quÍmica quÂntica e espectroscopia

QUÍMICA QUÂNTICA E ESPECTROSCOPIA

Igor Khmelinskii, FCT, DQBF

Modulo IV, ano lectivo 2007-2008

T10

Espectroscopia óptica e fotobiologia

Cap. 13 Peter Atkins, Julio de Paula

Physical Chemistry for Life Sciences

Recursos (Living graphs): http://www.oup.com/uk/orc/bin/9780199280957/01student/graphs

/ch13/Recursos (Web links):

http://www.oup.com/uk/orc/bin/9780199280957/01student/weblinks/part4/

http://www.oup.com/uk/orc/bin/9780199280957/01student/graphs/ch13/






















3

Correcção de erros das aulas TP

• Simetria de Estados do Benzeno• Fórmula da interacção dipolo permanente – dipolo

induzido (p. 466 do livro)

60

221

4 rV

4

Espectroscopia: ideias gerais

• Espectroscopia de emissão: a molécula passa do estado de energia elevada E2 para o estado de energia mais baixa, E1, emitindo o excesso na forma do fotão

• Mede-se a intensidade de emissão

5


• Transição de um estado de energia mais baixa, E1, para um estado de energia mais elevada, E2.

• Espectroscopia de absorção: mede-se a intensidade de absorção em função da frequência ou c.d.o.

6


• Espectroscopia de Raman: incide luz monocromática; medem-se as frequências presentes na luz espalhada pela amostra.

7


• Número de onda (Infravermelhos, espectroscopia de vibrações moleculares); mede-se em cm-1.

c

c

EEh

1~

21

8


9


• Transições vibracionais (infravermelho)

• Transições electrónicas (UV e visível)

10

Métodos experimentais

• Espectrómetro:– fonte da radiação– luz transmitida,

emitida ou espalhada pela amostra é

– colectada, – monocromatizada e – analisada pelo

detector

11

Fontes e detectores

• Infravermelho distante (de 35 até 200 cm-1): descarga em vapores de Hg

• Infravermelho médio (200 até 4000 cm-1) Globar ou fio de Nernst

• Visível: lâmpada de W-I

• UV: lâmpada de D2 ou Xe

• Elemento dispersivo: rede de difracção

12

Fontes e detectores

• Infravermelho: técnicas de transformado Fourier– Interferómetro de

Michelson

• Sensibilidade mais elevada

13

Fontes e detectores

• Um único elemento sensitivo ou uma matriz 1D ou 2D– Fotodíodos– CCDs – Infravermelho: detector Hg-

Cd-Te (MCT) – detector fotovoltaico

• Espectrómetros Raman– Laser (fonte)– Radiação espalhada (1

fotão em 107)– Bandas Stokes (fotão deu

parte de energia a molécula)

– Bandas anti-Stokes (fotão recebeu parte de energia da molécula)

– Filtros, redes de difracção, interferómetros de Michelson

14

Análise biosensorial• Mede-se cinética e termodinâmica de

interacções entre polímeros• O biosensor detecta as alterações das

propriedades ópticas da superfície em contacto com o biopolímero

• Oscilações da densidade electrónica em metais excitados pela luz – plasmons – Ressonância de plasmons na

superfície– Variando o material em contacto com

a superfície, varia o ângulo de ressonância

• Estudar ligação de moléculas ao material colocado na superfície: ADN – proteinas, anticorpo-antigeno

15

Intensidade de transições

• Espectroscopia de absorção

• Lei de Lambert-Beer• (L mol-1cm-1)

0

0

0

10

log

I

IT

II

lJI

IA

lJ

16

Dedução

0

0

0

0

0

logloglog

10lnlog10lnln

ln

dd

dd

***dd

0

I

I

I

IAlJ

I

I

xx

lJI

I

xJI

I

xJI

I

xIJI

lI

I

17

Exemplo: do triptofano

• Radiação, c.d.o.=280 nm; Célula 1 mm; 0,50 mmol L-1 triptófano; T = 0,54; Calcular: A e aos 280 nm, e T para l = 2,0 mm

)27,02(

112

1029,0)mm 0,2(

27,054,0log

mmmolL 104,5log

:.

T

A

lJ

T

R

--

0

0

0

10

log

I

IT

II

lJI

IA

lJ

18

Exemplo

• C = 0,10 mmol L-1 triptófano; T = 0,14; c.d.o.=240 nm; Célula l = 5,0 mm; Calcular: A e T(1,0mm)

68,010)mm 0,1(

80,020,0113,2

4,010log

10ln

)4,01ln(

10log)4,01log(10log)4,01log(

aproximado Cálculo

*85,014,0log

mmmolL 101,1log

:.

)5/85,0(

114

T

A

lJ

T

R

--

1912,21303,2110

1,ln1

303,210ln

1,11

1211)1(

1,1)1(

1,1)1(

1,1

1,)1ln(

2/1

/1

xxx

axaxa

xxx

xxx

kxkxx

kxkxx

xxe

xxx

x

x

k

k

x

Fórmulas de cálculo aproximado

20


• Coeficiente de absorção integrado (vs , para avaliar a intensidade de uma transição)

• Momento dipolar da transição

d

d

i*ffi,

i*ffi

xx

x

e

ex

21


• Momento dipolar da transição

III

ii

xx

x

RZere

e

ex

:geral

d

:H tipoátomo

d

i*ffi,

i*ffi

22

Regras de selecção

• Regra geral de selecção• Regras específicas

(alterações de números quânticos)

• Transições permitidas e proibidas

• Transições tipo dipolo eléctrico: a redistribuição da carga deve ser dipolar;

• A intensidade é proporcional ao número de moléculas no estado inicial, e à força da transição

2fi

23

Largura da linha de emissão

• Os estados excitados têm um certo tempo de vida

• Mecanismos:– Desactivação por colisões– Emissão espontânea:

proporcional a 3 • A largura natural das

transições electrónicas é muito maior que a das vibracionais;

• Valor típico: 10-8 s 510-4 cm-1

colcol

1

/

/δ

ps

cm3,5~δ

~δδ

δ

:decaimento

E

τ/

hcE

E

e t

24

Espectros vibracionais

• Moléculas diatómicas: 1 modo vibracional

• Junto ao mínimo:V=½k(R-Re)2

25

Espectro vibracional: oscilador harmónico

• Junto ao mínimo:V=½k(R-Re)2

al vibracionquântico número

2

1

... ,2 ,1 ,0 )2/1(

BA

BA

2/1

mm

mmk

hE

26

T-11

Exemplo• Monóxido de

carbono; 12C16O;k = 1860 Nm-1

• Calcular e a separação entre os estados

• R: = 64,32 THzE = 42,62 zJ; 1 zJ=10-21 J

27

Massas isotópicas12C 12.000 000 0(0)* 13C 13.003 354 8378(10)

C 12.010 7(8) 1H 1.00782 5032 1(4) 2H 2.01410 1778 0(4)

H 1.00794 (7)16O 15.9949 1463 (5)17O 16.9991 312 (4)18O 17.9991 603 (9)

O 15.9994 (3)

http://www.webelements.com/




28

Exemplo

• Substituição isotópica; (16O2) = 47,37 THz (18O2) -?

THz53,44THz37,4700,18

00,16)O(

00,18

00,16

)O(

)O(2

18

216

218

29

Transições vibracionais

• Energias 10-20 – 10-19 J• Frequências 1013 – 1014

Hz• Números de onda: 300 –

3000 cm-1 (infravermelho, MIR)

• Regra geral de selecção: a vibração deve alterar o momento eléctrico dipolar

• Molécula diatómica homonuclear: inactiva no IV

30

Exemplos

• Quais das seguintes moléculas podem contribuir para o aquecimento global (efeito de estufa), absorvendo os raios IV: O2, N2, H2O, CO2, CH4?

• Serão activos no IV as moléculas CH2=CH2 e NO?

31

Transições vibracionais

• Exemplo: CO em peptide: k = 1,2 kN m-1

Número de onda?• R: 1,7103 cm-1

)cm/s/()cm(~

2

1

OC

11

21

1612

c

ck

• Regra específica de selecção: v = 1;

• Isso corresponde a E = h

• A temperatura de ambiente, na maioria dos casos v = 0 – a molécula está no estado fundamental

32

Potencial real

• Movimento anarmónico – Os níveis tornam-se

mais próximos– Existem em número

finito• C–H – 5• I–I – ca. 60

– Sobretons • v = +2; +3 etc.

33

Espectroscopia vibracional de Raman

• Regra geral: a polarizabilidade da molécula deve ser alterada pela vibração

• Regra específica de selecção v = 1

• Linhas Stokes: v = +1 – mais intensas

• Linhas anti-Stokes: v = -1

• Diatómicas – todas activas

34

Vibrações em moléculas poliatómicas

• Número de modos vibracionais– Não lineares:

N.m.v.= 3N – 6– Lineares:

N.m.v.= 3N – 5

35


• Número de modos vibracionais– Não lineares:

N.m.v.= 3N – 6– Lineares:

N.m.v.= 3N – 5

Exemplos

• H2O N=3 n.m.v.=3

• Naftaleno C10H8 N=18 n.m.v.=48

• N=2 n.m.v.=1

• CO2 N=3 n.m.v.=4

• HCCH (etino) n.m.v.?• Proteína de 4000

átomos?

36


• Modos L e R são dependentes

• Modos 1 e 2 – modos normais – são independentes

• Modos normais: deslocações vibracionais colectivas e independentes

• Modos de alongamento têm frequências mais elevadas comparando com as de flexão

37


• Regra geral: os deslocamentos correspondentes ao modo normal devem alterar o momento dipolar

• CO2

38


Exemplos • Qual a diferença

entre o espectro IV de N2O e de CO2?

• CH4: quais dos modos são activos em IV?

39

Modos normais

• Alguns modos podem ser atribuídos aos grupos funcionais

• Outros – movimentos colectivos da molécula inteira; abaixo dos 1500 cm-1 (zona das impressões digitais)

40

Moléculas poliatómicas: espectros de Raman

• Exemplo:– Apenas o modo de

alongamento simétrico em CO2

• podemos confirmar pela regra de exclusão

• Regra geral: vibração no modo normal está acompanhada pela variação da polizabilidade

• Regra de exclusão: em moléculas com centro de inversão nenhum modo pode ser activo tanto em IV como em Raman

41

Espectros Raman de ressonância

• Maior intensidade do espectro

• Espectro simplificado

42

Exemplo: espectroscopia vibracional de proteinas

• Espectro de –CONH– comparando com N-metilacetamida CH3CONHCH3

• (a) (ordem crescente n.d.o.)– CH (CCH3) s e a;– CH (NCH3) s e a;– NH

• (b) amida I– CO – 1640-1670 cm-1

• (c) amida II– CO (along.) + NH (flexão) –

1620-1650 cm-1

43


• Algumas bandas – dos grupos laterais• Amida I e amida II – são sensíveis aos pontos de

hidrogénio; amida I para n.d.o. +baixos; N–H…O=C; amida II para n.d.o. +elevados

44


• Podemos observar alterações de conformação

45


• Espectros Raman de ressonância: selectivamente observar bandas de pigmentos ligados a um proteína– (a) 407 nm – clorofila a e -

caroteno– (b) 488 nm – -caroteno

– A parte restante da molécula e o solvente não absorvem a estes c.d.o.

46

Microscopia vibracional

• Limite da resolução; nr – índice de refracção do material da lente; a – abertura numérica

• Áreas até 9 m2 – necessidade de fontes de radiação muito intensas

sin61,0 rAiry na

ar

47

Microscopia vibracional

• Imagens de Raman• Espectrómetros de FTIR• Exemplo: célula viva (_)

vs célula a morrer (…)– 1545 e 1650 cm-1 – CO

peptídico – 1240 cm-1 – grupo

–PO2– de lípidos

– 1730 cm-1 – CO éster– Distribuição de proteínas e

lípidos na célula

48

Espectros UV e visível

e = 1,602 176 487(40) × 10-19 C

96,47

x100; -3,5%

3,0

NA = 6,022 141 79(30) ×1023 mol−1

49

Roda de cores do pintor

50

Espectros UV e visível

51

Princípio de Franck-Condon

• As transições electrónicas acontecem muito mais rapidamente que os núcleos conseguem reagir, sendo muito mais pesados que os electrões.

• Estrutura vibracional de uma banda.

52

T12

Princípio de Franck-Condon• A transição acontece

para um estado vibracionalmente excitado:– Núcleos parados

correspondem a um desvio máximo do equilíbrio.

53

Correcção (Cap. 11)

Massa molar

vs – volume específico do soluto; cm3/g

– densidade do solvente; g/cm3 • Para saber a massa molar M, basta determinar S e D,

medindo sedimentação e difusão

svbbD

SRTM

1

54

Absorção electrónica de moléculas biológicas

• Grupos cromóforos– 290 nm: CO

(transição n-; ca. 4eV)– Transições d-d (complexos);

Ex.: Cu2+ 500 – 700 nm (azurina)

– Transições c/transferência de carga (ML ou vice versa)

– Ligações duplas C=C (transição -*; ca. 7eV, UV); Conjugadas vis; Ex.: caroteno

55

Espectroscopia electrónica: instrumento bioquímico

• As posições e as intensidades são sensíveis às interacções intermoleculares

56

Exemplo

• Espectro de espiral tem duas transições * em vez de uma: acomplamento exitónico (dois estados excitados diferentes em vez de um)

• Pormenores adicionais: polarização da luz;– Polarização plana– Polarização circular – Actividade óptica:

moléculas quirais

57

Moléculas quirais

• Átomos de C assimétricos (com 4 substituintes diferentes)– Ex.: alanina

NH2CH(CH3)COOH

– Enantiómeros

58

Polarização da luz

lJ

AA RLRL

• As moléculas quirais absorvem a luz com polarizações circulares opostas de modo diferente

• Dicroísmo circular

59

Dicroísmo circular

• Estudar estrutura secundária de proteínas

60

Dicroísmo circular

• Estudar estrutura secundária de ADN

61

Decaimento por emissão e sem emissão

• Por emissão– Fluorescência – Fosforescência

• Sem emissão– Dissociação

62

Decaimento por emissão e sem emissão

• Sem emissão– Dissociação

– Transições verticais (princípio de Franck-Condon)

63

Processos que causam a fluorescência

Diagrama de Jablonski

64

Fluorescência e o relaxamento do solvente

• O c.d.o. da emissão (fluorescência) é maior que o c.d.o. de absorção – Relaxamento do

solvente– Transferência de

energia de excitação ao solvente

65

Processos que causam a fosforescência

Diagrama de Jablonski

• Desde um estado excitado tripleto (fluor.: estado excitado singuleto)

• Estado fundamental: singuleto (electrões emparelhados)

• Estado excitado depois de absorver o fotão: singuleto

• Processo de crusamento intersistemas (S T)

– Por acoplamento entre momento angular orbital e o momento angular de spin

– Facilitado na presença de átomos pesados (S, P), com uma carga nuclear maior

• A transição T1 S0 é proibida – emissão muito lenta

• A fosforescência é mais intensa em amostras sólidas, onde a transferência de energia é menos eficaz

66

Microscopia fluorescente

• Clorofilas• Flavinas• Aminoácidos

– Triptofano (280/348)– Tirosina (274/303)– Fenilalanina (257/282)– Ser-Tyr-Gly (oxidado)

– em GFP (395/509)

67

Lasers

• Emissão estimulada• Ampliação da

radiação• Inversão de

população

– Laser de 4 níveis

68

Laser

• Cavidade: – Meio activo– Espelho 100% reflector– Espelho semi-transparente

• Partícula (fotão) em caixa• Condição:• Modos ressonantes do

laser

Ln 2

69

Laser

• Mecanismo de acção do laser: emissão estimulada

• O feixe pode ser polarizado

• Com espelhos paralelos – pouca divergência

70

Aplicação de lasers em bioquímica

• Espalhamento de luz laser

• Espalhamento de Rayleigh: partículas com d <<

• I M -4

71

Espalhamento de luz laser

• cM – concertação mássica

• I0 – intensidade da luz incidente

• M – massa molar• K – depende do

índice de refracção da solução

• P – factor estrutural McKPI

IM

0

72


P – factor estrutural

• d << : P 1

• d ca. 0,1Rg – raio de giração

2

222

32sin16

1

gRP

73

Valores experimentais

74

Desvios de idealidade da solução

• Macromoléculas reorganizam o solvente e removem-no do espaço que ocupam

• Não têm liberdade de movimento no espaço ocupado por outras MM

• B – efeito do volume excluído

0M

M 1I

IRBcMPR

Kc

75


• Exemplo:

• cM = 2,0 kg m-3; 20ºC; = 532 nm; K = 2,4 10-2 mol m3 kg-2

• Assume-se que B = 0 e a molécula é pequena

• Tamanho e massa molar podem ser medidos medindo a luz espalhada em função do ângulo

15,0 45,0 70,0 85,0 90,0

R 23,8 22,9 21,6 20,7 20,4

76


MKcbR

m

RR

R

R

MKcR

g

g

M2

22

2

22

22

M

13

16:recta uma

2sin1

vs/1 :gráfico

2sin1

3

1611

102/R 4,20 4,37 4,63 4,83 4,90

(103/Rsin2(/2)

0,716 6,40 15,2 22,0 24,5

77


• m = 0,295; b = 4,18 10-2

mol kg1098,4

)1018,4()mkg00,2()kgm mol10402(

11

nm8,3916

295,0)nm532(3

16

3

1-2

23232M

2

1

2

22

1

2

2

,bKcM

mRg

78

Espalhamento dinâmico da luz• Estudos de

difusão• Interferência

da luz espalhada por várias moléculas provoca variações da intensidade

• depende do D tamanho

79

Espalhamento dinâmico da luz

80

T13

Espectroscopia com resolução temporal

• Ca. 10 ns: reacções controladas por difusão

• 1 fs – 1 ps: transferência de energia, vibrações moleculares

• Atraso d = 3 mm t = 10 ps

• Absorção, fluorescência, esp. Raman de ressonância

reacçãoCABB*A

emissãoA*A

absorção*AA

hv

hv

81

Espectroscopia de moléculas individuais

• Estratégias para ultrapassar o limite imposto pela difracção– Usar concentrações reduzidas – Near - field optical microsopy (NSOM) –

microscopia de campo próximo (resolução 50 – 100 nm)

– Microscopia confocal de campo remoto: a luz é focada

• Emissão de proteínas marcados por um indicador fluorescente

82


• Campo próximo: – = 550 nm; D = 100 nm; zona de campo próximo R 25 nm

83


• Epifluorescência de campo largo

• “epi” – “próximo a”

• A luz de excitação passa pela mesma lente da observação

84

Reacções fotoquímicas na atmosfera

85

Fotobiologia

• Reacções bioquímicas iniciadas por absorção da luz

• Fotossíntese• Visão• Danos a ADN• Terapias

86

Cinética de decaimento dos estados excitados

totalquântico rendimento

1

Velocidade

primário quântico rendimentoabsorvidos fotóes de Número

eventos de Número

abs

abs

i i

ii I

Vel

I

• HI + hv H + I

• H + HI H2 + I

• I + I + M I2 + M

= 2

87


• Absorção: 10-16 – 10-15 s• Fluorescência: 10-12 – 10-6 s• Reacções a partir do estado excitado singuleto: 10-15 – 10-12 s

– Visão– Fotossíntese

• Fosforescência: 10-6 – 10-1 s• Reacções a partir do estado excitado tripleto

*][*: interna Conversão

*][**: masintersiste Crusamento

*][*:ciaFluorescên

*:Absorção

ICIC

ISCISC

ff

absabs

SkvSS

SkvTS

SkvhSS

IvShS

f

i

88


• Taxa (?) e rendimento quântico de fluorescência

ICISCf

ff

ICISCf0

00

ICISCf

ICISCf

abs

1: ciafluorescên da aparente vidade Tempo

)/exp(*][*][

*])[(

*][*][*][:* da decaimento de Velocidade

:* da formação de Velocidade

kkk

k

kkk

tSS

Skkk

SkSkSkS

IS

t

89

Dedução

)(

*])[(

*][ciafluorescên de Taxa

*])[(

0*])[(d

*][d

ioestacionár estado do aprox. - Pequeno*][

ICISCf

ff

ICISCf

f

absf

ICISCfabs

ICISCfabs

kkk

k

Skkk

Sk

I

SkkkI

SkkkIt

S

S

90

Exemplo

• O tempo de vida aparente de fluorescência pode ser medido

• Exemplo: triptófano em H2O; f = 0,20; 0 = 2,6 ns; Então kf = 7,7107 s-1

f

f

fICISCf

f

ICISCf0

11

kkkkk

k

kkk

91

Supressão (quenching) de fluorescência

• Remoção de energia sem emissão

• Equação de Stern-Volmer

QkQ0f

0,f 1

92

Derivação

• Equação de Stern-Volmer

Q1Q

Q

0[Q] quando

Q

1 suppressor de presença na

Q

0*Qd

*][d

[Q][S*] supressão de taxa* Supressão

ICISCf

Q

ICISCf

QICISCf

f

QICISCf

ICISCf

f

f

f,0

ICISCf

ff,0

QICISCf

QICISCf

ff

QICISCfabs

Q

kkk

k

kkk

kkkk

k

kkkk

kkk

k

kkk

k

kkkk

kkkk

k

SkkkkIt

S

kQSQS

93

Supressão (quenching) de fluorescência

• Intensidade e tempo de vida são proporcionais ao rendimento quântico obedecem a mesma equação

QkI

IQ0

f

0,f0

f

0,f 1

94

Exemplo: constante de supressão

• Triptófano; O2 dissolvido

[O2]/(10-2 mol L-1) 0 2,3 5,5 8,0 10,8

/(10-9 s) 2,6 1,5 0,92 0,71 0,57

95

Exemplo: constante de supressão

• Triptófano; O2 dissolvido

kQ = 1,31010 L mol-1 s-1

QkQ0

11

96

T14

Mecanismos de supressão de estados excitados

*QSQS : energia de ressonante ciaTransferên

QSQSQS : aelectrónic ciaTransferên

QSQS :colisõespor excitação-De

*

ou*

*

• Por colisões: eficaz com Q – uma espécie pesada, como átomo I – Ex.: triptófano pode ser suprimido quando está na

superfície do proteína

97

Transferência electrónica

• Taxa de t.e.: Teoria de Marcus1. Diminui com a distância entre S* e Q

2. rG < 0 : o potencial de redução de S* deve ser mais baixo que o do Q

3. A energia de reorganização do reorganização do S*, Q e solvente deve ser próxima ao rG

• Pode ser estudado usando a espectroscopia com resolução temporal

98

Transferência ressonante de energia

• S* + Q S + Q*• Teoria de Förster

– S* e Q devem estar próximos (ca. nm)

– Fotões emitidos por S* podem ser absorvidos por Q

660

60

T

f,0

fT

:rígido sistema

1

RR

R

99

Valores de R0

100

Transferência ressonante de energia

• Medição de distâncias em sistemas biológicos

• Calcula-se a distância (entre 1 nm e 9 nm) sabendo o R0

660

60

T

f,0

fT

:rígido sistema

1

RR

R

101

Exemplo: usar a técnica FRET

• Um aminoácido na superfície de rodopsina for marcado com 1.5-I AEDANS

• Rendimento quântico foi reduzido de 0,75 para 0,68 (supressão por retinal)

• T = 0,093 (R0=5,4 nm) R=7,9 nm

102

Luz em biologia e medicina

• Luz solar: até 1 kW m-2

103

Visão

Xantofila: transição *; corrige aberração cromática

11-cis-retinal, ligado a rodopsina: pigmento visual

Fotoisomerisação: transição *; 200 ps; =2/3; em 0,25-0,50 ms rodopsina fica activado

104

Visão

• Xantofila: transição *; corrige aberração cromática

• 11-cis-retinal, ligado ao rodopsina: pigmento visual

• Fotoisomerisação: transição *; 200 ps; = 2/3; em 0,25-0,50 ms fica o rodopsina activado

105

Fotossíntese • Complexos de pigmentos com proteínas

– A luz excita a molécula a um estado singuleto

– 0,1 – 5 ps – transferência por Förster– Passados 100-200 ps, +90% da energia

chega ao centro da reacção– Excita-se o dímero de clorofila a – Transfere-se a energia a feofitina a (3 ps)– Transferência mais rápida que a emissão

(clorofila a: 5 ns)

106

Danos a ADN

• Fotodimerisação de timinas

• Existem mecanismos de reparação e protecção

107

Terapia fotodinâmica

• O medicamento sensibiliza o oxigênio singuleto

produtosreagentes

*

h

21

21

233

3

O: Oxidação

OPOP: bilizaçãoFotossensi

PP:masintersiste Crusamento

*PP:Absorção

quÍmica quÂntica e espectroscopia

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energia elevada e2

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luz monocromtica