i n c u b a t e d i n 2 0 mM T r i s - H C l b u f f e r ( p H 7 . 5 )c o n t a i n i n g 1 5 0 mM N a C l , 5 mM M g C l 2 , 0 . 1 mM EGTA, 1 . 1 4mM ATP, 0 . 5 mM A p p ( N H ) p , 0 . 2 5 mM o u a b a i n , a n d 0 . 5, u m [ 3 H ] G p p ( N H ) p . N o n s p e c i f i c b i n d i n g w a s d e f i n e d a s t h ea m o u n t o f [ 3 H ] G p p ( N H ) p b o u n d i n t h e p r e s e n c e o f a1 , 0 0 0 - f o l d m o l a r e x c e s s o f n o n l a b e l e d G p p ( N H ) p . I n c u b a -t i o n s w e r e t e r m i n a t e d a f t e r 1 2 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e b yr a p i d f i l t r a t i o n t h r o u g h c e l l u l o s e e s t e r m e m b r a n e s ( p o r e s i z e ,0 . 4 5 , u m ; M i l l i t i t e r HA f i l t r a t i o n p l a t e s ; M i l l i p o r e C o r p .E s c h b o r n , F R G ) . T h e f i l t e r s w e r e w a s h e d f o u r t i m e s w it h 2 0mM T r i s b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 2 5 mM M g C l 2 a n d 5 0 p u MEGTA. T h e d r i e d f i l t e r s w e r e m e a s u r e d f o r r a d i o a c t i v i t y b yl i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g .G T P a s e a s s a y . Membrane p r o t e i n ( 1 0 j i g ) w a s a d d e d t o 1 7 0, u l o f 2 0 mM T r i s - H C l b u f f e r ( p H 7 . 6 ) c o n t a i n i n g 1 5 0 mMN a C l , 5 mM M g C l 2 , 0 . 1 mM EGTA, 1 . 1 4 mM A T P , 0 . 5 mMA p p ( N H ) p , 5 mM p h o s p h o c r e a t i n i n e , 5 0 U o f c r e a t i n ep h o s p h o k i n a s e p e r , u l , a n d 0 . 2 5 , u M [ y - 3 2 P ] G T P ( 3 0 C i / m m o l ;Amersham C o r p . ) . T h e a s s a y w a s r u n f o r 1 2 0 m i n a n d w a st e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o f 1 m l o f 2 0 mM p o t a s s i u m p h o s -p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) c o n t a i n i n g 5 % c h a r c o a l , 0 . 5 % b o v i n es e r u m a l b u m i n , a n d 0 . 1 % d e x t r a n . T h e s a m p l e s w e r e c e n -t r i f u g e d f o r 8 m i n a t 1 3 , 0 0 0 x g , a n d t h e r a d i o a c t i v i t y i n 0 . 2m l o f t h e s u p e r n a t a n t w a s c o u n t e d . G T P a s e a c t i v i t y i sr e p o r t e d a s 3 2 P i r e l e a s e d f r o m [ - y - 3 2 P ] G T P .D e t e r m i n a t i o n o f LDH. LDH ( E C 1 . 1 . 1 . 2 7 ) w a s d e t e r -m i n e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 8 ) . Enzyme r e l e a s e w a sq u a n t i f i e d a s p e r c en t a g e o f t o t a l a c t i v i t i e s f r o m s o n i c a t e dc e l l s .S t a t i s t i c s . I f n o t s t a t e d o t h e r w i s e , a l l d a t a w e r e c a l c u l a t e d

E -LI )z iC -

- C -Z--Z

J O_ -A

1 0 0 0 0l - c A l- C ; i

-4

0 0 / 0 "B

1 0 ' /C - I

-c)

-z l

0 5 1 0 st i m e ( m l i n u t e s )

2 8 . 5l M

1 5 1 0 1 5t i r r e ( m i n u t e s )

,FiN a F - E o 31

0~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~5t i m e ( r r l n u t e s )

F I G . 1 . E f f e c t o f h e m o l y s i n , N a F , a n d NaF i n t h e p r e s e n c e o f E .c o l i 5 3 6 / 2 1 o n p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . S u s p e n s i o n s o f p l a t e l e t s weres t i m u l a t e d w i t h ( A ) 1 0 9 E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) c e l l s e x p r e s s i n gd i f f e r e n t h e m o l y s i n a c t i v i t i e s , ( B ) NaF a t t h e c o n c e n t r a t i o n s i n d i -c a t e d , a n d ( C ) e i t h e r ( 1 2 . 5 mM ) NaF o r 1 2 . 5 mM NaF i n t h ep r e s e n c e o f 1 0 9 w a s h e d b a c t e r i a . A g g r e g a t i o n was r e c o r d e d c o n t i n -u o u s l y . V a l u e s r e p r e s e n t t h e r e s u l t s f r o m s i x d i f f e r e n t p l a t e l e tp r e p a r a t i o n s .a s means s t a n d a r d d e v i a t i o n ( S D ) o f t h r e e i n d e p e n d e n te x p e r i m e n t s .

RESULTSP l a t e l e t a g g r e g a t i o n b y E . c o l i s t r a i n s . A g g r e g a t i o n s t u d i e s

w e r e c a r r i e d o u t a s a p a r a m e t e r o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n . To 8 0 0, u l o f w a s h e d p l a t e l e t s ( 1 0 8 / m l ) i n PBS w i t h c a l c i u m a n dm a g n e s i u m ( 0 . 8 m M ) , w a s h e d b a c t e r i a ( 1 0 0 , u l , 1 0 9 ) orc u l t u r e s u p e r n a t a n t ( 1 0 0 , u l ) wa s a d d e d . T h e h e m o l y s i n -n e g a t i v e b a c t e r i a d i d n o t i n d u c e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . S u b s e -q u e n t l y , w a s h e d E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) , w h i c h e x p r e s s e sh e m o l y s i n ( f r o m 1 0 t o 1 0 0 % ) , i n c o n t r a s t t o E . c o l i K - 1 2 , wass t u d i e d . A s s h o w n i n F i g . 1 , t h e h e m o l y s i n - e x p r e s s i n g s t r a i nw a s a b l e t o i n d u c e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n a d o s e - d e p e n d e n tm a n n e r . D e p e n d i n g on t h e h e m o l y s i n c o n c e n t r a t i o n , p l a t e l e ta g g r e g a t i o n s t a r t e d a f t e r a l a g p e r i o d o f 3 0 s ( 1 0 0 % h e m o l y s i na c t i v i t y ) t o 3 m i n ( 1 0 % h e m o l y s i n a c t i v i t y ) a n d r e a c h e dm a x i m a l v a l u e s w i t h i n 5 t o 3 0 m i n f r o m t h e o n s e t . To v e r i f yt h a t p l a t e l e t a g g r e g a t i o n wa s i n d u c e d b y h e m o l y s i n i t s e l f ,

VOL. 5 8 , 1 9 9 0

o ,

-I


4/9

1 5 9 4 KONIG ET A L .h e m o l y s i n - c o n t a i n i n g a n d h e m o l y s i n - f r e e c u l t u r e s u p e r n a -t a n t s w e r e a p p l i e d a s s t i m u l i . T h e h e m o l y s i n - p o s i t i v e c u l t u r es u p e r n a t a n t i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n a d o s e - d e p e n -d e n t m a n n e r , w h i l e t h e h e m o l y s i n - n e g a t i v e s u p e r n a t a n tf a i l e d t o d o s o ( d a t a n o t s h o w n ) . H e m o l y s i n d i d n o t a c tt h r o u g h p l a t e l e t c y t o t o x i c i t y , a s w a s e x a m i n e d b y l i g h tm i c r o s c o p y a n d LDH r e l e a s e .S i n c e G - p r o t e i n s h a v e b e e n d e s c r i b e d t o e x e r t a r e g u l a t o r yr o l e i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n , NaF w a s a d d e d a s a c o s t i m u l u sf o r p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . F i g u r e 1 B s h o w s t h e a g g r e g a t i o np at t e rn o f human p l a t e l e t s i n d u c e d b y N a F . A g g r e g a t i o ns t a r t e d a f t e r a l a g p e r i o d o f 1 m i n a n d r e a c h e d a maximumw i t h i n 5 m i n f r o m t h e o n s e t a t a NaF c o n c e n t r a t i o n o f 1 2 . 5mM . A t l o w e r Na F c o n c e n t r a t i o n s , t h e l a g p h a s e i n c r e a s e da n d m a x i m a l v a l u e s w e r e r e a c h e d a t l a t e r i n c u b a t i o n t i m e s .I n t h e p r e s e n c e o f N a F , t h e o n s et o f a g g r e g a t i o n i n d u c e d b yt h e h e m o l y s i n - p o s i t i v e E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) w a s s l i g h t l yf a s t e r t h a n w i t h t h e b a c t e r i a a l o n e . When p l a t e l e t s w e r ei n c u b a t e d w i t h NaF i n t h e p r e s e n c e o f t h e n o n h e m o l y t i c E .c o l i s t r a i n s , w h i c h b y t h e m s e l v e s d i d n o t i n d u c e p l a t e l e ta g g r e g a t i o n , N a F - i n d u c e d a g g r e g a t i o n w a s c o m p l e t e l y i n h i b -i t e d , a s i s s h o w n f o r E . c o l i 5 3 6 / 2 1 ( F i g . 1 C ) . A d h e s i n -b e a r i n g a n d a d h e s i n - d e f i c i e n t s t r a i n s w e r e s i m i l a r i n t h e i ri n h i b i t o r y e f f e c t s . A d d i t i o n o f t h e b a c t e r i a l s t r a i n s a t v a r i o u st i m e p o i n t s ( 1 t o 1 0 m i n ) a f t e r a c t i v a t i o n o f t h e p l a t e l e t s w i t hNa F d i d n o t i n h i b i t p l a t e l e t a g g r e g a t i o n , s u g g e s t i n g t h a t t h es i m u l t a n e o u s p r e s e n c e o f NaF a n d b a c t e r i a i s r e q u i r e d f o rs u p p r e s s i o n .S e r o t o n i n r e l e a s e f r o m human p l a t e l e t s . P l a t e l e t s ( 1 0 8 )l a b e l e d w i t h [ 3 H ] s e r o t o n i n w e r e i n c u b a t e d w i t h t h e v a r i o u sE . c o l i s t r a i n s . S e r o t o n i n r e l e a s e w a s m o n i t o r e d f r o m 3 0 s u pt o 4 0 m i n o f i n cu ba t io n . T h e h e m o l y s i n - n e g a t i v e s t r a i n s ,i n d e p e n d e n t o f t h e i r t y p e o f a d h e s i n , d i d n o t i n d u c e s e r o t o -n i n r e l e a s e e v e n a t c o n c e n t r a t i o n s u p t o 1 0 1 0 b a c t e r i a .P l a t e l e t s s t i m u l a t e d w i t h E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) r e v e a l e d as e r o t o n i n r e l e a s e w h i c h r a n g e d f r o m 1 0 % ( h e m o l y s i n a c t i v -i t y , 5 5 % ) t o 5 0 % ( h e m o l y s i n a c t i v i t y , 1 0 0 % ) ( F i g . 2 A ) . T h er e l e a s e o f s e r o t o n i n o b v i o u s l y o c c u r r e d 3 0 s a f t e r t h e s t i m -u l u s w a s a d d e d a n d r e a c h e d a p l a t e a u a f t e r 2 0 t o 4 0 m i n ,d e p e n d i n g o n t h e h e m o l y s i n a c t i v i t y . I n a d d i t i o n t o b a c t e r i a -b o u n d h e m o l y s i n , t h e h e m o l y s i n - p o s i t i v e c u l t u r e s u p e r n a -t a n t s ( " f r e e " h e m o l y s i n ) w e r e s t u d i e d a s s t i m u l i f o r s e r o t o -n i n r e l e a s e . T h e r e l e a s e o f s e r o t o n i n a l s o o c c u r r e d 3 0 s a f t e rt h e s t i m u l u s w a s a d d e d a n d r e a c h e d a p l a t e a u a f t e r 2 0 t o 4 0m i n , d e p e n d e n t o n t h e h e m o l y s i n a c t i v i t y ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e r e l e a s e o c c u r r e d u n d e r n o n c y t o t o x i c c o n d i t i o n s , a sa s s e s s e d b y t r y p a n b l u e e x c l u s i o n a n d f a i l u r e o f LDHr e l e a s e .Na F i s a l s o a p o t e n t s t i m u l u s f o r s e r o t o n i n r e l e a s e .Human p l a t e l e t s r e s p o n d w i t h t h e r e l e a s e o f s e r o t o n i n i n at i m e - a n d d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g . 2 B ) . When n o n h e -m o l y t i c E . c o l i b a c t e r i a a n d NaF w e r e a d d e d s i m u l t a n e o u s l yt o p l a t e l e t s , t h e p a t t e r n o f t h e N a F - i n d u c e d s e r o t o n i n r e l e a s ew a s c h a n g e d s l i g h t l y c o m p a r e d w i t h t h e p a t t e r n i n e x p e r i -m e n t s w i t h NaF a l o n e . E . c o l i 5 3 6 / 2 1 a n d m a n n o s e - s e n s i t i v eE . c o l i b a c t e r i a h a d n o o r a n i n h i b i t o r y e f f e c t ( 1 0 t o 2 0 % ) ,d e p e n d i n g o n t h e NaF c o n c e n t r a t i o n ( F i g . 3 ) . T h e E . c o l is t r a i n s b e a r i n g m a n n o s e - r e s i s t a n t a d h e s i n s s h o w e d a t l o wNa F c o n c e n t r a t i o n s a s t i m u l a t o r y e f f e c t ( 3 0 t o 5 0 % ) a s w a ss h o w n b y r e p e a t e d e x p e r i m e n t s ( F i g . 3 ) . W i t h h i g h e r NaFc o n c e n t r a t i o n s ( > 1 0 m M ) , t h e e f f e c t s w e r e m o r e p r o -n o u n c e d . P r e i n c u b a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h a d h e r e n t b a c t e r i af o r 1 h h a d n o e f f e c t o n s u b s e q u e n t N a F - i n d u c e d s e r o t o n i nr e l e a s e ( d a t a n o t s h o w n ) . When p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e dw i t h NaF a n d E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) ( h e m o l y s i n a c t i v i t y ,8 0 % ) , t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e h e m o l y s i n - i n d u c e d s e r o -

s e r o t o n i n r e l e a s e 1 % o f c o n t r o l l6 0 -5 0 -* E . c o l i K 1 240- - A , 5 5 % h e m o l y t . a c t i v . /

-.- 7 5 % h e m o l y t . a c t i v . ,30 -*- 82 % h e m o l y t . a c t i v .2 0- + - 1 0 0 % h e m o l y t . a c t i v . -1 0

5

B

6 0 1 -*- 2 . 5 m M40

1 0 2 0t i m e [ m i n i

s e r o t o n i n r e l e a s e [ % o f t o t a l l

- A- 1 2 . 5 m M a 7-*- 25mM

II AA~~~~

0 1 0 20t i m e [ m i n ] 30 40

F I G . 2 . D o s e - d e p e n d e n t e f f e c t o f h e m o l y s i n a n d NaF o n s e r o t o -n i n r e l e a s e . P l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d w i t h E . c o l i b a c t e r i a o f v a r i o u sh e m o l y t i c a c t i v i t i e s ( h e m o l y t . a c t i v . ) ( A ) a n d w i t h NaF a t t h ei n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n s ( B ) a t 3 7 C . S e r o t o n i n r e l e a s e w a s m o n i -t o r e d f o r u p t o 2 0 m i n . E a c h v a l u e r e p r e s e n t s t h e m e a n + SD o f a tl e a s t t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s .t o n i n r e l e a s e w a s n o t i n f l u e n c e d b y N a F . T h e r e w a s n oa d d i t i v e e f f e c t w i t h r e g a r d t o t h e a m o u n t o f s e r o t o n i nr e l e a s e d ( d a t a n o t s h o w n ) .I n d u c t i o n o f 12-HETE f o r m a t i o n f r o m human p l a t e l e t s b yE . c o l i s t r a i n s . W e t h e n s t u d i e d t h e e f f e c t o f t h e v a r i o u sw a s h e d E . c o l i s t r a i n s o n 12-HETE f o r m a t i o n f r o m humanp l a t e l e t s . E . c o l i 5 3 6 / 2 1 f a i l e d t o i n d u c e t h e r e l e a s e o f1 2 - H E T E . E . c o l i s t r a i n s w i t h a d h e s i n s i n d u c e d m i n i m a la m o u n t s o f 12-HETE ( 1 2 5 n g ) , w h i c h w e r e s l i g h t l y h i g h e rt h a n b a s e l i n e l e v e l s , i . e . , p l a t e l e t s i n t h e p r e s e n c e o f b u f f e r .T h e d i f f e r e n c e s among t h e v a r i o u s a d h e s i n s d i d n o t a f f e c t t h ef o r m a t i o n o f 1 2 - H E T E . W i t h E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) a s t h es t i m u l u s , a s l i g h t i n c r e a s e i n 12-HETE f o r m a t i o n c o m p a r e dw i t h t h e n o n h e m o l y t i c E . c o l i s t r a i n s w a s o b s e r v e d . T h ev a l u e s r a n g e d f r o m 1 9 6 n g a t a h e m o l y s i n a c t i v i t y o f 13%u p t o 2 5 6 n g a t a h e m o l y s i n a c t i v i t y o f 8 0 % .Na F w a s a v e r y e f f e c t i v e s t i m u l u s f o r 12-HETE r e l e a s ef r o m i n t a c t p l a t e l e t s . T h e r e s p o n s e w a s d e p e n d e n t o n t h ec o n c e n t r a t i o n o f s o d i u m f l u o r i d e . T h e a m o u n t s o f 12-HETEr a n g e d f r o m 9 0 2 9 n g a t a Na F c o n c e n t r a t i o n o f 2 . 5 mM u pt o 1 , 2 0 0 3 0 0 n g a t a c o n c e n tr a t i o n o f 1 2 . 5 mM a n d d e c l i n e da t a n NaF c o n c e n t r a t i o n o f 2 5 mM t o 9 0 0 1 5 0 n g . T h ea b i l i t y o f NaF t o i n d u c e t h e r e l e a s e o f 12-HETE w a sm a r k e d l y r e d u c e d ( b y 8 5 % ) i n t h e p r e s e n c e o f t h e n o n h e m o -l y t i c E . c o l i s t r a i n s a n d a l s o b y E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) .Among t h e n o n h e m o l y t i c E . c o l i s t r a i n s , a d h e s i n - e x p r e s s i n gb a c t e r i a w e r e b e t t e r a b l e t o i n h i b i t N a F - i n d u c e d 12-HETEf o r m a t i o n ( P < 0 . 0 5 ) t h a n E . c o l i 5 3 6 / 2 1 ( d a t a n o t s h o w n ) . A se x a m p l e s a r e s h o w n t h e k i n e t i c s o f N a F - i n d u c e d 12-HETE


2


5/9

HEMOLYSIN-POSITIVE AND -NEGATIVE E . COLI 1 5 9 5

5 0 -4 0 -3 0 -2 0 -1 0 -

------- S- MRH P - M R H S - M R H MSH P BSS - F i m P-Fim MS-Fim

s e r o t o n i n r e l e a s e [ % o f t o t a l ]

T I

v ------- S- MRH P- MRH S - M R H M SH PBSS - F i m P-Fim MS-Fim

F I G . 3 . I n t e r a c t i o n o f w a s h e d E . c o l i b a c t e r i a w i t h N a F - i n d u c e ds e r o t o n i n r e l e a s e f r o m p l a t e l e t s . P l a t e l e t s we r e i n c ub a te d w i th Na Fi n t h e presence o f no b a c t e r i a or o f E . c o l i b a c t e r i a e x p r e s s i n gd i f f e r e n t a d h e s i n s . U p p e r p a n e l , 2 . 5 mM N a F ; l o w e r p a n e l , 2 5 mMN a F . T h e i n c u b a t i o n t i m e was 1 5 m i n a t 3 7 C . E a c h v a l u e r e p r e s e n t st h e mean + SD o f a t l e a s t t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . * ,S i g n i f i c a n t c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l .f o r m a t i o n i n t h e presence o f E . c o l i 5 3 6 / 2 1 ( F i g . 4 ) . M a x i m a li n h i b i t i o n was o b s e r v e d a f t e r 2 0 t o 3 0 m i n o f i n c u b a t i o n .B i o c h e n i s t r y o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n . A d h e s i n s d o n o t seemt o p l a y an i m p o r t a n t r o l e i n d i r e c t p l a t e l e t a c t i v a t i o n , w h i c hd i f f e r s f r o m t h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h human g r a n u l o c y t e s .F o r t h i s purpose, t h e b i o c h e m i s t r y o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n wass t u d i e d w i t h o n l y t h r e e E . c o l i s t r a i n s , E . c o l i 5 3 6 / 2 1 ( H l y - ) ,E . c o l i K - 1 2 ( H l y - ) , a n d E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) ( H l y + ) .T r a ns l o c a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a c t i v i t y . Human p l a t e l e t s( 2 x 1 0 8 ) i n 1 m l o f PBS w i t h c a l c i u m ( 1 mM ) a n d m a g n e s i u m( 0 . 8 mM ) we r e i n c u b a t e d w i t h t h e d i f f e r e n t E . c o l i b a c t e r i a ( 5x 1 0 8 ) f o r v a r i o u s t i m e i n t e r v a l s . The r e m a i n i n g c y t o s o l i c

1 2 - H E T E r e l e a s e [ % o f c o n t r o l l100'80 -6040-2 0 ' \ i

0 1 0 2 0 3 0 4 0t i m e [ m i n ]

F I G . 4 . Time course o f 12-HETE r e l e a s e f r o m f l u o r i d e - s t i m u -l a t e d p l a t e l e t s i n t h e presence o f E . c o l i 5 3 6 / 2 1 . E a c h v a l u e r e p r e -s e n t s t h e mean + SD o f a t l e a s t t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s .

TABLE 2 . P r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n aMean c y t o s o l i c p r o t e i nE . c o l i s t r a i n M e a n h e m o l y s i n k i n a s e C a c t i v i t y SDac t i vi tyS D ( % ) ( % o f c o n t r o l ' )

5 3 6 / 2 1 9 0 4K - 1 2 5 8 6K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) 1 0 0 1 0 1 2 28 2 9 2 8 47 5 6 4 3 65 5 6 6 5 1 21 3 3 984

a R e s u l t s a r e m e a n s o f t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d i n t r i p l i -c a t e .b C o n t r o l a c t i v i t y wa s d e t e r m i n e d w i t h b u f f e r i n s t e a d o f b a c t e r i a .

p r o t e i n k i n a s e C a c t i v i t i e s w e r e q u a n t i t a t e d . A s a c o n t r o l ,p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e d w i t h p h o r b o l m y r i s t i c a c i d ( 1 0 - 8 M)f o r 1 0 m i n . W i t h t h e l o s s o f p r o t e i n k i n a s e C f r o m t h ec y t o s o l i c f r a c t i o n ( u p t o 40% o f t h e b u f f e r c o n t r o l ) , ac o n c o m i t a n t i n c r e a s e i n m e m b r a n e - a s s o c i a t e d p r o t e i n k i -n a s e C a c t i v i t y ( 1 2 0 v e r s u s 1 0 0 % o f t h e c o n t r o l v a l u e , i . e . ,u n s t i m u l a t e d c e l l s ) w a s o b s e r v e d . A l l E . c o l i s t r a i n s e x c e p tE . c o l i 5 3 6 / 2 1 i n d u c e d p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n . T h ed e c r e a s e i n c y t o s o l i c p r o t e i n k i n a s e C a c t i v i t y w a s d e t e c t -a b l e w i t h i n 5 t o 1 0 m i n a f t e r t h e a d d i t i o n o f b a c t e r i a .C y t o s o l i c p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t i e s i n t h e r a n g e o f 6 0 t o 8 0 %o f t h e c o n t r o l l e v e l s w e r e o b t a i n e d . T h e p r o t e i n k i n a s e Cl e v e l s o f t h e c y t o s o l r e t u r n e d t o b a s a l l e v e l s w i t h i n 2 0 t o 4 0m i n o f i n c u b a t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) . P l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t hE . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) ( H l y + ) s h o w e d a d o s e - d e p e n d e n ta c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e b y h e m o l y s i n ( T a b l e 2 ) . T h et r a n s l o c a t i o n p r o c e e d e d w i t h a l a g p h a s e o f 2 t o 1 0 m i n a n dw a s m o s t p r o n o u n c e d i n c e l l s i n c u b a t e d w i t h h i g h e r h e m o -l y s i n a c t i v i t i e s ( F i g . S A ) . A r e t u r n t o b a s a l l e v e l s w a s n o t e da f t e r 2 0 ( H l y + = 2 0 % ) t o 6 0 ( H l y + = 8 0 % ) m i n o f i n c u b a t i o n .To r u l e o u t p r o t e i n k i n a s e C i n a c t i v a t i o n b y h e m o l y s i n i t s e l f ,p a r t i a l l y p u r i f i e d p r o t e i n k i n a s e C f r o m u n s t i m u l a t e d p l a t e -l e t s w a s i n c u b a t e d w i t h h e m o l y s i n - p o s i t i v e E . c o l i b a c t e r i aa n d w i t h h e m o l y s i n - c o n t a i n i n g c u l t u r e s u p e r n a t a n t s . I n a c t i -v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y w a s n o t o b t a i n e d ( d a t a n o ts h o w n ) . W i t h f l u o r i d e a s t h e s t i m u l u s , t h e t r a n s l o c a t i o n o fp r o t e i n k i n a s e w a s d e t e c t a b l e 3 t o 5 m i n a f t e r t h e a d d i t i o n o fN a F . C o n t r o l l e v e l s w e r e r e a c h e d a f t e r 2 0 t o 3 0 m i n o fi n c u b a t i o n ( F i g . S B ) . I n s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s , t h e s i m u l -t a n e o u s a d d i t i o n o f Na F a n d E . c o l i b a c t e r i a w a s s t u d i e d .W i t h E . c o l i K - 1 2 , i t b e c a m e a p p a r e n t t h a t c o m b i n e d s t i m -u l a t i o n w i t h Na F d i d n o t d i f f e r f r o m t h e b a c t e r i a l l y i n d u c e dp r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n . S i m i l a r l y , t h e p a t t e r n o f a c t i v a -t i o n b y E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) w a s n o t m o d u l a t e d i n t h ep r e s e n c e o f Na F ( d a t a n o t s h o w n ) .E l e v a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m l e v e l s . P l a t e l e t s w e r el o a d e d w i t h t h e c a l c i u m - s e n s i t i v e f l u o r e s c e n t d y e f u r a - 2 , a n dt h e i n t r a c e l l u l a r C a 2 " c o n c e n t r a t i o n ( C a 2 " i ) w a s m e a s u r e d i ns u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s . C a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 ( 1 0 - 6M ) a s a c o n t r o l r e s u l t e d i n a n e x t r e m e l y r a p i d i n c r e a s e i nf l u o r e s c e n c e u p t o v a l u e s o b t a i n e d w i t h d i g i t o n i n f o r F m a x .E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) i n d u c e d r a p i d s u b s t a n t i a l i n c r e a s e si n p l a t e l e t c a l c i u m o v e r a c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 1 0 t o 1 0 0 %o f h e m o l y s i n a c t i v i t y ( T a b l e 3 ) . T h e i n c r e a s e s t a r t e d a f t e r 3 0s a n d r e a c h e d t h e m a x i m a l v a l u e o f 1 , 0 0 0 nM w i t h i n 3 m i nw i t h b a c t e r i a e x p r e s s i n g 1 0 0 % h e m o l y s i n ( F i g . 6 ) . B a c t e r i aw i t h 10% h e m o l y s i n r e a c h e d a v a l u e o f 2 0 0 nM a f t e r 3 m i n ,w h i l e f o r t h o s e w i t h 60 % h e m o l y s i n a v a l u e o f 5 0 0 t o 7 0 0 nMw a s o b t a i n e d . No i n c r e a s e i n C a 2 " i was o b s e r v e d whenp l a t e l e t s w e r e s t i m u l a t e d w i t h t h e n o n h e m o l y t i c s t r a i n E .

V O L . 5 8 , 1 9 9 0


6/9

1 5 9 6 KONIG ET A L .A c y t o s o l i c PKC a c t i v i t y [ % o f c o n t r o l i

1 0 0 - X80-I6 0 - - - - - - - - -4 0 -2 0 - I0 0 5 1 0 20 30

t i m e [ m i n i* 80 % h e m o l y t i c a c t i v . * 60 % h e m o l y t i c a c t i v .

a 10% h e m o l y t i c a c t i v i t yPKC a c t i v i t y [ % o f c o n t r o l l

1\.-*- 6 mM-,- 1 2 . 5 mM i-0- 2 8 . 5 mM 0 2 4 m0 1 2 3 4 [ m i n ]

0 5 1 0t i m e [ m i n i

20 30

F I G . 5 . T i m e - a n d d o s e - d e p e n d e n t a c t i v a t i o n o f c y t o s o l i c p r o t e i nk i n a s e C ( P K C ) b y h e m o l y s i n a n d NaF i n h u m a n p l a t e l e t s . P l a t e l e t sw e r e t r e a t e d w i t h h e m o l y s i n o f t h e i n d i c a t e d h e m o l y t i c a c t i v i t y( a c t i v . ) ( A ) o r w i t h Na F a t t h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n s ( B ) f o rv a r i o u s t i m e s . T h e c o n t r o l w a s u n t r e a t e d . R e s u l t s a r e m e a n s SDf r o m t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s .

c o l i K - 1 2 ( d a t a n o t s h o w n ) . When NaF was u s e d a s as t i m u l u s f o r p l a t e l e t a c t i v a t i o n a t c o n c e n t r a t i o n s f r o m 2 . 5 t o1 2 . 5 mM , t h e r i s e was l e s s ( 5 0 0 nM a t 5 mM a n d a t h i g h e rc o n c e n t r a t i o n s ) c o m p a r e d w i t h t h e i n c r e a s e o b t a i n e d w i t ht h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 a n d E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) .F i g u r e 6 p r e s e n t s a t y p i c a l f l u o r e s c e n c e t r a c i n g a f t e r s t i m u -l a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s w i t h Na F ( 2 5 mM ) a t t h e o p t i m a lc o n c e n t r a t i o n . T h e s i m u l t a n e o u s s t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t sw i t h Na F ( 1 2 . 5 mM ) a n d n o n h e m o l y t i c E . c o l i s t r a i n s ( K - 1 2TABLE 3 . E f f e c t o f Ca i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 , N a F , a n d b a c t e r i ao n i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m l e v e l s i n h u m a n p l a t e l e t s a

Mean i n c r e a s e L a g T i m e o fS t i m u l u s i n C a 2 . i + SD p h a s e m a x i m a l C a 2 + i( n M ) ( m i n ) ( m i n p o s t a d d i t i o n )

C a i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 7 2 0 1 2 0


7/9

HEMOLYSIN-POSITIVE AND -NEGATIVE E . COLI 1 5 9 7

K12pANN 5 2 1 14 0 % 2 0 % 1 0 %

F I G . 7 . B i n d i n g o f Gpp(NH)p t o p l a t e l e t m e m b r a n e s . P l a t e l e t swere s t i m u l a t e d w i t h b u f f e r , 2 5 mM NaF, E . c o l i K - 1 2 , or E . c o l iK-12(pANN5211) e x p r e s s i n g d i f f e r e n t h e m o l y s i n a c t i v i t i e s . Thei n c u b a t i o n p r o c e e d e d f o r 4 0 m i n . The e x p e r i m e n t shown i s r e p r e -s e nt a ti v e o f a t l e a s t t h r e e e x p e r i m e n t s .o d s , a n d t h e h y d r o l y s i s o f [ 3 2 P ] G T P was d e t e r m i n e d . As l i g h t s t i m u l a t i o n o f GTPase a c t i v i t y was d e t e c t e d upona d d i t i o n o f E . c o l i K - 1 2 ( A c p m , 3 , 0 4 4 8 4 ) compared w i t ht h e PBS c o n t r o l ( A c p m , 1 0 3 0 ) . NaF a n d E . c o l i K -1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) ( H l y + ) i n c r e a s e d GTPase a c t i v i t y 6 - f o l d( A c p m , 2 0 , 8 7 0 5 8 0 ) a n d 1 0 - f o l d (Acpm, 2 8 , 2 2 4 2 4 5 ) ,r e s p e c t i v e l y .

DISCUSSIONOur d a t a c l e a r l y d e m o n s t r a t e t h a t h e m o l y s i n - p o s i t i v e E .c o l i b a c t e r i a and h e m o l y s i n - n e g a t i v e E . c o l i s t r a i n s a c t i v a t et h e s i g n a l t r a n s d u c t i o n cascase o f p l a t e l e t s i n a d i f f e r e n t

way, as shown by p l a t e l e t a c t i v a t i o n ( s e r o t o n i n r e l e a s e ,a g g r e g a t i o n , 1 2 -HETE f o r m a t i o n ) a n d e a r l y s t i m u l u s - t r a n s -d u c i n g events ( G - p r o t e i n i n v o l v e m e n t , p r o t e i n k i n a s e C ,c a l c i u m m o b i l i z a t i o n , a n d G - p r o t e i n - m e d i a t e d a c t i v a t i o n b yN a F ) . I s o g e n i c E . c o l i s t r a i n s w i t h d e f i n e d types o f a d h e s i n sa n d h e m o l y s i n e x p r e s s i o n were s t u d i e d .T he h e m o l y s i n - p o s i t i v e E . c o l i s t r a i n K-12(pANN5211)( H l y + ) as w e l l as t h e h e m o l y s i n - p o s i t i v e c u l t u r e superna-t a n t s i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e r o t o n i n r e l e a s e i n ad o s e - d e p e n d e n t manner. E . c o l i K-12(pANN5211) a l s o i n -d u c e d 1 2 -HETE f o r m a t i o n . A l l n o n h e m o l y t i c b a c t e r i a f a i l e dt o i n d u c e s e r o t o n i n r e l e a s e f r o m p l a t e l e t d e n s e g r a n u l e s .C o n s i s t e n t w i t h t h e s e r e s u l t s , t h e n o n h e m o l y t i c b a c t e r i a ,u n l i k e t h e h e m o l y s i n - p o s i t i v e E . c o l i s t r a i n s , d i d not i n d u c ei r r e v e r s i b l e p l a t e l e t a g g r e g a t i o n .

I n e a r l i e r i n v e s t i g a t i o n s , i t c o u l d b e d e m o n s t r a t e d t h a t t h ev a r i o u s a d h e s i n s a n d t h e h e m o l y s i n o f E . c o l i are potentp a t h o g e n i c i t y f a c t o r s ( 1 9 ) . I n human g r a n u l o c y t e s and r a tmast c e l l s , E . c o l i w i t h S - t y p e m a n n o s e - r e s i s t a n t a d h e s i n swas t h e most potent i n d u c e r f o r l e u k o t r i e n e f o r m a t i o n a n dh i s t a m i n e r e l e a s e ( 1 7 ) ; E . c o l i b a c t e r i a w i t h P - t y p e mannose-r e s i s t a n t a d h e s i n s were l e s s a c t i v e . M a n n o s e - s e n s i t i v e a d -h e s i n s seemed to p l a y no r o l e i n l e u k o t r i e n e f o r m a t i o n a n dh i s t a m i n e r e l e a s e . Wi th hu man l y m p h o c y t e s , monocytes,a n d b a s o p h i l s , t h e v a r i o u s k i n d s o f a d h e s i n s d i f f e r e d i n t h e i ra b i l i t y t o i n h i b i t c e l l u l a r responses b y a s u b s e q u e n t s t i m u l u s .T he a c t i v a t i o n o f t h e i n f l a m m a t o r y c e l l s was s i g n i f i c a n t l yenhanced i n t h e presence o f h e m o l y s i n . I t i s apparent f r o mour d a t a t h a t E . c o l i a - h e m o l y s i n i s a potent component i np l a t e l e t a c t i v a t i o n . I n contrast t o human p o l y m o r p h o n u c l e a r

l e u k o c y t e s , l y m p h o c y t e s , m o n o c y t e s , a n d b a s o p h i l s , h u m a np l a t e l e t s d i d n o t s h o w a d h e s i n - s p e c i f i c m e d i a t o r r e l e a s e . Af a i l u r e o f r e c e p t o r s p e c i f i c i t y o n human p l a t e l e t s may a c -c o u n t f o r t h e d i f f e r e n t r e s u l t s o b t a i n e d .No d a t a e x i s t a s t o t h e s i g n a l - t r a n s d u c i n g e v e n t s i n p l a t e l e ta c t i v a t i o n b y w h o l e b a c t e r i a o r d e f i n e d p a t h o g e n i c i t y f a c t o r so f E . c o l i , e . g . , t h e a - h e m o l y s i n . T h e r o l e o f p r o t e i n k i n a s eC i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d r e g u l a t i o n h a s b e e n t h e s u b j e c t o fn u m e r o u s i n v e s t i g a t i o n s ( 2 6 , 3 2 , 3 3 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e dt h a t s o m e h u m a n p l a t e l e t r e s p o n s e s a r e m e d i a t e d a t l e a s t i np a r t t h r o u g h t h e a c t i v a t i o n o f t h e p r o t e i n k i n a s e C s y s t e m .S t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t s b y n e u r o t r a n s m i t t e r s , h o r m o n e s ,a n d b i o l o g i c a l l y a c t i v e s u b s t a n c e s r e s u l t s i n t h e a c t i v a t i o n o ft w o e n z y m e s , m y o s i n l i g h t - c h a i n k i n a s e a n d p r o t e i n k i n a s eC ( 1 3 , 3 2 ) . M y o s i n l i g h t - c h a i n k i n a s e , a c a l m o d u l i n - d e p e n -d e n t e n z y m e , r e q u i r e s a n i n c r e a s e i n f r e e c y t o p l a s m i c c a l -c i u m c o n c e n t r a t i o n f o r i t s a c t i v a t i o n ( 9 ) , w h i l e p r o t e i n k i n a s eC s t i m u l a t i o n a l s o o c c u r s a t r e s t i n g c a l c i u m l e v e l s ( 3 0 ) . T h eh e m o l y s i n - p o s i t i v e E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) i n d u c e d p r o t e i nk i n a s e C a c t i v a t i o n i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r a s w e l l a s ar i s e i n i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m l e v e l s . H e m o l y s i n a c t i v i t yg r e a t e r t h a n 50% w a s r e q u i r e d t o i n d u c e s e r o t o n i n r e l e a s e .T h e s e a c t i v i t i e s e x c e e d e d t h o s e r e q u i r e d f o r p r o t e i n k i n a s ea c t i v a t i o n i n p l a t e l e t s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t s e r o t o n i nr e l e a s e b y h e m o l y s i n m i g h t n o t b e d u e t o t h e a c t i v a t i o n o fp r o t e i n k i n a s e a l o n e . A l l n o n h e m o l y t i c b a c t e r i a e x c e p t E .c o l i 5 3 6 / 2 1 , w h i c h h a s n o a d h e s i n s , a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s eC b u t d i d n o t i n d u c e c a l c i u m i n f l u x . T h e s e r e s u l t s s u g g e s tt h a t s t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e r o t o n i n r e l e a s em i g h t n o t b e d u e t o t h e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a l o n e .T h e d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h e a r l i e r o b s e r v a t i o n s i n w h i c ht h e i n d e p e n d e n t i n d u c t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o na n d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n w a s s h o w n b y u s i n g t h e e x o g e n o u sa d d i t i o n o f s y n t h e t i c d i a c y l g l y c e r o l o r 1 2 - O - t e t r a d e c a -n o y l p h o r b o l - 1 3 - a c e t a t e f o r t h e f o r m e r a n d t h e c a l c i u m i o n o -p h o r e A 2 3 1 8 7 f o r t h e l a t t e r a c t i v a t i o n p r o c e s s ( 2 , 9 , 4 0 ) .U n d e r a p p r o p r i a t e c o n d i t i o n s , p r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o na n d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n a l s o a c t s y n e r g i s t i c a l l y t o e l i c i t ap h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e o f t h e p l a t e l e t s , e . g . , t h e r e l e a s e o fs e r o t o n i n .Human p l a t e l e t s r e s p o n d t o a g o n i s t s b y g e n e r a t i n g f r e ea r a c h i d o n i c a c i d , t h e p r e c u r s o r o f t h r o m b o x a n e A2 a n d1 2 - H E T E . E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) i n d u c e d o n l y l o wa m o u n t s o f 1 2 - H E T E . A l l h e m o l y s i n - n e g a t i v e E . c o l i s t r a i n s ,i n d e p e n d e n t o f t h e i r a d h e s i n s , i n d u c e d t h e r e l e a s e o f o n l yn e g l i g i b l e a m o u n t s o f 1 2 - H E T E . A l t h o u g h t h e r e g u l a t o r ym e c h a n i s m s w h i c h u n d e r l i e t h e a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s ep r o c e s s a r e n o t c l e a r l y u n d e r s t o o d , a c r u c i a l r o l e f o r c a l c i u mi s i n d i c a t e d b y t h e a b i l i t y o f t h e C a i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 t og e n e r a t e a r a c h i d o n i c a c i d a n d 1 2 - H E T E f r o m p l a t e l e t s . T h ee x i s t e n c e o f a c a l c i u m - a n d p h o s p h o l i p i d - i n d e p e n d e n t f o r mo f p r o t e i n k i n a s e C a s w e l l a s g e n e t i c a l l y d i f f e r e n t s u b s e t s o fp r o t e i n k i n a s e C ( 7 , 1 1 , 1 2 , 1 6 , 2 0 , 2 4 ) s u g g e s t t h a t t h ep r e f e r e n t i a l a c t i v a t i o n o f t h e s e k i n a s e s may m o d u l a t e d i f -f e r e n t a s p e c t s o f t h e c e l l u l a r r e s p o n s e s .To t r a n s d u c e t h e i n f o r m a t i o n a c r o s s t h e c e l l m e m b r a n e ,m o s t t i s s u e s s e e m t o h a v e a t l e a s t t w o m a j o r r e c e p t o rc l a s s e s . O n e c l a s s d e p e n d s o n t h e g e n e r a t i o n o f c y c l i c AMPa s a s e c o n d m e s s e n g e r , w h i l e t h e o t h e r c l a s s o f r e c e p t o r si n d u c e a r a p i d t u r n o v e r o f i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d s a s w e l l a sm o b i l i z i n g C a 2 " . A l t h o u g h t h e r o l e o f t h e t w o g u a n i n er e g u l a t o r y p r o t e i n s G . a n d G i i n t h e a d e n y l a t e c y c l a s es y s t e m i s w e l l e s t a b l i s h e d , t h e i r p o s s i b l e i n v o l v e m e n t i np l a t e l e t r e s p o n s e s i n d u c e d a f t e r s t i m u l a t i o n w i t h E . c o l ih e m o l y s i n o r a d h e r e n t E . c o l i b a c t e r i a h a s n o t y e t b e e ne x a m i n e d .

B i n d i n g o f G p p ( N H ) p [ c p m l3000-250 0-20 0 0-1500-1 0 0 0-50 0 -

PBS NaF K 1 2h e m o l y t i c a c t i v i t y 0 %

H

VOL. 5 8 , 1 9 9 0


8/9

1 5 9 8 KONIG ET AL.F l u o r i d e b y i t s e l f i n d u c e s s e r o t o n i n r e l e a s e , p l a t e l e t a g -g r e g a t i o n , a n d 1 2 - H E T E f o r m a t i o n i n a t i m e - a n d d o s e -d e p e n d e n t m a n n e r . I t s a c t i v a t i o n i s d u e t o a c t i v a t i o n o fG - p r o t e i n b y m i m i c k i n g t h e - y- p h o sp h at e o f G T P . S i n c eh e m o l y s i n - p o s i t i v e E . c o l i i n d u c e s i m i l a r a c t i v i t i e s i n p l a t e -l e t s e v e n t h o u g h 12-HETE f o r m a t i o n i s r a t h e r l o w , i t a p -

p e a r s t h a t t h e G - p r o t e i n s y s t e m i s c l o s e l y i n v o l v e d i n s i g n a lt r a n s d u c t i o n .O u r r e s u l t s s h o w t h a t G - p r o t e i n s a r e i n v o l v e d i n p l a t e l e ta c t i v a t i o n i n d u c e d b y h e m o l y s i n - p o s i t i v e a n d h e m o l y s i n -n e g a t i v e E . c o l i b a c t e r i a . An i n c r e a s e d b i n d i n g o f t h e n o n -h y d r o l y z a b l e GT P a n a l o g Gpp(NH)p t o s t i m u l a t e d p l a t e l e tm e m b r a n e s a s w e l l a s a n i n c r e a s e i n G T P a s e a c t i v i t y w a so b t a i n e d . T h e r o l e o f G - p r o t e i n s a s r e g u l a t o r y u n i t s w a ss h o w n b y t h e s i m u l t a n e o u s s t i m u l a t i o n o f p l a t e l e t s w i t h NaFa n d E . c o l i b a c t e r i a . Na F d o e s n o t a l t e r t h e r e s p o n s e o fp l a t e l e t s t o w a r d s E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) w i t h r e g a r d t op l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d s e r o t o n i n r e l e a s e . I n c o m p a r i s o n t on o n h e m o l y t i c E . c o l i s t r a i n s , E . c o l i K - 1 2 ( p A N N 5 2 1 1 ) d o e sn o t i n h i b i t 12-HETE r e l e a s e i n d u c e d b y N a F . T h u s , Na Fa n d h e m o l y s i n d o n o t c o u n t e r a c t e a c h o t h e r i n t h e c e l l u l a rt r a n s d u c t i o n s y s t e m .One may s u g g e s t t h a t t h e s t a t e o f a c t i v a t i o n o f G - p r o t e i n s( G i , G j ) i s a n i m p o r t a n t p a r a m e t e r f o r c e l l u l a r r e s p o n s i v e -n e s s . I n f a c t we r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e l i g a n dr e c e p t o r - i n d u c e d l e u k o t r i e n e f o r m a t i o n b y f o r m y l - m e t h i o -n y l - l e u c y l - p h e n y l a l a n i n e ( f M L P ) i s m o d u l a t e d i n t h e p r e s -e n c e o f NaF a n d f u r t h e r t h a t p r e v i o u s a c t i v a t i o n o f g r a n u -l o c y t e s b y Na F a l s o m o d u l a t e s t h e f M L P - i n d u c e d c e l l u l a rr e s p o n s e s . T h e s e r e s u l t s e m p h a s i z e t h e i m p o r t a n t r o l e o fG - p r o t e i n p r e s t i m u l a t i o n f o r t h e s u b s e q u e n t r e s p o n s e .S e v e r a l c o n c l u s i o n s c a n b e d r a w n f r o m t h e r e s u l t s o b -s e r v e d i n p l a t e l e t s : ( i ) a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a l o n e i sn o t s u f f i c i e n t f o r t h e c o m p l e t e s i g n a l t r a n s d u c t i o n l e a d i n g t oi n f l a m n m a t o r y m e d i a t o r r e l e a s e ; ( i i ) a g g r e g a t i o n a n d s e r o t o -n i n r e l e a s e a r e r e g u l a t e d d i f f e r e n t l y f r o m 1 2 - H E T E f o r m a -t i o n ; ( i i i ) t h e G - p r o t e i n s y s t e m s e e m s t o b e i n v o l v e d i n c e l la c t i v a t i o n b y h e m o l y s i n a n d n o n h e m o l y t i c b a c t e r i a ; a n d ( i v )n o n h e m o l y t i c E . c o l i s t r a i n s c o u n t e r a c t t h e N a F - i n d u c e dp l a t e l e t a c t i v a t i o n w h i l e n o e f f e c t i s o b t a i n e d f o r t h e a -h e m o l y s i n . E x p e r i m e n t s w i l l b e c a r r i e d o u t t o s t u d y t h e r o l eo f p r o t e i n k i n a s e C a n d g u a n i n e n u c l e o t i d e - b i n d i n g p r o t e i n si n s u b s e q u e n t p l a t e l e t a c t i v a t i o n b y h e m o l y s i n - p o s i t i v e a n dh e m o l y s i n - n e g a t i v e E . c o l i s t r a i n s .

LITERATURE CITED1 . B r a d f o r d , M . M. 1 9 7 6 . A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h eq u a n t i t a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h ep r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d i n g . A n a l . B i o c h e m . 7 2 : 2 4 8 - 2 5 4 .2 . B r u n s , C . , D . S c h a c h t e l e , a n d D . M a r m e . 1 9 8 7 . S y n t h e t i cd i a c y l g l y c e r o l s i n d u c e a r i s e o f q u i n - 2 d e t e c t a b l e f r e e i n t r a c e l -l u l a r c a l c i u m i n human p l a t e l e t s . FEBS L e t t . 2 2 1 : 2 3 - 2 7 .3 . C a v a l i e r i , S . J . , G . A . B o h a c h , a n d I . S . S n y d e r . 1 9 8 4 . E s c h e -r i c h i a c o l i a - h e m o l y s i n : c h a r a c t e r i s t i c s a n d p r o b a b l e r o l e i np a t h o g e n i c i t y . M i c r o b i o l . R e v . 4 8 : 3 2 6 - 3 4 3 .4 . C h a r o , J . F . , R . D . F e i n m a n , a n d T . C . D e t w i l e r . 1 9 7 6 . I n h i b i t i o no f p l a t e l e t s e c r e t i o n b y a n a n t a g o n i s t o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m .B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 7 2 : 1 4 6 2 - 1 4 6 7 .5 . C h r i s t i a n s e n , N . O . , V . S . L a r s e n , H . J u h l , a n d V . E s m a n . 1 9 8 6 .M e m b r a n e - a s s o c i a t e d p r o t e i n k i n a s e s i n p h o r b o l e s t e r - a c t i v a t e dhuman p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a8 8 4 : 5 4 - 5 9 .6 . C o c h e t , C . , M . K e r a m i d a s , C . S o u v i g r a t , a n d E . M . C h a m b a z .1 9 8 6 . P h o r b o l - e s t e r - i n d u c e d a l t e r a t i o n o f PKC c a t a l y t i c p r o p e r -t i e s o c c u r s a t t h e m e m b r a n e l e v e l a n d i s n o t r e p r o d u c e d b yp h y s i o l o g i c a l s t i m u l i . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 1 3 8 :1 2 8 3 - 1 2 9 0 .7 . C o u s s e n s , , L . , J . P a r k e r , L . R h e e , T . L . Y a n g - F e n g , E . C h e n , M .

D . W a t e r f i e l d , U . F r a n c k e , a n d A . U l i r i c h . 1 9 8 6 . M u l t i p l e ,d i s t i n c t f o r m s o f b o v i n e a n d h u m a n p r o t e i n k i n a s e C s u g g e s td i v e r s i t y i n c e l l u l a r s i g n a l l i n g p a t h w a y s . S c i e n c e 2 3 3 : 8 5 9 - 8 6 6 .8 . H a c k e r , J . , C . H u g h e s , H . H o f , a n d W. G o e b e l . 1 9 8 3 . C l o n e dh e m o l y s i n g e n e s f r o m E s c h e r i c h i a c o l i t h a t c a u s e u r i n a r y t r a c ti n f e c t i o n d e t e r m i n e d i f f e r e n t l e v e l s o f t o x i c i t y i n m i c e . I n f e c t .I m m u n . 4 2 : 5 7 - 6 3 .9 . H a l l a m , J . , J . L . D a n i e l s , J . K e n d r i c k - J o n e s , a n d T . J . R i n k .1 9 8 5 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c y t o p l a s m i c f r e e c a l c i u m a n d m y o -s i n l i g h t c h a i n p h o s p h o r y l a t i o n i n i n t a c t p l a t e l e t s . B i o c h e m . J .2 3 2 : 3 7 3 - 3 7 7 .1 0 . H e l f m a n , D . M . , B . D . A p p e l b a u m , R . W i l k i a m , R . V o g l e r , a n dJ . F . K u o . 1 9 8 3 . P h o s p h o l i p i d - s e n s i t i v e C a - d e p e n d e n t p r o t e i nk i n a s e a n d i t s s u b s t r a t e s i n h u m a n n e u t r o p h i l s . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 1 1 : 8 4 7 - 8 5 3 .1 1 . H o u s e y , G . M . , C . A . O ' B r i a n , M. D . J o h n s o n , P . K i r s c h n e i e r ,a n d J . B . W e i n s t e i n . 1 9 8 7 . I s o l a t i o n o f cDNA c l o n e s e n c o d i n gp r o t e i n k i n a s e C : e v i d e n c e f o r a p r o t e i n k i n a s e C - r e l a t e d g e n ef a m i l y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 4 : 1 0 6 5 - 1 0 6 9 .1 2 . H u a n g , F . L . , Y . Y o s h i d a , H . N a k a b a y a s h i , J . L . K n o p f , W. S .Y o u ng , a n d K . - P . H u a n g . 1 9 8 7 . I m m u n o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o no f PKC i s o e n z y m e s a s p r o d u c t o f d i s c r e t e g e n e s . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . Commun. 1 4 9 : 9 4 6 7 5 2 .1 3 . K a i b u c h i , K . , Y . T a k a i , M. S a w a m u r a , M . H o s h i j i m a , T . F u -

j i k a w a , a n d Y . N i s h i z u k a . 1 9 8 3 . S y n e r g i s t i c f u n c t i o n o f p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n a n d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n i n p l a t e l e t a c t i v a t i o n .J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 6 7 0 1 - 6 7 0 4 .1 4 . K a l l e n i u s , G . , R . M o l l b y , S . B . S v e n s o n , J . W i n d b e r g , A .L u n d b l a d , S . S v e n s o n , a n d B . C a d e r g r e n . 1 9 8 0 . T h e p k a n t i g e na s r e c e p t o r f o r t h e h a e m a g g l u t i n a t i o n o f p y e l o n e p h r i t i c E s c h e -r i c h i a c o l i . FEMS M i c r o b i o l . L e t t . 7 : 2 9 7 - 3 0 2 .1 5 . K i k k a w a , U . , Y . T a k a i , Y . T a n a k a , S . M i y a k e r , a n d Y . N i s h i -z u k a . 1 9 8 3 . P r o t e i n k i n a s e C a s a p o s s i b l e r e c e p t o r p r o t e i n o ft u m o r - p r o m o t i n g p h o r b o l e s t e r s . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 1 1 4 4 2 -1 1 4 4 5 .1 6 . K i s h i m o t o , A . , N . K a j i k a w a , M . S h i o t a , a n d Y . N i s h i z u k a . 1 9 8 3 .P r o t e o l y t i c a c t i v a t i o n o f c a l c i u m - a c t i v a t e d , p h o s p h o l i p i d - d e -p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e b y c a l c i u m - d e p e n d e n t n e u t r a l p r o t e a s e .J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 1 1 5 6 - 1 1 6 4 .1 7 . K o l l e r , M . , W. S c h o n f e l d , J . K n o l i e r , K . D . B r e m m , W. K o n i g ,B . S p u r , A . C r e a , a n d W . P e t e r s . 1 9 8 5 . T h e m e t a b o l i s m o fl e u k o t r i e n e s i n b l o o d p l a s m a s t u d i e d b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 3 3 : 1 2 8 - 1 3 4 .1 8 . K o n i g , B . , W. K o n i g , J . S c h e f f e r , J . H a c k e r , a n d W. G o e b e l .1 9 8 6 . R o l e o f E s c h e r i c h i a c o l i a l p h a - h e m o l y s i n a n d b a c t e r i a la d h e r e n c e i n i n f e c t i o n : r e q u i r e m e n t f o r r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r ym e d i a t o r s f r o m g r a n u l o c y t e s a n d m a st c e l l s . I n f e c t . I m m u n .5 4 : 8 8 6 - 8 9 2 .1 9 . K o m n g , W . , B . K o n i g , J . S c h e f f e r , J . H a c k e r , a n d W. G o e b e l .1 9 8 9 . R o l e o f c l o n e d v i r u l e n c e f a c t o r s ( m a n n o s e - r e s i s t a n th a e m a g g l u t i n a t i o n , m a n n o s e - r e s i s t a n t a d h e s i n s ) f r o m u r o p a t h o -g e n i c E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s i n t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r ym e d i a t o r s f r o m n e u t r o p h i l s a n d m a s t c e l l s . I m m u n o l o g y 6 7 :4 0 1 - 4 0 7 .2 0 . K o s a k a , Y . , K . O g i t a , K . A s e , H . N o m a r a , U . K i k k a w a , a n d Y .N i s h i z u k a . 1 9 8 8 . T h e h e t e r o g e n e i t y o f PKC i n v a r i o u s r a tt i s s u e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 1 5 1 : 9 7 3 - 9 8 1 .2 1 . K r a f t , A . S . , a n d W. B . A n d e r s o n . 1 9 8 3 . P h o r b o l e s t e r s i n c r e a s et h e a m o u n t o f C a 2 " , p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s ea s s o c i a t e d w i t h p l a s m a m e m b r a n e . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 1 : 6 2 1 -6 2 3 .2 2 . M a r r e , R . , J . H a c k e r , W . H e n k e l , a n d W. G o e b e l . 1 9 8 6 . C o n t r i -b u ti o n o f c l o n e d v i r u l e n c e f a c t o r s f r o m u r o p a t h o g e n i c E s c h e -r i c h i a c o l i s t r a i n s t o n e p h r o p a t h o g e n i c i t y i n a n e x p e r i m e n t a l r a tp y e l o n e p h r i t i s m o d e l . I n f e c t . I m m u n . 5 4 : 7 6 1 - 7 6 7 .2 3 . M a s s i n i , P . , a n d E . F . L u s c h e r . 1 9 7 6 . On t h e s i g n i f i c a n c e o f t h ei n f l u x o f c a l c i u m i o n s i n t o s t i m u l a t e d h u m a n b l o o d p l a t e l e t s .B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 3 6 : 6 5 2 - 6 6 3 .2 3 a . M a t s u m o t o , T . , T . F . M o l s k i , Y . K a n a t s a , E . L . B e c k e r , a n dR . I . S h a ' o f i . 1 9 8 7 . G - p r o t e i n d i s s o c i a t i o n , GTP-GDP e x c h a n g ea n d G T P a s e a c t i v i t y i n c o n t r o l a n d P M A t r e a t e d n e u t r o p h i l ss t i m u l a t e d b y f - M L P . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 1 4 3 :4 8 9 - 4 9 4 .



9/9

HEMOLYSIN-POSITIVE AND -NEGATIVE E . COLI 1 5 9 92 4 . M e l l o n i , E . , S . P o n t r e m o l i , M. M i c h e t t i , 0. S a c c o , B . S p a r a to z e,a n d F . S a l a m i n o . 1 9 8 5 . B i n d i n g o f p r o t e i n k i n a s e C t o n e u t r o p h i lm e m b r a n e s i n t h e pr e s ence o f C a 2 l a n d i t s a c t i v a t i o n b y aC a 2 " - r e q u i r i n g p r o t e i n a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 2 :6 4 3 5 - 6 4 3 9 .2 5 . M e i l o n i , E . , S . P o n t r e m o l i , M. M i c h e t t i , 0. S a c c o , B . S p a r a t o r e ,a n d B . L . H o r e c k e r . 1 9 8 6 . T h e i n v o l v e m e n t o f c a l p a i n i n t h ea c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C i n n e u tr o p h il s s t im u l a te d b yp h o r b o l m y r i s t i c a c i d . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 4 1 0 1 - 4 1 0 5 .2 6 . N a k a , M . , M. N i s h i k a w a , R . S . A d e l s t e i n , a n d H . H i d a k a . 1 9 8 3 .P h o r b o l e s t e r - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f human p l a t e l e t s i s a s s o c i -a t e d w i t h p r o t e i n k i n a s e C p h o s p h o r y l a t io n o f m y o s i n l i g h tc h a i n s . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 6 : 4 9 0 - 4 9 2 .2 7 . N i sh i z u k a , Y . 1 9 8 4 . T h e r o l e o f p r o t e i n k i n a s e C i n c e l l s u r f a c es i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d tumour p r o m o t i o n . N a t u r e ( L o n d o n )3 0 8 : 6 9 3 - 6 9 8 .2 8 . N o r t h r u p , J . K . , M. D . S m i g e l , P . C . S t e r n w e i s , a n d A . G .G i l m a n . 1 9 8 3 . T h e s u b u n i t s o f t h e s t i m u l a t o r y r e g u l a t o r y com-p o n e n t o f a d e n y l a t e c y c l a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 1 1 3 6 9 - 1 1 3 7 6 .2 9 . P a r k i n e n , J . , J . F i n n e , M. A c h t m a n , V . V a i s a n e n , a n d T . K .K o r h o n e n . 1 9 8 3 . E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s b i n d i n g a - 2 - 3 g a l a c t o -s i d e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 1 1 1 : 4 5 6 - 4 6 1 .3 0 . R i n k , T . J . , A . S a nc h ez , a n d T . J . H a l l a m . 1 9 8 3 . D i a c y l g l y c e r o la n d p h o r b o l e s t e r s t i m u l a t e s e c r e t i o n w i t h o u t r a i s i n g c y t o p l a s -m i c f r e e c a l c i u m i n human p l a t e l e t s . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 5 :3 1 7 - 3 1 9 .3 1 . S a n c h e z , A . , T . J . H a l l a m , a n d T . J . R i n k . 1 9 8 3 . T r i f l u o r o p e r a -z i n e a n d c h l o r p r o m a z i n e b l o c k s e c r e t i o n f r o m human p l a t e l e t -e v o k e d b a s a l c y t o p l a s m i c f r e e c a l c i u m b y a c t i v a t o r s o f c - k i n a s e .FEBS L e t t . 1 6 4 : 4 3 - 4 6 .3 2 . S a n o , K ., Y . T a k a i , J . Y a m a n i s h i , a n d Y . N i s h i z u k a . 1 9 8 3 . A r o l eo f c a l c i u m - a c t i v a t e d p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e i nhuman p l a t e l e t a c t i v a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 2 0 1 0 - 2 0 1 3 .3 3 . S c h i c h t e l e , C . , R . S e i f e r t , a n d H . O s s w a l d . 1 9 8 8 . S t i m u l u s -d e p e n d e n t i n h i b i t i o n o f p l a t e l e t a g g r e g a t i o n b y t h e p r o t e i nk i n a s e C i n h i b i t o r s p o l y m y x i n B , H - 7 a n d s t a u r o s p o r i n e . B i o -

c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 1 5 1 : 5 4 2 - 5 4 7 .3 4 . S c h e f f e r , J . , W. K o n i g , J . H a c k e r , a n d W. G o e b e l . 1 9 8 8 . B a c t e -r i a l a d h e r e n c e a n d h e m o l y s i n p r o d u c t i o n f r o m E s c h e r i c h i a c o l ii n d u c e s h i s ta m i ne a n d l e u k o t r i e n e r e l e a s e f r o m v a r i o u s c e l l s .I n f e c t . I m m u n . 5 0 : 2 7 1 - 2 7 8 .3 5 , S t e r n w e i s s , P . C . , a n d A . G . G i l m a n . 1 9 8 2 . A l u m i n u m : ar e q u i r e m e n t f o r a c t i v a t i o n o f t h e r e g u l a t o r y c o m p o n e n t o fa d e n y l a t e c y c l a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 7 9 : 4 8 8 8 - 4 8 9 1 .3 6 . T a p l e y , P . M . , a n d A . W. M u r r a y . 1 9 8 5 . E v i d e n c e t h a t t r e a t -m e n t o f p l a t e l e t s w i t h p h o r b o l e s t e r c a u s e s p r o t e o l y t i c a c t i v a -t i o n o f C a 2 " - a c t i v a t e d , p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e .E u r . J . B i o c h e m . 1 5 1 : 4 1 9 - 4 2 3 .3 6 a . T s i e n , R . Y . , T . P o z z a n , a n d T . J . R i n k . 1 9 8 2 . C a l c i u m h o m e o -s t a s i s i n i n t a c t l y m ph o c yt e s: c y to p l a sm i c f r e e c a l c i u m m o n i -t o r e d w i t h a ne w i n t r a c e l l u l a r l y t r a p p e d f l u o r e s c e n t i n d i c a t o r . J .C e l l B i o l . 9 4 : 3 2 5 - 3 2 9 .3 7 . V a i s a n e n , V . , L . G . T a l l g r e n , P . H . M a k e l a , G . K a l l e n i u s , H .H u l t b e r g , J . E l o , a n d A . S i l t o n e n . 1 9 8 1 . M a n n o s e - r e s i s t a n th a e m a g g l u t i n a t i o n a n d P a n t i g e n r e c o g n i t i o n a r e c h a r a c t e r i s t i co f E s c h e r i c h i a c o l i c a u s i n g p r i m a r y p y e l o n e p h r i t i s . L a n c e ti i : 1 3 6 6 - 1 3 7 2 .3 8 . V a i s a n e n - R h e n , V . , J . E l o , E . V a i s a n e n , A . S i l t o n e n , I . O r n e n , I .0 r s k o v , F . 0 r s k o v , S . B . S v e n s o n , P . H . M a k e l a , a n d K .K o r h o n e n . 1 9 8 4 . P - f i m b r i a t e d c l o n e s among u r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s . I n f e c t . I m m u n . 4 3 : 1 4 9 - 1 5 5 .3 9 . W a a l w U k , C . , D . M. M a c L a r e n , a n d J . d e G r a a f . 1 9 8 3 . I n v i v of u n c t i o n o f h e m o l y s i n i n t h e n e p h r o p a t h o g e n i c i t y o f E s ch e r i c h iac o l i . I n f e c t . I m m u n . 4 2 : 2 4 5 - 2 4 9 .4 0 . W a r e , J . A . , P . C . J o h n s o n , M . S m i t h , a n d E . W. S a l z m a n . 1 9 8 5 .A e q u o r i n d e t e c t s i n c r e a s e d c y to p l a sm i c c a l c i um i n p l a t e l e t ss t i m u l a t e d w i t h p h o r b o l e s t e r o r d i a c y l g l y c e r o l . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . Commun. 1 3 3 : 9 8 - 1 0 4 .4 1 . Y a m i n i s h i , J . , Y . T a k a i , K . K a i b u c h i , K . S a n o , M. C a s t a g n a , a n dY . N i s h i z u k a . 1 9 8 3 . S y n g e r g i s t i c f u n c t i o n s o f p h o r b o l e s t e r a n dc a l c i u m i n s e r o t o n i n r e l e a s e f r o m h u m a n p l a t e l e t s . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 1 2 : 7 7 8 - 7 8 6 .

V O L . 5 8 , 1 9 9 0

signal trans duct ion in human platelets and inflammatory mediator

Documents