shuguang zhang et al- spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable...

8/3/2019 Shuguang Zhang et al- Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 0 , p p . 3 3 3 4 - 3 3 3 8 , A p r i l 1 9 9 3C h e m i s t r y

S p o n t a n e o u s a s s e m b l y o f a s e l f - c o m p l e m e n t a r y o l i g o p e p t i d e t o f o r ma s t a b l e m a c r o s c o p i c membrane( , B - s h e e t / i n s o l u b l e f i l a m e n t s / i o n i c b o n d s / o r i g i n o f l i f e / z u o t i n )

SHUGUANG Z H A N G * t , TODD H O L M E S t , C U R T I S L O C K S H I N * , AND ALEXANDER R I C H * tD e p a r t m e n t s o f * B i o l o g y 1 6 - 7 3 9 a n d t B r a i n a n d C o g n i t i v e S c i e n c e s , M a s s a c h u s e t t s I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y , C a m b r i d g e , MA 0 2 1 3 9C o n t r i b u t e d b y A l e x a n d e r R i c h , D e c e m b e r 3 0 , 1 9 9 2ABSTRACT A 1 6 - r e s i d u e p e p t i d e [ ( A l a - G l u - A l a - G l u - A l a -L y s - A l a - L y s ) 2 J h a s a c h a r a c t e r i s t i c 1 3 - s h e e t c i r c u l a r d i c h r o i s ms p e c t r u m i n w a t e r . U p o n t h e a d d i t i o n o f s a l t , t h e p e p t i d es p o n t a n e o u s l y a s s e m b l e s t o f o r m a m a c r o s c o p i c m e m b r a n e .T h e m e m b r a n e d o e s n o t d i s s o l v e i n h e a t o r i n a c i d i c o r a l k a l i n es o l u t i o n s , n o r d o e s i t d i s s o l v e u p o n a d d i t i o n o f g u a n i d i n eh y d r o c h l o r i d e , S D S / u r e a , o r a v a r i e t y o f p r o t e o l y t i c e n z y m e s .S c a n n i n g EM r e v e a l s a n e t w o r k o f i n t e r w o v e n f r a m e n t s" " 1 0 - 2 0 n m i n d i a m e t e r . An i m p o r t a n t c o m p o n e n t o f t h es t a b i l i t y i s p r o b a b l y d u e t o f o r m a t i o n o f c o m p l e m e n t a r y i o n i cb o n d s b e t w e e n g l u t a m i c a n d l y s i n e s i d e c h a i n s . T h i s p h e n o m -e n o n may b e a m o d e l f o r s t u d y i n g t h e i n s o l u b l e p e p t i d e s f o u n di n c e r t a i n n e u r o l o g i c a l d i s o r d e r s . I t may a l s o h a v e i m p l i c a t i o n sf o r b i o m a t e r i a l s a n d o r i g i n - o f - l i f e r e s e a r c h .P e p t i d e s o f a l t e r n a t i n g h y d r o p h i l i c a n d h y d r o p h o b i c a m i n oa c i d r e s i d u e s h a v e a t e n d e n c y t o a d o p t a ( 3 - s h e e t s t r u c t u r e .T h e c o m p l e t e s e q u e n c e o f ( A l a - G l u - A l a - G l u - A l a - L y s - A l a -L y s ) 2 ( E A K 1 6 ) w a s o r i g i n a l l y f o u n d i n a r e g i o n o f a l t e r n a t i n gh y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i c r e s i d u e s i n z u o t i n , a y e a s tp r o t e i n t h a t w a s i n i t i a l l y i d e n t i f i e d f o r i t s a b i l i t y t o b i n dp r e f e r e n t i a l l y t o l e f t - h a n d e d Z-DNA ( 1 ) . P r e v i o u s s t u d i e sw i t h a l t e r n a t i n g a m p h i p h i l i c - p e p t i d e p o l y m e r s - e . g . , p o l y -( V a l - L y s ) , p o l y ( G l u - A l a ) , p o l y ( T y r - G l u ) , p o l y ( L y s - P h e ) ,p o l y ( L y s - L e u ) - a n d o l i g o p e p t i d e s [ ( V a l - G l u - V a l - O r n ) j _ 3 ] -V a l ( 2 - 7 ) h a v e s h o w n t h a t t h e s e p o l y m e r s c a n a d o p t ( 3 - s h e e ts t r u c t u r e s a n d c a n a g g r e g a t e , d e p e n d i n g u p o n p H , s a l t , a n dt i m e . H o w e v e r , s e l f - c o m p l e m e n t a r y EAK16 i s d i s t i n c t i v e i nt h a t i t f o r m s a n i n s o l u b l e m a c r o s c o p i c m e m b r a n e .

MATERIALS A N D METHODSP e p t i d e s . T h e G l u - A l a - L y s p e p t i d e s w e r e s y n t h e s i z e d b y ap e p t i d e s y n t h e s i z e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) , p u r i f i e d b y r e -v e r s e - p h a s e HPLC, a n d e l u t e d b y a l i n e a r g r a d i e n t o f 5 - 8 0 %a c e t o n i t r i l e / 0 . 1 % t r i f l u o a c e t i c a c i d . T h e p e p t i d e s t o c k s o l u -t i o n s w e r e d i s s o l v e d i n w a t e r ( 1 - 5 m g / m l ) o r i n 23% a c e t o -n i t r i l e ( 1 0 m g / m l ) . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e p e p t i d e s w e r ed e t e r m i n e d b y d i s s o l v i n g d r i e d p e p t i d e i n w a t e r ( w t / v o l ) a n dc e n t r i f u g i n g t h e s o l u t i o n . A p o r t i o n o f t h e s o l u t i o n w a s t h e n

a n a l y z e d b y h y d r o l y s i s w i t h i n t e r n a l c o n t r o l s . T h e s e q u e n c eo f t h e p e p t i d e s w a s c o n f i r m e d b y m i c r o s e q u e n c i n g . T h ec o m p o s i t i o n o f t h e p e p t i d e s w a s c o n f w r m e d b y h y d r o l y t i ca n a l y s i s . A l a - G l u - A l a - L y s - A l a - G l u - A l a - G l u - A l a - L y s - A l a -L y s ( E A K 1 2 ) a n d EAK16 a r e a c e t y l a t e d a n d a m i n a t e d a t t h eN - a n d C - t e r m i n a l e n d s , r e s p e c t i v e l y . B l o c k i n g o f b o t h N a n dC t e r m i n i o f EAK16 a p p e a r s n o n e s s e n t i a l f o r m e m b r a n ef o r m a t i o n .CD M e a s u r e m e n t . CD s p e c t r a w e r e g a t h e r e d o n a n A v i vm o d e l 6 O D S s p e c t r o p o l a r i m e t e r w i t h 6 O H D S s o f t w a r e f o r d a t ap r o c e s s i n g . B e c a u s e EAK16 c o n t a i n s b o t h p o s i t i v e l y a n d

n e g a t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e s , t h e p e p t i d e i t s e l f c a n s e r v e a s ab u f f e r . CD s a m p l e s w e r e p r e p a r e d b y d i l u t i n g s t o c k p e p t i d es o l u t i o n ( 1 - 5 m g / m l ) i n w a t e r .M e m b r a n e P r e p a r a t i o n s . T h e m e m b r a n e s w e r e p r e p a r e d a sf o l l o w s : 5 - 1 0 , 4 o f t h e s t o c k s o l u t i o n o f EAK16 p e p t i d e ( 1 - 5m g / m l ) was a d d e d t o 0 . 5 - 1 . 0 m l o f p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e( 1 5 0 mM N a C l / 1 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e , pH 7 . 4 ) w i t h0 . 0 0 0 0 1 % C o n g o r e d i n a 2 4 - w e l l - m i c r o t i t e r p l a t e . T h e m e m -b r a n e w as p h o t o g r a p h e d u n d e r a n i n v e r t e d o p t i c a l m i c r o -s c o p e w i t h a r u l e u n d e r n e a t h i t a s a s i z e r e f e r e n c e . T h es a m p l e s f o r s c a n n i n g EM w e r e p r e p a r e d b y f i r s t i n c u b a t i n gt h e m e m b r a n e s i n 5% g l u t a r a l d e h y d e a t 4 C f o r 3 0 m i n a n dt h e n d e h y d r a t i n g t h e m s e q u e n t i a l l y w i t h 2 0 , 5 0 , 7 0 , 9 0 , a n d1 0 0 % e t h a n o l a n d l i q u i d C O 2 . T h e s p e c i m e n w a s e x a m i n e d b yu s i n g s c a n n i n g EM a t x 4 0 0 - x 2 0 , 0 0 0 m a g n i f i c a t i o n .

RESULTS AN D DISCUSSIONP r o p e r t i e s o f E A K 1 6 . CD s t u d i e s o f EAK16 i n d i c a t e at y p i c a l s p e c t r u m o f 3 - s h e e t f o r m a t i o n w i t h a m i n i m u m e l l i p -t i c i t y a t 2 1 8 n m a n d a maximum e l l i p t i c i t y a t 1 9 5 n m ( F i g . 1 ) .B e c a u s e o f t h i s f o r m , t h e m o l e c u l e h a s h y d r o p h o b i c a l a n i n es i d e c h a i n s o n o n e s i d e a n d s e l f - c o m p l e m e n t a r y p a i r s o fp o s i t i v e l y c h a r g e d l y s i n e - a n d n e g a t i v e l y c h a r g e d g l u t a m i ca c i d - s i d e c h a i n s o n t h e o t h e r s u r f a c e . EAK16 s p o n t a n e o u s l ya s s o c i a t e s t o f o r m a m a c r o s c o p i c m e m b r a n e , w h e r e a s t h e1 2 - a m i n o a c i d p e p t i d e A l a - G l u - A l a - L y s - A l a - G l u - A l a - G l u - A l a -L y s - A l a - L y s ( E A K 1 2 ) o f s i m i l a r c o m p o s i t i o n c a n a s s o c i a t e t oa much s m a l l e r e x t e n t . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t a l t e r n a t i n gp a i r s o f c o m p l e m e n t a r y i o n i c b o n d s may b e i m p o r t a n t o r t h a tt h e s t r u c t u r e h a s p a r a l l e l ( 3 - s h e e t s . F i v e o t h e r p e p t i d e s w i t hv a r i o u s c o m p o s i t i o n s a n d l e n g t h s , i n c l u d i n g a s i n g l e u n i t o f t h er e p e a t A l a - G l u - A l a - G l u - A l a - L y s - A l a - L y s ( E A K 8 ) , d i d n o tf o r m a m e m b r a n e u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s ( T a b l e 1 ) .M a c r o s c o p i c M e m b r a n e F o r m a t i o n . T h e s p o n t a n e o u s a s -s e m b l y o f EAK16 w a s f i r s t o b s e r v e d s e r e n d i p i t o u s l y i nD u l b e c c o m o d i f i e d E a g l e ' s m e d i u m / c a l f s e r u m w h e n i t w a sb e i n g t e s t e d f o r t o x i c i t y . EAK16 d i d n o t a f f e c t t h e g r o w t hr a t e o f n e r v e g r o w t h f a c t o r - d i f f e r e n t i a t e d r a t P C - 1 2 c e l l s a n dw a s a p p a r e n t l y n o n t o x i c ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , at r a n s p a r e n t m e m b r a n e w a s s e e n when v i e w e d u n d e r x 1 0 0

m a g n i f i c a t i o n p h a s e - c o n t r a s t m i c r o s c o p y ; t h e m e m b r a n ew a s a l s o v i s i b l e i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( F i g . 2 A ) . T h em e m b r a n e c a n b e s t a i n e d b y C o n g o r e d ( F i g . 2 B a n d C ) , ad y e t h a t p r e f e r e n t i a l l y s t a i n s ( 3 - p l e a t e d s h e e t s t r u c t u r e s a n di s c o m m o n l y u s e d t o v i s u a l i z e a b n o r m a l p r o t e i n d e p o s i t i o n i nt i s s u e s ( 1 0 ) . H o w e v e r , o t h e r p e p t i d es l i s t e d i n T a b l e 1 d i d n o tf o r m v i s i b l e m a c r o s c o p i c m e m b r a n e s when t e s t e d .S t a b i l i t y o f t h e M e m b r a n e . O n c e t h e m e m b r a n e i s f o r m e d ,i t i s s t a b l e a n d r e s i s t a n t t o d i g e s t i o n w i t h s e v e r a l p r o t e a s e s -i n c l u d i n g t r y p s i n , a - c h y m o t r y p s i n , p a p a i n , p r o t e a s e K , a n dp r o n a s e - a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 p . g / m l , e v e n t h o u g hEAK16 c o n t a i n s p o t e n t i a l p r o t e a s e - c l e a v a g e s i t e s ( T a b l e 1 ) .A b b r e v i a t i o n : EAK16, ( A l a - G l u - A l a - G l u - A l a - L y s - A l a - L y s ) 2 .t T o w ho m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

3 3 3 4

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


2/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 0 ( 1 9 9 3 ) 3 3 3 5

J w u u - XE 2 6 0 0 0 -o 2 2 0 0 0 -

1 8 0 0 0 -10 14000-E 10000-

6 0 0 02 0 0 0- 2 0 0 0- 6 0 0 0

-10000-- 1 4 0 0 0 --18000--220001 9 0 1 9 5 200 205 210 2 15 2 20 22 5 2 30 2 3 5 2 40 2 45 2 50W a v e l e n g t h ( n m )

F I G . 1 . CD s p e c t r u m o f t h e EAK16 p e p t i d e . T h e EAK16 p e p t i d e w a s d i s s o l v e d i n w a t e r ( 1 0 , u M ) b e f o r e t a k i n g t h e CD s p e c t r u m . A t y p i c a l( - s h e e t CD s p e c t r u m w i t h a 2 1 8 - n m minimum a n d a 1 9 5 - n m maximum i s d e t e c t e d .T h e m e m b r a n e i s s t a b l e i n 1 % SDS a t 9 0 C f o r >4 h r . T h e s eo b s e r v a t i o n s ar e c o n s i s t e n t w i t h o t h e r s t u d i e s t h a t s h o w e dt h a t t h e 3 - s h e e t CD s p e c t r u m was n o t s i g n i f i c a n t l y c h a n g e db y h e a t i n g t h e EAK16 s o l u t i o n t o 9 0 C , b y v a r i o u s pH ( 1 . 5 ,3 . 0 , 7 . 0 , a n d 1 1 ) , or b y 0 . 1 % S D S , 7 M g u a n i d i n e h y d r o c h l o -r i d e , or 8 M urea ( S . Z . a n d C . L . , u n p u b l i s h e d w o r k ) . Th emembrane i s m e c h a n i c a l l y s t a b l e a n d c a n b e t r a n s f e r r e d f r o mon e s o l u t i o n t o a n o t h e r b y u s i n g a s o l i d s u p p o r t b u t c a n b eb r o k e n b y c u t t i n g , t e a r i n g , or s h e a r i n g .E f f e c t o f S a l t s . S a l t appears t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h i ss p o n t a n e o u s - a s s e m b l y process. A v a r i e t y o f c a t i o n s w e r et e s t e d . T h e o r de r o f e f f e c t i v e n e s s i n i n d u c i n g membranef o r m a t i o n appears t o b e L i + > Na+ > K+ > C s + . C s + l a r g e l yp r o d u c e s p r e c i p i t a t e s r a t h e r t h a n a s t r u c t u r a l m e m b r a n e . I naq u eou s s o l u t i o n , L i + h a s t h e l a r g e s t h y d r a t e d r a d i u s ( 3 . 4 A ) ,w h e r e a s Na+ ( 2 . 7 6 A ) , K+ ( 2 . 3 2 A ) , a n d C s + ( 2 . 2 8 A ) h a v es m a l l e r h y d r a t e d r a d i i ( 1 1 ) . T h e f o r m a t i o n o f t h e membranes e e m s t o c o r r e l a t e w i t h t h e o r d e r o f t h e e n t h a l p i e s o f t h em o n o v a l e n t m e t a l i o n s ( 1 1 ) . On t h e o t h e r h a n d , N H+ a n d

T r i s - H C l seem n o t t o i n d u c e EAK16 t o f o r m a m e m b r a n e .U n d e r ou r c o n d i t i o n s , d i v a l e n t m e t a l i o n s p r i m a r i l y i n d u c e da g g r e g a t e s r a t h e r t h a n membrane f o r m a t i o n . A t p r e s e n t , i t i sn o t known i f t h e m e t a l i o n s a c t as t h e c a t a l y s t or ar et h e m s e l v e s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e m e m b r a n e , a l t h o u g h t h el a t t e r s e e m s more l i k e l y .T h e r e ar e n u m e r o u s e x a m p l e s o f m o n o v a l e n t m e t a l i o n st h a t p r o m o t e a n d s t a b i l i z e o t h e r s t r u c t u r e s . One o f t h e s e i st h e a s s o c i at i o n o f f o u r g u a n o s i n e n u c l e o t i d e s i n n u c l e i c a c i d sc a l l e d a G - q u a r t e t ( 1 2 , 1 3 ) . I n t h i s c a s e , t h e o r d e r o f t h ee f f e c t i v e n e s s i s K+ > Na+ > C s + >>> L i + f o r G - q u a r t e tf o r m a t i o n ( 1 2 ) . B r a c k a n d O r g e l ( 2 ) r e p o r t e d t h a t p o l y ( V a l -L y s ) i n w a t e r a t pH 2 . 3 c o u l d b e c h a n g e d f r o m a random c o i lt o a s t a b l e / - s h e e t i n h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t a g g r e g a t e s i n t h epresen ce o f 1 0 0 mM N a C l . F u r t h e r m o r e , p o l y ( P h e - L y s ) a n dp o l y ( T y r - L y s ) , b u t n o t n o n a l t e r n a t i n g p e p t i d e s o f s i m i l a rc o m p o s i t i o n s , c a n a s s o c i a t e t o f o r m h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h tc o m p l e x e s i n t h e presence o f s a l t ( 4 , 6 ) . An a d d i t i o n a le x a m p l e o f s a l t - i n d u c e d p e p t i d e a g g r e g a t i o n i s t h e ( 3 - a m y l o i d

T a b l e 1 . P e p t i d e s u s e d i n t h i s s t u d yP e p t i d e S e q u e n c e * DMEMt P B S t W a t e r t S t r u c t u r e * R e f .

EAK16 Ac-HN-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2 ++++ ++++ - , B T hi s s t u dyEAK12 Ac-HN-AEAKAEAEAKAK-CONH2 ++ + - a , ( 3 T h i s s t u d yEAK8 H2N-AEAEAKAK-COOH - - - RC T h i s s t u d y, B - A m y l o i d - ( 1 - 2 8 ) H2N-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-COOH - - - R C , a , , B 8, B - A m y l o i d - ( 2 5 - 3 5 ) H2N-GSNKGAIIGLM-CONH2 - - - RC T h i s s t u d yS u b s t a n c e P H2N-RPKPQQFGLM-CONH2 - - - ND T h i s s t u d yS p a n t i d e H2N-(D)RPKPQQ(D)WL(D)L-CONH2 - - - ND T h i s s t u d yEAK12 a n d EAK16 a r e a c e t y l a t e d a n d a m i n a t e d a t N - a n d C - t e r m i n a l e n d s , r e s p e c t i v e l y . B l o c k i n g o f b o t h N a n d C t e r m i n i o f EAK16 a p p e a r sn o n e s s e n t i a l f o r m e m b r a n e f o r m a t i o n . A v o l u m e o f 5 - 1 0 u l o f d i s s o l v e d p e p t i d e w a s a p p l i e d t o t h e D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s m e d i u m( D M E M ) , p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) , o r w a t e r . F o r m a t i o n o f t h e m e m b r a n e - l i k e s t r u c t u r e w a s f i r s t o b s e r v e d u n d e r a p h a s e - c o n t r a s tm i c r o s c o p e a n d t h e n b y n a k e d e y e . S u s t a n c e P , S p a n t i d e , a n d P - a m y l o i d - ( 1 - 2 8 ) a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e f r o m B a c h e m . T h e ( D ) i n S p a n t i d ei n d i c a t e s D - a m i n o a c i d s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e p e p t i d e . S u b s t a n c e P , S p a n t i d e , a n d , B - a m y l o i d - ( 2 5 - 3 5 ) a r e a m i n a t e d o n t h e C - t e r m i n a l e n d s .* O n e - l e t t e r a m i n o a c i d c o d e i s u s e d .t T h e + a n d - d e n o t e t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f t h e m e m b r a n o u s s t r u c t u r e , r e s p e c t i v e l y .t a , a - H e l i x ; ( , ( - s h e e t ; R C , r a n d o m c o i l ; ND, s t r u c t u r e s n o t d e t e r m i n e d .

C h e m i s t r y : Z h a n g e t a l .


3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 0 ( 1 9 9 3 )

C

F I G . 2 . P h o t o g r a p h s o f t h em e m b r a n e . ( A ) T h e s t r u c t u r e w a sf o r m e d i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a -l i n e a n d t r a n s f e r r e d t o a g l a s ss l i d e . T h e c o l o r l e s s m e m b r a n o u ss t r u c t u r e s a r e i s o b u o y a n t ; t h e r e -f o r e , t h e i m a g e i s n o t c o m p l e t e l yi n f o c u s . ( x 7 5 ; N o m a r s k i m i c r o -s c o p e . ) ( B ) T h e s t r u c t u r e s t a i n e db r i g h t r e d w i t h C o n g o r e d ( 9 ) a n dc a n t h e n b e s e e n b y t h e n a k e d e y e .( x 1 5 ; e a c h s c a l e u n i t = 1 m m ) . ( C )A p o r t i o n o f a w e l l - d e f i n e d mem-b r a n o u s s t r u c t u r e w i t h l a y e r s i sc l e a r l y v i s i b l e ; t h e d i m e n s i o n s o ft h i s p a r t i c u l a r m e m b r a n e a r e - 2x 3 mm. ( x 2 0 . )

p r o t e i n f o u n d i n t h e p l a q u e s o f A l z h e i m e r d i s e a s e . T h e3 - a m y l o i d p r o t e i n h a s 4 3 - a m i n o a c i d r e s i d u e s a n d i s h i g h l ys o l u b l e i n w a t e r ( u p t o 3 0 m g / m l ) , b u t i t i s p o o r l y s o l u b l e ( 0 . 5m g / m l ) i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( 1 4 ) .S c a n n n g EM. T h e a r c h i t e c t u r e o f t h e m e m b r a n e a p p e a r s t or e s e m b l e h i g h - d e n s i t y f e l t . A t l o w m a g n i f i c a t i o n ( x 2 0 -x 1 0 0 ) , t h e s t r u c t u r e l o o k s l i k e a f l a t m e m b r a n e . H o w e v e r ,s t r u c t u r a l d e t a i l s a r e r e v e a l e d b y s c a n n i n g EM a t h i g h

F I G . 3 . S e r i a l p h o t o g r a p h y o fs c a n n i n g EM . T h e d i a m e t e r o f t h ef i l a m e n t s a r e - 1 0 - 2 0 n m , a n d t h ed i s t a n c e b e t w e e n f i b e r s a r e- 5 0 - 8 0 n m . A r r o w s m a r k t h esame l o c a t i o n . ( a , x 3 0 0 ; b ,x 1 2 0 0 ; c , x 4 5 0 0 ; d , x 1 5 , 0 0 0 . )

3 3 3 6 C h e m i s t r y : Z h a n g e t a l .

. . . . + . .


4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 0 ( 1 9 9 3 ) 3 3 3 7a-

l a0

om._

Q

z H?{H R }L n S i m p l i f i e d P e p t i d e bond

I 0 . X

1 N H 2 C

7/ydrophobicb o n d i n g

I o n i c bonding

X, Along t h e l e n g t h o f s t a g g e r e d p e p t i d e sF I G . 4 . P r o p o s e d m o d e l o f t h e m e m b r a n e . ( a ) V i e w p e r p e n d i c u l a r t o t h e 3 - s h e e t , w h i c h i s t h e y a x i s . T h r e e m o l e c u l e s o f EAK16 p e p t i d ef o r m t h r e e l a y e r s o f a n a n t i p a r a l l e l 3 - s h e e t , h e l d t o g e t h e r on on e s i d e b y h y d r o p h o b i c b o n d i n g b e t w e e n a l a n i n e s i d e c h a i n s f a c i n g e a c h o t h e ra n d t h e c h a r g e d l y s i n e s a n d g l u t a m i c a c i d s i d e c h a i n s f a c i n g e a c h o t h e r t o f o r m i o n i c b o n d s . T h e s t r u c t u r e c a n a l s o b e d r a w n as a p a r a l l e l , - s h e e t .I n e i t h e r c a s e , t h e p e p t i d e w o u l d b e s t ag g e r ed a l o ng x , as s h o w n i n t h e d i a g r a m . ( b ) S t a c k i n g o f j - s h e e t s . T h e s t a g g e r e d p e p t i d e s ar e o r i e n t e da l o n g t h e x a x i s . T h e z a x i s h a s t h e c o m p l e m e n t a r y i o n i c b o n d s b e t w e e n l y s i n e a n d g l u t a m i c a c i d , as w el l a s t h e h y d r o p h o b i c b o n d s b e t w e e na l a n i n e s r e f e r r e d t o i n a . T h e y a x i s c o n t a i n s t h e c o n v e n t i o n a l ( - s h e e t h y d r o g e n b o n d s . S i m i l a r i n t e r a c t i o n s ar e f o u n d i n s a w f l y s i l k f i b r o i nc o n t a i n i n g 70-80% a l a n i n e a n d g l u t a m i n e b u t w i t h o u t t h e i o n i c p a i r i n g ( 2 1 ) .

m a g n i f i c a t i o n ( F i g . 3 ) . T h e membrane appears f o r m e d f r o mi n t e r w o v e n i n d i v i d u a l f i l a m e n t s . T h e s e l f - c o m p l e m e n t a r yi n d i v i d u a l EAK16 o l i g o p e p t i d e s p r o b a b l y i n t e r a c t s t r o n g l y t of o r m a s t a b l e s t r u c t u r e p r o m o t e d b y t h e h y d r a t e d s a l t i o n s .O t h e r e x a m p l e s o f o l i g o p e p t i d e s f o r m i n g i n s o l u b l e f i l a m e n t sare f o u n d i n s e v e r a l p a t h o l o g i c a l d i se a s e s - e. g . , t he neu-r o f i b r i l l a r y t a n g l e s f o u n d i n A l z h e i m e r d i s e a s e p l a q u e s f o r ms a l t - d e p e n d e n t a g g r e g a t e s f r o m , B - a m y l o i d p r o t e i n w i t h a n

bIff- --MOF- -Iqm b dop-

0

i m p - --0 S W O O O ,

C h e m i s t r y : Z h a n g e t a l .

0^%00.6.. - % t 4 o . l% % 0 0 0 "

N 6 6 0 0 0_ 1 4 p


5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 0 ( 1 9 9 3 )e x t r e m e l y s t a b l e ( - s h e e t s t r u c t u r e t h a t s t a i n s w i t h C o n g o r e d( 1 5 ) . A t h i g h m a g n i f i c a t i o n , t h e a g g r e g a t e d A l z h e i m e r f i l a -ments h a v e a d i a m e t e r o f - 1 0 - 1 5 nm ( 1 4 - 1 7 ) , s i m i l a r t o t h eEAK16 f i l a m e n t s . T h e s c r a p i e p r i o n p r o t e i n l i k e w i s e s t a i n sw i t h C o n g o r e d a n d f o r m s a g g r e g a t e d f i l a m e n t s t h a t a r ee x t r e m e l y s t a b l e a n d r e s i s t a n t t o p r o t e a s e s ( 1 8 , 1 9 ) . P e p t i d e st h a t s p o n t a n e o u s l y a s s e m b l e t o f o r m an i n s o l u b l e f i l a m e n th a v e a l s o b e e n r e p o r t e d i n l i v e r c i r r h o s i s , w h e r e i n t r a c e l l u l a ri n c l u s i o n s a r e f o u n d d u e t o a m u t a t i o n t h a t o c c u r s a t t h e A3 - s h e e t r e g i o n o f t h e Z a 1 - a n t i t r y p s i n ( 2 0 ) .P r o p o s e d S t r u c t u r e o f t h e M e m b r a n e . EAK16 c o n t a i n st w o - u n i t r e p e a t s o f a l t e r n a t i n g h y d r o p h i l i c a n d h y d r o p h o b i cr e s i d u e s , w h e r e e v e r y o t h e r r e s i d u e i n t h e p e p t i d e i s a l a n i n e .A t n e u t r a l p H , t h e f o u r g l u t a m i c a c i d s a n d f o u r l y s i n e s a r en e g a t i v e l y a n d p o s i t i v e l y c h a r g e d , r e s p e c t i v e l y . B e c a u s e o ft h e 1 3 - s h e e t s t r u c t u r e , a l l o f t h e c h a r g e d a m i n o a c i d s l i e on t h es a m e s i d e a n d , t h u s , h a v e c o m p l e m e n t a r y p a t t e r n s w i t h p a i r so f p o s i t i v e l y a n d n e g a t i v e l y c h a r g e d i o n i c g r o u p s . T h e p e p -t i d e s may b e s t a g g e r e d , w h i c h w o u l d c o n t r i b u t e t o s t a b i l i t y i nt h e d i r e c t i o n a l o n g t h e m o l e c u l e ( F i g . 4 a a n d b , x a x i s ) . T h ea l a n i n e s on on e s i d e o f t h e 8 3 - s h e e t f o r m h y d r o p h o b i c b o n d s ,a s i n s i l k f i b r o i n ( 2 1 ) , a n d g l u t a m i c a c i d s a n d l y s i n e s on t h eo t h e r s i d e f o r m c o m p l e m e n t a r y i o n i c b o n d s ( F i g . 4 a a n d b ,z a x i s ) . H o w e v e r , t h e p e p t i d e s c o u l d a l s o b e o r g a n i z e d i nr e g i s t e r , w i t h o u t s t a g g e r i n g . T h e r e s u l t s o f x - r a y d i f f r a c t i o ns t u d i e s w i l l b e p u b l i s h e d e l s e w h e r e .I m p l i c a t i o n s o f t h e S e l f - C o m p l e m e n t a r y P e p t i d e S t r u c t u r e .S p o n t a n e o u s f o r m a t i o n o f s u c h a m a c r o s c o p i c m e m b r a n e h a ss o m e i m p l i c a t i o n s f o r b i o l o g y a n d f o r b i o m a t e r i a l r e s e a r c h .B e c a u s e o f t h e e x t r e m e s t a b i l i t y o f t h e EAK16 m e m b r a n e i ns e r u m , w h e r e i t w a s o r i g i n a l l y d i s c o v e r e d , i t s h i g h r e s i s t a n c et o p r o t e o l y t i c d i g e s t i o n , s i m p l e c o m p o s i t i o n , a p p a r e n t l a c k o fc y t o t o x i c i t y , a n d e a s y s y n t h e s i s i n l a r g e q u a n t i t i e s , s u c hm a t e r i a l s m i g h t b e u s e f u l f o r b i o m a t e r i a l a p p l i c a t i o n s . T h e s ec o u l d i n c l u d e s l o w - d i f f u s i o n d r u g - d e l i v e r y s y s t e m s , a r t i f i c i a ls k i n , a n d s e p a r a t i o n m a t r i c e s .T h e s i m i l a r i t y o f t h e EAK16 f i l a m e n t s t o t h e i n s o l u b l ep r o t e i n s f o u n d i n v a r i o u s p a t h o l o g i c a l d i s e a s e s ( 1 4 - 2 0 ) s u g -g e s t s t h a t i t m i g h t b e a u s e f u l m o d e l s y s t e m f o r e x p l o r i n gt h o s e a s p e c t s o f s t r u c t u r e s a n d s e q u e n c e s t h a t p r o d u c e s u c hu n u s u a l p r o p e r t i e s a s e x t r e m e i n s o l u b i l i t y , r e s i s t a n c e t op r o t e o l y t i c d i g e s t i o n , a n d s p o n t a n e o u s a s s e m b l y . D r u g s t h a ti n h i b i t s e l f - a s s e m b l y o f t h e p e p t i d e s may b e u s e f u l f o r t h et r e a t m e n t o f t h e s e d i s e a s e s .I t i s o f g r e a t i n t e r e s t t h a t o l i g o p e p t i d e s c o n t a i n i n g s i m p l es e l f - c o m p l e m e n t a r y r e p e a t s c an s p o n t a n e o u s l y a s s e m b l e t of o r m r e l a t i v e l y o r d e r e d m a c r o s c o p i c s t r u c t u r e s , i n d e p e n d e n to f an e x t e r n a l a s s e m b l y m e c h a n i s m o r i n s t r u c t i o n c o d e .B r a c k a n d O r g e l ( 2 ) s u g g e s t e d t h a t a l t e r n a t i n g p e p t i d e s w i t ha t e n d e n c y t o f o r m 1 - s h e e t s may b e a b l e t o f o r m " m e m b r a n e -l i k e a g g r e g a t e s . " O u r o b s e r v a t i o n o f a m a c r o s c o p i c mem-b r a n e s p o n t a n e o u s l y a s s e m b l e d f r o m EAK16 i s c o n s i s t e n tw i t h t h e h y p o t h e s i s t h a t s u c h s i m p l e m o l e c u l e s may f o r ml a r g e r a n d more c o m p l e x s t r u c t u r e s , w h i c h may h a v e b e e ni m p o r t a n t i n t h e o r i g i n o f l i f e . M i l l e r a n d U r e y ( 2 2 ) h a v es h o w n t h a t a m i n o a c i d s a r e r e a d i l y s y n t h e s i z e d f r o m C H 4 ,N H 3 , H 2 , a n d H 2 0 m o l e c u l e s a n d t h a t a m i n o a c i d s c a n b ec o n d e n s e d t o f o r m o l i g o p e p t i d e s i n p r e b i o t i c c o n d i t i o n s ( f o rr e v i e w , s e e r e f . 2 3 ) . F u r t h e r , Y a n a g a w a e t a l . ( 9 ) r e p o r t e dt h a t a 1 2 - r e s i d u e p e p t i d e o f g l y c i n e s c a n a l s o f o r m 3 0 - t o5 0 - , u m m i c r o s c o p i c a g g r e g a t e s o f d i f f e r e n t s h a p e s a n d t e x -t u r e s , d e p e n d e n t on s a l t a n d o t h e r c o n d i t i o n s a n d s i m i l a r t oou r o b s e r v a t i o n s . W e s p e c u l a t e t h a t o l i g o p e p t i d e s w i t h s e l f -c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e s , a s i n t h e e x a m p l e o f E A K 1 6 ,

m i g h t s e r v e a s t e m p l a t e s t o c o n d e n s e t e t r a - o r o c t a p e p t i d e so f s i m i l a r s e q u e n c e t o f o r m l o n g e r o l i g o p e p t i d e s . T h e s eo l i g o p e p t i d e s c o u l d t h e n s p o n t a n e o u s l y a s s e m b l e t o f o r mm e m b r a n e s , y i e l d i n g c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n a n d e v e n t u a l l ye s t a b l i s h a n e n c l o s e d e n v i r o n m e n t f o r a p r i m i t i v e m e t a b o l i s m( 2 4 ) .W e t h a n k R i c h ar d C o o k a n d M i c h a e l K e l l e y f o r s y n t h e s i s o fp e p t i d e s ; B a r b a r a S l a c k f o r s u g g e s t i n g u s e o f C o n g o r e d ; B e t h S a w i n ,G a b r i e l l a K r o c h m a l n i c , a n d P a t r i c i a R e i l e y f o r h e l p i n g w i t h some o ft h e p h o t o g r a p h s ; a n d D r . C h u l h e e K a n g f o r h e l p i n g w i t h c o m p u t e rg r a p h i c s . W e a l s o t h a n k D r s . M a r t i n E g l i , S t a f e n W o l f l , M o n t yK r i e g e r , V i n c e n t R o t e l l o , a n d J u l i u s R e b e k , J r . , f o r h e l p f u l d i s c u s -s i o n s . T h i s w o r k i s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e so f H e a l t h , t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n , t h e N a t i o n a l A e r o n a u -t i c s a n d S p a c e A d m i n i s t r a t i o n , t h e O f f i c e o f N a v a l R e s e a r c h , a n d t h eA m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y . S . Z . w a s a n A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t yP o s t d o c t o r a l F e l l o w .

1 . Z h a n g , S . , L o c k s h i n , C . , H e r b e r t , A . , W i n t e r , E . & R i c h , A .( 1 9 9 2 ) EMBO J . 1 1 , 3 7 8 7 - 3 7 9 6 .2 . B r a c k , A . & O r g e l , L . E . ( 1 9 7 5 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 5 6 , 3 8 3 - 3 8 7 .3 . R i p p o n , W. B . , C h e n , H . H . & W a l t o n , A . G . ( 1 9 7 3 ) J . M o l .B i o l . 7 5 , 3 6 9 - 3 7 5 .4 . S e i p k e , G . , A r f m a n n , H . A . & W a g n e r , K . G . ( 1 9 7 4 ) B i o p o l y -m e r s 1 3 , 1 6 2 1 - 1 6 3 3 .5 . P i g g i o n , E . , C o s a n i , A . , T e r b o j e v i c h , M . & B o r i n , G . ( 1 9 7 2 )B i o p o l y m e r s 1 1 , 6 3 3 - 6 4 3 .6 . S t . P i e r r e , S . , I n g w a l l , R . T . , V a r l a n d e r , M. S . & G o o d m a n , M .( 1 9 7 8 ) B i o p o l y m e r s 1 7 , 1 8 3 7 - 1 8 4 7 .7 . O s t e r m a n , D . G . & K a i s e r , E . T . ( 1 9 8 5 ) J . C e l l . B i o c h e m . 2 9 ,5 7 - 7 2 .8 . B a r r o w , C . J . & Z a g o r s k i , M . G . ( 1 9 9 1 ) S c i e n c e 2 5 3 , 1 7 9 - 1 8 2 .9 . Y a n a g a w a , H . , N i s h i z a w a , M. & K o j i m a , K . ( 1 9 8 4 ) O r i g i n s L i f e1 4 , 2 6 7 - 2 7 2 .1 0 . P e a r s , A . G . E . ( 1 9 6 0 ) H i s t o c h e m i s t r y : T h e o r e t i c a l a n d A p -p l i e d ( L i t t l e , B r o w n , B o s t o n ) , 2 n d E d .1 1 . P a u l i n g , L . ( 1 9 6 0 ) N a t u r e o f t h e C h e m i c a l B o n d a n d t h eS t r u c t u r e o f M o l e c u l e s a n d C r y s t a l s : An I n t r o d u c t i o n t o M o d e lS t r u c t u r a l C h e m i s t r y ( C o r n e l l U n i v . P r e s s , I t h a c a , N Y ) , 3 r dE d .1 2 . W i l l i a m s o n , J . R . , R a g h u r a m a n , M . K . & C e c h , T . R . ( 1 9 8 9 )C e l l 5 9 , 8 7 1 - 8 8 0 .1 3 . K a n g , C . - H . , Z h a n g , X . , R a t l i f f , R . , M o y z i s , R . & R i c h , A .( 1 9 9 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 5 6 , 1 2 6 - 1 3 1 .1 4 . H i l b i c h , C . , K i s t e r s - W o i k e , B . , R e e d , J . , M a s t e r s , C . L . &B e y r e u t h e r , K . ( 1 9 9 1 ) J . M o l . B i o l . 5 0 , 1 4 9 - 1 6 5 .1 5 . I q b a l , K . & W i s n i e w s k i , H . M . ( 1 9 8 3 ) i n A l z h e i m e r ' s D i s e a s e :T h e S t an d ar d R e f e r e n c e , e d . R e i s b e r g , B . ( F r e e P r e s s , C o l l i e rM a c m i l l a n , L o n d o n ) , p p . 4 8 - 5 6 .1 6 . H a l v e r s o n , K . , F r a s e r , P . E . , K i r s c h n e r , D . A . & L a n s b u r y ,P . T . , J r . ( 1 9 9 0 ) B i o c h e m i s t r y 2 9 , 2 6 3 9 - 2 6 4 4 .1 7 . K i r s c h n e r , D . A . , I n o u y e , H . , D u f f y , L . K . , S i n c l a i r , A . , L i n d ,M . & S e l k o e , D . J . ( 1 9 8 7 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 4 ,6 9 5 3 - 6 9 5 7 .1 8 . P r u s i n e r , S . B . , M c k i n l e y , M . P . , B o w m a n , K . A . , B o l t o n ,D . C . , B e n d h e i n , P . E . , G r o t h , D . F . & G l e n n e r , G . G . ( 1 9 8 3 )C e l l 3 5 , 3 4 9 - 3 5 8 .1 9 . B r o w n , P . , L i b e r s k i , P . P . , W o l f f , A . & G a j d u s e k , C . ( 1 9 9 0 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 7 , 7 2 4 0 - 7 2 4 4 .2 0 . L o m a s , D . A . , E v a n s , D . L . , F i n c h , J . T . & C a r r e l l , R . W .( 1 9 9 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 5 7 , 6 0 5 - 6 0 7 .2 1 . L u c a s , F . & R u d a l l , K . M . ( 1 9 6 8 ) i n C o m p r e h e n s i v e B i o c h e m -i s t r y , e d s . F l o r i k i n , M . & S t o t z , F . H . ( E l s e v i e r , A m s t e r d a m ) ,V o l . 2 6 B , p p . 4 7 5 - 5 5 8 .2 2 . M i l l e r , S . L . & U r e y , H . C . ( 1 9 5 9 ) S c i e n c e 1 3 0 , 2 4 5 - 2 5 1 .2 3 . C h y b a , C . & S a g a n , C . ( 1 9 9 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 5 5 , 1 2 5 - 1 3 2 .2 4 . B e r n a l , J . D . ( 1 9 6 5 ) i n T h e O r i g i n s o f P r e b i o l o g i c a l S y s t e m sa n d o f T h e i r M o l e c u l a r M a t r i c e s , e d . F o x , S . W. ( A c a d e m i c ,Ne w Y o r k ) , p p . 6 5 - 8 8 .

3 3 3 8 C h e m i s t r y : Z h a n g e t a l .

shuguang zhang et al- spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable...

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