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PRODUCCION DE ACIDO L (+) LÁCTICO A PARTIR DE LACTOSUERO
UTILIZANDO Lactobacillus casei EN UN CULTIVO BATCH
CARLOS ALBERTO GARCIA MOGOLLON
UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE INGENIERÍAS
MAESTRIA EN CIENCIAS AGROALIMENTARIAS
BERASTEGUI
2011
ii
PRODUCCION DE ACIDO L (+) LÁCTICO A PARTIR DE LACTOSUERO
UTILIZANDO Lactobacillus casei EN UN CULTIVO BATCH
CARLOS ALBERTO GARCIA MOGOLLON
UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE INGENIERIAS
MAESTRIA EN CIENCIAS AGROALIMENTARIAS
BERASTEGUI
2011
iii
PRODUCCION DE ACIDO L (+) LÁCTICO A PARTIR DE LACTOSUERO
UTILIZANDO Lactobacillus casei EN UN CULTIVO BATCH
CARLOS ALBERTO GARCIA MOGOLLON
PhD. GUILLERMO ARRAZOLA PATERNINA
Director
UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE INGENIERIAS
MAESTRIA EN CIENCIAS AGROALIMENTARIAS
BERASTEGUI
2011
iv
La responsabilidad ética, legal y científica de las ideas, conceptos y resultados del
proyecto, serán responsabilidad de los autores.
Artículo 61, acuerdo N° 093 del 26 de noviembre de 2002 del consejo superior.
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Nota de aceptación
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Firma del jurado
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Firma del jurado
________________________________
Firma del jurado
vi
Dedicatoria
"La Fuerza que nos da la energía para alcanzar el conocimiento"
¡Es menester ir encendiendo la LUZ en el túnel que nos toca revelar!
vii
Agradecimientos a:
La Universidad de Córdoba y al Programa de Ingeniería de Alimentos
Mi director Guillermo Arrazola, por su valioso apoyo y colaboración
Mis socios experimentales Yeinner Peluffo y Jorge Payares
Los auxiliares de laboratorios Yira Cogollo.
Todas aquellas personas que de una u otra forma, colaboraron o participaron en la
realización de esta investigación.
viii
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCION .................................................................................................. 14
2. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................................ 17
2.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO POR VÍA BIOTECNOLÓGICA ...... 17
2.1.1. Microorganismos utilizados en la producción de ácido láctico ................... 19
2.2. MATERIAS PRIMAS PARA LA PRODUCCIÓN BIOTECNOLOGICA DE
ÁCIDO LÁCTICO ......................................................................................................... 24
2.2.1 El lactosuero como medio de cultivo ............................................................... 27
2.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO ............................................. 28
2.4. FERMENTACION ÁCIDO LACTICA ............................................................. 33
3. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 36
3.1. TIPO DE INVESTIGACION ......................................................................... 36
3.2. LOCALIZACION ........................................................................................... 36
3.3. PROCEDIMIENTOS ............................................................................................ 36
3.3.1. Caracterización del lactosuero. .................................................................. 36
3.3.2. Preparación del lactosuero. ......................................................................... 37
3.3.3. Activación del Lactobacillus casei ATCC 393. .......................................... 37
3.3.4. Adaptación del microorganismo................................................................. 37
3.3.5. Fermentación acido láctica. ......................................................................... 37
3.3.6. Cinética de crecimiento. .............................................................................. 38
3.3.4. Diseño experimental. ................................................................................... 38
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 40
4.1. COMPOSICIÓN DEL LACTOSUERO ....................................................... 40
4.2. FERMENTACIÓN DE LACTOSUERO ...................................................... 40
4.3. MODELOS CINETICOS ............................................................................... 46
4.3.1. Parámetros estequiométricos ....................................................................... 46
4.3.2. Parámetros cinéticos. .................................................................................... 47
ix
4.4. PRODUCTIVIDAD DE LA FERMENTACIÓN ............................................... 55
4.5. OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO .......... 56
5. CONCLUSIONES .................................................................................................. 63
6. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 65
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 66
ANEXOS ......................................................................................................................... 73
x
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Propiedades físico-químicas del ácido láctico. 18
Tabla 2. Microorganismos utilizados en producción biotecnológica de ácido láctico. 20 Tabla 3. Bacterias ácido lácticas homo y heterofermentativas 22
Tabla 4. Producción de ácido láctico a partir de sustratos puros glucosa y lactosa. 26 Tabla 5. Producción de ácido láctico a partir sustratos diferentes complejos. 26
Tabla 6. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero suplementado 45 Tabla 7. Coeficientes estequiométricos Yx/s y Yp/s. 46
Tabla 8. Parámetros cinético α de formación de ácido láctico. 47 Tabla 9. Parámetros cinético fase exponencial. 48 Tabla 10. Parámetros de los modelos. 53
Tabla 11. Parámetros cinéticos. 54 Tabla 12. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero. 56
Tabla 13. Análisis de varianza para ácido láctico. 57 Tabla 14. Estimación de los coeficientes de regresión cubica 58
Tabla 15. Especificadores del Lactobacillus casei ATCC 393 74 Tabla 16. Modelos cinéticos basados en Monod 76
Tabla 17. Modelos no basados en Monod 77 Tabla 18. Niveles experimentales de las variables independientes. 78 Tabla 19. Matriz del diseño Central Compuesto 78
Tabla 20. Ajuste de modelos cinéticos 81 Tabla 21. Parámetros cinéticos en estudios previos 82
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Revisión de dos métodos de manufactura de ácido láctico; síntesis química (a) y
fermentación microbiana (b). SSF, representa Simultánea Sacarificación y
Fermentación. 19
Figura 2. Curva de crecimiento microbiano. Los parámetros representan: λ el tiempo lag,
μmax la velocidad máxima específica de crecimiento y As el valor de la asíntota. 33
Figure 3. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□),
ácido láctico () y recuento de L. casei (▲) a 47,9 g L-1
inicial de lactosa. 41 Figure 4. . Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□),
ácido láctico () y recuento de L. casei (▲) a 55,88 g L-1
inicial de lactosa. 41 Figure 5. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□),
ácido láctico () y recuento de L. casei (▲) a 67,75 g L-1
inicial de lactosa. 42 Figure 6. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□),
ácido láctico () y recuento de L. casei (▲) a 79,63 g L-1
inicial de lactosa. 43 Figure 7. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□),
ácido láctico () y recuento de L. casei (▲) a 87,72 g L-1
inicial de lactosa. 44 Figure 8. Cinética de la fermentación con 47,9 g L
-1 inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico
modificado (∆). 50 Figure 9. Cinética de la fermentación con 55,88 g L
-1 inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico
modificado (∆). 51 Figure 10. Cinética de la fermentación con 67,75 g L
-1 inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico
modificado (∆). 51
Figure 11. Cinética de la fermentación con 79,63 g L-1
inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico
modificado (∆). 52
Figura 12. Cinética de la fermentación con 87,72 g L-1
inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico
modificado (∆). 52 Figura 13. Productividad de ácido láctico a las 8h(□) y 21h (♦) de fermentación. 55 Figura 14. Superficie de respuesta representando el efecto de la concentración de lactosa
y sulfato de amonio sobre la producción de ácido láctico. 59
xii
LISTA DE ANEXOS
Anexo A. ATCC catálogo. 74
Anexo B. Curvas de calibración 75 Anexo C. Modelos cinéticos. 76 Anexo D. Combinación de tratamientos DCC 78 Anexo E. Análisis estadístico diseño factorial 79
Anexo F. Ajustes de modelos. 81 Anexo G. Parámetros cinéticos reportados de estudios previos. 82
Anexo H. Evaluación estadística del Diseño Central Compuesto. 83
xiii
RESUMEN
La producción microbiana de ácido L(+) láctico tiene un gran interés en los últimos años
y el uso de lactosuero como sustrato para producir ácido láctico por fermentación es
favorable por el bajo costo y alto contenido de materia orgánica. El objetivo de este
estudio fue desarrollar un modelo cinético para la producción de ácido láctico a partir de
lactosuero utilizando Lactobacillus casei en cultivo batch. El lactosuero pasteurizado y
desproteinizado, se suplementó con lactosa y sulfato de amonio 1,28:2,62; 9,38:5;
21,25:8,5; 33,13:11,99 y 41,22:14,37 g L-1
, inoculando con 10% de cultivo adaptado y
fermentando a 37 ºC, 150 rpm y pH 6,5 durante 21 h. Se obtuvo una productividad
máxima de 1,1 g L-1
h-1
en ácido láctico, un rendimiento Yp/s de 0,5306 - 0,2488 g g -1
para 47,9 g L-1
y 87,72g L-1
de lactosa inicial. Se ajustaron los modelos reparametrizados
Logístico, Gompertz y Baranyi y la formación de producto se modelo con Luedeking-
Piret. Los parámetros cinéticos del L. casei fueron la max de 0.264 h-1
, α de 2,075 g
ácido láctico UFC-1
y β de 0,759 g ácido láctico UFC-1
h-1
. La forma modificada de la
ecuación logística y Gompertz describieron la mayoría de los experimentos de
fermentación con alta precisión (0.03< SSE <0.06 y 0,99 < Bf < 1,00) y las condiciones
óptimas de 17,69 g L-1
de lactosa y 6,34 g L-1
de sulfato de amonio maximizaron la
producción de ácido láctico. El lactosuero como materia prima permitió obtener buenos
resultados en la producción de ácido láctico.
xiv
ABSTRACT
Microbial production of acid L (+) lactic has a great interest in recent years and the use
of whey as a substrate to produce lactic acid by fermentation is favorable because of the
low cost and its high content of organic matter. The objective of this study was to
develop a kinetic model for the production of lactic acid from whey using Lactobacillus
casei in batch culture. Whey was pasteurize, desproteinized and suplemented with
lactose and ammonium sulfate, 28:2,62; 9,38:5; 21,25:8,5; 33,13:11,99 and 41,22:15, 37
g L-1
, inoculating with 10% of adapted crop and fermenting to 37 °C, 150 rpm and pH
6.5 for 21 hours. We collected a maximum output of 1,1 g L-1
h-1
lactic acid, a Yp/s
performance of 0,5306 - 0,2488 g g - 1
for 47,9 g L-1
and 87, 72 g L-1
initial lactose. The
kinetic parameters were obtained by adjusting Baranyi, Gompertz and logistics
reparametrizados models and product training model with Luedeking-Piret. The kinetic
parameters of L. casei were the max of 0.264 h-1
, α of 2,075 lactic acid g UFC-1
and β
0,759 lactic acid g UFC-1
h-1
. The modified form of the logistic equation and Gompertz
described most of the experiments of fermentation with high accuracy (0.03< SSE <0.06
y 0,99 < Bf < 1,00) and optimum conditions of 17,69 g L-1
, lactose and 6.34 g L-1
ammonium sulfate maximize the production of lactic acid during the fermentation of
whey by Lactobacillus casei for 21 h. Whey as a raw material allowed to obtain good
results in the production of lactic acid.
14
1. INTRODUCCION
El lactosuero es un líquido claro de color amarillo verdoso subproducto del
procesamiento de leche en la elaboración de quesos, con una producción mundial de 82
millones de toneladas métricas (Oreopoulou y Russ 2007). Se ha constituido en el
principal residuo de la industria láctea, donde una parte de éste es usado para
alimentación animal, y el resto tratado como un desecho vertido directamente en los
cursos de agua naturales. El vertimiento directo del lactosuero a los cursos de agua sin
un tratamiento previo genera un problema de contaminación ambiental debido a la
materia orgánica constituida por 4,8% de lactosa, 0,75% de proteínas y 6,2% de materia
seca (Oreopoulou y Russ 2007), nutrientes valiosos al momento de aprovecharlos como
alimento y medio de cultivo para fermentaciones industriales. La aplicación de procesos
biotecnológicos permite obtener sustancias con interesantes aplicaciones en la industria
de alimentos, química y farmacéutica; como es el caso del ácido L(+) láctico cuya
demanda mundial ascendió en el 2007 a 130-150 TM/año y se espera un crecimiento del
10 al 15% anual (Araya et al. 2010). En Colombia todo el producto se importa y
equivale a mil millones de pesos anuales (Serrato y Caicedo 2005). La producción de
leche en Colombia, para el año 2009 fue de 5.730 millones de litros (ENA 2009), de los
cuales, aproximadamente, un 18% se destinó a la producción de quesos y un 9% a
leches fermentadas (Agrocadenas 2008; Parra 2009), lo que quiere decir que la
15
producción nacional de lactosuero, correspondió a 876.766 millones de litros. En el
departamento de Córdoba la producción industrial de la leche y los derivados generó
cerca de 300 empleos y una producción bruta industrial de $ 109.000 millones,
equivalente a 25% de la producción láctea de la región Caribe y a 5,58% del total
nacional. Estas condiciones de disponibilidad y oportunidades del mercado hace
necesaria la búsqueda de mecanismos para lograr un aprovechamiento del lactosuero
mediante la extracción de nutrientes o su transformación en insumos o aditivos
alimentarios y plantear alternativas de producción limpia, útil para el medio ambiente y
que genere valor al lactosuero mediante su potencial uso como medio para la obtención
de ácido L (+) láctico en un cultivo batch de Lactobacillus casei.
El objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo cinético para la producción de
ácido láctico a partir de lactosuero utilizando Lactobacillus casei en cultivo batch. Las
fermentaciones se realizaron usando Lactobacillus casei ATCC 393 homofermentativo,
suplementando el medio con lactosa (1,28; 9,38; 21,25; 33,13 y 41,22 g L-1
) y sulfato de
amonio (2,62; 5; 8,5; 11,99 y 14,37 g L-1
) como fuente de carbono y nitrógeno
respectivamente para la producción del ácido láctico. La fermentación batch se llevó a
cabo manteniendo la temperatura en 37°C a 150rpm, un pH inicial de 6,5 y condiciones
de anaerobiosis; durante un periodo de 21 horas donde se evaluó la concentración del
microorganismo (Log UFC mL-1
), ácido láctico (g L-1
) y lactosa (g L-1
), y se
relacionaron con modelos cinéticos para entender su comportamiento a través de
parámetros cinéticos de crecimiento (max, Yp/s, Yx/s, α, β) y las productividades (Pr).
Se aplicó una metodología de superficie de respuesta a través de un diseño central
16
compuesto para conocer las condiciones óptimas de suplementación del medio para
maximizar la concentración de ácido láctico.
17
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO POR VÍA BIOTECNOLÓGICA
El ácido láctico se denomina acido 2-hidroxipropanoico y está formado por los grupos
funcionales alcohol y carboxilo, conformando un carbono asimétrico que le confiere su
actividad óptica. Existen dos isómeros ópticos, el D(-) láctico y el L(+) láctico y una
forma racémica constituidas por fracciones equimolares de las formas L(+) y D(-). A
diferencia del isómero D(-), la configuración L(+) es metabolizada por el organismo
humano. Tanto las dos formas ópticamente activas como la racémica se encuentran en
forma líquida, siendo incoloros y solubles en agua. En estado puro son sólidos
altamente higroscópicos de punto de fusión bajo. Las formas isoméricas del ácido
láctico pueden ser polimerizadas y producir polímeros con diferentes propiedades
dependiendo de la composición. Las propiedades fisicoquímicas del ácido láctico se
muestran en la tabla 1 (Serna y Rodríguez 2005a).
El L(+) ácido láctico es clasificado por la FDA (Food and Drug Administration) como
una sustancia generalmente reconocida como segura (GRAS) para uso como aditivo
alimenticio, pero el ácido D(–) láctico afecta la salud de los consumidores generando
acidosis y descalcificación.
18
Tabla 1. Propiedades físico-químicas del ácido láctico. Formula C3H6O3
Peso molecular 90.08
Índice de refracción 1.4414
Punto de fusión L(+) y D(-): 52.8 a 54°C
DL(según composición): 16.8 a 33°C Punto de ebullición 125-140°C
Gravedad especifica 1206
Calor de combustión 3616cal/g
Viscosidad 40.33mNsm-2
Densidad 1,249
Constante dieléctrica 22
Fuente: Serna y Rodríguez 2005. Produccion biotecnologica de ácido láctico: estado del arte
La producción de ácido láctico puede ser por vía química o biotecnológica (Figura 1).
El proceso por síntesis química está basado en el lactonitrilo, donde el ácido cianhídrico
es adicionado al acetaldehído en presencia de una base para dar lactonitrilo que es
recuperado y purificado por destilación. Esta reacción ocurre en fase líquida y a altas
presiones. El lactonitrilo es hidrolizado hasta ácido láctico, usando HCl o H2SO4
concentrado para producir la correspondiente sal de amonio y ácido láctico.
Esterificando con metanol para producir metil lactato, el cual es recuperado y purificado
por destilación e hidrolizado en agua bajo catálisis ácida para producir ácido láctico y
metanol, el cual es reciclado (Narayanan et al. 2004).
Aunque la forma racémica es siempre producido por vía química, los isómeros puros
L(+) o ácido D(–) láctico pueden ser obtenidos por fermentación microbiana de una
fuente renovable cuando el microorganismo es seleccionado apropiadamente. La
producción biotecnológica de ácido láctico ha generado un gran interés, porque ofrece
19
una alternativa a la contaminación ambiental causada por la industria petroquímica y el
limitado suministro de los recursos (Wee et al. 2006).
Recurso petroquimico
Acetaldehido (CH3CHO)
Lactonitrilo (CH3CHOHCN)
Solo DL - Ácido Láctico
Adición de HCN y catalisis
Hidrólisis por H2SO4
Recurso renovable
Carbohidratos fermentables
Masa fermentada
Isómero puro L(+) o D(-)-
Ácido Láctico
Pretratamiento (hidrólisis ácida o enzimática)
Fermentación microbiana
Recuperación y purificación
SSF
(a) Síntesis Química (b) Fermentación microbiana
Figura 1. Revisión de dos métodos de manufactura de ácido láctico; síntesis química (a)
y fermentación microbiana (b). SSF, representa Simultánea Sacarificación y
Fermentación (Vijayakumar et al. 2008)
La producción biotecnológica está basada en la fermentación de sustratos ricos en
carbohidratos por medio de bacterias u hongos para formar los enantiómeros
ópticamente activos y depende del tipo de microorganismo utilizado, la inmovilización o
recirculación del microorganismo, pH, temperatura, la fuente de carbono, la fuente de
nitrógeno, el modo de fermentación empleado y la formación de subproductos
(Hofvendahl y Hagerdal 2000).
2.1.1. Microorganismos utilizados en la producción de ácido láctico
Los microorganismos seleccionados en las recientes investigaciones de producción
biotecnológica de ácido láctico están listados en la tabla 2. La mayoría de las
20
investigaciones se han llevado a cabo con bacterias acido lácticas; aunque también los
hongos filamentosos como Rhizopus utilizan la glucosa en condiciones aeróbicas para
producir ácido láctico, especies de Rhizopus tales como R. oryzae y R. arrhizus tienen
actividad amilolítica para convertir directamente el almidón a ácido L (+) láctico. La
fermentación fúngica tiene la ventaja de requerir un medio simple para producir ácido
láctico, pero también tiene requerimientos elevados de aireación puesto que R. oryzae es
un aerobio obligado (Tay y Yang 2002).
Tabla 2. Microorganismos utilizados en producción biotecnológica de ácido láctico.
Organismo g ácido láctico L-1
Y
g g-1
Pr (g L-1 h-1)
Fuente
Rhizopus oryzae
ATCC 52311
83,0 0,88 2,6 Zhou et al. 1999
Enterococcus faecalis
RKY1
144,0 0,96 5,1 Wee et al. 2006
Lactobacillus rhamnosus
ATCC 10863
67,0 0,84 2,5 Berry et al.,1999
Lactobacillus helveticus
ATCC 15009
65,5 0,66 2,7 Schepers et al. 2002
Lactobacillus bulgaricus
NRRL B-548
38,7 0,90 3,5 Burgos et al. 2000
Lactobacillus delbrueckii
Mutant Uc-3
90 0,9 2,25 Adsul et al. 2007
Lactobacillus casei
NRRL B-441
0,91 5,.6 Altiok, 2004
Tay y Yang (2002) inmovilizaron R. oryzae en un lecho fibrosa para producir ácido
láctico a partir de glucosa y almidón. Kosakai et al. (1999) cultivaron células de R.
oryzae con el uso de floculos “mycelial flocs”, formados por la adición de soporte
mineral y polímero, donde observaron que los micelios con forma de algodón tuvieron
una óptima morfología en el cultivo. Park et al. (1998) reportaron que la producción de
ácido láctico fue mejorada en el cultivo de R. oryzae, cuando fue inducida la forma
21
micelial. Esos resultados también sugieren que la forma de algodón micelar fue la
morfología óptima para el uso en un bioreactor air-lift. Aunque se ha persistido en
producir ácido láctico a través de fermentación fúngica, las bacterias ácido lácticas han
sido comúnmente usadas para producir ácido láctico debido a las desventajas de la
fermentación fúngica.
Cuando se utilizan bacterias en la fermentación, se busca que estas sean preferiblemente
termófilas, que fermenten rápida y completamente sustratos baratos, con adición mínima
de nutrientes nitrogenados, que crezcan en valores bajos de pH, que presenten poca
producción de biomasa y una despreciable cantidad de subproductos (Akerberg et al.
1998). Las bacterias ácido lácticas (BAL) pueden ser clasificadas en dos grupos:
homofermentativas y heterofermentativas. Mientras las homofermentativas convierten
la glucosa casi exclusivamente en ácido láctico, las heterofermentativas catabolizan la
glucosa en ácido láctico, además, de etanol y CO2. Las homofermentativas usualmente
metabolizan la glucosa vía Embden-Meyerhof dando como resultado dos moléculas de
ácido láctico de cada molécula de glucosa con un rendimiento mayor a 0,9 g g-1
.
Solamente las bacterias acido lácticas homofermentativas son utilizadas para la
producción comercial de ácido láctico (Hofvendahl y Hagerdal 2000).
Las bacterias ácido lácticas carecen de la habilidad de sintetizar citocromos y porfirinas
(componentes de la cadena respiratoria) y por lo tanto no pueden generar ATP por la
creación de un gradiente de protones. De tal manera, que no usan oxígeno para
producir energía. Éstas crecen en condiciones anaerobias, pero también pueden crecer
en presencia de oxígeno, al estar protegidas de subproductos del oxígeno (H2O2) por
22
peroxidasas en su sistema (Vijayakumar et al. 2008). La mayoría de las BAL producen
únicamente una forma isomérica de ácido láctico; las formas isoméricas de lactato
deshidrogenasa presente en las BAL determinan el isómero de ácido láctico producido,
ya que la deshidrogenasa láctica es esteroespecífica; las especies de los géneros
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus y Tetragenococcus producen
únicamente isómeros D (Tabla 3). Sin embargo, algunas BAL producen formas
racémica donde el isómero predominante depende de los cambios en la aireación,
cantidad de NaCl, tipo de fermentación, incrementos de pH y concentración de sustrato.
Tabla 3. Bacterias ácido lácticas homo y heterofermentativas
Genero y especie Homofermentativo Heterofermentativo Configuración del ácido láctico
Lactobacillus
L. delbrueckii + – D(–)
L. lactis + – D(–)
L. bulgaricus + – D(–)
L. casei + – L(+)
L. plantarum + – DL
L. curvatus + – DL
L. brevis – + DL
L. fermentum – + DL
Sporolactobacillus
S. inulinus + – D(–)
Streptococcus
S. cremoris + – L(+)
S. lactis + – L(+)
Leuconostoc
L. mesenteroides – + D(–)
Fuente: Vijayakumar et al. 2008.
Las especies del genero Lactobacillus por ejemplo, producen además de las formas
isoméricas L(+) y D(-), una mezcla racémica de ambos isómeros.
23
Las homofermentativas fermentan la glucosa hasta 2 moles de ácido láctico, generando 2
ATP por mol de glucosa metabolizada; mientras, las heterofermentativas fermentan 1
mol de glucosa hasta 1 mol de ácido láctico, 1 mol de etanol y 1 mol de CO2. Una mol
de ATP es generada por mol de glucosa, resultando en un menor crecimiento. Debido a
los bajos rendimientos en energía, las bacterias ácido lácticas crecen más lentamente y
producen colonias pequeñas de 2 a 3mm (Vijayakumar et al. 2008).
Lactobacillus: son bacilos microaerófilos, Gram positivos y catalasa negativos, estos
organismos forman ácido láctico como producto principal de la fermentación de los
azúcares. Dentro del género Lactobacillus, existen bacterias homofermentativas
obligadas y facultativas, dando lugar a ácido láctico como producto principal de la
fermentación. Este grupo está integrado por Lb. caucasicus, Lb. bulgaricus, Lb. Lactis,
Lb. helveticus Lb acidophilus y Lb. delbrueckii. La mayoría de las especies
pertenecientes a estos géneros tienen alta tolerancia a pH por debajo de 5,0. Esta
tolerancia ácida les da la ventaja competitiva sobre otras bacterias; la temperatura
óptima de crecimiento varía entre géneros y está en un rango de 20°C a 40°C
(Hofvendahl y Hagerdal 2000). Son microorganismos de rápido crecimiento con
pequeños genomas, metabolismo simple y relevancia industrial.
Lactobacillus casei es un microorganismo facultativo productor de ácido láctico que se
emplea también en la industria láctea. Esta especie de Lactobacillus es particularmente
resistente a rangos amplios de pH (Aguirre et al. 2009) y en estudios recientes se ha
observado que un pH de 6,0 a 6,5 no tiene un efecto significativo en la producción de
24
ácido láctico (Panesar 2007b; Vijayakumar 2008). Prefiere temperaturas de 28–35°C,
reportándose 28°C como óptima (Nabi et al. 2004) y 37°C como la temperatura de
máxima producción de ácido láctico (Panesar 2007b). El Lactobacillus casei prefiere
lactosa como fuente de carbono para su crecimiento y producción de ácido láctico,
seguido de la glucosa y maltosa, mientras que la sacarosa es poco utilizada
(Vijayakumar 2008). Además, de ser usado como productor de ácido láctico, el
Lactobacillus casei es un probiotico, cuya ingestión regular reduce los niveles de
colesterol sérico, ayuda a prevenir ciertos tipos de cáncer y mejora las funciones
digestivas e intestinales, entre otras características (Londoño 2008).
2.2. MATERIAS PRIMAS PARA LA PRODUCCIÓN BIOTECNOLOGICA DE
ÁCIDO LÁCTICO
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y
en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Para
que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo, éste debe reunir una
serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La elección de un microorganismo depende del carbohidrato a ser fermentado:
Lactobacillus delbreuckii subspecies delbreuckii fermentan la sacarosa; Lactobacillus
delbreuckii subspecies bulgaricus usa la lactosa; Lactobacillus helveticus es capaz de
25
fermentar lactosa y galactosa; Lactobacillus amylophylus y Lactobacillus amylovirus
fermentan almidón. Lactobacillus lactis puede fermentar glucosa, sacarosa y galactosa
(Narayanan et al. 2004). El estudio de la producción de ácido láctico cultivando las
células en un medio con diferentes azúcares reveló que Lactobacillus casei prefiere
lactosa para su crecimiento y producción de ácido láctico, seguido por glucosa y
maltosa; mientras la sacarosa fue poco usada (Senthuran et al. 1999).
Diferentes sustratos han sido usados para la producción fermentativa de ácido láctico
con Lactobacillus. El producto más puro ha sido obtenido cuando es fermentado un
medio simple o azúcar puro (Tabla 4), resultando en menores costos de purificación;
pero esto es desfavorable, dado lo costoso de los medios puros y el ácido láctico es un
producto económico, siendo más útil el uso de medios complejos o productos derivados
de desechos orgánicos de industrias agroindustriales (Tabla 5).
Las BAL típicamente tienen requerimientos nutricionales complejos, debido a su
limitada habilidad para sintetizar sus propios factores de crecimiento tales como
vitaminas B y aminoácidos. Ellas requieren algunos elementos para el crecimiento, tales
como fuentes de carbono y nitrógeno, en la forma de carbohidratos, aminoácidos,
vitaminas y minerales (Amrane 2000).
26
Tabla 4. Producción de ácido láctico a partir de sustratos puros glucosa y lactosa.
E.L. Extracto de Levadura; B: Batch; F-B: Fed Batch; C: Continuo; LE: lecho empaquetado; NR: no
reportado
Tabla 5. Producción de ácido láctico a partir sustratos diferentes complejos.
Sustrato Microorganismo Suplemento Condiciones
Ác.
Láctico (g L-1)
Yp/s (g g-1)
Pr (g L-1h-1) Sistema Fuente
Melazas Lb. delbrueckkii ATCC 10241
Extracto de
malta, Sulfato de
amonio
45-46°C 300rpm
1,78 0,63; NR
B Laverde y Muñoz, 1990
Almidón de
maíz Lb. Amylophilus 37°C/pH6,5 46-76,2
0,96;
1,05 B
Vishnu, et al.,
2000
Salvado de trigo
(10g)
L. amylophilus
GV6
Peptona (1-9%); E.L. (1-0,88%);
ACM (2%)
37°C/pH
6,75/5-9d
0,187-
0,23
0,36;
NR
Fase
sólida
Naveena et al.,
2005a,b
Banano rechazo
Lactobacillus
casei rhamnosus
(ATCC 11443)
Diluido en 3
partes de agua
con sales y E.L.
0,88; 1.14
B R. Lopez, 2005
Jugos de
cogollo y hojas
+ jugo de caña de azúcar
Lactococcus lactis subsp.
lactis
3% p/v E.L. 32°C/pH 6,0 >70,19 0,88;
0,97 B
(Serna Cock &
Rodríguez de
Stouvenel, 2005)
Desperdicios
(Almidón 55-88%/CHOS)
Lb.
manihotivorans LMG18011
0.2M MnSO4 pH5.0-5.5 48,7 a
31,2
19,5g g-1 B Y. Ohkouchi,
2005
E.L. Extracto de Levadura; B: Batch; F-B: Fed Batch; C: Continuo
Sustrato Microorganismo Suplemento Condiciones Ácido
Láctico Yp/s (g g-1)
Pr ( g L-1 h-1) Sistema Fuente
Lactosa
(60g/L)
Lb. Plantarum
ATCC 21023
37°C/pH 5-6 150rpm/36h
41g L-1 0,95;
1,05 B
Fu et al.,
1999
Lactosa
(100g/L)
Lb. Helveticus
ATCC 15009 10g E.L.
42°C/pH 5,5
150rpm/18h 0,88; 3,9 C, LE
Tango y
Ghaly, 2002
Glucosa (100g/L)
L. rhamnosus 350h 0,68; 8,18 C Min-tian et al. 2005
Glucosa (30g/L)
Lb. delbrueckkii, casei y salivarius
MRS+ acetato y citrato
35°C/pH 6,0 26,8-27,8 g L-1
0,89-0,99 g L-1 B Siebold et al. 1995
Sacarosa de melaza de caña (cepa C y D sin
identificar)
37-39°C/pH
5,6/150rpm
0,77;0,069-
0,145 B Gómez, 2000
MRS+20g/L
glucosa
Mezcla Lb. casei; Lb.
delbrueckkii subsp
lactis/Lb. helveticus, Lb. delbrueckii
Agua de cocido de maíz
50g L-1
42°C/pH
5,5/120rpm/62h 110 g L-1
NR;
1,48 B Lee, 2004
27
Hay varios factores que estimulan el crecimiento y que tienen considerable efecto sobre
la producción de ácido láctico. La mezcla de aminoácidos, péptidos y aminoácidos, y
amidas usualmente estimulan el crecimiento de las BAL y resultan en velocidades de
crecimiento mucho más altas que en un medio libre de aminoácidos. Los ácidos grasos
también influyen en el crecimiento, y los fosfatos son la sal más importante en la
fermentación ácido láctica.
2.2.1 El lactosuero como medio de cultivo
El lactosuero o suero de queso es un excelente medio de cultivo y por esto se utiliza
como sustrato para la obtención de un buen número de productos a través de la
fermentación. Al ser la lactosa la principal fuente de carbono, parecería que solo
puede emplearse microorganismos capaces de emplear este disacárido como fuente de
carbono. Pero se le puede dar muchas más aplicaciones dado que el azúcar del
lactosuero se puede hidrolizar a través de una vía enzimática o a través de una vía
ácida y de esta manera poder aprovechar el azúcar utilizando microorganismos que
utilicen como fuente de carbono la glucosa y la galactosa en un sin número de procesos
fermentativos.
El lactosuero es el mayor sub-producto de la industria láctea y es útil en procesos
comerciales por contener 50g de lactosa por litro y 4%p/p de nitrógeno (McNeil y
Harvey, 2008); además, grasa y sales minerales. Amrane et al. (2000) reportaron la
producción de ácido láctico a partir de lactosuero y explicó la influencia de la
deficiencia en péptidos (fuente de nitrógeno). La lactosa se utilizará para la obtención
28
de ácido láctico sin necesidad de hidrolizar el azúcar del lactosuero debido a que los
microorganismos utilizan la lactosa como fuente de carbono. Por otra parte, el
contenido de proteínas es alto y es un excelente medio para los microorganismos que
requieren aminoácidos y son capaces de hidrolizar las proteínas. Recientemente se
utiliza el lactosuero para la obtención de ácido láctico utilizando Lactobacillus
helveticus, esta fermentación se realiza y se obtiene una conversión de un 80 – 90%
de lactosa en ácido láctico en un tiempo de 24 horas.
2.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Durante un cultivo batch el medio nutritivo es inoculado con un cultivo semilla; donde
los microorganismos toman selectivamente los nutrientes disueltos en el medio y los
convierten en biomasa y/o productos. Un cultivo típico por lotes incluye diversas fases:
(1) fase lag, ocurre inmediatamente después de la inoculación y es un período de
adaptación de las células a su nuevo ambiente. Durante este período la biomasa se
incrementa muy poco, y no existe reproducción celular. La duración de la fase lag puede
verse afectada por la baja concentración de algunos nutrientes y/o factores de
crecimiento, tales como: concentración de Mg+2
, concentración de CO2, edad del
inocúlo, composición del medio de cultivo, tamaño del cultivo y viabilidad del cultivo;
(2) fase de crecimiento exponencial, logarítmico o de crecimiento balanceado, las
células ya adaptadas a su nuevo ambiente, crecen y se reproducen rápidamente
dividiéndose en forma constante, la actividad metabólica: respiración celular, la síntesis
de proteínas es máxima y el tiempo generacional es mínimo y constante. El número de
células vivas en reproducción es mucho mayor que las células vivas de la población que
29
comienzan a morir. En el momento final de esta fase y como resultado de la alta tasa de
reproducción, comienzan a escasear los nutrientes y el ambiente se torna tóxico por el
exceso de productos de desecho. Es el momento en el cual las células son más sensibles
a los antimicrobianos o a las radiaciones que pueden intervenir negativamente en su
crecimiento. Esta fase se representa por una línea recta ascendente; (3) fase de
desaceleración, en esta se disminuye el crecimiento debido al agotamiento de uno o más
nutrientes esenciales o a la acumulación de subproductos tóxicos del crecimiento,
resultando en un crecimiento desbalanceado; (4) fase estacionaria, inicia al final de la
fase de desaceleración cuando la velocidad neta de crecimiento es cero (no hay división
celular) o cuando la velocidad de crecimiento es igual a la velocidad de muerte. En esta
etapa, las células aún son metabólicamente activas y se estimula la producción de
metabolitos secundarios; (5) fase de muerte o declive, es causada por agotamiento de
nutrientes o sobreacumulación de productos, las células muertas suelen lisarse liberando
sustancias intracelulares al medio de cultivo (Altiok 2004).
Debido a la naturaleza autocatalítica del crecimiento microbiano, es lógico suponer que
la concentración de microorganismos (X) influye en la velocidad con que aumenta la
población (rx), la cual para un tipo de microorganismo depende principalmente de la
composición y concentración del medio de cultivo, presencia de inhibidores,
temperatura y pH. Existen diversos modelos de crecimiento (Anexo A) que representan
un proceso dado, con un microorganismo y en una fase del proceso fermentativo. El más
difundido es la ecuación de Monod, que relaciona el valor de μ con la concentración de
un componente del medio de cultivo, representado por:
30
Donde S es la concentración de sustrato limitante, μm es la velocidad de crecimiento
específica máxima, y Ks se conoce como constante de saturación. El valor de Ks está
inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato. Cuando S
» Ks, μ toma el valor de μm y rx sólo depende de X.
En general, Ks tiene valore muy bajos, del orden de los mg L-1
, por tanto
concentraciones relativamente bajas de S son suficientes para hacer que μ=μm. En
promedio las bacterias poseen valores de μm cercanos a 0,9 h-1
, las levaduras 0,45 h-1
y
los hongos filamentosos 0,25 h-1
; de todos modos μm debe ser determinado
experimentalmente para cada caso en particular.
La presencia de inhibidores del crecimiento en el medio de cultivo causa disminución en
el valor de μ. La substancia inhibidora puede ser algún componente del medio de cultivo
o algún producto formado por los microorganismos. El tipo de inhibición, al igual que
en cinética enzimática, puede ser competitiva o no competitiva.
Los productos formados del metabolismo microbiano pueden ser clasificados en tres
categorías:
1. Productos asociados al crecimiento, donde la velocidad especifica de formación del
producto (qp) y crecimiento (μ) son proporcionales:
31
2. Productos no asociados al crecimiento, formados durante la fase estacionaria cuando
la velocidad de crecimiento es cero. La velocidad específica de formación del producto
es constante:
Metabolitos secundarios como los antibióticos pertenecen a este grupo.
3. Los productos asociados y no asociados al crecimiento, donde la velocidad de
formación es representada por la ecuación de Luedeking – Piret (1959):
El consumo de sustrato sólo es posible cuando hay crecimiento; sin embargo, cuando el
sustrato considerado es la fuente de carbono y energía, puede darse el caso en que el
crecimiento es nulo (r x = 0) y el consumo de sustrato no. A este consumo de sustrato
que no redunda en aumento de biomasa se lo asocia con el mantenimiento de funciones
vitales tales como recambio de material celular, mantenimiento de gradientes de
concentración y movilidad.
La velocidad de consumo de la fuente de carbono y energía:
msX
xY'
xr sr
Donde ms es el coeficiente de mantenimiento e Y'x/s es el rendimiento que se obtendría
si el mantenimiento fuese nulo. El valor de Yx/s es, obviamente, inferior al de Y'x/s.
Valores de ms de 0,01 a 0,04 g h-1
son frecuentes de hallar, pero se incrementan con la
temperatura y con la presión osmótica del medio de cultivo. Por ejemplo, para
Saccharomyces cerevisiae creciendo en anaerobiosis se encuentra un valor de ms =0,036
32
g h-1
, mientras que es diez veces superior si el medio contiene una concentración de
NaCl 1 M, lo cual da cuenta del trabajo osmótico que deben realizar las células. De este
modo el mantenimiento celular posee una implicancia tecnológica directa, ya que un
proceso destinado a la producción de biomasa debe conducirse de modo tal que el valor
de ms sea pequeño.
Otros modelos no basados en Monod buscan describir la cinética del proceso con pocos
parámetros, mientras puedan definir con exactitud las distintas etapas de crecimiento.
Entre estos modelos encontramos el Logístico, Logístico modificado, Gompertz que
describen una función sigmoidal de crecimiento considerados modelos mecanísticos y
sus formas “re-parametrizadas” empíricas que le dan un significado físico a sus
parámetros. En la última década, una nueva generación de modelos de crecimiento se
han desarrollado con el propósito de tener una base mecanistica, por ejemplo, el modelo
de Baranyi, Hills, Buchanan, entre otros (McKellar y Lu, 2004).
Se puede expresar el crecimiento microbiano como el cambio en el tamaño de la
población N o como el logaritmo del tamaño relativo de la población ln(N/No) (Van
Boekel 2009). La velocidad de crecimiento es por definición dN/dt (incremento
absoluto de la población por unidad de tiempo). El incremento de la concentración
celular por unidad de tiempo por célula es:
33
Usualmente, la curva de crecimiento microbiano es de naturaleza sigmoidal (Figura 2) y
el modelo debe ajustarse a esa forma.
Figura 2. Curva de crecimiento microbiano. Los parámetros representan: λ el tiempo lag,
μmax la velocidad máxima específica de crecimiento y As el valor de la asíntota.
Por lo expuesto hasta aquí es evidente que el crecimiento puede ser caracterizado
mediante los parámetros: α, β, μmax, λ, As, Yp/s y Yx/s. Estos dependen tanto del
microorganismo como del medio de cultivo empleado, por lo que su evaluación debe
realizarse para cada caso en particular.
2.4. FERMENTACION ÁCIDO LACTICA
La fermentación batch, fed-batch y continua han sido usadas para producir ácido láctico.
En el cultivo continuo se han alcanzado altas productividades, mientras que en el bath y
fed-batch se han logrado altas concentraciones de ácido. Se han hecho varios intentos
para producir ácido láctico a partir de lactosuero en cultivos batch utilizando
Lactobacillus casei. Schepers et al. (2002) reportaron la producción de ácido láctico a
pH controlado durante un cultivo batch en un medio con permeado de
Fase
Lag
Fase
Exponencial
Fase
Estacionaria
Punto de inflexión
ln (
N/N
o)
Tiempo λ
As=ln(N/Nmax)
34
lactosuero/extracto de levadura. Senthuran et al. (1999) reportó la producción de ácido
láctico a través de un cultivo continuo de Lactobacillus casei inmovilizado en
polietilenamina. Para conocer la cinética de producción de ácido láctico es necesario
determinar los parámetros cinéticos que determinan el desarrollo de la fermentación a
las condiciones propias de cada microorganismo, es decir, oxígeno, temperatura, pH,
densidad celular y requerimientos nutricionales.
Entre los parámetros que influyen en el proceso de fermentación están las condiciones
anaerobias preferidas por las LAB (Hofvendahl y Hagerdal, 2000). El efecto de la
temperatura sobre la concentración másica y productividad del ácido láctico fue
estudiada para varios microorganismos. Por ejemplo, para Lactobacillus casei y
Lactobacillus paracasei la temperatura óptima fue reportada entre 37°C y 44°C. De tal
forma que las mayores productividades son en algunos casos menor a la temperatura que
resulta en el mayor rendimiento y concentración, mientras que en otros casos se obtienen
los mismos resultados en todas las categorías. En cuanto al pH en la fermentación, éste
es ajustado al inicio y va decreciendo debido a la producción de ácido o es controlado
por la titulación con base, o por extracción, adsorción o diálisis del ácido láctico. El pH
óptimo para la producción varía entre 5 y 7 (Vijayakumar et al. 2008). Senthuran et al.
(1999) investigaron la producción de ácido láctico por Lactobacillus casei a diferentes
valores de pH mostrando que la productividad fue la más alta a pH 6,0 con células libres
y a un pH 6,5 cuando las inmovilizó. La productividad tanto como la densidad celular
decreció a los más bajos y altos valores de pH. En cuanto a la densidad celular, las más
altas densidades (48 - 108g células L-1
) han sido logradas con recirculación, pero en
35
fermentaciones sin recirculación se han alcanzado entre 60 y 77 g células L-1
. La
fermentación de las BAL, está acompañada de un incremento de la masa celular, lo que
constituye un subproducto indeseado si el objetivo del proceso es la producción de ácido
láctico. Pero, al obtener altas concentraciones de microorganismos, estos pueden ser
usados como materias primas principales en la producción de probióticos (Hofvendahl y
Hagerdal 2000).
36
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. TIPO DE INVESTIGACION
La investigación será de tipo experimental.
3.2. LOCALIZACION
Esta investigación se llevó a cabo en los laboratorios de biotecnología de alimentos y en
la planta de tecnología de frutas que hace parte del programa de ingeniería de alimentos
de la Universidad de Córdoba con sede en el corregimiento de Berasategui, municipio de
Ciénaga de Oro, departamento de Córdoba, Colombia; con una temperatura promedio de
27°C, humedad relativa 80% y 20 m.s.n.m, situada geográficamente en las coordenadas
8º 40` 26“ de latitud oeste con respecto al meridiano de Greenwich.
3.3. PROCEDIMIENTOS
3.3.1. Caracterización del lactosuero.
El Lactosuero fue suministrado por la empresa Empresa PROCAMP Ltda. Vía Cereté –
Ciénaga de Oro, Córdoba – Colombia. Se utilizó lactosuero fresco, proveniente de la
producción de queso costeño. Se evaluó la composición del lactosuero en lactosa por el
método espectrofotométrico (A.O.A.C. 160.51), el contenido de nitrógeno se determinó
37
por el método de Kjeldahl (A.O.A.C. 976.06), ácido láctico por titulometría (A.O.A.C.
947.05) y pH por potenciómetría (A.O.A.C. 973.41).
3.3.2. Preparación del lactosuero.
El lactosuero pasteurizado se desproteinizo por filtración y se suplementó con lactosa y
sulfato de amonio (Lo:So) 1,28:2,62; 9,38:5; 21,25:8,5; 33,13:11,99 y 41,22:14,37 g L-1
,
ajustando el pH a 6,5 utilizando carbonato de sodio 2,5 N y adicionando 5 g L-1
de
hexametafosfato para 500 mL de lactosuero.
3.3.3. Activación del Lactobacillus casei ATCC 393.
Se activó el Lactobacillus casei ATCC 393 (Anexo A) en 10 mL de caldo MRS
incubando a 37°C durante 24 h, periodo después del cual se tomó 1 mL y se agregó a 9
mL de caldo MRS e incubó a 37°C durante 6 h. Del caldo se tomó 1 mL y se realizaron
siembras en profundidad en Agar MRS y se incubaron a 37°C durante 48 h. Se
realizaron 3 repeticiones en cada etapa.
3.3.4. Adaptación del microorganismo.
Se adaptó inoculando con 10 mL de Lactobacillus casei activado en 500 mL de
lactosuero e incubando a 37°C durante 12 h.
3.3.5. Fermentación acido láctica.
Se llevó a cabo en un Fermentador Tecferm 1L con un volumen de trabajo de 500ml. Se
inoculó 10% del cultivo con el microorganismo adaptado, garantizando una población
mínima de 106 UFC mL
-1. Las condiciones de trabajo fueron a presión atmosférica, 37
°C y 150 rpm de agitación magnética. Se monitoreo la fermentación durante 21h a 37°C
ajustando el pH a 6.5, determinando concentración de lactosa (g L-1
) y Lactobacillus
38
casei (LogUFC mL-1
) a través de la densidad óptica (DO) medida en un Spectronic +20
a 610 nm tomando 10 mL de muestra y centrifugando a 6,000 rpm por 15 min. Para
relacionar la DO con la concentración de biomasa se elaboró una curva de calibración
DO vs logUFC mL-1
(Anexo B) acorde a Altiok 2004.
3.3.6. Cinética de crecimiento.
Las variables respuesta como la concentración de Lactobacillus casei (LogUFC mL-1
),
de ácido láctico (g L-1
), lactosa, la velocidad especifica de crecimiento (μ) y los
parámetros de producción α y β, fueron estimados para modelar el crecimiento y la
producción de ácido láctico. La velocidad de producción de ácido láctico fue descrita
por el modelo de Luedeking y Piret (LP): dP/dt = αdN/dt + βN. Los valores de los
parámetros del modelo fueron ajustados minimizando la función objetivo:
La ecuación (SSE) es la suma del cuadrado del error, donde N es el número de
observaciones en la fermentación de cada tratamiento, “exp” representa el dato
experimental y “cal” el dato calculado por el modelo (Anexo C).
3.3.4. Diseño experimental.
Se estableció un diseño completamente al azar con arreglo factorial completo 22 con sus
factores concentración de lactosa y sulfato de amonio suplementado. Aplicando la
metodología de superficie de respuesta a través de un diseño central compuesto (Tabla
6) con 5 repeticiones en el punto central, 4 en los puntos factoriales y 8 en los puntos
estrella, esto es, los puntos que tienen una distancia axial al centro de (±1.68179) para el
factor concentración de lactosa y en total 21 unidades experimentales (Anexo D). Las
39
condiciones óptimas se estimaron por el análisis de los datos y la gráfica de superficie de
respuesta generada por el paquete Design Expert 6.0, maximizando la respuesta de
concentración de ácido láctico.
40
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. COMPOSICIÓN DEL LACTOSUERO
La caracterización del lactosuero pasteurizado tiene una composición en lactosa de
46,5%±0,02 y la desproteinización redujo el nitrógeno a 0,154±0,005%N. El pH del
suero (6,2) lo define como un suero dulce y se ajustó a 6,5 correspondiente al pH en la
fermentación. Los valores obtenidos están dentro de los rangos aceptables para suero de
leche rango (Urríbarrí 2006) y es similar al usado en otros estudios (Schepers et al.
2002; Nabi y Ardalan 2004; Panesar et al. 2007; Ustaríz, et al. 2008; Panesar et al.
2010).
4.2. FERMENTACIÓN DE LACTOSUERO
El medio con lactosa inicial (Lo) de 47,9 g L-1
alcanzo una concentración de lactosa de
6 g L-1
al final de la fermentación (Figura 3) correspondiente a una conversión a 22,23 g
L-1
de ácido láctico y una población microbiana de 7,69 logUFC mL-1
de Lactobacillus
casei. Para la concentración inicial de 55,88 g L-1
se obtuvo un consumo de 87,4% de
lactosa, 22,05 g L-1
de ácido láctico y 7,68 logUFC mL-1
del microorganismo hasta el
final de la fermentación (Figura 4).
41
Figure 3. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□), ácido
láctico () y recuento de L. casei (▲) a 47,9 g L-1
inicial de lactosa.
Figure 4. . Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□), ácido
láctico () y recuento de L. casei (▲) a 55,88 g L-1
inicial de lactosa.
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
LogU
FC/
mL
Lac
tosa
, ác
ido
lác
tico
(g.L
-1)
Tiempo (h)
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Lo
gU
FC
/ m
L
Lac
tosa
, ác
ido
lác
tico
(g.L
-1)
Tiempo (h)
42
Con 67,75 g L-1
de lactosa, se alcanzó una conversión del 84,00% y una producción de
ácido láctico de 18,69 g L-1
y 7,61 logUFC mL-1
de L. casei a las 21 horas de
fermentación (Figura 5). Plessas et al. (2008) reportaron que a concentraciones iniciales
de lactosa de 36 g L-1
y 52 g L-1
se alcanzó un azúcar residual de 8,5 g L-1
y 7,5 g L-1
utilizando L. helveticus y cuando usaron L. bulgaricus un residual de 11,5 g L-1
y 19,4 g
L-1
respectivamente. Chronopoulos et al. (2002) obtuvieron producciones de ácido
láctico de 13,1, 17,2 y 19,1 g L-1
a temperaturas de 32, 37 y 43ºC respectivamente,
utilizando 50 g L-1
de lactosa en un medio suplementado con minerales y 5 g de extracto
de levadura.
Figure 5. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□), ácido
láctico () y recuento de L. casei (▲) a 67,75 g L-1
inicial de lactosa.
En la fermentación con 79,63 g L-1
de lactosa inicial se convirtió el 79,10% con un
residual de 16,6 g L-1
de lactosa, una producción de ácido láctico 13,76 g L-1
y
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
LogU
FC/
mL
Lac
tosa
, ác
ido
lác
tico
(g.L
-1)
Tiempo (h)
43
7,62 logUFC mL-1
(Figura 6). Al igual que la concentración de lactosa anterior la
conversión fue (77,40%) la más baja para la fermentación con Lo de 87,72 g L-1
;
además, se obtuvo una concentración de ácido láctico de 16,89 g L-1
y 7,61 logUFC mL-
1 del microorganismo (Figura 7).
Figure 6. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□), ácido
láctico () y recuento de L. casei (▲) a 79,63 g L-1
inicial de lactosa.
La alta concentración inicial de lactosa causo una reducción de su conversión durante el
tiempo de fermentación y una más baja producción de ácido láctico. En cuanto al
crecimiento no hubo un efecto importante en la concentración final de Lactobacillus
casei que fue de 7,64 ±0,04 logUFC mL-1
, excepto para una concentración inicial de
lactosa de 67,75 g L-1
. En el tiempo total de las fermentaciones no se observa una fase
estacionaria y de adaptación bien definida, si una fase exponencial, con asociación de la
formación de producto al crecimiento microbiano.
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
LogU
FC/
mL
Lac
tosa
, ác
ido
lác
tico
(g.L
-1)
Tiempo (h)
44
Figure 7. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□), ácido
láctico () y recuento de L. casei (▲) a 87,72 g L-1
inicial de lactosa.
La tabla 6 muestra los tratamientos evaluados para producir ácido láctico a partir de
lactosuero y los valores medios de concentración de ácido láctico (P) y la concentración
de L. casei (N) y consumo de lactosa (%) a las 21 horas de fermentación. Estos
resultados muestran que L. casei fue capaz de producir ácido láctico al suplementar con
lactosa y sulfato de amonio. La variable sulfato de amonio tienen un efecto significativo
(p<0,05) sobre la producción de ácido láctico y la concentración de lactosa tiene un
efecto significativo (p<0,05) sobre la concentración del L. casei al final de la
fermentación (Anexo E). El tratamiento 2 y 5 presentaron la mayor producción de
ácido láctico y el 4 la menor, con una composición del medio de 5 g L-1
de sulfato de
amonio y 9,38 g L-1
de lactosa para una producción de 21,46 g L-1
de ácido láctico. La
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
LogU
FC/
mL
Lac
tosa
, ác
ido
lác
tico
(g.L
-1)
Tiempo (h)
45
producción más baja (13,76 g L-1
) de ácido láctico fue obtenida con una concentración
de 11,99 g L-1
de sulfato de amonio y 79,63 g L-1
de lactosa inicial.
Tabla 6. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero suplementado Suplemento
Tratamientos So(g L-1
) L(g L-1
) Lo (g L-1
) P (g L-1
) N (logUFC mL-1
) Consumo
Lactosa
(%)
1 2,62 1,27 47,9 17,89 ab 5,42 a 87,5
2 5 9,38 55,88 21,46 b 7,32 b 87,4
3 8,5 21,25 67,75 17,87 ab 7,61 c 84,0
4 11,99 33,13 79,63 13,76 a 7,62 c 79,1
5 14,37 41,22 87,72 20,86 b 8,39 d 77,4
Las medias con las mismas letras no difieren entre si al nivel de significancia del 5% por test de Duncan.
El crecimiento del L. casei en el cultivo estuvo directamente relacionado con la
concentración de lactosa; es decir, el mayor crecimiento de 8,39 log UFC mL-1
se
obtuvo a 87,72 g L-1
de lactosa, aunque fue la menor conversión de ésta, lo cual sugiere
una mayor predisposición del medio para el crecimiento del L. casei que para la
formación de ácido láctico. En consecuencia, los resultados obtenidos confirman el
efecto de la suplementación con sulfato de amonio y su balance con la lactosa sobre la
bioconversión a ácido láctico; tal como lo muestran los estudios cuando al suplementar
con una fuente de nitrógeno se mejoró la velocidad de bioconversión y se duplico el
ácido láctico producido (Arasaratnam et al. 1996; Nancib et al. 2005; Ohkouchi y Inoue
2006; De Lima et al. 2009).
46
4.3. MODELOS CINETICOS
4.3.1. Parámetros estequiométricos
Basado en los datos experimentales de concentración de lactosa, ácido láctico y recuento
de Lactobacillus casei los coeficientes estequiométricos fueron determinados para
formación de producto y biomasa (Tabla 7) en cada una de las concentraciones iniciales
de lactosa.
Tabla 7. Coeficientes estequiométricos Yx/s y Yp/s.
Suplemento
L(g L-1
) So(g L-1
) Lo (g L-1
) Yx/s (LogUFC g-1
) Yp/s
1,4 2,62 47,9 0,255a 0,5306a
9,38 5,0
55,88 0,218b 0,4511b
21,25 8,5 67,75 0,173c 0,3284c
33,13 11,99 79,63 0,168d 0,2781d
41,22 14,37
87,72 0,156e 0,2488e
El rendimiento de producto por sustrato (Yp/s) decrece con el aumento de la
concentración de lactosa. Mirdamadi et al. (2008) reportaron rendimientos de 0,47 a
0,33 (g ácido láctico / g lactosa) cuando suplementaron con glucosa, Plessas et al. (2008)
reportaron 0,15 y 0,23 en lactosuero diluido (36 g L-1
) y no diluido (52 g L-1
)
respectivamente, usando L. helveticus. Aguirre et, al. (2009) reportaron rendimientos
Yx/s de 0,36 LogUFC g-1
de L. casei y Yp/s de 0,52 g g-1
en suero de leche de cabra en
un cultivo batch con un consumo de lactosa de 28,36 g L-1
después de 40 h de
fermentación. Los resultados muestran la asociación existente entre la producción de
biomasa y de ácido láctico; además, de que altas concentraciones de lactosa no
favorecen directamente el crecimiento microbiano o la formación de producto.
47
4.3.2. Parámetros cinéticos.
La velocidad de formación de ácido láctico está directamente relacionada a la velocidad
de crecimiento, comportamiento característico de un metabolito primario de formación
asociada al crecimiento, definida por los parámetros α y β del modelo Luedeking-Piret.
El valor α es el parámetro asociado al crecimiento del microorganismo en la etapa
exponencial calculándose mediante los datos experimentales de ácido láctico y UFC
mL-1 del Lactobacillus casei correspondiente a:
Los resultados muestran que no es función de la concentración inicial de lactosa (Tabla
8) y hay un ajuste a los parámetros α (g ácido láctico UFC-1
) y β (g ácido láctico UFC-1
h-1
).
Tabla 8. Parámetros cinético α de formación de ácido láctico.
Modelo Básico Modelo Luedeking-Piret
So α SSE R2 α SSE R2
47,9 2,075 0,561 0,973 2,075 0,759 0,168 0,902
55,88 2,075 0,683 0,968 2,075 0,759 0,100 0,962 67,75 2,075 0,242 0,985 2,075 0,758 0,019 0,794
79,63 2,075 0,225 0,985 2,075 0,759 0,002 0,929
87,72 2,075 0,331 0,981 2,075 0,759 0,051 0,918
Quedando:
La formación de ácido láctico es descrita por la cinética de Luedeking-Piret asociado y
no asociado al crecimiento del Lactobacillus casei en el rango de concentraciones
evaluado.
La velocidad específica máxima de crecimiento (μmax) fue determinada ajustando los
modelos de crecimiento en cada concentración inicial de lactosa, basados en la
48
aplicación de la ecuación en fase exponencial, Monod, Monod con Inhibición, Modelo
Logístico, Mosser, Tessier y los modelos de Gompertz, Logistico modificado y Baranyi
integrado.
Los modelos aplicables en la fase logarítmica consideran que la velocidad de
crecimiento específica es constante y los efectos inhibitorios por concentración de
sustrato o producto no juegan un papel importante. El modelo en la fase exponencial
que relaciona la concentración de microorganismo con el tiempo tiene un buen ajuste en
esta fase a las diferentes Lo (Tabla 9); sin embargo, el modelo es solo función del
tiempo, no revela el comportamiento durante todas las fases de crecimiento y los efectos
de otros factores.
Tabla 9. Parámetros cinético fase exponencial.
Lo μmax(h-1
) td (h) SSE R2
47,900 0,057 12,124 0,081 0,957
55,880 0,049 14,079 0,083 0,972
67,750 0,074 9,362 0,001 0,995
79,630 0,033 20,956 0,145 0,755
87,720 0,027 25,500 0,269 0,757
El modelo de Monod se aplicó considerando que el rango de concentración inicial de
lactosa era el único factor limitante del crecimiento y no hay efecto toxico de la
formación del ácido láctico dado el ajuste de pH a 6,5. La ecuación de Monod no
presentó ajustes individuales satisfactorios (rango de SSE 0,08 a 0,15) para cada
condición inicial de sustrato; por lo tanto, no permitió obtener una buena representación
de los datos de crecimiento (Anexo F).
49
Los modelos con inhibición, Mosser y Tessier basados en Monod dan buen ajuste (SSE
0,015 a 0,052), excepto a 79,63 g L-1
cuyo SSE de 0,008 en el modelo de Mosser
mostro el mejor ajuste (Anexo F). El crecimiento del microorganismo está gobernado
por una relación hiperbólica y hay un límite a la máxima concentración celular
alcanzable; sin embargo, los modelos de Monod y los basados en éste solo representan
una relación exponencial y no describen las fases de crecimiento durante las 21 horas de
fermentación. Los modelos logístico, logístico modificado, Gompertz y Baranyi
pretenden describir tal cinética de crecimiento representan las fases lag, exponencial y
estacionaria.
Usualmente, la curva de crecimiento es de naturaleza sigmoidal y por ende el modelo
debe ajustarse a esta forma (Van Boekel, 2009). El modelo logístico describe
apropiadamente este comportamiento basándose en la proporcionalidad de la velocidad
de crecimiento al tamaño de la población microbiana y a los recursos disponibles para la
población existente. Desde el punto de vista del ajuste a los datos experimentales la
función logística arrojo valores menores de SSE a los modelos previos con Lo de 79,63
g L-1
y 87,72 g L-1
(SSE < 0,008). Para las otras concentraciones (47,9 g L-1
, 55,88 g
L-1
, 67,75 g L-1
) el ajuste no fue mejor.
El modelo logístico modificado es una reparametrización a parámetros microbianos de
fácil interpretación como son μmax, λ y As; al igual que los modelos de Gompertz y
Baranyi. Cuando se representa el crecimiento microbiano como el logaritmo del tamaño
50
de la población (ln(N/No)) versus el tiempo, el parámetro λ representa el tiempo lag,
periodo después del cual la fase exponencial se caracteriza por la velocidad máxima de
crecimiento μmax, parámetro común a los anteriores modelos. Cuando aparece la fase
estacionaria el valor de la asíntota del parámetro As es alcanzado (ln(Nmax/No)).
El uso de estos modelos es más ventajoso que los anteriores modelos aplicados. Sin
embargo, hay una buena predicción entre los datos simulados del modelo y los
experimentales en los modelos logístico modificado y Gompertz durante las 21 horas de
fermentación, pero no en Baranyi. Los resultados de la simulación se representan en
Figuras 8 a 12.
Figure 8. Cinética de la fermentación con 47,9 g L-1
inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico modificado (∆).
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
LnN
/No
Tiempo (h)
51
Figure 9. Cinética de la fermentación con 55,88 g L-1
inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico modificado (∆).
Figure 10. Cinética de la fermentación con 67,75 g L-1
inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico modificado (∆).
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Ln N
/No
Tiempo (h)
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
LnN
/No
Tiempo(h)
52
Figure 11. Cinética de la fermentación con 79,63 g L
-1 inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico modificado (∆).
Figura 12. Cinética de la fermentación con 87,72 g L
-1 inicial de sustrato para los datos
experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico modificado (∆).
Cabe destacar que la reparametrización de los datos experimentales (ln(N/No)) permite
observar que se presenta una fase lag bien definida a 67,75 g L-1
y en menor grado a
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
LnN
/No
Tiempo (h)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Ln N
/No
Tiempo (h)
53
87,72 g L-1
, en las otras concentraciones no se presenta. En el caso de la fase
estacionaria (asíntota superior) solo a 67,75 g L-1
no se presenta (Figura 10).
Los modelos empíricos de Gompertz y modificado Logístico describen mejor los datos
experimentales que el modelo de Baranyi integrado, el cual incluye un enfoque más
mecanistico presentando la fase exponencial característica y una fase lag determinada
por la función de ajuste (A(t)), por lo que describe mejor el comportamiento cuando So
es igual a 67,75 g L-1
y 87,72 g L-1
.
Se describen bien los datos experimentales, siendo Gompertz y Logístico modificado los
que mejor ajuste presentaron (Tabla 10) para las fermentaciones, arrojando velocidades
específicas de crecimiento máximas (μmax) similares y tiempos lag (λ) diferentes.
Baranyi arroja μmax inferiores.
Tabla 10. Parámetros de los modelos.
So Modelo μmax(h-1
) As λ(h) SSE Bf
47,90 Gompertz 0,267 3,532 0,073 0,031 0,999
Logístico modificado 0,265 0,279 0,279 0,061 1,000
Baranyi integrado 0,406
0,732 1,488 0,977
55,880 Gompertz 0,269 3,487 -0,010 0,047 0,999
Logístico modificado 0,267 3,339 0,172 0,073 1,000
Baranyi integrado 0,413
-5,121 1,452 0,982
67,750 Gompertz 0,124 1,807 2,275 0,031 0,998
Logístico modificado 0,131 1,667 2,851 0,031 1,000
Baranyi integrado 0,277
-7,257 0,230 0,996
79,630 Gompertz 0,263 3,336 0,559 0,009 1,000
Logístico modificado 0,261 3,194 0,767 0,094 1,001
Baranyi integrado 0,391
-5,446 1,124 0,990
87,720 Gompertz 0,306 3,268 1,801 0,066 1,000
Logístico modificado 0,308 3,146 2,082 0,242 1,001
Baranyi integrado 0,369
-5,964 0,588 0,990
54
La medida cuantitativa (Bf) para el desempeño de los modelos Gompertz y Logístico
modificado y Baranyi están dentro del rango (0,9 – 1,05) interpretado como un buen
ajuste (Mellefont et al. 2003).
Los parámetros cinéticos max, YP/S, YX/S, α y β son dados en la tabla 11. Para los
coeficientes estequiométricos Yp/s y Yx/s se tomó el rango obtenido de las cinco
fermentaciones. Con respecto a μmax es común a las So excepto a 67.75 g L-1
que fue de
0,125 h-1
, tomada de los modelos que mejor describieron el comportamiento del L. casei.
Tabla 11. Parámetros cinéticos.
Parámetros Valor experimental
μmax (h-1
) 0,26
YP/S (g ácido láctico /g lactosa) 0,5306 - 0,2488
YX/S (Log UFC /g lactosa) 0,255 - 0,156
α (g ácido láctico UFC-1
) 2,075
β (g ácido láctico (UFC h)-1
) 0,759
Estos parámetros cinéticos concuerdan con los reportados por la literatura (Anexo G) y
Altiok (2004) cuando evaluó la producción de ácido láctico en lactosuero suplementando
con lactosa (9 a 95 g L-1
) alcanzando coeficientes YP/S y α superiores y β inferior
comparado con los reportados en este estudio.
55
4.4. PRODUCTIVIDAD DE LA FERMENTACIÓN
La productividad fue calculada con los datos experimentales a las 21 horas de la
fermentación (Pr) y graficada con respecto a So (Figura 13) y en la fase exponencial
(Prexp) de las 4 a las 12 horas de fermentación (8horas).
Figura 13. Productividad de ácido láctico a las 8h(□) y 21h (♦) de fermentación.
Se observa que la productividad se mantiene constante a cierta concentración inicial de
sustrato y se puede asociar al consumo de sustrato de 87% en 47,9 y 55,88 g L-1
; de
84%, 79% y 77% para 67,75, 79,63 y 87,72 g L-1
respectivamente.
La suplementación con una fuente de nitrógeno (extracto de levadura, peptona o licor de
maíz (CSL) mejora la productividad con respecto al lactosuero no suplementado (Tabla
12). En este estudio al suplementar con sulfato de amonio de 2,62 a 14,37 g L-1
se
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
40 50 60 70 80 90
Pr
exp
(g L
-1 h
-1)
Pro
duct
ivid
ad (
g L
-1 h
-1)
Lactosa inicial (g L-1 )
56
alcanzaron productividades de 0,8 a 1,1 g L-1
h-1
resultando buenas considerando el alto
costo que representa el extracto de levadura en la producción industrial.
Tabla 12. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero.
Lactosuero Microorganismo Suplemento Condiciones
Ác.
Láctico
g L-1
Pr
g L-1 h-1
Sistem
a Fuente
50 g L-1 lactosa Lactobacillus sp E.L. 35°C, pH6,5,
250 rpm,22 h 18,7-33,4 NR B, C
Zayed y Winter,
1995
Desproteinizado Lb. lactis y casei 48 h 41 NR B Roukas y Kotzekidon,1991
Desproteinizado
(100 g L-1) Lb. lactis y casei NR 46 NR B
Roukas y
Kotzekidon, 1998
Lactosuero Lb. helveticus R211
E.L. NR 66 1,4 B A.W. Schepers et al., 2002
Lactosuero Lb. casei
NRRL B-441 46 4,0 B
A.O. Büyükkilci,
2004
Desproteinizado Lb. helveticus
ATCC 8018
20 g L-1
E.L.;10 g L-1
peptona
tripsica de
caseína
pH 5,9, 40°C,
100 rpm, 7 h
13,02;
2,17 B
Lauris Urribarrí
et al., 2004
Lactosuero
Lactobacillus
casei subsp. casei ATCC 39392
CSL, Glucose
(80 g L-1)
42ºC, 180
rpm, pH 4.8-5
0.375FC
0.625 y 0.425 IC
B Mirdamadi et al.
2008
Diluido 36 g L-1 helveticus y
bulgaricus
37ºC,
150rpm, pH inicial 6,6
4,1 y 3,9 4,1 y 3,8
g.l.dia-1 B
Plessas et al.
2008
52 g L-1 lactosa helveticus y bulgaricus
37ºC,
150rpm, pH
inicial 6,6
10,1 y 9,6 5,1 y 4,8 g.l.dia-1
B Plessas et al. 2008
E.L. Extracto de Levadura; CSL: Corn Steep Licuor; B: Batch; F-B: Fed Batch; C: Continuo; FC: células libres; IC: células inmovilizadas
4.5. OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO
La metodología de superficie de respuesta fue usada para determinar la concentración
óptima de lactosa y sulfato de amonio para maximizar la producción de ácido láctico. El
efecto de las dos variables anteriores y su interacción ha sido determinado usando un
diseño central compuesto.
57
El analisis de varianza para la concentración de ácido láctico se presenta en la tabla 13.
La superficie de respuesta lineal, interaccion de 2 factores (2FI) y el modelo cúbico son
significativos(P<0,05), no lo es el cuadratico. La falta de ajuste de los modelos lineal,
2FI es significativa (Anexo H) y no significativa para el modelo cúbico (P>0,05).
Tabla 13. Análisis de varianza para ácido láctico.
FV SC GL CM F P> F
Media 6702,57284 1 6702,57284
Lineal 118,473907 2 59,2369534 5,73981032 0.0118
2FI 56,3463341 1 56,3463341 7,401372 0.0145
Cuadrático 31,7024498 2 15,8512249 2,43321367 0.1216
Cubico 94,04202 2 47,02101 166,295905 < 0.0001
Residual 3,6758159 13 0,28275507
Total 7006,81336 21 333,657779
El ajuste del modelo cubico fue evaluado por medio del coeficiente de regresión (R2) y
la significancia de los coeficientes (Tabla 14). En este caso el valor del R2
ajustado
(0,981) indica que el modelo explica el 98,1% de la variabilidad en la concentración de
ácido láctico y demuestra el ajuste de las observaciones experimentales con los valores
predichos. Esta correlación es validada por la gráfica de valores predichos versus
observados, cuando todos los puntos se arreglan alrededor de la línea diagonal (Anexo
F), lo cual significa que no se encontraron violaciones significativas del modelo.
Estos resultados muestran que el modelo elegido explica satisfactoriamente el efecto de
la concentración inicial de sustrato y sulfato de amonio en la producción de ácido láctico
por Lactobacillus casei ATCC 393.
58
Tabla 14. Estimación de los coeficientes de regresión cúbica
FV SC DF CM F Pr> F
Modelo 300,564711 7 42,9378158 151,855158 < 0.0001
A 0,125 1 0,125 0,44207872 0.5177
B 4,41045 1 4,41045 15,5981288 0.0017
A2 29,4120117 1 29,4120117 104,019397 < 0.0001
B2 0,09255881 1 0,09255881 0,32734626 0.5770
AB 56,3463341 1 56,3463341 199,276123 < 0.0001
A2B 86,1186832 1 86,1186832 304,5699 < 0.0001
AB2 7,92333684 1 7,92333684 28,0219091 0.0001
A3
7,92 1 7,92 28,02 0,0001
B3
86,12 1 86,12 304,57 < 0.0001
Residual 3,6758159 13 0,28275507
Falta de ajuste 0,0188611 1 0,0188611 0,06189117 0.8077
Error 3,6569548 12 0,30474623
Total 304,240527 20
A: (g.l-1) lactosa; B: (g.l-1) sulfato de amonio.
El siguiente modelo fue ajustado para la concentración de acido láctico:
El efecto de los variables independientes y su interacción en la formación de ácido
láctico es ilustrado en el análisis de superficie de respuesta (Figura 14) a partir de la
ecuación. Para altas concentraciones de sulfato, hay una reducción de la respuesta,
debido al exceso de nitrógeno en el medio de fermentación. Los Lactobacillus tienen
requerimientos nutricionales complejos y la síntesis de ácido láctico es asociada al
crecimiento microbiano. Además, no hay formación de producto si el medio no tiene la
adecuada concentración de nitrógeno. Por otro lado, las altas concentraciones de
59
nitrógeno pueden conducir a la muerte celular e inhibir por ende la formación de
producto (De lima et al. 2009).
Figura 14. Superficie de respuesta representando el efecto de la concentración de
lactosa y sulfato de amonio sobre la producción de ácido láctico.
Se determinaron los valores óptimos de los factores por medio de Design-Expert 6.0
basado en la optimización numérica sobre una función objetivo llamada Deseabilidad
(D). Cuando se evaluaron los factores en el rango experimental y las respuesta en las
condiciones de frontera se establecen 10 posibles soluciones, donde la concentración
mayor de ácido láctico (21.9 g L-1
) corresponden a 19,57 g L-1
de lactosa y 6.65 g L-1
de
Áci
do
lác
tico
(g
L-1
)
Sulfato de
Amonio (g L-1
)
Lactosa (g L-1
)
60
sulfato de amonio con una D de 1.0; al minimizar la concentración de biomasa
(7.36LogUFC L-1
) el medio optimo es 9,38 g L-1
lactosa y 5,0 g L-1
de sulfato de amonio
para producir 22.07 g L-1
de ácido láctico (D=0,63). La combinación de 17,69 g L-1
de
lactosa y 6,34g l-1 de sulfato de amonio, maximizando la concentración de biomasa
(7,81LogUFC L-1
) y ácido láctico (22,05 g L-1
) arrojan una D igual a 0,907; de igual
forma, cuando se maximiza la concentración de ácido láctico y no se considera biomasa,
la respuesta optima es 20,07 g L-1
de lactosa, 5,25 g L-1
de sulfato de amonio y una D
de 1,0. Las óptimas para maximizar biomasa (7,54LogUFC L-1
) y minimizar ácido
láctico (17,07 g L-1
) son de 11,03 g L-1
sulfato de amonio y 33,12 g L-1
de lactosa con
una D de 0,523.
La fermentación de lactosuero por Lactobacillus casei ATCC 393 suplementando con
lactosa y sulfato de amonio como fuentes de carbono y nitrógeno respectivamente arrojo
una significativa producción de ácido (L+)láctico (21.5 a 23,08 g L-1
) en 21 h de
fermentación. Teniendo en cuenta que las Lactobacillus tienen requerimientos
nutricionales complejos y que la síntesis de ácido láctico está asociada al crecimiento
microbiano, no hay formación de producto si el medio no tiene la adecuada
concentración de nitrógeno. Por otro lado, las altas concentraciones de nitrógeno pueden
conducir a la muerte celular e inhibir por ende la formación de producto (De Lima et al.
2009). Los resultados de este estudio mostraron que altas concentraciones de nitrógeno
no favorecieron la producción de biomasa y ácido láctico y que se requirió suplementar
mas con la fuente de nitrógeno (5 a 6,34 g L-1
) que con la fuente de carbono (9,38 a
20,07 g L-1
) con respecto a la composición inicial del lactosuero (46,5%±0,02 de lactosa
61
y 0,154±0,005% N) para maximizar la producción de ácido láctico, esto muestra la
dependencia de la síntesis de ácido láctico al crecimiento del Lactobacillus casei.
Utilizando otras fuentes de nitrógeno suplementando el medio con 100 g L-1
de glucosa,
licor de maiz (CSL) 40 g L-1
y extracto levadura (EL) 5 g L-1
(Korbekandi et al. 2007)
para maximizar a 21,55 g L-1
el ácido láctico producido; con EL, CSL y glucosa de
0,697%, 1,708% y 2,215% respectiviamente y una productividad de 0,697 g L-1
h-1
en
24 h de fermentación (Mi-Young et al. 2003); con 60 g L-1
CSL en 36 h de fermentación
produjeron 48,6 g L-1
de ácido lactico (Wee et al. 2006); con 5 g L-1
de CSL, 3,6 g L-1
de
EL y 10 g L-1
de peptona obtuvieron un maximo de 58,9 g L-1
de ácido lactico ( Bustos et
al. 2004); utilizando la metodologia de superficie de respuesta determinaron las
maximas concentraciones formulando melaza de caña de azucar 100 g L-1
, 20 g L-1
de
EL y 4 g L-1
de peptona como el mejor medio para producir ácido láctico (Hauly et al.
2003), reportando que los incrementos en melaza y CSL proveen una mayor producción
de ácido en un menor tiempo de fermentación (Yu et al. 2007). La principal fuente de
nitrogeno usada en la producción de ácido láctico es EL por ser una excelente fuente de
complejo B y factores requeridos por las Lactobacillus para obtener una rapida
velocidad de crecimiento y producción; sin embargo, el alto costo de EL es un factor
negativo cuendo se usa a nivel industrial (Hurok et al. 2005). Al evaluar la influencia
de fuentes alternativas de nitrógeno reemplazando peptona y EL por Lenteja rojo y
levadura de panadería lograron incrementar un 40% la producción de ácido láctico
usando almidón como fuente de carbono (Altaf et al. 2007). El sulfato de amonio es una
fuente pura de nitrogeno que no ofrece los complementos asociados al EL; sin embargo,
62
se obtuvieron resultados importantes considerando el tiempo de fermentación y el uso de
otras fuentes de nitrogeno con respecto a los estudios anteriormente citados.
Estos resultados muestran que el modelo elegido explica satisfactoriamente el efecto de
suplementar con lactosa y sulfato de amonio en la producción de ácido láctico por
Lactobacillus casei ATCC 393 y la importancia de formular medios con fuentes de
carbono y nitrogeno balanceadas. Los resultados a partir de la deseabilidad indican que
las condiciones optimas del medio son deseables para producir ácido láctico más que
Lactobacillus casei; aunque, es importante la asociación entre crecimiento y formación
de producto.
63
5. CONCLUSIONES
El lactosuero es una materia prima favorable para producir ácido láctico mediante el
proceso de fermentación por lactobacillus casei a las condiciones de 37°C y pH 6,5.
El L. casei creció con un alto rendimiento en ácido láctico, que se redujo al
incrementarse la concentración inicial de lactosa (fuente de carbono) y de sulfato de
amonio (fuente de nitrógeno) en el medio; de tal forma, que el lactosuero requiere una
mayor suplementación con fuentes de nitrógeno que de carbono.
Los modelos cinéticos basados en Monod no logran describir las etapas de crecimiento
del L. casei y no se ajustan tanto como los modelos reparametrizados Logístico,
Gompertz y Baranyi. Las ecuaciones logística modificada y Gompertz son las que
mejor ajuste tienen para describir las etapas lag, exponencial y estacionaria del L. casei
en los medios suplementados con lactosa y sulfato de amonio. Para la formación de
producto el modelo de Luedeking y Piret asociado y no asociado al crecimiento se ajusto
apropiadamente a los datos experimentales.
64
Los parámetros cinéticos de crecimiento (µmax de 0.26 h-1
) y de formación de producto
(α de 2,075 g ácido láctico UFC-1
y de 0,759 g ácido láctico (UFC h)-1
) de la
fermentación del lactosuero suplementado con lactosa y sulfato de amonio inicial
representan la asociación de la producción de ácido láctico al crecimiento del L.casei
más que a la masa total de éste.
El modelo elegido explica satisfactoriamente el efecto de suplementar con lactosa y
sulfato de amonio en la producción de ácido láctico por Lactobacillus casei ATCC 393
y la importancia de formular medios con fuentes de carbono y nitrogeno balanceadas.
Los resultados a partir de la deseabilidad indican que las condiciones optimas del medio
son deseables para producir ácido láctico más que Lactobacillus casei; aunque, es
importante la asociación entre crecimiento y formación de producto.
65
6. RECOMENDACIONES
Complementar el estudio suplementando con fuente de minerales específicos como
Magnesio y Fosforo para optimizar un medio más completo en cuanto a requerimientos
nutricionales y desarrollar modelos estructurados complementarios.
Estudiar la cinética de fermentación y suplementación del lactosuero direccionada a la
producción de biomasa del L. casei, reconocido como un microorganismo probiótico.
Escalar la producción de ácido láctico y asociarlo a métodos de purificación económicos
que faciliten la implementación de este proceso biotecnológico y aprovechar la oferta de
lactosuero y otros fuentes disponibles de nutrientes.
66
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74
Anexo A. ATCC catálogo.
Tabla 15. Especificadores del Lactobacillus casei ATCC 393
ATCC
® Number: 393™
Organism: Lactobacillus casei (Orla-Jensen) Hansen and Lessel
deposited as Lactobacillus casei subsp. casei (Orla-Jensen)
Hansen and Lessel
Designations: 03 [7, IAM 12473, Orland L-323, R.P. Tittsler 303]
Isolation: dairy products (cheese)
Depositor: GJ Hucker
Biosafety Level: 1
Shipped: freeze-dried
Growth
Conditions:
ATCC medium416: Lactobacilli MRS broth
Temperature: 37.0°C
Permits/Forms: In addition to the MTA mentioned above, other ATCC
and/or regulatory permits may be required for the transfer of
this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is
ultimately responsible for obtaining the permits. Please click
here for information regarding the specific requirements for
shipment to your location.
References: Nucleotide (GenBank) : AF129168 Lactobacillus casei
sorbose operon, partial sequence.
Nucleotide (GenBank) : Z75478 L.casei rrn operon, 16S-
23S rRNA spacer (long), tRNA-Ile and tRNA-Ala genes.
Nucleotide (GenBank) : Z80834 L.casei lacT gene.
75
Anexo B. Curvas de calibración
Figura B.1. Curva de calibración lactosa
Figura BA.2. Curva de calibración microorganismo
y = 0,0006x R² = 0,9916
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 200 400 600 800
Ab
sorb
anci
a
Lactosa (ppm)
y = 466,4x + 36,754 R² = 0,9868
0
50
100
150
200
250
300
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
UFC
/ml
DO
76
Anexo C. Modelos cinéticos.
Tabla 16. Modelos cinéticos basados en Monod
Referencia Modelo Cinético biomasa
Monod sK
s
S
max
Teissier Ks/s
max e1
Moser n
S
n
maxsK
s
Referencia Modelo Cinético consumo sustrato
Moser y Steiner
Monod X
Xcresc
Y
r
dt
dS
Hanson y Tsao
Aborhey y
Williamson mX
dt
dP
Y
1
dt
dX
Y
1
dt
dS
PX
Referencia Modelo Cinético Producto
Gaden
xkr
xsK
sqr rYr
Y
YY com Yqou rYr
PP
S
maxPPSS/PP
S/X
S/P
P/XX/PPxX/PP
Luedecking-Piret Xdt
dX
dt
dP
Giona et al 2L1P kkq
Gaden pX/PP kYq
sx
X
sm
Y
1
77
Tabla 17. Modelos no basados en Monod
Logistico
Gompertz
Logistico modificado
Modelo de Baranyi integrado
78
Anexo D. Combinación de tratamientos DCC
Tabla 18. Niveles experimentales de las variables independientes.
Variable
independiente
Niveles
-α -1 0 +1 +α
Lactosa (L) 1,28 9,38 21,25 33,13 41,22
Sulfato de
Amonio (SA) 2,62 5 8,5 11,99 14,37
Tabla 19. Matriz del diseño Central Compuesto
Lactosa Inicial (g.l-
1)
Sulfato amonio (g.l-1)
Ácido Láctico (g.l-
1)
Biomasa (logUFC.l-1)
33,13 11,99 9,38 5,00 21,25 14,37 41,22 8,50 33,13 11,99 9,38 11,99 33,13 11,99 9,38 11,99 21,25 8,50 33,13 5,00 21,25 8,50 21,25 8,50 1,28 8,50 21,25 8,50 33,13 5,00 21,25 2,62 33,13 5,00 9,38 5,00 21,25 8,50 9,38 5,00 9,38 11,99
79
Anexo E. Análisis estadístico Diseño factorial
Análisis de Varianza para Ácido Láctico - Suma de Cuadrados Tipo III
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
SulAmonio 96,198 1 96,198 9,87 0,0067
EFECTOS PRINCIPALES
A:Lactosa 61,8576 4 15,4644 1,59 0,2290
RESIDUOS 146,188 15 9,74586
TOTAL (CORREGIDO) 304,241 20
Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Lactosa
Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Lactosa Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
1,27 1 14,5522 3,12184 X
41,22 1 15,0522 3,12184 X
9,38 6 16,0257 1,27448 X
21,25 7 19,1783 1,17994 X
33,13 6 19,1942 1,27448 X
Análisis de Varianza para Aclactico - Suma de Cuadrados Tipo III
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
Lactosa 22,3233 1 22,3233 3,55 0,0791
EFECTOS PRINCIPALES
A:SulAmonio 187,61 4 46,9024 7,46 0,0016
RESIDUOS 94,3104 15 6,28736
TOTAL (CORREGIDO) 304,241 20
Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Sulfato de Amonio
Método: 95,0 porcentaje Duncan
SulAmonio Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
11,99 6 13,7609 1,02367 X
8,5 7 17,8702 0,947731 XX
2,62 1 17,8902 2,50746 XX
14,37 1 20,8602 2,50746 X
5 6 21,4608 1,02367 X
Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Sulfato de Amonio
Método: 95,0 porcentaje Duncan
SulAmonio Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
11,99 6 13,7609 1,02367 X
8,5 7 17,8702 0,947731 XX
2,62 1 17,8902 2,50746 XX
14,37 1 20,8602 2,50746 X
5 6 21,4608 1,02367 X
80
Contraste Sig. Diferencia
2,62 - 5 -3,57053
2,62 - 8,5 0,0200076
2,62 - 11,99 4,12931
2,62 - 14,37 -2,97
5 - 8,5 3,59053
5 - 11,99 * 7,69983
5 - 14,37 0,600527
8,5 - 11,99 4,1093
8,5 - 14,37 -2,99001
11,99 - 14,37 * -7,09931
* indica una diferencia significativa.
Análisis de Varianza para Biomasa - Suma de Cuadrados Tipo III
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
COVARIABLES
SulAmonio 0,00560539 1 0,00560539 0,09 0,7660
EFECTOS PRINCIPALES
A:Lactosa 5,44516 4 1,36129 22,30 0,0000
RESIDUOS 0,915633 15 0,0610422
TOTAL (CORREGIDO) 6,36638 20
Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
Pruebas de Múltiple Rangos para Biomasa por Lactosa
Método: 95,0 porcentaje LSD
Lactosa Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
1,27 1 5,42998 0,247067 X
9,38 6 7,32334 0,100865 X
21,25 7 7,6157 0,0933826 X
33,13 6 7,62334 0,100865 X
41,22 1 8,39998 0,247067 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
1,27 - 9,38 * -1,89336 0,475361
1,27 - 21,25 * -2,18572 0,65289
1,27 - 33,13 * -2,19336 0,645765
1,27 - 41,22 * -2,97 0,65289
9,38 - 21,25 * -0,292363 0,237654
9,38 - 33,13 * -0,3 0,229187
9,38 - 41,22 * -1,07664 0,237654
21,25 - 33,13 -0,00763726 0,29298
21,25 - 41,22 * -0,784278 0,30404
33,13 - 41,22 * -0,776641 0,29298
* indica una diferencia significativa.
81
Anexo F. Ajustes de modelos.
Tabla 20. Ajuste de modelos cinéticos
Inhibición Tratamiento So Umaxh-1 Ks Ki SSE
T-α 47,900 55,614 10169,012 1583,355 0,022 T-1 55,880 56,722 10169,004 1583,355 0,046 T0 67,750 22,500 10169,033 1,212 0,052 T+1 79,630 31,661 10169,131 1583,355 0,014 T+α 87,720 29,275 10169,139 1583,355 0,025
Tessier Tratamiento So Umaxh-1 Ks SSE
T-α 47,900 39221858,677 5990948670,027 0,027 T-1 55,880 7711404,596 1408040879,396 0,043 T0 67,750 0,200 86,271 0,057 T+1 79,630 11247654,691 2981743508,243 0,037
T+α 87,720 9788955,503 3220116259,528 0,026
Mosser Tratamiento So Umaxh-1 Ks lamda SSE
T-α 47,900 0,798 1056,416 1,636 0,018 T-1 55,880 0,893 1056,416 1,531 0,023
T0 67,750 0,097 359224838,34
3 6,388 0,043 T+1 79,630 0,822 1056,417 1,406 0,008 T+α 87,720 20230,449 35971328,231 1,402 0,010
Logístico Tratamiento So Umaxh-1 SSE
T-α 47,900 0,122 0,114 T-1 55,880 0,291 0,021 T0 67,750 0,162 0,069 T+1 79,630 0,291 0,005 T+α 87,720 0,320 0,008
82
Anexo G. Parámetros cinéticos reportados de estudios previos.
Tabla 21. Parámetros cinéticos en estudios previos
Referencia μmax Ks α β ms Yx/s Yp/s
Schepers et al. (2002) L. helveticus 0,7 0,22 - - - - -
Amrane and Prigent (1997) L. helveticus 0,76 - 2,69 0,71 - - -
Kulozik and Wilde (1999) L. helveticus - - 4,26 0,5 - - -
Boonmee et al. (2003) Lactococcus
lactis
1.1 1.32 0.932 3.02 - - 0.93
Biazar et al. (2003) L. helveticus 0,25 0,9 4,6 0,23 2,65 0,064 0,61
Kwon et al. (2001) L. rhamnosus 0,633 0.3 6,6 0,33 - 1 1
Amrane (2001) L. helveticus 0,49 -
2,56 0,76 - - 0,84
Schepers et al. (2002) L. helveticus 0,82 0,22 4,5 1,62 - - 0,95
Messens et al. (2002) L. curvatus - - - - - 0,23 1
Tango and Ghaly (1999) L. helveticus 0,21 - - - - 0,08 0,71
Luedeking and Piret (1959) L. helveticus - - 2,2 0,55 - - -
Akarberg et al. (1998) Lactococcus
lactis
0,403 0,79 13,2 0,064 - - -
Monteagudo et al. (1997) L. delbrueckii 0,831 - 0,235 0,087 - 0,27 0,91
Dutta et al. (1996) L. delbrueckii 0,069 0,096 0,385 0,003 0,00
014
- -
Fu and Mathews (1999) L. plantarum 0,364 44,4 - - - - 1,02
Fuente: Altiok 2004
83
Anexo H. Evaluación estadística del Diseño Central Compuesto.
Falta de ajuste de los modelos
Sum of
Mean F
Source Squares DF Square Value Prob > F Linear 182,109665 6 30,3516108 99,5963445 < 0.0001 2FI 125,763331 5 25,1526662 82,5364301 < 0.0001 Quadratic 94,0608811 3 31,353627 102,884379 < 0.0001 Cubic 0,0188611 1 0,0188611 0,06189117 0.8077 Pure Error 3,6569548 12 0,30474623
Ajuste R2
Std.
Adjusted Predicted
Source Dev. R-Squared R-Squared R-Squared PRESS Linear 3,21253292 0,3894087 0,32156522 0,09480579 275,396762 2FI 2,75915893 0,57461195 0,49954347 0,3241894 205,608973
Quadratic 2,55235624 0,67881387 0,57175183 -
0,11189482 338,283465 Cubic 0,53174719 0,98791806 0,9814124 0,97993449 6,10474169
Modelo lineal
Sum of
Mean F
Source Squares DF Square Value Prob > F Model 118,473907 2 59,2369534 5,73981032 0.0118 A 22,3198399 1 22,3198399 2,16269811 0.1587 B 96,1540669 1 96,1540669 9,31692252 0.0069 Residual 185,76662 18 10,3203678
Lack of Fit 182,109665 6 30,3516108 99,5963445 < 0.0001 Pure Error 3,6569548 12 0,30474623
Cor Total 304,240527 20
Modelo 2FI
Sum of
Mean F
Source Squares DF Square Value Prob > F Model 174,820241 3 58,2734136 7,65450351 0.0019 A 22,3198399 1 22,3198399 2,93182229 0.1050 B 96,1540669 1 96,1540669 12,6303162 0.0024 AB 56,3463341 1 56,3463341 7,401372 0.0145 Residual 129,420286 17 7,61295799
Lack of Fit 125,763331 5 25,1526662 82,5364301 < 0.0001 Pure Error 3,6569548 12 0,30474623
Cor Total 304,240527 20
84
Modelo cubico modificado
Sum of
Mean F
Source Squares DF Square Value Prob > F Model 300,564711 7 42,9378158 151,855158 < 0.0001 A 0,125 1 0,125 0,44207872 0.5177 B 4,41045 1 4,41045 15,5981288 0.0017 A2 29,4120117 1 29,4120117 104,019397 < 0.0001 B2 0,09255881 1 0,09255881 0,32734626 0.5770 AB 56,3463341 1 56,3463341 199,276123 < 0.0001 A2B 86,1186832 1 86,1186832 304,5699 < 0.0001
AB2 7,92333684 1 7,92333684 28,0219091 0.0001 Residual 3,6758159 13 0,28275507
Lack of Fit 0,0188611 1 0,0188611 0,06189117 0.8077 Pure Error 3,6569548 12 0,30474623
Cor Total 304,240527 20
Diagnóstico del modelo
DESIGN-EXPERT Plot
Ac.lactico
Studentized Residuals
Norm
al % pr
obabili
ty
Normal plot of residuals
-0.92 0.20 1.32 2.44 3.56
1
5
10
20
30
50
70
80
90
95
99
85
Grafica de predichos versus observados
DESIGN-EXPERT Plot
Ac.lactico22
22
22
Actual
Pred
icte
d
Predicted vs. Actual
9.88
12.93
15.97
19.02
22.07
9.88 12.93 15.97 19.02 22.07
DESIGN-EXPERT Plot
Ac.lactico
Lambda
Current = 1
Best = 0.81
Low C.I. = 0.01
High C.I. = 1.78
Recommend transform:
None
(Lambda = 1)
Lambda
Ln(R
esidu
alSS)
Box-Cox Plot for Power Transforms
1.29
2.09
2.89
3.69
4.50
-3 -2 -1 0 1 2 3