UNIVERSITAS INDONESIA

PROPOSAL TUGAS KHUSUS PRAKTIKUM ANALISIS SEDIAAN

FARMASI

ANALISIS TABLET ISONIAZID DAN PIRIDOKSIN

HIDROKLORIDA SECARA KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI (KCKT)

Kelompok A2:

Agung Ismal Saleh

Annisa Azka Hikmawati Aulia

Andika Galih P.

Debby Dystra M.

Kristiyanti

Novia Ayu Fajarningrum

Rizki Fadhilah

Antonius Julio F.

Jennifer Christie

Stephanie Epiphania

FAKULTAS FARMASI

DEPOK

NOVEMBER 2014

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI...........................................................................................................ii

BAB I : PENDAHULUAN.....................................................................................1

1.1 Latar Belakang..................................................................................................1

1.2 Tujuan ..............................................................................................................2

1.3 Ruang Lingkup Masalah ..................................................................................3

BAB II : TINJAUAN PUSTAKA.........................................................................4

2.1 Sifat Fisikokimia..............................................................................................4

2.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.....................................................................5

2.2.1 Prinsip Kerja..........................................................................................5

2.2.2 Instrumentasi dalam KCKT .................................................................6

2.2.3 Uji Kesesuaian Sistem...........................................................................8

BAB III : METODE PENGUJIAN....................................................................13

3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan.....................................................................13

3.1 Alat dan Bahan yang digunakan ....................................................................13

3.2 Identifikasi Isoniazid dan Piridoksi HCl dalam tablet....................................13

3.3 Penetapan Kadar dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.........................13

DAFTAR PUSTAKA...........................................................................................18

ii

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sekarang ini, banyak sedian farmasi yang beredar di pasaran, dari sediaan berbentuk

solid (tablet, kaplet, kapsul, serbuk, dll), bentuk semi solid (salep, krim, pasta, dll), sampai

bentuk liquid (sirup, suspensi, emulsi, eliksir, dll). Untuk mengimbangi banyaknya sediaan

farmasi yang beredar, perlu diimbangi dengan peningkatan kualitas dari sediaan tersebut.

Pengujian yang biasa dilakukan seperti pengujian identitas sediaan, penetapan kadar sediaan

terhadap etiket, serta pengujian-pengujian lainnya.

Analisis kualitatif adalah suatu proses dalam mengidentifikasi keberadaan suatu

senyawa kimia dalam suatu larutan/sampel yang tidak diketahui. Analisis kualitatif disebut

juga analisa jenis yaitu suatu cara yang dilakukan untuk menentukan macam, jenis zat atau

komponen-komponen bahan yang dianalisa. Tujuan analisis kualitatif adalah untuk

memisahkan dan mengidentifikasi sejumlah unsur/senyawa.Sedangkan, analisis kuantitatif

adalah analisis kimia yang menyangkut penetuan jumlah zat tertentu yang ada di dalam suatu

sample. Analisis kuantitatif terdiri atas analisa titrimetri, analisa gravimetri dan analisa

instrumental. Analisis kualitatif maupun analisis kuantitatif suatu senyawa obat atau bahan

kimia harus memenuhi persyaratan yang tercantum dalam Farmakope atau sumber acuan

resmi lainnya.

Isoniazid atau isonikotinil hidrazid yang disingkat dengan INH. Isoniazid secara in

vitro bersifat tuberkulostatik (menahan perkembangan bakteri) dan tuberkulosid (membunuh

bakteri). Mekanisme kerja isoniazid memiliki efek pada lemak, biosintesis asam nukleat,dan

glikolisis. Efek utamanya ialah menghambat biosintesis asam mikolat (mycolic acid) yang

merupakan unsur penting dinding sel mikobakterium. Isoniazid menghilangkan sifat tahan

asam dan menurunkan jumlah lemak yang terekstrasi oleh metanol dari mikobakterium.

Isoniazid diperkenalkan pada tahun 1952 sebagai obat yang cukup efektif dalam pengobatan

tuberkulosis dan sebagian besar penderita dapat disembuhkan dengan obat ini (Katzung,

1998). Piridoksin HCl (Vitamin B6) ditemukan padatahun 1938 dalam bentuk kristal dari

kulit beras maupun dari ragi (Schunack, 1998). Isoniazid dalam perdagangan sering

dikombinasi dengan Vitamin B6, yang bertujuan untuk mencegah efek samping dari

Isoniazid yang berupa neuritis perifer (gangguan saraf dengan gejala kejang – kejang).

1

Kombinasi dari kedua zat aktif tersebut (isoniazid dan vitamin B6) menimbulkan

masalah dalam analisis kuantitatif sediaan kombinasi tersebut. Masalah ini disebabkan oleh

struktur kedua senyawa yang mirip (sama sama memiliki gugus N heterosiklik), memiliki

sifat fisikokimia yang hampir sama, keduanya juga memilii struktur molekul kimia yang

sama, yaitu memiliki gugus kromofor dan ausokrom.

Dalam United States Pharmacopoeia 32 (2008), British Pharmacopoeia 2013, dan

Farmakope Indonesia edisi IV (1995) belum terdapat monografi sediaan tablet kombinasi

Isoniazid dan Vitamin B6. Penetapan kadar Isoniazid dalam sediaan tablet dapat dilakukan

dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Farmakope Indoensia edisi IV tahun 1995; United

States Pharmacopoeia 32nd edition tahun 2008), dapat juga ditetapkan kadarnya dengan titrasi

bromometri (British Pharmacopoeia tahun 2013).

Sedangkan, penetapan kadar Vitamin B6 (Piridoksin hidroklorida) dalam sediaan

tablet dapat dilakukan dengan Spektrofotometri UV-Vis (Farmakope Indoensia edisi IV tahun

1995; United States Pharmacopoeia 32nd edition tahun 2008; dan British Pharmacopoeia

tahun 2013), juga dapat dilakukan penetapan kadar Vitamin B6 dengan cara Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons tahun 2005).

Persyaratan kadar sediaan Tablet Kombinasi Isoniazid dan Piridoksin HCl belum

tercantum di dalam monografi, namun, kami melihat persyaratan kadar dari sediaan tunggal

masing-masing zat aktif. Menurut USP 32, Tablet Isoniazid mengandung Isoniazid tidak

kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 102,0%. Sedangkan, untuk tablet Piridoksin HCl

menurut USP 32 mengandung Piridoksin HCl tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari

115,0%. Baik penentuan kadar pada Isoniazid dan Vitamin B6 dapat dibandingkan dengan

label pada etiket.

1.4 Tujuan

1.2.1 Mengidentifikasi keberadaan Isoniazid dan Piridoksin HCl dalam sediaan tablet

menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1.2.2 Menentukan kadar Isoniazid dan Piridoksin HCl dalam sediaan tablet

menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1.5 Ruang Lingkup Permasalahan

2

Ruang lingkup analisis sediaan farmasi kali ini adalag identifikasi dan penetapan kadar

secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Adapun sediaan yang diperiksa adalah Tablet

Isoniazid dan Piridoksin HCl.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Sifat FisikokimiaII.1.1 Isoniazid

Gambar. 1 Rumus Struktur Isoniazid

Rumus Molekul : C6H7N3O

Berat Molekul : 137,14

Pemerian :Hablur putih atau tidak berwarna atau serbuk hablur putih,

tidak berbau, rasa agak pahit, terurai perlahan-lahan oleh

udara dan cahaya

Kelarutan :Mudah larut dalam air (1:8); agak sukar larut dalam etano

(1:45) ; sukar larut dalam kloroform (1:1000) dan eter.

Jarak Lebur : Antara 170˚C dan 173˚C

pH :Antara 6,0-7,5; lakukan penetapan menggunakan larutan 1:10

Indikasi :Pengobatan dan pencegahan tuberkulosis, dalam bentuk

pengobatan tunggal maupun kombinasi dengan obat

tuberculosis lainnya. Dan untuk pengobatan infeksi

mikobakterium non-tuberkulosis.

4

II.1.2 Piridoksin HCl

Gambar 2. Rumus Struktur Piridoksin HCl

RumusMolekul : C8H11NO3. HCl

Berat Molekul : 205,64

Pemerian :Hablur atau serbuk hablur putih atau hamper putih; stabil di

udara

Kelarutan : Mudah larut dalam air (1:5); sukar larut dalam etanol

(1:90) ;tidak larut dalam eter.

pH : Larutan mempunyai pH lebih kurang 3

JarakLebur : 204oC dan 208oC, disertai peruraian

Indikasi : Untuk menghilangkan rasa nyeri (analgetik), anti piretik dan

anti inflamasi, migrain, neuralgia, polineuritis, gangguan

sirkulasi perifer, kelelahan dan gangguan kesuburan. Sebagai

terapi profilaksis bersama isoniazid untuk pengobatan

tuberkulosis.

II.2. Kromatografi Cair Kinerja TinggiII.2.1 Prinsip Kerja

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau yang juga dikenal sebagai

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan teknik analisis yang

paling cepat berkembang dalam kimia analitik. Prinsip kerja dari HPLC adalah

pemisahan zat berdasarkan perbedaan komponen zat dalam sampel pada fase diam

dan fase gerak berdasakan polaritasnya. Instrumen yang digunakan untuk analisis

terdiri dari kolom (sebagai fase diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya.

5

Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC

digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fase gerak. Campuran analit akan terpisah

berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu

retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-

puncaknya terpisah.

Metode dalam kromatografi cair dibagi atas dua macam :

a. Kromatografi cair retensif

Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat terlarut dengan fase diam. Tipe ini

mencakup fase normal, fase terbalik dan kromatografi ion.

b. Kromatografi cair non retensif

Pemisahan yang dicapai tergantung kepada perbedaan besar molekul zat terlarut

dimana terjadi interaksi antara zat terlarut dengan pori-pori yang terdapat di

permukaan fase diam. Tipe ini dikenal sebagai kromatografi eksklusi.

II.2.2 Instrumentasi dalam KCKT

Alat KCKT terdiri dari beberapa bagian yaitu reservoir pelarut, pompa,

injector, kolom, detektor, dan integrator.

Gambar 3. Diagram alat dan komponen KCKT

a. Pompa

Pompa berfungsi untuk mengalirkan eluen ke dalam kolom pada rentang laju

alirdari 0,1 hingga 10 mL/menit dengan presisi 0,5% atau lebih baik. Pompa harus

dapat beroperasi pada tekanan hingga 7000 psi (48,3 MPa) dan sistem harus dapat

mengeluarkan udara terlarut dan gas lainnya dari eluen.

b. Injektor

Injektor berfungsi untuk memasukkan cuplikan ke dalam kolom

6

c. Kolom

Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen dalam

senyawa yang dianalisis.

Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam memilih kolom antara lain:

1. Panjang kolom

Panjang kolom biasanya berkisar antara 5-100 cm. Bertambahnya panjang kolom

akan mengakibatkan waktu retensi bertambah, dan pemisahan yang semakin baik.

2. Diameter kolom

Dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kolom analitik dengan diameter dalam 2-6

mm dan kolom preparatif dengan diameter dalam 6 mm atau lebih yang dapat dipakai

untuk ukuran cuplikan yang lebih besar.

3. Pengisi kolom

Bahan pengisi kolom dapat berupa partikel bulat atau tidak teratur. Partikel dengan

bentuk tidak teratur menyebabkan hambatan yang lebih besar terhadap aliran pelarut.

Secara struktur partikel dengan bentuk tidak teratur juga kurang kuat daripada pengisi

partikel bulat. Jadi kolom dengan pengisi partikel bulat cenderung lebih baik terhadap

goncangan mekanis dan tekanan pelarut yang tinggi. Ukuran bahan pengisi juga

berpengaruh terhadap resolusi sistem. Ukuran partikel kecil akan menghasilkan

efisiensi pemisahan yang baik. Ukuran dan bentuk partikel akan mempengaruhi

kepadatan kolom dan hal ini akan mempengaruhi aliran fase gerak secara langsung

dan pemisahan atau efisiensi kolom secara tidak langsung.

4. Fase gerak

Harus selektif terhadap komponen yang dikehendaki dan tidak kental agar dapat

memperkecil penurunan tekanan.

5. Tekanan kolom

Tekanan kolom timbul akibat hambatan terhadap eluen. Partikel yang berdiameter

lebih kecil dan menggunakan eluen dengan viskositas rendah dapat menurunkan

tekanan kolom.

d. Detektor

Fungsi detektor pada KCKT adalah untuk memonitor keluaran kolom dan

mendeteksi senyawa terlarut di dalamnya. Pemilihan detektor lebih sering dipengaruhi

7

oleh karakteristik kimia dari sampel analit dan pemilihan ini dideterminasi oleh eluen

yang digunakan dan juga dipengaruhi oleh fase stasioner dan jenis kromatografi.

Respon detektor akan berhubungan dengan jumlah analit pada keluaran kolom

meskipun analit yang berbeda akan memberikan respon luasan yang berbeda sehingga

detektor harus dikalibrasi terhadap analit yang digunakan.

e. Integrator

Integrator berfungsi untuk menghitung luas puncak. Ada dua macam

integrator, yaitu:

1. Integrator piringan yang bekerja secara mekanik

2. Integrator digital/elektronik, dapat memberikan ketelitian tinggi dan

waktu integrasi singkat.

f. Fase gerak

Pemilihan fase gerak pada KCKT didasarkan pada :

1. Kesesuaian dengan mekanisme pemisahan

2. Kemampuannya melarutkan cuplikan

3. Kepolaran yang dapat diubah dengan mengubah komposisi

II.2.3 Uji Kesesuaian Sistem

Uji kesesuaian sistem menggambarkan bagian dari metode yang digunakan

untuk memastikan kinerja sistem kromatografi baik. Effisiensi, rasio ditribusi sistem,

resolusi, retensi relatif dan faktor ikutan adalah parameter yang biasanya dijadikan

bahan penilaian kinerja suatu kolom. Faktor yang dapat mempengaruhi hasil

kromatogram meliputi komposisi, kekuatan ion, suhu dan tekanan, dan karakteristik

fase gerak meliputi porositas, ukuran partikel, tipe partikel, luas area spesifik, dan

pada kasus fase terbalik, perluasan modifikasi kimia (seperti end-capping, carbon

loading, dll).

Syarat-syarat yang harus dipenuhi adalah sebagai berikut, kecuali jika

dituliskan pada monografi :

Faktor ikutan (tailing factor) dari puncak utama adalah antara 0.8-1.5 kecuali

dinyatakan di dalam monografi. Syarat ini dapat diaplikasikan baik untuk berbagai uji

dan penetapan kadar zat.

8

Di mana :

W0.05 = lebar puncak pada seperduapuluh tinggi puncak

d = jarak antara garis kurva menaik dengan puncak kurva pada seperduapuluh

tinggi puncak.

Standar deviasi relatif yang diizinkan untuk pengulangan injeksi larutan

standar tidak boleh lebih dari 2.0%. Syarat ini dapat diaplikasikan hanya untuk

penentuan kadar.

y = nilai yang menggambarkan luas puncak, tinggi puncak, atau rasio luas dengan

internal standar

ӯ = nilai rata-rata

n = jumlah pengulangan

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter

tersebut memenuhi persyaratan penggunaannya. Beberapa parameter analisis yang harus

dipertimbangkan dalam validasi metode analisis adalah sebagai berikut:

a. Accuracy (Kecermatan) ketepatan sesuai dengan sebenarnya

Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan

kadar analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan kembali

(recovery) analit yang ditambahkan.

% Perolehan kembali = kadar hasil analisis (baku) x 100%

kadar sebenarnya

98%-102%

9

b. Precision (Keseksamaan) keberulangan

Precision adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji

individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur

diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang

homogen.

.

.

KV= SD 100%

x

SD = standar deviasi

X = kadar

X = rata-rata kadar

N = jumlah pengulangan

KV = Koefisien variasi

(Menunjukkan sensistivitas) 2%

Selektivitas (Spesifisitas)

Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya

mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain

yang mungkin ada dalam matriks sampel.

c. Linearitas dan Rentang (Selektivitas)

Linearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional

terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas

terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan

kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima.

Dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50

– 150 % kadar analit dalam sampel. Di dalam pustaka, sering ditemukan rentang

konsentrasi yang digunakan antara 0 – 200 %. Sebagai parameter adanya hubungan linier 10

digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a + bX. Hubungan linier

yang r = +1 atau –1 bergantung pada arah garis. Parameter lain yang harus dihitung

adalah simpangan baku residual (Sy). yang digunakan adalah baku

Sy = √∑(y1-y1)

N-2

Dimana y1= a+bx

Sxo = Sy

b

Vxo = Sxo

B

r 2 lebih baik mendekati 1

d. Batas Deteksi (Limit of Detection) dan Batas Kuantitasi (Limit of Quatification)

Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi

yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas

kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas

terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.

Q = (k x Sb)/S1

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)

k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi

Sb = simpangan baku respon analitik dari blangko

Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap

konsentrasi

= slope (b pada persamaan garis y = a+bx)

Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis

regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada

persamaan garis linier y = a + bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan

simpangan baku residual (Sy/x.)

Batas deteksi (LoD); Karena k = 3, Simpanganbaku (Sb) = Sy/x, maka:

LoD = (3 Sy/x)/ Sl

Batas kuantitasi (LoQ); Karena k = 10, Simpanganbaku (Sb) = Sy/x, maka:

LoQ = (10 Sy/x)/Sl

e. Ketangguhan metode (ruggedness)

11

Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari

analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium,

analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll.

f. Kekuatan (Robustness)

Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi

yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan

akurasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan

prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organic fase

gerak (1%), pH fase gerak (± 0,2 unit), dan perubahan temperature kolom (± 2 – 3° C)

12

BAB III

TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Tempat dan Waktu Pelaksanaan

Laboratorium analisis kualitatif dan kuantitatif Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia

pada waktu sesuai dengan yang ditentukan.

II.2. Alat dan Bahan

Labu ukur (50 ml dan 100 ml), pipet volume (1,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml; 5,0 ml; 10,0 ml;

dan 15,0 ml), gelas beaker (100 ml, 250 ml, dan 1 liter), timbangan analitik, batang

pengaduk, spatel logam, syringe mikro 20 μl, KCKT serta detektor UV, dan kolom

C18.

Isoniazid standar, piridoksin HCl standar, sampel tablet isoniazid-piridoksin HCl,

kalium hydrogen phtalat, asetonitril.

II.3. Identifikasi Isoniazid dan Piridoksin HCl dalam Tablet

Identifikasi isoniazid dan piridoksin HCl dilakukan dengan membandingkan waktu

retensi terhadap standar dengan menggunakan sistem KCKT pada panjang gelombang

yang dapat ditentukan dengan spektrofotometer UV-Vis dimana perpotongan spektrum

antara spektrum isoniazid dan spektrum piridoksin.

II.4. Penetapan Kadar dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Pembuatan Buffer Fosfat

Pembuatan buffer kalium dihidrogen fosfat 0,2 M (FI III hal 746):

Larutkan sejumlah kalium dihidrogen fosfat P dalam air bebas karbondioksida P

secukupnya hingga tiap 1000,0 ml mengandung 27,218 gr KH2PO4.

Pembuatan buffer kalium dihidrogen fosfat 0,015 M:

Larutkan sejumlah kalium dihidrogen fosfat P dalam ar bebas karbondioksida P

secukupnya hingga tiap 1000,0 ml mengandung 2, 04135 gr KH2PO4.

1. Pembuatan Fase gerak asetonitril – buffer fosfat

Terdiri atas asetonitril (A) dan 15 mmol L-1 (0,015 M) buffer kalium dihidrogen

fosfat. Cukupkan pH hingga 4.0 ± 0.1 menggunakan asam ortofosfat/ asam fosfat (B).

Pada 4,5 menit awal digunakan perbandingan A:B adalah 11:89 v/v. Laju alir adalah

1ml per menit

13

Sebelum analisis, fase gerak dan larutan sampel di sonikasi untuk menghilangkan

gas dan disaring dengan kertas saring 0,2 mm.

2. Pembuatan Larutan Baku Isoniazid

LARUTAN KURVA KALIBRASI ISONIAZID

Larutan stok standar : Ditimbang serbuk Isoniazid BPFI sebanyak 100 mg, masukkan ke

dalam labu ukur 100 ml, larutkan dalam fase gerak dan cukupkan volumenya hingga batas

dengan menggunakan fase gerak. Pipet 10 ml larutan, masukkan ke dalam labu ukur 100 ml

dan cukupkan volumenya hingga batas dengan menggunakan fase gerak. Kocok hingga

homogen.

Larutan kurva kalibrasi lebih baik gunakan mikropipet suntikan 20 mikro liter

1. Pipet 10.0 ml larutan induk standar dan masukkan ke dalam labu ukur 100 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (10 ml/100 ml x 100 ppm = 10 ppm)

2. Pipet 15.0 ml larutan induk standar dan masukkan ke dalam labu ukur 100 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (15 ml/100 ml x 100 ppm = 15 ppm)

3. Pipet 10.0 ml larutan induk standar dan masukkan ke dalam labu ukur 50 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (10 ml/50 ml x 100 ppm = 20 ppm)

4. Pipet 3.0 ml larutan induk standar dan masukkan ke dalam labu ukur 10 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (3 ml/10 ml x 100 ppm = 30 ppm)

5. Pipet 4.0 ml larutan induk standar dan masukkan ke dalam labu ukur 10 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (4 ml/10 ml x 100 ppm = 40 ppm) atau 2.0 ml

larutan induk standar masukkan ke dalam labu ukur 5 ml.

6. Pipet 5.0 ml larutan induk standar dan masukkan ke dalam labu ukur 10 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (5 ml/10 ml x 100 ppm = 50 ppm)

3. Pembuatan Larutan Baku Piridoksin HCl

LARUTAN KURVA KALIBRASI PIRIDOKSIN HCl

Larutan Stok Standar : Ditimbang serbuk piridoksin HCl BPFI sebanyak 50 mg, masukkan ke

dalam labu ukur 100 ml, larutkan dalam fase gerak dan cukupkan volumenya hingga batas

dengan menggunakan fase gerak. Pipet 10 ml larutan, masukkan ke dalam labu ukur 100 ml

dan cukupkan volumenya hingga batas dengan menggunakan fase gerak. Kocok hingga

homogen.(50 ppm)

Larutan Kurva Kalibrasi

14

1. Pipet 1,0 ml Larutan Stok Standar dan masukkan ke dalam labu ukur 100 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (0,5 ppm)

2. Pipet 1,0 ml Laruran Stok Standar dan masukkan ke dalam labu ukur 50 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (1 ppm)

3. Pipet 5.0 ml Larutan Stok Standar dan masukkan ke dalam labu ukur 100 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (2,5 ppm)

4. Pipet 5.0 ml Larutan Stok Standar dan masukkan ke dalam labu ukur 50 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (5 ppm)

5. Pipet 10.0 ml Larutan Stok Standar dan masukkan ke dalam labu ukur 50 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (10 ppm)

6. Pipet 15.0 ml Larutan Stok Standar dan masukkan ke dalam labu ukur 50 ml,

tambahkan fase gerak hingga batas (15 ppm)

4. Penyiapan Sampel Tablet Isoniazid dan Piridoksin HCl

a. Timbang 20 tablet masing-masing, lalu tentukan bobot rata-ratanya.

b. Gerus homogen 20 tablet tersebut.

c. Timbang setara massa 0,625 mg piridoksin dan setara dengan 25 mg isoniazid,

masukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan larutkan dalam 50 mL hplc-grade

water. (pelarut untuk HPLC).

d. Kocok kuat selama 25 menit, lalu saring dengan menggunakan Kertas Filter

Whatman #41, hasil saring dimasukan ke labu ukur 100 ml. Cuci residu

dengan pelarut. Kemudian, tambahkan pelarut hingga 100 mL.

e. Sebelum diakukan pengujian, dibagi 6 bagian yang sama (masing-masing 20

uL dalam volume) dari larutan stock tablet encer, disonikasi selama 15 menit,

kemudian diinjeksikan ke dalam sistem kromatografi dan dianalisa secara

kuantitatif.

f. Identitas kimia piridoksin HCl dan Isoniazid ditentukan dengan

membandingkan waktu retensi dari komponen larutan sampel dengan larutan

standar campuran

5. Pencucian Kolom

a. Asetonitril dialirkan ke dalam kolom C18 yang digunakan dengan laju alir 1

mL/menit selama 30 menit

15

b. Dapar dihidrogen fosfat yang telah disaring dengan penyaring 0,2 uL,

dialirkan ke dalam kolom C18 yang digunakan dengan laju alir 1 ml/menit

selama 30 menit.

c. Fase gerak yang telah disaring dengan penyaring 0,2 uL dialirkan ke dalam

kolom dengan laju alir 1 mL/menit selama 30 menit.

d. Dilakukan injeksi untuk pengambilan data sampel dan standar pada laju alir 1

mL/menit, yang telah disaring terlebih dahulu dengan penyaring 0,2 uL

e. Setelah selesai digunakan, kolom dicuci dialiri kembali dengan fase gerak

yang digunakan yang telah disaring dengan penyaring 0,2 uL. selama 30 menit

dengan laju alir 1mL /menit

f. Dapar dihidrogen fosfat yang telah disaring dengan penyaring 0,2 uL dialirkan

ke kolom selama 30 menit dengan laju alir 1mL/menit.

g. Terakhir, pencucian dengan mengalirkan asetonitril ke dalam kolom selama 30

menit dengan laju alir 1 mL/menit.

6. Sistem Kromatografi dalam satu hari kerjakan dalam dua kondisi, berdasarkan

literatur atau dimodifikasi nggak jadi

Kerjakan eluennya bersama dengan kelompok parallel

Gunakan pH meter yang dari bayer

Dapar pakai 2 L sekalian untuk cuci kolom, masukkan ke jerigen jangan

lupa kasih label (simpan disuhu ruang)

tR dibandingkan secara kualitatif dan kuantatif ( tidak usah dibandingkan

dengan literatur, tapi dibandingkan dengan baku saja)

Jika ingin dibandingkan antara baku dan sampel maka jaraknya jangan

terlalu lama karena dikhawatirkan akan berbeda kondisinya

Atau dengan metode spiking yaitu dengan penyuntikan berurutan, maka

peak yang dihasilkan akan lebih besar maka bisa diliaht perbandingannya.

Siapkan kertas saring whatman yang seukuran corong

Siapkan labu untuk baku dan sampel (gunakan labu yang kecil saja) dan

mikro pipet

Karena belum diketahui panjang gelombangnya maka lakukan

spektrofometri UV-Vis dulu menggunakan baku ( sisanya disimpan di

kulkas dan dipakai pada saat spiking)

16

Baku yang disuntikkan harus satu per satu

Untuk akurasi dan presisi yang lebih diutamakan isoniazid saja

Model : HPLC

Sistem elusi : Gradien

Detektor : Detektor serapan UV, panjang gelombang 235 nm

Fase diam : Non polar

- Kolom : Packed column

- Panjang kolom : 250 cm

- Diameter kolom : 4,6 mm

- Pengisi kolom : C18

- Diameter partikel: 5 µm

Fase gerak : Polar

- Jenis eluen : asetonitril (A) dan 15 mmol L-1 buffer potasium

dihidrogen fosfat pH 4,0 ± 0,1 dengan asam fosfat (B)

yaitu A : B = 11 : 89 v/v selama 4,5 menit komposisi

bisa diubah

Laju alir : 1 ml menit-1 bisa lajunya dipercepat atau diperlambat

Volume injeksi : 20 µL

Temperatur ruang : 25 ± 2oC

Total run time : 20 menit

Persyaratan:

- Faktor retensi (k): 1 < k < 10

- Resolution : Rs > 2

7. Prosedur

a. Buat larutan baku dan larutan uji pada berbagai konsentrasi.

b. Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 20 mikro

L), larutan baku dan larutan uji ke dalam kromatograf, ukur respon puncak

utama.

17

DAFTAR PUSTAKADepartemen Kesehatan Republik Indonesia. 1979. Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta :

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 586Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta :

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 769Dhal S. K., Sharma R. 2009. Development and Validation of RP-HPLC Method for

Simultaneous Determination of Pyridoxine Hydrochloride, Isoniazid, Pyrazinamide, and Rifampicin in Pharmaceutical Formulation. Chem. Anal (Warsaw). 54, 1487-1499.

The Department of Health, Social Service, and Public Safety. 2013. British Pharmacopeia 2013. London : The Department of Health, Social Service, and Public Safety.

The United States Pharmacopeial Convention. 2008. United States Pharmacopeial 32. United States: The United States Pharmacopeial Convention.

18