rapport de synthÄse validation de la mÅthode coli id … · application • la microbiologie...

accrÄditation CofracnÅ1-0144

portÄe disponiblesur www.cofrac.fr

ADRIA DEVELOPPEMENTCreac’h Gwen - F. 29196 QUIMPER Cedex - T�l. (33) 02.98.10.18.18 - Fax (33) 02.98.10.18.08

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SOCIETE BIOMERIEUXService Recherche & D�veloppement IndustrieChemin de l’Orme69280 MARCY L’ETOILE

Validation AFNOR des m�thodes alternatives d’analyseApplication � la microbiologie alimentaire

Rapport de synthÄse(Etudes pr�liminaire et collaborative

conduites selon la norme NF EN ISO 16140)

Validation de la mÅthode Coli ID pour le dÅnombrement des Escherichia coli Ç 37ÉC

MÄthodes quantitatives

SYNTHESE Coli ID - E. coli 37�C (Version 2)4 ao�t 2008

Annule et remplace la version prÄcÄdenteL’ancienne version doit �tre restitu�e

� ADRIA D�veloppement ou d�truite en interne.

Ce rapport comprend 34 pages dont 4 annexes.La reproduction de ce rapport n’est autoris�e que sous sa forme int�grale.

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ADRIA D�veloppement 2/34 4 ao�t 2008 SYNTHESE Coli ID - E. coli 37�C (Version 2)

Sommaire

1 INTRODUCTION _______________________________________________ 4

1.1 R�f�rentiel de validation ____________________________________ 4

1.2 Protocole et principe de la m�thode alternative _________________ 4

1.3 Domaine d’application demand� _____________________________ 4

1.4 M�thode de r�f�rence ______________________________________ 4

1.5 Historique de la validation __________________________________ 4

2 ETUDE COMPARATIVE _________________________________________ 7

2.1 Lin�arit� _________________________________________________ 7

2.2 Exactitude relative _________________________________________ 9

2.3 Limite de d�tection (LOD) et limite de quantification (LOQ) ______ 11

2.4 Sensibilit� relative ________________________________________ 12

2.5 Sp�cificit�/S�lectivit� _____________________________________ 13

2.6 Praticabilit�______________________________________________ 14

3 ETUDE COLLABORATIVE ______________________________________ 14

3.1 Organisation de l’�tude____________________________________ 14

3.2 Contr�le des param�tres exp�rimentaux _____________________ 16

3.3 R�sultats des analyses ____________________________________ 18

3.4 Calculs et interpr�tation statistique__________________________ 18

4 CONCLUSION ________________________________________________ 22

Annexe 1 - M�thode alternative _____________________________________________________ 23Annexe 2 - M�thode de r�f�rence : NF ISO 16649-2 (juillet 2001) : m�thode horizontale pour le d�nombrement des Escherichia coli - -glucuronidase positive______________________________ 28Annexe 3 - Lin�arit� : graphiques bidimensionnels et droites de r�gression ___________________ 29Annexe 4 - Exactitude relative : graphiques bidimensionnels et droites de r�gression pour chacune des matrices et pour l’ensemble des matrices ______________________________________________ 32

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Les modifications apportÅes au rapport sont indiquÅes par un double trait dans la marge Ç gauche.

Avant Propos

L’accr�ditation du COFRAC atteste de la comp�tence des laboratoires pour les seuls essais couverts par l’accr�ditation qui sont identifi�s par le symbole.

L’ensemble des renseignements permettant de valider la garantie des analyses est tenu � la disposition de la Soci�t� BioM�rieux.

Les r�sultats sont synth�tis�s au sein de tableaux et interpr�t�s selon la norme NF EN ISO 16140.

o Fabricant : Soci�t� BIOMERIEUXChemin de l’Orme69280 MARCY L’ETOILE

o Laboratoire expert : ADRIA D�veloppementZA Creac’h Gwen29196 QUIMPER Cedex

o MÅthode Ç valider : G�lose coli ID pour le d�nombrement des Escherichia coli

o RÅfÅrentiel de validation : NF EN ISO 16140 (octobre 2003) : protocole pour la validation des m�thodes alternatives

o MÅthode de rÅfÅrence : Norme NF ISO 16649-2 (juillet 2001) : m�thode horizontale pour le d�nombrement des Escherichia coli - -glucuronidase positive

o Etendue de la validation : Tous produits d’alimentation humaine

NF ISO 16649-2 (juillet 2001) : essai effectu� sous le couvert de l’accr�ditation par le laboratoire expert

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1 INTRODUCTION

1.1 R�f�rentiel de validation

Le r�f�rentiel de validation utilis� est la norme NF EN ISO 16140 (octobre 2003) : protocole pour la validation des m�thodes alternatives.

1.2 Protocole et principe de la m�thode alternative

Le protocole et la notice technique sont donn�s en Annexe 1.

Le milieu Coli ID est un milieu chromog�ne permettant le d�nombrement des coliformes et d’E. coli ; ce milieu contient deux substrats chromog�nes. Les coliformes autres qu’E. coli apparaissent sous forme de colonies bleues, gr�ce � la mise en �vidence de la -galatosidase ; les colonies d’E. coli apparaissent roses gr�ce � la mise en �vidence de la -glucuronidase.

La validation est demand�e avec une incubation � 37�C de la g�lose Coli ID.

1.3 Domaine d’application demand�

Tous produits d’alimentation humaine

1.4 M�thode de r�f�rence

La m�thode de r�f�rence est la m�thode NF ISO 16649-2 (juillet 2001) � M�thode horizontale pour le d�nombrement des Escherichia coli-glucuronidase positive �.

Le protocole est sch�matis� en Annexe 2.

1.5 Historique de la validation

1.5.1 Date de la premi�re validation

La m�thode Coli ID a �t� valid�e le 19 janvier 1999 (attestation n� BIO 12/5-01/99) avec une incubation � 44�C 1�C pour les abats et � 37�C 1�C pour tous les autres produits. La reconduction a �t� obtenue le 6 f�vrier 2002 avec une incubation � 44�C 1�C pour l’ensemble des produits.

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Une extension de validation portant sur la modification du protocole d’ensemencement (de la double couche vers la simple couche) a �t� obtenue en 2004 sans r�alisation d’essais compl�mentaires.

La validation expire le 19 janvier 2007.

1.5.2 Protocole valid� en 2002

Pr�paration d’une suspension m�re en peptone sel

Dilutions d�cimales en peptone sel

Inoculation d’une bo�te de Petri avec 1 ml de dilution

Ajout d’environ 15 ml de milieu Coli ID en surfusion

Incuber � 44�C 1�C pendant 24 h 2 h

D�nombrement des colonies caract�ristiques d’E. coli(diam�tre 0,5 � 2 mm, couleur rose violet)

1.5.3 M�thodes de r�f�rence auxquelles la m�thode alternative a �t� compar�e

- Etude de 1998 : Norme NF V08-017 - Microbiologie alimentaire. Directives g�n�rales pour le d�nombrement des coliformes f�caux et d’Escherichia coli (incubation au VRBL � 44,5�C 0,5�C)

- Etude de 2002 : Norme NF ISO 16649-2 - Microbiologie alimentaire. M�thode horizontale pour le d�nombrement des Escherichia coli --glucuronidase positive - Partie 2 : technique du comptage des colonies � 44�C au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl D-glucuronate (incubation du TBX � 44�C 1�C).

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1.5.4 Principaux r�sultats obtenus lors de la validation initiale et des �ventuelles reconductions et extensions

1.4.5.1 Etude men�e en 1998

La m�thode Coli ID est facile � mettre en œuvre, en comparaison � la m�thode de r�f�rence NF V08-017 qui n�cessite une confirmation d’E. coli, rendue al�atoire par le principe m�me du repiquage au hasard d’un certain nombre de colonies (d’autant plus al�atoire que la charge totale en coliformes thermotol�rants est �lev�e).

Son d�lai de r�ponse est nettement plus court que celui de la m�thode de r�f�rence (24 h au lieu de 5 jours).

Cette m�thode est sp�cifique des souches d’E. coli -glucuronidase positives ; une seule souche d’E. coli sur 20 a donn� une r�action n�gative (pas de coloration rose). En ce qui concerne la s�lectivit� de la m�thode, des faux-positifs peuvent �tre observ�s en cas de pr�sence d’E. vulneris ou de Plesiomonas shigello�des.

La m�thode Coli ID pr�sente une lin�arit� satisfaisante.

Cette m�thode est juste lors de la comparaison de ses r�sultats � ceux de la m�thode de r�f�rence NF V08-017. Pour quelques �chantillons, la m�thode Coli ID a donn� un d�nombrement sup�rieur � celui de la m�thode de r�f�rence ; ces r�sultats pourraient �tre expliqu�s par la diff�rence de sensibilit� des deux m�thodes, surtout en cas de forte contamination en coliformes thermotol�rants.

Cette m�thode pr�sente des caract�ristiques de fid�lit� satisfaisantes : la r�p�tabilit� est comprise entre 0,046 et 0,080 log UFC ; la reproductibilit� est comprise entre 0,13 et 0,57 log UFC.

1.4.5.2 Etude men�e en 2002

La m�thode de d�nombrement de E. coli dans les produits alimentaires par la g�lose Coli ID, incub�e � 44�C 1�C, a des performances de praticabilit� sup�rieures � celles de la m�thode de r�f�rence.

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Les temps de manipulation avec cette m�thode sont moins importants que ceux de la m�thode de r�f�rence.

La m�thode est sp�cifique. Elle a une justesse �quivalente � celle de la m�thode de r�f�rence et une fid�lit� comparable avec celle de la m�thode de r�f�rence.

La m�thode est lin�aire.

La m�thode est r�p�table et reproductible.

2 ETUDE COMPARATIVE

2.1 Lin�arit�

2.1.1 Matrices utilis�es

Cinq cat�gories de produits ont �t� analys�es (une matrice par cat�gorie), � cinq niveaux de contamination et deux r�p�titions ont �t� r�alis�es par �chantillon. Au total, 50 analyses ont �t� effectu�es � la fois par la m�thode de r�f�rence et par la m�thode alternative.

Les niveaux de contamination, les matrices test�es, ainsi que les souches utilis�es sont list�s dans le tableau suivant :

Matrice test�e Souche Taux d’inoculation (UFC/g)Steak hach� E. coli 13Lait E. coli 94Filet de sandre E. coli Ad 228Petits pois E. coli 19Coule d’œuf E. coli 142

50 - 100100 - 500

500 - 1 0001 000 - 5 0005 000 - 10 000

2.1.2 R�sultats bruts

Les �chantillons ont �t� test�s en double par chacune des deux m�thodes.

Les graphiques bidimensionnels sont donn�s en Annexe 3.

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2.1.3 Interpr�tation statistique

Matrice R R�gressionutilis�e

Rob.F Valeurcritique

P% Coefficientde corr�lation

Droite de r�gression

Steak hach� 1,80 GMFR 0,000 5,41 100 0,999 Log Alt = 0,987 log Ref + 0,006Lait 0,43 OLS2 2,686 5,41 16 0,988 Log Ref = 0,990 log Alt + 0,025Filet de sandre 0,80 GMFR 16,953 5,41 0 0,995 Log Alt = 0,914 log Ref + 0,304Petits pois 2,00 GMFR 0,856 5,41 52 0,996 Log Alt = 0,903 log Ref + 0,342Coule d’œuf 0,36 OLS2 0,570 5,41 66 0,995 Log Ref = 0,845 log Alt + 0,470

Interpr�tation statistique : P > 5 % : pas significatif 1 % < P < 5 % : significatif0,1 % < P < 1 % : tr�s significatif P < 0,1 % : hyper significatif

Les droites de r�gression sont donn�es en Annexe 3.

2.1.4 Conclusion

Les coefficients de corr�lation sont tous sup�rieurs ou �gaux � 0,988, valeur tr�s satisfaisante pouvant mettre en d�faut la robustesse du test de lin�arit�.

Les tests de lin�arit� sont accept�s avec une valeur de P > � 5 % pour les matrices steak hach�, lait, petits pois et coule d’œuf.

Bien que montrant un test de lin�arit� avec une valeur < 5%, la droite obtenue pour la matrice poisson appara�t satisfaisante :

log Alt = 0,914 log Ref + 0,304

La lin�arit� de la m�thode Coli ID appara�t satisfaisante.

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2.2 Exactitude relative

2.2.1 Nombre et nature des �chantillons

Tableau 1 - Nombre et nature des �chantillons

Cat�gories TypesNombre

d’�chantillons analys�s

Nombrede r�sultatsexploit�s*

Produits carn�s Viandes crues, charcuterie, plats cuisin�s 20 11Produits laitiers Laits crus, fromages, p�tisseries 11 10Produits de la mer Poissons crus, poissons fum�s 10 10V�g�taux Crus, surgel�s, plats traiteurs 21 13

Ovoproduits Coule d’œuf, mayonnaise, cr�mes, p�tisseries 26 21

TOTAL 88 65

* Certains r�sultats n’ont pas pu �tre exploit�s car :

- le r�sultat est inf�rieur au seuil par l’une et/ou l’autre des m�thodes,- les bo�tes sont tr�s charg�es et donc illisibles.

2.2.2 Contamination artificielle des �chantillons

Tableau 2

N� �chantillon Type de stress Evaluation � stress � (Log)*

Souche utilis�e Origine

1287, 1288, 1289 Traitement thermique 50�C, 15 min 0,9 E. coli 6 Saucisse de porc

1290, 1291, 1292, 1293 Traitement thermique 50�C, 15 min, 48 h � 4�C 0,3 E. coli 14 Lait cru

1346, 1347, 1348, 1349 - 20�C 2,1 E. coli 19 Carottes r�p�es1342, 1343, 1344, 1345 30 �/�� NaCl 0,8 E. coli Ad 228 Poisson

1350, 1351, 1352, 1353 Traitement thermique 50�C, 15 min, 48 h � 4�C

1,4 E. coli 142 Coule d’œuf

* log milieu TSYEA – log milieu TBX

16 �chantillons ont �t� artificiellement contamin�s sur un total de 65 r�sultats exploitables.

Le pourcentage de contamination artificielle est de 25 %.

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2.2.3 R�sultats bruts

Les �chantillons ont �t� analys�s en double par chacune des deux m�thodes.

Tableau 3

Cat�gorie d’aliments Domaine de contamination (log UFC/g)Produits carn�s 1,00 � 6,08Produits laitiers 1,36 � 3,99Produits de la mer 2,60 � 5,71V�g�taux 1,00 � 5,95Ovoproduits 1,48 � 4,60

2.2.4 Interpr�tation

Tableau 4

P%Cat�gorie n R

R�gressionutilis�e

a t(a) b t(b) T critique Ordonn�e� 0

Pente �1

Produits carn�s 11 1,08 GMFR - 0,291 2,106 1,048 1,118 2,262 4 20Produits laitiers 10 1,46 GMFR 0,090 0,702 0,953 1,048 2,306 50 33

Produits de la mer 10 0,43 OLS2 0,156 1,059 0,988 0,350 2,306 32 74V�g�taux 13 0,88 GMFR 0,049 0,488 0,974 1,154 2,200 64 27

Ovoproduits 21 0,58 GMFR - 0,317 1,599 1,096 1,164 2,093 13 12Tous produits 65 0,64 GMFR - 0,099 1,960 1,096 1,770 1,998 5 43

Tableau 5

Cat�gorie Biais D(m�diane)

R�p�tabilit� m�thode alternative

R�p�tabilit� m�thode de r�f�rence

Produits carn�s - 0,095 0,382 0,352Produits laitiers - 0,018 0,279 0,191Produits de la mer - 0,123 0,146 0,337V�g�taux - 0,055 0,205 0,235Ovoproduits 0,020 0,205 0,352Toutes cat�gories confondues - 0,040 0,205 0,322

Les graphiques bidimensionnels et les droites de r�gression sont donn�s en Annexe 4.

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2.2.5 Conclusion

Les biais entre les deux m�thodes sont compris entre - 0,123 et + 0,020 log UFC/g.

Tous produits confondus, la r�p�tabilit� de la m�thode alternative est de 0,203 et celle de la m�thode de r�f�rence de 0,322.

Les tests statistiques valident l’hypoth�se des pentes = 1 et des ordonn�es = 0 pour chaque cat�gorie test�e et toutes cat�gories confondues, avec des valeurs de P 5 %. Seule une valeur P �gale � 4% est observ�e pour l’hypoth�se de l’ordonn�e = 0 dans la cat�gorie produits carn�s.

L’�quation de la droite pour cette derni�re cat�gorie montre cependant des valeurs de coefficients a et b correctes :

log Alt = 1,048 log Ref – 0,291

De m�me, toutes cat�gories confondues, la droite est la suivante :

log Alt = 1,096 log Ref – 0,099

L’exactitude de la m�thode alternative appara�t satisfaisante.

2.3 Limite de d�tection (LOD) et limite de quantification (LOQ)

2.3.1 Protocole

La limite de d�tection de la m�thode a �t� r�alis�e en cultures pures. Trois niveaux d’inoculation ont �t� test�s, � raison de 6 r�plicats par niveau, soit 18 analyses par la m�thode alternative. Une souche de E. coli a �t� utilis�e pour 6 d�terminations ind�pendantes de diluant st�rile.

2.3.2 R�sultats

Les donn�es sont intrins�ques � la m�thode. Les r�sultats sont donn�s dans les tableaux suivants :

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Tableau 6

Niveau Nombre d’�chantillons positifs Ecart-type Biais0 0 / 6 / /

0,5 3 / 6 0,816 0,51 6 / 6 1,169 2

Tableau 7

Formules Valeurs obtenuesLC 1,65 S0 + X0 1,8

LOD 3,3 S0 + X0 3,2LOQ 10 S0 + X0 8,7

2.4 Sensibilit� relative

Les donn�es sont intrins�ques � la m�thode. Elles sont obtenues � partir des r�sultats obtenus dans l’�tude de lin�arit� (pas de nouveau protocole sp�cifique mis en oeuvre)

Les profils de pr�cision obtenus pour les diff�rentes matrices sont pr�sent�s figure 1.

Figure 1 - Profils de pr�cision obtenus pour les diff�rentes matrices

0,0%

5,0%

10,0%

15,0%

20,0%

25,0%

30,0%

35,0%

0 1 2 3 4 5 6 7

M �t hode d e r �f �r e nc e log uf c / g ( x )

Steak hach� Petits pois Lait Filet de sandre Coule d'œuf

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2.5 Sp�cificit�/S�lectivit�

2.5.1 Protocoles d’essai

L’objectif de cette �tude est de v�rifier que les souches positives sont bien d�nombr�es par la m�thode alternative et que les souches n�gatives ne le sont pas.

Au cours de l’�tude men�e en 1998, 20 souches positives et 23 souches n�gatives avaient �t� test�es ; les donn�es ont �t� reprises et compl�t�es avec 10 souches positives. Trois souches n�gatives ont �galement �t� test�es.

2.5.2 R�sultats

Inclusivit�

Sur les 30 souches de E. coli test�es, 3 donnent des colonies non caract�ristiques bleues sur Coli ID.

L’une d’entre elles est une colonie de E. coli O157:H7 glucuronidase n�gative, qui montre �galement des colonies non caract�ristiques sur g�lose TBX.

E. coli 12 et E. coli 20 ont �t� caract�ris�es sur galerie ID 32E : la souche E. coli 20 a donn� une r�action n�gative au test -glucuronidase, et appara�t �galement non caract�ristique sur g�lose TBX de la m�thode de r�f�rence NF ISO 16649-2.

Exclusivit�

Sur les 23 souches test�es, seules une souche d’Escherichia vulneris (souche E. vulneris 51) et une souche de Plesiomonas shigelloides ont pr�sent� une coloration rose sur Coli ID. Trois souches suppl�mentaires d’E. vulneris ont �t� test�es : elles ne montrent pas de colonies caract�ristiques, ni sur milieu Coli ID , ni sur le milieu TBX de la m�thode de r�f�rence.

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2.6 Praticabilit�

La praticabilit� du milieu Coli ID a �t� �valu�e selon 13 crit�res :

Temps r�el de manipulation, flexibilit� de la technique par rapport au nombre d’�chantillons � analyser, leur charge en bact�ries : le gain de temps par la m�thode Coli ID est obtenu par le fait qu’une seule bo�te est d�nombr�e par dilution, ainsi que dans la facilit� de lecture des tests.

Temps en minutesM�thode de r�f�rence M�thode Coli ID

15 �chantillons 25 �chantillons 15 �chantillons 25 �chantillonsPr�l�vement 26 40 26 40Broyage 22,5 37,5 22,5 37,5Analyse 31 69 25 31Lecture 25 20 12,5 10Total 104,5 166,5 86 118,5Temps / �chantillon 7 6,7 5,7 4,7

D�lai d’obtention des r�sultats : le d�lai d’obtention des r�sultats par la m�thode Coli ID est identique � celui de la m�thode de r�f�rence.

M�thode de r�f�rence M�thode Coli IDPr�l�vement, broyage J0 J0Analyse J0 J0Lecture J1 J1

Tra�abilit� des r�sultats : aucune tra�abilit� particuli�re n’est propos�e. Le laboratoire utilise ses propres proc�dures.

3 ETUDE COLLABORATIVE

3.1 Organisation de l’�tude

3.1.1 Laboratoires collaborateurs

14 laboratoires ont particip� � l’�tude.

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3.1.2 Instructions aux laboratoires collaborateurs

Les instructions d�taill�es ont �t� transmises aux laboratoires par le laboratoire expert.

3.1.3 Echantillons

Du lait pasteuris� demi-�cr�m� a �t� inocul� par Escherichia coli 94.

3.1.4 Inoculation

Les taux d’inoculation vis�s ont �t� les suivants :

- 0 UFC/ml,- 10 – 100 UFC/ml,- 100 – 1 000 UFC/ml,- 1 000 - 10 000 UFC/ml.

Les �chantillons ont �t� r�partis � raison de 25 ml par flacon. Deux �chantillons par taux et par laboratoire ont �t� pr�par�s, soit huit �chantillons par laboratoire.

3.1.5 Etiquetage, exp�dition

Les �chantillons cod�s (code connu uniquement du laboratoire expert) ont �t� plac�s dans des caisses isothermes contenant des blocs r�frig�rants et ont �t� exp�di�s aux diff�rents laboratoires � l’aide d’un transport express.

Un flacon t�moin temp�rature contenant un enregistreur de temp�ratures a �t� joint au colis, afin de suivre la temp�rature au cours du transport et de la mesurer � r�ception.

Les �chantillons ont �t� livr�s en 24 h � 48 h aux laboratoires collaborateurs. La temp�rature des �chantillons devait �tre inf�rieure ou �gale � 8�C pendant le transport et comprise entre 0�C et 8,4�C � l’arriv�e.

3.1.6 Analyses

Les laboratoires collaborateurs et le laboratoire expert ont analys� les �chantillons par la m�thode alternative et par la m�thode de r�f�rence.

Une �tude de stabilit� de la souche inocul�e dans la matrice a �t� r�alis�e afin de v�rifier qu’il n’y a pas d’�volution au cours du transport.

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3.2 Contr�le des param�tres exp�rimentaux

3.2.1 Stabilit� de la souche au cours du transport

Afin de v�rifier la stabilit� de la souche Escherichia coli 94, un d�nombrement de la flore des six flacons inocul�s a �t� effectu� le jour de l’inoculation, ainsi qu’apr�s 24 h (avec simulation de transport) et 48 h de conservation � 4�C ; les r�sultats sont report�s dans le tableau 8.

Tableau 8 - D�nombrement d’Escherichia coli 94 par la m�thode NF EN ISO 16649-2 (en UFC/ml)

Taux 1 Taux 2 Taux 3R�p�tition 1 R�p�tition 2 R�p�tition 1 R�p�tition 2 R�p�tition 1 R�p�tition 2

J0 55 47 450 450 3 500 2 700J1 36 53 420 350 3 900 4 500J2 38 47 340 550 5 000 4 400

Aucune �volution de la souche n’est observ�e au bout de 48 h de conservation � 4�C.

3.2.2 R�sultats obtenus pour les deux m�thodes

Les r�sultats de d�nombrement des Escherichia coli par le laboratoire expert, par la m�thode de r�f�rence et par la m�thode alternative, sont pr�sent�s dans le tableau 9.

Tableau 9 - R�sultats du laboratoire expert (en log UFC/g)

M�thode de r�f�rence M�thode alternative Taux vis�(log UFC/g) Duplicat 1 Duplicat 2 Duplicat 1 Duplicat 2

< 1 < 1 < 1 < 1 < 11 � 2 1,64 1,68 1,76 1,682 � 3 2,54 2,59 2,70 2,693 � 4 3,63 3,59 3,83 3,79

Les taux de contamination vis�s ont �t� atteints.

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3.2.3 Temp�rature des �chantillons � r�ception

Les temp�ratures mesur�es � r�ception sont donn�es dans le tableau 10.

Tableau 10 - Temp�rature des �chantillons � r�ception

Laboratoires Temp�rature mesur�e� r�ception (�C)

Date et heure de r�ception des �chantillons

Temp�rature mesur�e par le thermobouton

A 7,5 J2 14h00 0,5B 2,0 J1 11h15 0,0C 4,0 J1 11h30 Thermobouton

non r�cup�r�D 3,0 J1 08h30 0,0E 2,5 J2 09h10 0,0F 0,3 J1 11h20 - 2,51

G 4,6 J1 10h00 0,00H 0,2 J1 08h15 0,00I 0,4 J1 09h30 0,00J 1,0 J1 11h30 - 1,001

K 0,6 J1 09h20 0,00L 0,3 J1 13h15 0,00M 0,0 J1 11h00 0,00N 0,3 J1 08h45 0,00

3.2.4 Temp�rature des �chantillons pendant le transport

Tous les colis ont �t� livr�s � J1 � l’exception de deux laboratoires (A et E) qui ont �t� livr�s � J2. Aucun probl�me de temp�rature n’a �t� rencontr� lors du transport. Toutes les temp�ratures � r�ception �taient inf�rieures � 8,4�C.

1 Certaines temp�ratures inf�rieures � 0�C ont �t� relev�es pour ces thermoboutons. Aucune cong�lation de la matrice n’a �t� not�e par les laboratoires collaborateurs : les r�sultats ont �t� conserv�s dans les interpr�tations.

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3.3 R�sultats des analyses

Certains laboratoires n’ont pas inocul� les dilutions 0, -1, -2 et -3 mais uniquement les dilutions -1, -2 et -3, ce qui explique les r�sultats obtenus pour le niveau 0 (< 1 et < 10 UFC/ml).

Le d�nombrement de la flore a�robie m�sophile varie de 2 200 � 480 000 UFC/ml. Le laboratoire B n’a pas pu r�aliser ce d�nombrement, le flacon s’�tant cass� au cours du transport.

3.4 Calculs et interpr�tation statistique

3.4.1 Synth�se des r�sultats obtenus par les deux m�thodes

Une synth�se des r�sultats est pr�sent�e tableau 11

Tableau 11 - Synth�se des r�sultats obtenus par la m�thode alternative et la m�thode de r�f�rence (en UFC)

Niveau 0 Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3Laboratoires M�thode de

r�f�renceM�thode

alternativeM�thode der�f�rence

M�thodealternative

M�thode der�f�rence


M�thode der�f�rence


A <10 <10 <10 <10 35 40 30 50 390 510 520 500 3200 3800 4600 6600B <1 <1 <1 <1 43 42 55 55 620 550 590 450 5500 4900 7200 6000C <10 <10 <10 <10 65 55 40 40 380 400 340 460 5300 4400 4500 4800D <10 <10 <10 <10 30 50 50 90 440 360 510 500 3000 3600 4800 3600E <1 <1 <1 <1 44 45 49 31 480 380 550 520 4800 4400 6700 5600F <1 <1 <1 <1 25 41 54 50 490 600 640 620 5200 7000 4800 4900G <10 <10 <10 <10 35 45 40 80 360 330 280 430 3500 3500 3800 4700H <1 <1 <1 <1 25 43 24 26 360 400 390 280 4000 5000 4400 4200I <1 <1 <1 <1 40 39 45 55 420 510 570 470 4000 4900 5400 6700J <1 <1 <1 <1 39 34 42 49 440 400 440 550 6100 5000 4800 5700K <10 <10 <10 <10 35 45 40 40 590 420 600 460 4600 5000 7000 5900L <10 <10 <10 <10 35 50 50 50 430 480 350 560 4800 6500 5400 5500M <1 <1 <1 <1 39 43 45 44 430 480 450 410 4800 6500 6100 3700N <1 <1 <1 <1 24 20 47 46 450 360 540 540 3600 3700 6000 6300

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3.4.2 Calcul du biais

Pour chaque niveau, la diff�rence des moyennes des r�plicats (di) obtenues par la m�thode alternative et la m�thode de r�f�rence est calcul�e : di = (Mi,alt - Mi, r�f).

La m�diane (MED {di} des di permet de d�terminer le biais D (MED{di} = biais D).

Le biais D et l’�cart-type robuste S {di} = K1Sn donnent une statistique de t (t(d) = MED{di} n /S{di}). Cette valeur de t obtenue est compar�e � une valeur critique trouv�e dans la table de Student (pour n = 14, t critique = 2,179).

Les valeurs de t(d) obtenues par niveau sont report�es dans le tableau 12.

Tableau 12 - Valeurs de t(d) obtenues par niveau

NiveauNombre de r�sultats

exploitables(nombre de laboratoires)

Biais D t critiqueddl (n-1) Conclusion

1 n = 14 0,086 2,160 Biais non significatif2 n = 14 0,036 2,160 Biais non significatif3 n = 14 0,092 2,160 Biais non significatif

Niveau critique : t(d) < t critique

Le biais entre les deux m�thodes appara�t non significatif ; il est compris entre + 0,036 et + 0,092 log UFC/g.

Le biais entre les deux m�thodes d�termin� au cours de l’�tude pr�liminaire est �gal � - 0,040 log UFC/g, toutes cat�gories confondues.

3.4.3 Calcul de la r�p�tabilit�

Les valeurs obtenues pour la limite de r�p�tabilit�, ainsi que les valeurs obtenues pour le test F sont donn�es dans le tableau 13.

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Tableau 13 - Valeurs obtenues pour la limite de r�p�tabilit� et valeurs pour le Test F

Limite de r�p�tabilit�Niveau

Nombre der�sultats exploitables

(nombre de laboratoires)M�thode

de r�f�renceM�thode

alternative

Fcalcul�

(ou 1/F*)

Fcritique

(0,05 ; n ; n)P %

1 n = 14 0,223 0,100 4,952* 2,48 02 n = 14 0,200 0,265 1,756 2,48 153 n = 14 0,235 0,224 1,100* 2,48 43

Interpr�tation statistique : P > 5% : non significatif 1 % < P < 5 % : significatif0,1 % < P < 1 % : tr�s significatif P < 0,1 % : hyper significatif

La limite de r�p�tabilit� de la m�thode alternative d�termin�e au cours de l’�tude pr�liminaire est �gal � 0,205 log UFC/g pour toutes cat�gories confondues, celle de la m�thode de r�f�rence � 0,323 log UFC/g.

Les limites de r�p�tabilit� de la m�thode alternative montrent des valeurs comparables � celles de la m�thode de r�f�rence, � l’exception de la limite de r�p�tabilit� observ�e pour le niveau 1. La limite de r�p�tabilit� de la m�thode alternative est alors meilleure que celle de la m�thode de r�f�rence.

3.4.4 Reproductibilit�

Les valeurs obtenues pour la limite de reproductibilit�, ainsi que les valeurs obtenues pour le test F sont donn�es dans le tableau 14.

Tableau 14 - Valeurs obtenues pour la limite de reproductibilit� et valeurs pour le Test F

Limite de reproductibilit�Niveau


(nombre de laboratoires)M�thode

de r�f�renceM�thode

alternative

Fcalcul�

(ou 1/F *)

Fcritique

(0,05 ; n - 1 ; n - 1) P %

1 n = 14 0,216(2)

0,223 0,310 2,900 2,58 4

2 n = 14 0,240 0,231(2)

0,265 1,114* 2,58 34

3 n = 14 0,338 0,279 1,466* 2,58 25

Interpr�tation statistique : P > 5% : non significatif 1 % < P < 5 % : significatif0,1 % < P < 1 % : tr�s significatif P < 0,1 % : hyper significatif

(2) Valeurs calcul�es < limite de r�p�tabilit�, donc la valeur de la limite de r�p�tabilit� est retenue.

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Les limites de reproductibilit� de la m�thode alternative montrent des valeurs comparables � celles de la m�thode de r�f�rence, � l’exception du niveau 1. La limite de reproductibilit� est alors sup�rieure � celle de la m�thode de r�f�rence.

3.4.5 Rapports limite de reproductibilit� / limite de r�p�tabilit�

Les rapports limite de reproductibilit� / limite de r�p�tabilit� sont donn�s dans le tableau 15.

Tableau 15 - Rapports limite de reproductibilit� / limite de r�p�tabilit�

Limite de reproductibilit� / limite de r�p�tabilit�Niveau


(nombre de laboratoires) M�thode de r�f�rence M�thode alternative

1 n = 14 1,000 3,1012 n = 14 1,198 1,0003 n = 14 1,44 1,247

Niveau critique : reproductibilit� / r�p�tabilit� : < 2

Les rapports limite de reproductibilit� / limite de r�p�tabilit� sont tous inf�rieurs � 2, except� pour la m�thode alternative au niveau 1.

3.4.6 Dispersion entre les laboratoires

Niveau Nombre de r�sultats exploitables

(nombre de laboratoires)

M�thode de r�f�renceF (ou 1/F*)

M�thode alternativeF (ou 1/F*)

F crititque(0,05 ; n - 1 ; n)

1 n = 14 1,129 18,232 2,552 n = 14 1,869 1,924 2,553 n = 14 3,145 2,110 2,55

Niveau critique : F ou 1/F < F (critique)

La dispersion des r�sultats entre laboratoires est d’ordre similaire entre les deux m�thodes, except� pour le niveau 1, pour lequel une valeur �lev�e est obtenue pour la m�thode alternative.

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4 CONCLUSION

Les conclusions de l’�tude pr�liminaire sont les suivantes :

La lin�arit� et l’exactitude de la m�thode COLI ID pour le d�nombrement des E. coli � 37�C sont satisfaisantes.

Tous produits confondus, la limite de r�p�tabilit� de la m�thode alternative est de 0,203 et celle de la m�thode de r�f�rence de 0,322.

Le biais entre les deux m�thodes est faible, compris entre -0,123 et + 0,20 log UFC/ g.

La m�thode COLI ID est sp�cifique et s�lective.

Les conclusions de l’�tude interlaboratoire sont les suivantes :

Le biais entre les deux m�thodes est tr�s faible (0,036 � 0,092 log UFC/g).

Les limites de r�p�tabilit� et de reproductibilit� de la m�thode alternative sont g�n�ralement comparables � celles de la m�thode de r�f�rence.

La dispersion entre laboratoires est g�n�ralement similaire entre les deux m�thodes, � l’exception du niveau 1 o� une valeur plus �lev�e est obtenue pour la m�thode alternative.

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Annexe 1 - M�thode alternative

Pr�paration d’une suspension m�re en peptone sel

Dilutions d�cimales en peptone sel

Inoculation d’une bo�te de Petri avec 1 ml de dilution

Ajout d’environ 15 ml de milieu Coli ID en surfusion

Incuber � 37�C 1�C pendant 24 h 2 h

D�nombrement des colonies caract�ristiques d’E. coli(diam�tre 0,5 � 2 mm, couleur rose violet)

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Annexe 2 - M�thode de r�f�rence : NF ISO 16649-2 (juillet 2001) : m�thode horizontale pour le d�nombrement des Escherichia coli -

-glucuronidase positive

Pr�paration d’une suspension-m�re

Dilutions d�cimales en TS

Inoculation de 2 bo�tes de Petri par 1 ml de suspension m�reou d’une dilution d�cimale si n�cessaire

Ajout d’environ 15 ml de milieu TBX refroidi � 47�C 2�C

Micro-organismes stress�s Micro-organismes non stress�s

Incuber 4 h � 37�C 1�C Incuber � 44�C 1�C pendant 18 � 24 h

Incuber � 44�C 1�C (incubation maximale : 24 h)pendant 18 � 24 h

(incubation maximale : 24 h)

Retenir les bo�tes contenant moins de 150 colonies caract�ristiques (bleues)et moins de 300 colonies au total. D�nombrer les colonies bleues

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Annexe 3 - Lin�arit� : graphiques bidimensionnels et droites de r�gression

Graphiques bidimensionnels

Steak hach�

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00

l og ( M �t h o d e d e r� f �re n c e )

Lait

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


Filet de sandre

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


Petits pois surgel�s

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


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Graphiques bidimensionnels

Coule d'oeuf

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


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Droites de r�gression

Steak hach� -R�gression GMFR

y = 0,9867x + 0,0057

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

R�f �r e n c e

Lait - R�gression OLS 2

y = 0,9904x + 0,0249

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

A l t e r n a t i v e

Filet de sandre -R�gression GMFR

y = 0,9141x + 0,304

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

R�f �r e n c e

Petits pois - R�gression GMFR

y = 0,9026x + 0,3419

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

R�f �r e n c e

Coule d'œuf -R�gression OLS 2

y = 0,8453x + 0,4697

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00


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Annexe 4 - Exactitude relative : graphiques bidimensionnels et droites de r�gression pour chacune des matrices et pour l’ensemble des

matrices

Graphique bidimensionnel

Produits carn�sColi ID-Eco37

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


Produits laitiersColi ID-Eco37

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


Produits de la m erColi ID-Eco37

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


V�g�tauxColi ID-Eco37

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


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Graphique bidimensionnel

OvoproduitsColi ID-Eco37

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


Tous produits

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00


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Droites de r�gressionProduits carn�s

R�gression GMFR

y = 1,0477x - 0,2909

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

R�f�rence

Alte

rnat

ive

Produits laitiersR�gression GMFR

y = 0,9528x + 0,0902

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

R�f�rence

Alte

rnat

ive

Produits de la m erR�gression OLS 2

y = 0,988x + 0,1562

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00


OvoproduitsR�gression GMFR

y = 1,0959x - 0,317

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

R�f�rence

Alte

rnat

ive

V�g�tauxR�gression GMFR

y = 0,9744x + 0,049

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

R�f�rence

Alte

rnat

ive

Tous produitsR�gression GMFR

y = 1,0108x - 0,0987

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

R�f�rence

Alte

rnat

ive

rapport de synthÄse validation de la mÅthode coli id … · application • la microbiologie...

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