Research Collection

Doctoral Thesis

A new downstream process for a unique lipoteichoic acidestablished via quantitative immunoanalysis

Author(s): Matthey-de-l'Endroit, François

Publication Date: 1999

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-003927160

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ETH Library

DissETH No. 13536

A NEWDOWNSTREAMPROCESSFORA UNIQUELIPOTEICHOIC ACID ESTABLISHEDVIAQUANTITATIVEIMMUNOANALYSIS

A dissertationsubmitted to the

SWISS FEDERAbINSTITUTEOF TECHNOLOGY

ZÜRICH

For the degree of

Doctor of Natural Sciences

Presented byFRANQOIS MATTHEY-DE-EENDROIT

Dipl. Lm. Ing. ETHM.S. University of Nebraska-Lincoln

Born May 1, 1969

Citizen of Le Locle NE

Accepted on the recommendationof

Prof. Dr. U. Spichiger, examinerProf. Dr. B. Witholt, co-examiner

PD Dr. B. Sonnleitner, co-examinerDr. P. Röthlisberger, co-examiner

Zürich 1999

7 Summary

SummaryA unique lipoteichoic acid (LTA) was isolated from a new Gram-positivebacterium, Streptococcus sp. PT DSM 8747. This organism was discovered in a

cancer patient suffering from recurrent erysipelas after surgery for Carcinoma of

the breast. The structure of this LTA is exceptional with respectto the glycolipidanchor and the very short hydrophilic chain length. It consists of a linear 1,3-linked poly(glycerophosphate) chain, attached to position 0-6 of a galacto-furanosyldiacylglycerol.The hydrophilicchain is substituted only with D-alanine.

This LTA was identified as a promising candidate for cancer therapy and is

currently being investigated due to its novel chemical structure and biologicalactivity. The concentrationof this LTA has been estimated to be around 0.1% of

cell dry weight. The Standard downstream process employing phenol was not

feasible for scale up.This thesis describes a new scalable downstream process establishedwith a

quantitative analytical system based on enzyme immunoassays(EIAs). A non-

ionic detergent, Triton X-114 (TX114) showed an interesting ability to selectivelyextract LTA at high yield and could replace phenol. For process development,in-house EIAs specific for LTA were designed and evaluated for their analyticalPerformance with samples from the lab scale process. A two-site assay with

an inhibition step and fluorescent detection showed best resultswith regard to

accuracy (96-105%), detection limit (2-10"11 M), precision and reproducibility(<15% CV). Cellular LTA was released with mechanical, enzymatic(mutanolysin M-1) and chemical (SDS) treatments as a basis for process yieldcalculations. The CMC of this LTA was the highest ever reported (3-10~5 M),suggesting a broad ränge of biological activity.The strain was cultivated with complex medium in up to 30 m3 bioreactor.The

cultivation yield of LTA could be increased at least two-fold with sucrose as a C-

source. The downstreamprocess comprised bead mill cell disruption, TX114extraction and liquid-liquid Separation with the detergent-based aqueous two-

phase system. LTA partitioned aimost entirely in the detergent rieh phase. This

phase was purified with two Chromatographiesteps. Scale up necessitated

cycling processes for chromatography with at least four runs. TX114 was

Summary 8

separated from LTA with anion-exchangechromatography. After salt addition to

remove excess 1-propanol, LTA was purified with hydrophobic interaction

chromatography. Residual lipid impurities were removed with a 1-butanol

extraction. Pure LTA without any detectable amount of proteins, lipids, nucleic

acids and carbohydrates could be produced in gram-scale for clinical studies.

Although the overall downstream process yield was 19% for the pilot scale (labscale: 43%), the feasibility of this process was proven to be successful in

industrial scale.

Zusammenfassung

ZusammenfassungEine bisher nicht beschriebene Lipoteichonsäure(lipoteichoic acid; LTA) wurdeaus einem neuen Gram-positiven Bakterium, Streptococcus sp. PT DSM 8747

isoliert. Dieser Stamm wurde in einer Krebspatientin mit einem

Mammakarzinom entdeckt, die postoperativ an einem rezidivierenden Erysipel(Hautinfektion) litt. Die Struktur dieser LTA ist aussergewöhnlich wegen ihrem

Lipidanker und ihrer sehr kurzen hydrophilen Kettenlänge.Diese LTA besteht

aus einer linearen 1,3-verknüpften poly(glycerinphosphat)-Kettedie an die

Stellung 0-6 eines Galactofuranosyl-diacylglycerin gebunden ist. Die

hydrophile Kette ist nur mit D-Alanine substitutiert.

Diese LTA wurde als potentiellerKandidat für Krebstherapie identifiziert undwird jetzt wegen ihrer Struktur und biologischen Aktivität untersucht. Ihr Anteil

am Trockengewichtder Zelle erreicht ungefähr 0.1%. Der früher entwickelte

Standard-Reinigungsprozessmit Phenol war für die Massstabsvergrösserungnicht geeignet.Die vorliegende Dissertation beschreibt einen neuen skalierbaren Isolierungs¬und Aufreinigungsprozess entwickelt mit einem neuen quantitativenanalytischenSystem gestützt auf Enzym Immunassays (EIAs). Mit einem nicht¬

ionischen Detergens, Triton X-114 (TX114), als Ersatz für Phenol konnte die

LTA selektiv und mit hoher Ausbeute extrahiert werden. Selbst entwickelte

EIAs, spezifisch für LTA, wurden bezüglich ihrer analytischen Leistung mit

Proben aus dem Labormassstabsprozessfür die Prozessentwicklung überprüftund weiterentwickelt. Ein zwei-seitiger (Sandwich) Assay mit einem

Inhibitionsschritt und fluorimetrischer Detektion wies beste Ergebnissebezüglich Richtigkeit (96-105% accuracy), Nachweisgrenze (2-10~11 M),Präzision und Reproduzierbarkeit (<15% relative Standardabweichung) auf.

Zelluläre LTA wurde mit mechanischen,enzymatischen (Mutanolysin M-1) und

chemischen (SDS) Behandlungen als Basis für die Berechnungen der

Prozessausbeute in Lösung gebracht. Die kritische mizellare Konzentration

dieser LTA ist höher (3-10"5 M) als bei anderen LTAs. Es lässt sich einen

breiteren Bereich biologischer Aktivität vermuten.

Zusammenfassung 10

Der Stamm wurde mit Komplexmediumbis zum 30 m3-Massstab gezüchtet. Die

Ausbeute von LTA konnte mit Saccharose als C-Quelle mindestenszweifach

gesteigert werden. Der Aufarbeitungsprozess bestand aus Zellaufschlussmit

einer Rührwerkskugelmühle,TX114 Extraktion und flüssig-flüssig Trennung mit

dem Detergens induzierten zwei-phasigen System. LTA verteilt sich in der

detergensreichen Phase, welche in zwei Chromatographiestufenaufgereinigtwurde. Die Massstabsvergrösserungerforderte einen zyklischen Prozess fürdie Chromatographie mit mindestens vier Chargen. TX114 wurde mit

Anionenaustauschchromatographievon LTA abgetrennt. Nach einer

Salzzugabe für die Entfernung des überflüssigen 1-Propanol wurde LTA mit

hydrophober Interaktions-Chromatographie aufgereinigt. Restliche Lipid-verunreinigungen wurden mit einer 1-Butanol Extraktion entfernt. Reine LTA

konnte in Gram-Mengen für klinischeStudien ohne nachweisbareMengen von

Lipide, Proteine, Nukleinsäure und Kohlenhydrate produziert werden.Obwohl die Ausbeute des Downstream-Prozessesim Pilotmasstab einen Wertvon 19% (Vergleich Labormasstab:43%) erreichte, konnte die technische

Durchführbarkeitdieses Prozesses erfolgreichim industriellen Masstab gezeigtwerden.

11 Resume

Resume

Un unique acide lipoteicholque (lipoteichoic acid: LTA) a ete isole ä partir d'unenouvelle bacterie, Streptococcus sp. PT DSM 8747. Cet organisme fut

decouvert chez une patiente souffrante d'erysipeles recidivants apres ablation

chirurgicale d'une tumeur au sein. La structure de cet LTA est exceptionnelle en

considerant l'ancre glycolipidique et la tres courte chaTne hydrophilique le

composant. Elle consiste en une chaTne lineaire de polyphosphates de

glycerine ä liaison 1-3, attache ä la position 0-6 d'un

galactofuranosyldiacylglycerol. La chaTne hydrophilique est substituee

uniquement avec la D-alanine.

Cet LTA a ete identifie comme un candidat prometteur pour la therapie des

Cancers et est maintenant etudie ä cause de sa nouvelle structure et son

activite biologique. La concentration de cet LTA a ete estimee

approximativement ä 0.1% de la matiere cellulaire seche. Le proceded'extraction et de purification Standard utilisant le phenol n'est pas adapte pourl'echelle industrielle.

Cette these de doctorat decrit un nouveau procede d'isolation-purificationcapable d'etre transfere ä l'echelle de production industrielle dont les

Performances ont ete estimees avec l'aide d'un Systeme analytique base sur

les dosages immunoenzymatiques (enzymes immunoassays: EIAs). Un

detergent non-ionise, TritonX-114 (TX114) a la capacite interessante d'extraire

selectivement le LTA avec un rendement eleve et pourrait remplacer le phenol.Les EIAs speeifiques pour le LTA ont ete mis au point pour le developpementdu procede et evalues pour leur performance analytique avec des echantillons

provenant du processus ä l'echelle du laboratoire. Un dosage sandwich avecinhibition et detection fluorescente a presente les meilleurs resultatsconcernant

l'exactitude de quantification (96-105%), la limite de detection (2-10"11 M), la

precision et la repetabilite (<15% CV). Le LTA ancre dans la membrane

cytoplasmique est libere avec l'aide de traitements mechaniques,enzymatiques(mutanolysin M-1) et chimiques (SDS) comme base pour les calculs de

rendement des Operations unitaire du procede. La concentration critique

Resume 12

micellaire de cet LTA est la plus elevee jamais reportee (3-10~5 M), suggerantun large domaine d'activite biologique.La souche de bacteries a ete cultivee en milieu complexe dans des

bioreacteursau maximum de 30 m 3. Le rendement de la productiondu LTA a

pu etre ameliore au moins deux fois avec le Saccharose comme source de

carbone. Le procede d'extraction-purificationa consiste en l'ouverture des

cellules avec un extracteur billes, une extraction au TX114 et une Separationliquide-liquide avec le Systeme aqueux ä deux phases base sur le detergent. Le

LTA s'est reparti presqueentierement dans la phase riche en detergent. Cette

phase a ete purifiee avec deux etapes de Chromatographie liquide. Le

changementd'echelle de production a necessite des procedesde purification ä

plusieurs cycles de Chromatographie avec au moins quatre charges. TX114 a

ete separe du LTA par Chromatographie echangeuse d'anions. Apres additionde sei, afin d'eliminer l'exces de 1-propanol, le LTA a ete purifie parChromatographie ä interaction hydrophobique.Les impuretes lipides ont ete separees ä l'aide d'une extraction au 1-butanol.

Le LTA pur a pu etre produit en quantite ä l'echelle du gramme pour les etudes

cliniques sans quantite detectable en proteines, lipides, aeides nucleiques ouhydrates de carbone. Bien que le rendement total du procede d'extraction-

purification a ete de 19% pour l'echelle pilote (laboratoire: 43%), la realisation

de ce procede a ete un succes ä l'echelle industrielle.