RED DE BIODEGRADACIÓN RED DE BIODEGRADACIÓN DE LIGNINA Y HEMICELULOSADE LIGNINA Y HEMICELULOSA

“ “ Estudio comparativo de la acción de Estudio comparativo de la acción de mediadores redox de lacasa en la transformación mediadores redox de lacasa en la transformación

de ligninasde ligninas””

K. González ArzolaK. González Arzola aa, M.C. Arévalo , M.C. Arévalo bb, M.A. Falcón , M.A. Falcón aa

a. Departamento de Microbiología y Biología Celular, Universidad de La Laguna, Tenerife.a. Departamento de Microbiología y Biología Celular, Universidad de La Laguna, Tenerife.b. Departamento de Química Física, Universidad de La Laguna, Tenerife.b. Departamento de Química Física, Universidad de La Laguna, Tenerife.

OBJETIVOSOBJETIVOS

• Caracterización electroquímica de los Caracterización electroquímica de los mediadores redoxmediadores redox

• Desarrollo de sistemas acuosos lacasa-Desarrollo de sistemas acuosos lacasa-mediador para la transformación de ligninasmediador para la transformación de ligninas

• Estudio de las transformaciones mediante técnicas Estudio de las transformaciones mediante técnicas cromatográficas, espectrofotométricas y electroquímicascromatográficas, espectrofotométricas y electroquímicas

MediadoresMediadores

S

N

N N

S

NO3S

SO3

N

N

N OHH

H

O

OO

2,2’-azino-bis-3- etilbenzotiazolin2,2’-azino-bis-3- etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico-6-ácido sulfónico (ABTS)ABTS)

Ácido violúricoÁcido violúrico ((VAVA))

1-Hidroxibenzotriazol 1-Hidroxibenzotriazol ((HBTHBT))

N

N

N

OH

LigninasLigninas

Lignina de Kraft (Indulina AT, Lignina de Kraft (Indulina AT, Westvaco): Westvaco): KLKL

Lignina Björkman de pino: Lignina Björkman de pino: PLPL

1 mM 1 mM HBT HBT

Sistema Lacasa-mediador Sistema Lacasa-mediador (LMSs)(LMSs)

ComponentesComponentes

1 mg 1 mg LigninaLignina (KL o PL) (KL o PL)en 5 mM NaOHen 5 mM NaOH

0.2 U 0.2 U LacasaLacasaen Tampón Mc Ilvaine 0,1 M en Tampón Mc Ilvaine 0,1 M

pH 6 pH 6

1 mM 1 mM ABTSABTS

10 mM 10 mM VAVA

37ºC 1400 rpm37ºC 1400 rpm

Después de 48 h de incubación:Después de 48 h de incubación:

Espectrofotometría UV-Vis Espectrofotometría UV-Vis

Cromatografía de Exclusión Cromatografía de Exclusión molecular (SE) en HPLCmolecular (SE) en HPLC

Cromatografía de exclusión Cromatografía de exclusión molecular en HPLCmolecular en HPLC

Aliquat 336 20 mM en Tetrahidrofurano

Bomba binaria Waters 1525

Inyector automático

ColumnasGHXL

HXL 3000HXL 4000

Fotodiodo Array

0

1

2

3

210 260 310 360 410 460

Longitud de onda (nm)

Abs

orba

ncia

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Abs

orba

ncia

280

nm

Perfiles de MM

Espectros UV-Vis

Voltametría CíclicaVoltametría Cíclica

Electrodo de trabajo (grafito)Electrodo de trabajo (grafito)

Electrodo de ref. Electrodo de ref. (ECS)(ECS)

Contraelectrodo Contraelectrodo (Pt)(Pt)

Potenciostato-Potenciostato-galvanostatogalvanostato

-18

-12

-6

0

6

12

18

0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1Potencial (V)

Co

rrie

nte

(u

A)

Citrato sódico pH 6 Citrato sódico pH 6 37ºC37ºC

CiclovoltagramasCiclovoltagramas

• Mediadores 0,2 mMMediadores 0,2 mM

• Ligninas 0,2 mg/mlLigninas 0,2 mg/ml

• Velocidad 5 mV/sVelocidad 5 mV/s

• 37ºC37ºC

Voltametría Cíclica: Voltametría Cíclica: ABTSABTS

ABTS·+

E0’ 440 mV

ABTS2+

E0’ 854 mV

ABTS

KL

KL + ABTS

ABTS

PL + ABTS

PL

Potencial (V)

0.2 0.6 10.80.4

9

14

-1

4

19

Co

rrie

nte

(μ

A)

0.2 0.6 10.80.4

7

11

-1

3

15

Co

rrie

nte

(μ

A)

Potencial (V)

Potencial (V)

0.2 0.6 10.80.4

4

7

-2

1

10

Co

rrie

nte

(μ

A)

Voltametría Cíclica: Voltametría Cíclica: VAVA

VA

PL + VA

E0’ 632 mV

KL

KL + VA

VAPL

Potencial (V)

0.2 0.6 10.80.4

2.8

4.8

-1.2

0.8

6.8

Co

rrie

nte

(μ

A)

Potencial (V)

0.2 0.6 10.80.4

4

6

0

2

8

Co

rrie

nte

(μ

A)

Potencial (V)

0.2 0.6 10.80.4

5

7.5

0

2.5

10

Co

rrie

nte

(μ

A)

KL + HBT

Voltametría Cíclica: Voltametría Cíclica: HBTHBT

PL + HBT

HBT

E0’~ 840 mV

KL

HBT

PL

Lac activa

10 20 30 40 50 60 70

0.03

0

0.06

0.09

0.12

Tiempo (min)

Ab

sorb

anci

a 28

0 n

m

0.0125

0

0.025

0.0375

0.05

Tiempo (min)

Ab

sorb

ance

280

nm

10 20 30 40 50 60 70

Cromatografía SE : Cromatografía SE : ABTSABTS

Control

87 kDa 0,8 kDa

KL PL

Control

Lac activa

87 kDa 0,8 kDa

Espectrofotometría UV- VISEspectrofotometría UV- VIS

nmnm 230230 240240 260260 270270 280280 300300 340340 395395

KLKL

ABTS(66 min)(66 min)

62.4 160.9 89.9 658.9 58.5 166.4 113.2 7.7

VA(32 min)(32 min)

4.6 3.1 3.6 3.5 3.4 3.7 4.0 4.7

HBT(32 min)(32 min)

1.4 1.5 1.6 1.6 1.6 1.7 1.3 1.7

PLPL

ABTS(46 min)(46 min)

16.9 17.4 12.2 13.5 14.1 22.7 203.2 4.2

VA(26 min)(26 min)

23.6 30.2 19.9 6.7 6.7 3.5 4.8 3.9

HBT(24 min)(24 min)

0.9 4.1 4.3 3.5 2.8 2.7 3.3 3.4

89.9 658.9 113.2

Tiempo (min)

0.03

0

0.06

0.09

0.12

10 20 30 40 50 60 70

Ab

sorb

anci

a 28

0 n

m

KL

400 kDa 5,6 kDa

Cromatografía SE : Cromatografía SE : VAVA

Control

Lac activa

PL

Control

Lac activa

400 kDa 5,6 kDa

Tiempo (min)

0.015

0

0.03

0.045

0.06

10 20 30 40 50 60 70

Ab

sorb

anci

a 28

0 n

m

Tiempo (min)

Ab

sorb

anci

a 28

0 n

m

0.12

0

0.24

0.36

0.48

10 20 30 40 50 60 70

Cromatografía SE : Cromatografía SE : HBTHBT

KL

ControlLac activa

400 kDa 5,6 kDa

PL

ControlLac activa

400 kDa 5,6 kDa

Tiempo (min)

0.045

0

0.09

0.135

0.18

10 20 30 40 50 60 70

Ab

sorb

anci

a 28

0 n

m

Los mediadores HBT y VA inactivan a las Los mediadores HBT y VA inactivan a las lacasas (Li et al. 1999).lacasas (Li et al. 1999).

La estabilidad de los sistemas lacasa-La estabilidad de los sistemas lacasa-mediador se incrementa en presencia de las mediador se incrementa en presencia de las ligninas.ligninas.

Por tanto, la gran despolimerización Por tanto, la gran despolimerización detectada podría deberse a este efecto. detectada podría deberse a este efecto.

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

1. Los estudios electroquímicos revelaron que el ABTS presentó los mejores resultados catalíticos. El radical ABTS.+ oxidó la KL con mayor intensidad, mientras que el dicatión ABTS2+ catalizó mejor a la PL.

2. El sistema lacasa-ABTS despolimerizó ambas ligninas, despolimerización que resultó más importante para la PL.

3. Los sistemas constituidos por los mediadores N-OH (VA y HBT) polimerizaron ambas ligninas. Esta polimerización fue más intensa que con lacasa sola, lo que se podría atribuir parcialmente a la mayor estabilidad en presencia de estos mediadores y de ligninas.