primer reporte de fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

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Original Paper

ARTICLE HISTORYReceived 24 November 2019 / Accepted 14 July 2020Published on line: 12 October 2020

CORRESPONDING AUTHOR Medali Huarhua, [email protected]: 0000-0002-1482-8170

DOI: 10.33885/sf.2020.50.1257(2020) Vol. 50:e1257

Primer reporte de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 1 aislada de tomate (Solanum lycopersicum L.)

proveniente de la Costa central del Perú

First Report of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 1 isolated of Tomato (Solanum lycopersicum L.) comes from the Central Coast of Peru

Medali Huarhua1, Liliana Aragón1, Juan Flores1, Rin Tsuzuki2, Tsutomu Arie2

1 Departamento de Fitopatología, Clínica de Diagnosis de Fitopatología, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú.2 Laboratory of Plant Pathology, Graduate School of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology (TUAT), Fuchu, Tokyo 183-8509, Japón.

RESUMENAntecedentes: Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) causa la marchitez vascular en tomate. Las especies de Fu-sarium pueden llegar a ser identificadas por características morfológicas. Sin embargo, para poder detectar las formas especiales, razas o formas patogénicas se emplean herramientas moleculares o cultivares diferenciales. Actualmente, en el Perú no existe reporte de la identificación de razas de Fol.Objetivos: Identificar mediante técnicas moleculares y empleo de cultivares diferenciales, razas de Fusarium oxysporum asociados a la marchitez de tomate provenientes de la costa del Perú.Métodos: Identificación morfológica de ocho aislamientos de Fusarium de tomate, seguido de los análisis filogenéticos basados en las regiones espaciadoras intergénicas del ADN ribosomal (IGS). Además, se realizó la detección de los genes (SIX4, SIX3 y SIX1) y fragmentos de los genes endo (pg1) y exo (pgx4) poligalacturonasa. La prueba de patogeni-cidad fue realizada en cultivares diferenciales de tomates (Ponderosa, Momotaro, Momotaro 8 y Block).Resultados y conclusiones: De acuerdo a los análisis moleculares y prueba de patogenicidad, se identificó al aislamiento HEI 11 como Fol raza 1.Palabras clave: Cultivares, IGS, genes SIX, poligalacturonasa, xilema

ABSTRACTBackground: Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) causes wilt symptoms on tomato. Fusarium species can be iden-tified by morphological characteristics. However, in order to detect special form, races or pathogenic forms, molecular methods and differential cultivars are used. Currently, in Peru there is no report of the identification of races of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.Objectives: Identify by molecular techniques and the use of differential cultivars, Fusarium oxysporum races associated with tomato wilt from the coast of Peru.Methods: Morphological Identification of eight Fusarium i solates from tomato were done followed by phylogenetic analysis based on the intergenic spaces (IGS) of DNA r. In addition, avirulence genes (SIX4, SIX3 and SIX1) and fragments of the endo (pg1) and exo (pgx4) polygalacturonase genes of the pathogen were detected. Pathogenicity tests were carried out on tomato differential cultivars (Ponderosa, Momotaro, Momotaro 8 and Block).Results and conclusions: According to the molecular techniques and pathogenicity test, the HEI 11 isolate was identified as Fol race 1.Keywords: Cultivars, IGS, genes SIX, polygalacturonase, xylem

Huarhua ET AL. Primer reporte de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici...

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INTRODUCCIÓN

El tomate es una de las hortalizas ampliamente pro-ducidas y consumidas a nivel mundial como producto fresco y para industrialización (Kimura y Sinha, 2008). El rendimiento promedio del Perú fue de 41.5 t ha-1 en el año 2017, siendo las principales provincias produc-toras: Ica, Lima y Arequipa (SIEA, 2017; INEI,2018). Sin embargo, la rentabilidad se ha visto mermada por di-ferentes factores y entre ellos problemas patológicos. Tal es el caso de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder y Hans, agente causal de la marchitez vascular en el cultivo de tomate (Blancard, 2011). Este patógeno es responsable de numerosas pérdidas eco-nómicas y actualmente se encuentra distribuido por to-dos los continentes (González et al., 2012). Se conoce que hasta el momento F. oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) ha sido agrupado en tres razas fisiológicas (Raza 1, 2 y 3) de acuerdo con Hirano y Arie (2006) y Arie (2010). Fol ingresa por el sistema radicular y se despla-za a través del tejido vascular para habitar y obstruir los vasos del xilema, lo que conlleva al estrés hídrico severo en la planta, cuya sintomatología se manifiesta en el amarillamiento de las hojas, iniciando por la parte del tercio inferior de un solo lado en los foliolos, acom-pañado de una decoloración vascular, marchitez y fi-nalmente la muerte de la planta (Srinivas et al., 2019). Durante la infección Fol secreta algunas enzimas que degradan la pared celular de la planta, tal es el caso de las poligalacturonasas (PG) a partir de las cuales se han diseñado oligonucleótidos basadas sobre las diferen-cias nucleotídicas de los genes de la exopoligalactu-ronas (pgx4) y endopoligalacturonas (pg1) que poseen los tipos patogénicos (Hirano y Arie, 2006; Balogun et al., 2008; Çolak y Bicici, 2013). Así mismo, otros oligo-nucleótidos fueron diseñados a partir de proteínas úni-cas secretadas a nivel del xilema, llamadas proteínas SIX (Secreted In Xylem, por sus siglas en inglés), tres de las cuales, AVR1 (SIX4), AVR2 (SIX3) y AVR3 (SIX1) promueven la virulencia y colonización en el cultivo de tomate (Lievens et al., 2009). Por la supresión de me-canismos de resistencia basales, el conjunto de estas proteínas determina la virulencia del patógeno hacia un hospedante en particular (Hirano y Arie, 2006; Gon-zález et al., 2012; Inami et al., 2012). Las tres razas fisio-lógicas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici solo pueden ser detectados mediante métodos basados en la PCR y/o acorde a su capacidad de infectar a un

conjunto de cultivares diferenciales de tomate y la res-puesta de susceptibilidad y resistencia frente al aisla-miento de Fol (Hirano y Arie, 2006; Arie, 2010; Kashiwa et al., 2016). En el Perú la identificación de las especies de Fusarium se basa en características morfológicas y se asumen formas especiales de acuerdo al síntoma y al huésped de donde se aisló. A nivel mundial existen técnicas moleculares para el diagnóstico de Fol, pero aún no han sido implementadas en el país y por ende no existe una identificación de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici y sus razas. Por lo expuesto, el objetivo de este trabajo es identificar mediante técnicas mole-culares y empleo de cultivares diferenciales razas de Fusarium oxysporum asociados a la marchitez de to-mate provenientes de la costa del Perú.

MATERIALES Y MÉTODOS

Procedencia de las muestrasLos aislamientos de Fusarium fueron proporcionados por la Clínica de Diagnosis de Fitopatología para su identificación molecular. Los aislamientos fueron envia-dos de las principales zonas productoras: Ica (6), Lima (1) y Arequipa (1) en los años 2012 al 2016. Las mues-tras fueron colectadas de plantas con síntomas de mar-chitez y para el envío se tomaron plantas completas acompañadas de sustrato colocadas en bolsas oscuras y enviadas en cajas de Tecnopor; para luego ser pro-cesadas en el laboratorio de la Clínica de Diagnosis de Fitopatología. Los controles positivos, se emplearon las tres razas de F. oxysporum f. sp. lycopersici MAFF 305121 (Raza 1), JCM 12575 (raza 2) y Ch12-1A (raza 3), provistos por la Universidad de Agricultura y Tecno-logía de Tokio (Tabla 1).

Material biológicoLos aislamientos fueron obtenidos a partir de plantas con síntomas de marchitez y decoloración vascular del cultivo, los tejidos se lavaron con agua potable para eliminar la materia orgánica presente, seguido con agua destilada estéril, dentro de la cámara de siembra se realizaron cortes de pequeñas porciones de tallo y raíz que se colocaron en hipoclorito de sodio al 0.5 % por 3 minutos, se secó sobre un papel toalla por 20 minutos, transcurrido el tiempo se procedió a sembrar cuatro puntos en medio KOMADA fueron incubadas a 25 °C por 5 días (Carrillo-Fasio et al., 2003; Komada, 1975). De cada aislamiento se realizó un cultivo mo-

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nospórico, para lo cual una porción de 0.5 cm2 de PDA con tejido de micelio de 7 días se colocó en un tubo de vidrio que contenía 10 mL de agua destilada estéril, se mezcló en vortex y contabilizó por campo visual de 10 X, un número de 10 a 20 conidios, se tomó 50 µL y se extendió sobre un medio agar agua, luego de 18 horas se evaluó y seleccionó las conidios germinadas y se sembró en medios PDA (Duarte et al.,2016).

Identificación morfológica Para la caracterización morfológica de F. oxysporum se tomaron en cuenta características del desarrollo en medio PDA basados en las claves descritas por Boo-th (1970), Piontelli y Toro (1992) y Leslie y Summerell (2006). La producción de clamidosporas se realizó a partir de macroconidios producidos en el medio PDA, estos fueron cosechadas y concentrados por centri-fugación, luego suspendidos en agua destilada esté-ril por 20 a 30 días a 25 °C (Dhingra y Sinclair, 1995). Las medidas de estas estructuras fueron comparadas con descriptores empleados por Booth (1970) y Hoog (2000).

Extracción de ADN El método empleado para la extracción de ADN fue el desarrollado por la Universidad de TUAT, método de mini preparación propuesto por Saitoh et al. (2006) y Liu et al. (2000). De cada aislamiento, se obtuvo una porción de 5-10 mm de agar con micelio en crecimien-to activo, los cuales fueron depositados en tubos de 1.5 mL con 500 µL de Buffer de Lisis (100 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, 1M KCl; pH 8.0). Se trituró el micelio y

se incubó por 10 minutos, luego se agregó fenol-clo-roformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y se centrifugó 10 minutos a 12000 rpm. Se recuperó la fase acuosa supe-rior, a la cual se añadieron 2 µL de ARNasa y se incubó a 37 °C por 30 minutos, se añadió un volumen similar al colectado de Isopropanol y se colocó a -20 °C por 15 minutos. Se centrifugó a 12000 rpm por 10 minutos a temperatura de ambiente y se descartó el sobrena-dante; luego se realizó un lavado con 1 mL de etanol al 70 % y se centrifugó durante 5 minutos. Posteriormen-te se eliminó el etanol y se secó al vacío. Finalmente, el ADN se resuspendió en 30 µL de agua ultra pura y fue almacenado a -30 °C.

Reacción de PCRSe preparó un volumen de reacción de 25 µL, que con-tenía 1 µL de ADN genómico (50 ng-100ng), 4 µL de Buffer de reacción para la PCR (10 X) (ACTaqTM); 2 µL de cada dNTPs (2.5 mM); 0.5 µL de cada oligonucleó-tido (20 µM) y 0.125 µL de Taq ADN polimerasa (AC-TaqTM) (5 U. µL-1) y se completó con agua ultra pura. Para la amplificación de la región IGS se emplearon los oligonucleótidos FIGS11/ FIGS y para los genes SIX se emplearon los oligonucleótidos: SIX4F1/R1, SIX3- F1/R2 Y P12-F1/R1, 12. Las condiciones de la PCR fueron iguales: desnaturalización inicial a 94 °C por 2 min; se-guido de 35 ciclos de 30s a 94 °C, 30 s de anillamiento a 61 °C y 30 s de elongación a 72 °C; y un ciclo final de 72 °C por 7 min (Rep et al., 2004; Inami et al., 2012, 2014). Para la amplificación de los genes endo (pg1) y exo (pgx4) poligalacturonasa se utilizaron los oligo-nucleótidos: uni, spr13 y spr23 y se llevó a cabo con

Tabla 1. Aislamientos de Fusarium oxysporum obtenidos del cultivo de tomate que fueron empleados para el estudio

Nombre del aislamieNTo localizacióN Fecha de procedeNcia

HEI 1HEI 2

IcaCachiche-Ica

11-201312-2013

HEI 3 Majes-Arequipa 06-2013

HEI 5 Subtanjalla-Ica 12-2014

HEI 6 Mala-Lima 03-2016

HEI 9 Ica 12-2014

HEI 10 Ica 03-2012

HEI 11 Ica 04-2016

MAFF 305121 Raza 1 TUAT Kawabe et al. (2005)

JCM 12575 Raza 2 TUAT Inami et al. (2012)

Ch12-1A Raza 3 TUAT Inami et al. (2012)


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una desnaturalización inicial de 94 °C por 5 minutos; 45 ciclos de segunda desnaturalización a 94 °C por 1 minuto, hibridación a 61 °C por 1 minuto, elongación a 72 °C por 2 minutos; y una extensión final a 72 °C por 10 minutos (Çolak y Bicici, 2013). La reacción de la PCR fue visualizada bajo electroforesis en un gel de agarosa al 2 %.La purificación del producto de PCR se realizó median-te el Kit Wizard SV Gel and PCR Clean y se sometió a una reacción de calidad de ADN. La secuenciación del ADN se realizó usando el protocolo de temperatura de alargamiento escalonado (STeP) descrito por Platt et al. (2007); Finalmente, la reacción de secuenciación STeP realizó en un volumen de 10 µL con 100 ng de ADN de amplicon y 0.5µL BigDye Terminator v3.1.

Secuenciación Para obtener la secuencia completa se ensamblaron manualmente los fragmentos continuos generados por los cebadores “Forward” y “Reverse”, usando el programa GENETIX-MAC and ENZYME X. La identifi-cación se determinó en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI), utilizan-do el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Las se-cuencias de la región IGS fueron alineadas para gene-rar árboles filogenéticos (Inami et al., 2012). El árbol filogenético fue generado por el método de máxima Parsimonia con el programa MEGA 7 (Kumar et al., 2016).

Preparación del inóculo El método empleado fue descrito por Balogun et al. (2008). Se preparó un caldo de papa dextrosa, en volú-menes de 40 mL en matraces Erlenmeyer (100 mL) para ser sometido a 121 °C por 30 min en autoclave. Luego se procedió a colocar en el caldo una pequeña porción (< 0.5 cm2) de PDA con micelio del hongo de cuatro días de edad de cada uno de los aislamientos. Este caldo con el inóculo fue incubado a temperatura am-biente por cinco días en un agitador orbital a 120 rpm, para producción de brotes celulares (conidios unicelu-lares), terminando el período de incubación, se filtró la solución, se centrifugó a 3000 rpm por 15 minutos, se eliminó el sobrenadante y se quedó con el precipitado, donde se encontraron los conidios. La suspensión de conidios que se obtuvo de la preparación, se ajustó a la concentración a 1 x 10 7 conidios mL -1.

Evaluación de la patogenicidad en invernadero Se sembraron semillas de tomate de cada cultivar dife-rencial (Ponderosa, Momotaro, Momotaro 8, Block) en contenedores de plástico en un sustrato estéril; se em-plearon tres contenedores y cada una contenían dos semillas del cultivar diferencial, haciendo un total de seis plantas de cada cultivar por aislamiento, después de 21 días se procedió a realizar heridas en las raíces introduciendo una espátula de plástico a nivel radicu-lar, seguido se inoculó en la base de cada planta con 1 mL de la suspensión conidial en una concentración de 1 x 10 7 conidios mL-1. A la cuarta semana después de la inoculación se evaluaron los síntomas externos de cada planta, empleando la escala descrita por Ina-mi et al. (2012); así mismo, se evaluó el pardeamiento del cilindro vascular con la escala descrita por Kashi-wa et al. (2016) que es empleada en el laboratorio de TUAT. Una vez concluido el experimento se procedió al reaislamiento del patógeno de las plantas inoculadas, para lo cual se empleó el medio KOMADA y medio PDA. Los postulados de Koch se verificaron median-te el reaislamiento del hongo a partir de raíces y tallo con síntomas, para lo cual se emplearon los medios ya descritos para el aislamiento y la corroboración de la identificación del organismo se realizó mediante carac-terísticas morfológicas y moleculares (análisis basados en los genes de la poligalacturonasa) bajo la metodo-logía previamente descrita.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación morfológicaLos ocho aislados en estudio, se identificaron como F. oxysporum, de acuerdo a las características morfológi-cas y mediciones microscópicas en el medio PDA y se identificaron como HEI 1, HEI 2, HEI 3, HEI 5, HEI 6, HEI 9 y HEI 10. En cuanto a las características morfológicas, el menor y mayor crecimiento de la colonia después de siete días de evaluación fue para los aislamientos HEI 3 y HEI 10 con 5 cm y a 7 cm respectivamente. Para dos aislamientos, HEI 1 y HEI 11, produjeron colonias con micelio de coloración violácea evaluadas sobre y bajo la superficie de la placa; para los aislados: HEI 2, HEI3, HEI 5, HEI 6, HEI 9, HEI 10, la pigmentación fue de una tonalidad blanca sobre la superficie y en el reverso de la placa la coloración fue de violácea clara a oscura. El desarrollo micelial de las colonias se caracterizó por tener un crecimiento radial y concéntrico, con micelio

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afelpado y algodonoso. En cuanto a las características de medición de las estructuras, los ocho aislamientos presentaron microconidios de forma oval a elíptica, cuyas mediciones oscilaron entre: 6.72 (+0.82) - 11.46 (+1.6) × 2.64 (+0.51) - 3.48 (+0.96) µm., usualmente de 0-1 septo. Los macroconidios de 25.2 (+1.72) - 29.28 (+1.91) × 3.58 (+0.8) - 4.44 (+0.63) µm., con 3-5 sep-tos; ligeramente curvadas con la presencia de una cé-lula pie, las clamidosporas fueron simples y dobles con diámetros de 6.86 (+0.78) - 12.64 (+1.49) µm (Tabla 2). Estas mediciones coincidieron con los descripto-res propuestos por Booth (1970), Hoog (2000), Leslie y Summerell (2006) e investigaciones realizadas por Ciampi et al. (2009) y Hafizi et al. (2013) para la especie de F. oxysporum.

PCR y análisis filogenético de la región IGSEn todos los aislamientos se logró amplificar la re-gión IGS con el uso de los oligonucleótidos FIGS11 y FIGS12, los productos fueron visualizados por electro-foresis en gel de agarosa al 1.2 % observándose una única banda de alrededor de 600 bp. Investigaciones previas realizadas por Kawabe et al. (2005), Balogun et al.(2008) e Inami et al. (2014); han demostrado el uso de dichos oligonucleótidos para la región IGS en F. oxys-porum, debido a que las especies estrechamente rela-

cionadas pueden mostrar considerable diversidad en la región IGS, manifestándose en variaciones frecuen-tes en cuanto a longitud y secuencia; lo que permite la diferenciación entre especies cercanas genéticamente (Appel y Gordon, 1995; Gómez, 2008). Al realizar la construcción filogenética, a partir de los alineamientos obtenidos de la región IGS del ADNr de las muestras y de las secuencias obtenidas de formas especiales de F. oxysporum que fueron tomados de la base de da-tos NCBI, con una prueba de Bootstrap (1000 réplicas) para evaluar el soporte de agrupaciones, se obtuvo que las ocho muestras de estudio fueron agrupadas dentro de F. oxysporum f. sp. lycopersici obtenidos del NCBI y separadas de Gibberella fujikuroi (FGSC 7610) (Figura 1). No obstante Silva et al. (2014) y Alanis-Mar-tínez et al. (2015) mencionaron que las formas espe-ciales de F. oxysporum pueden tener una información genética muy distinta atribuida a su origen polifilético, para el caso de Fol, se presentan tres clados (A1, A2 y A3), lo que sugiere una relación polifilética de nuestros aislamientos con al menos 3 orígenes. Kawabe et al. (2005), manifiesta que no se ha encontrado una rela-ción entre las razas y grupos polifiléticos reportados. Por lo que, el agrupamiento de los aislamientos a nivel de clado no indicarían la patogenicidad del aislamien-to, solo refiere el grado de cercanía en relación con los

Tabla 2. Mediciones de las estructuras de los ocho aislamientos de Fusarium oxysporum aisladas del cultivo de tomate

aislamieNTo

microcoNidias macrocoNidias clamidospora

Tamaño a sepTas Tamaño a sepTas diámeTro b descripcióN

HEI 1 11.34 (+1.46) × 3.48 (+0.96) 0 a 1 26.46 (+1.85) × 3.84(+0.84) 3 a 4 10.99 (+1.06) Simple/Pares

HEI 2 6.72(+0.82) × 2.64 (+0.51) 0 a 1 27.36 (+1.86) × 4.44 (+0.63) 3 a 5 8.905 (+0.98) Simple/pares

HEI 3 10.02 (+1.88) × 3.06 (+0.62) 0 33.18 (+3.1) × 4.26 (+0.65) 3 a 5 7.64 (+1.13) Simple/Pares

HEI 5 8.94 (+1.08) × 3.36 (+0.78) 0 a 1 25.2 (+1.72) × 4.38 (+0.62) 3 a 4 8.35 (+0.99) Simple/Pares

HEI 6 7.14 (+0.97) × 2.64 (+0.48) 0 a 1 29.28 (+1.91) × 4.38 (+0.58) 3 a 4 9.36 (+1.07) Simple

HEI 9 11.46 (+1.6) × 3.06 (+0.6) 0 a 1 26.28 (+1.78) × 4.20 (+0.73) 3 a 4 8.43 (+0.91) Simple/Pares

HEI 10 10.9 (+1.4) × 2.8 (+0.57) 0 a 1 25.66 (+1.67) × 3.58 (+0.8) 3 a 5 6.86 (+0.78) Simple

HEI 11 8.94 (+1.22) × 3.48 (+0.36) 0 27 (+1.97) × 4.44 (+0.55) 3 a 4 12.64 (+1.49) Simple

A = Promedio de longitud y ancho de 100 Microconidias /Macroconidias ± desviación estándar.B = Promedio de diámetro de 100 clamidosporas ± desviación estándar.


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Figura 1. Análisis filogenético utilizando Mega 7. Método de Máxima parsimonia con 1000 replicaciones para el Bootstrap. Se compararon las secuencias espaciadoras internas (IGS) de los aislamientos de Fusarium oxysporum obtenidos en el estudio con las diferentes secuen-cias de Fusarium oxysporum obtenidas del NCBI y un aislamiento como grupo externo, Gibberella fujikuroi.

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Fol y/o Fo de tomates no patogénicos (Appel y Gor-don, 1995; Kawabe et al., 2005). De acuerdo con el trabajo de Arie (2010), Fusarium oxysporum no pato-génico dio origen a las formas patogénicas (Fol) duran-te la asociación saprofítica con el tomate, después del inicio de la domesticación asociado con la actividad de los elementos móviles presentes en el genoma de F. oxysporum que contribuyeron a la emergencia de Fol y a su diversidad patogénica; en ese sentido, sin bien nuestros aislamientos se encuentran cercanamente re-lacionados con los F. oxysporum f. sp. lycopersici, no se podría atribuir a una forma especial a nivel de esta región; ya que podrían estar cercanamente asociados a Fo no patogénicos; por lo que, solo con la informa-ción reportada de la región IGS no brinda precisión al detectar formas especiales, ya que los determinantes de la especificad del hospedero pueden transferirse horizontalmente entre cepas de F. oxysporum de dife-rentes linajes, este intercambio genético hace que sea difícil desarrollar oligonucleótidos para la detección especifica de una forma especial dada. Por ello, los marcadores moleculares basados en los determinantes genéticos de la patogenicidad, son promisorios para distinguir la forma especial (Van Der Does et al., 2008; Silva et al., 2014).

PCR para detección de genes de avirulencia (gen SIX) en Fusarium oxysporumDe acuerdo a los resultados el aislamiento HEI 11 es el único en el que se evidenció la presencia de los tres genes de avirulencia (SIX4, SIX3 y SIX1) con un tamaño de banda igual a los controles positivos SIX4 (800bp), SIX3 (570 bp) y SIX1(400bp) y se confirmó su alto grado de identidad con sus respectivos genes SIX reportados para F. oxysporum f. sp. lycopersici con un porcentaje de identidad de 100 % para SIX4, 99 % para SIX3 y 98 % para SIX1, respectivamente. Por otro lado, para los aislamientos HEI 2, HEI 3, HEI 5, HEI 6, HEI 9, HEI 10, se observaron productos de am-plificación solo con el juego de los oligonucleótidos SIX3-F1/SIX3-R2 para el gen SIX3 (AVR2); sin embar-go, los tamaños amplificados fueron diferentes a los controles positivos (Figura 2). Las proteínas efectoras en hongos son secretadas dentro del espacio extrace-lular, las cuales pueden actuar a este nivel o pueden ser absorbidos por las células de la planta e interactuar con objetivos intracelulares (Houterman et al., 2007). El grupo de proteína efectoras, determina la virulen-

cia de un patógeno hacia un hospedante en particular (González et al., 2012). Para el caso de las proteínas relacionadas a la patogenicidad de F. oxysporum f. sp. lycopersici, Rep et al. (2003) mencionaron que éstas se encuentran acumuladas en la savia del xilema tras la infección y promueven la virulencia de este patógeno hacia el tomate. Entre ellos se reportaron 3 genes de avirulencia AVR1 (=SIX4), AVR2 (=SIX3) y AVR3 (=SIX1). Por lo que, las razas de F. oxysporum f. sp. lycopersici

Figura 2. Productos de PCR de los tres genes SIX (SIX4, SIX3, SIX1) del aislado HEI 11 (11) en gel de agarosa con bandas de tamaño esperado a los controles positivos: R1, Fol raza 1; R2, Fol raza 2; R3, Fol raza 3. A: banda correspondiente a SIX4 usando los oligonucleó-tidos SIX4 F1/SIX4 R1. B: banda correspondiente a SIX3 usando los oligonucleótidos SIX3 F1/SIX3 R2. C: banda correspondiente a SIX 1usando los oligonucleótidos P12 F1/P 12 R1. Las muestras 1, 2, 3,5, 6, 9, 10 y 11 corresponden a los aislados HEI 1, HEI 2, HEI3, HEI 5, HEI 6, HEI 9, HEI 10, HEI 11, respectivamente.


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por Hirano y Arie (2006) para Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 1. Las poligalacturonasas son las primeras enzimas involucradas en la degradación de la pared celular durante la patogénesis y juegan un papel importante en el desarrollo de la infección al menos en dos fases: penetración de la corteza de la raíz, con el fin de alcanzar el sistema vascular; y colo-nización y difusión del hongo hacia la parte superior a través de los vasos del xilema (Bravo, 2013; Srinivas et al., 2019). Por lo que, el diseño de los oligonucleó-tidos específicos (uni, sp13, sp23, sprl) diseñados por Hirano y Arie (2006) a partir de secuencias nucleotídi-cas parciales de genes como la endopoligalacturonas (pg 1) y exopoligalacturonasas (pgx 4) de aislamien-tos de Fol y F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, permitieron la confirmación del aislamiento HEI 11 como Fol raza 1. El juego de oligonucleótidos “uni” amplificó un producto con un mismo tamaño de ban-da con respecto a los controles positivos R1, R2, y R3, confirmando la presencia de F. oxysporum. Además, amplificó para el set de oligonucleótidos sp13 (445 bp) el cual indica que el aislamiento HEI 11, podría pertenecer a la raza 1 o raza 3; sin embargo, al no amplificar con el juego del oligonucleótido sp23 (518 bp), el cual solo amplifica para raza 2 o raza 3, se des-cartó que HEI 11 pertenezca a la raza 3, con lo que se valida que, a nivel molecular el aislamiento HEI 11 pertenece a F. oxysporum f. sp. lycopersici raza 1. Pruebas similares fueron realizadas por Kawabe et al. (2005) y Baysal et al.(2009).

Prueba de patogenicidad De los ocho aislamientos evaluados, solo HEI 11 causó los síntomas característicos de Fol (Figura 4), los cuales se observaron a partir de la tercera semana (síntomas secundarios) después de la inoculación, solo en el cul-tivar susceptible a las tres razas (ponderosa) y no en los otros cultivares con resistencia a una de las razas (Momotaro, Momotaro 8 y Block), los síntomas coin-cidieron con los descritos por Walker (1971) para F. oxysporum f. sp. lycopersici dentro de un invernadero, los cuales comenzaron con una ligera decoloración a nivel de las nervaduras de las hojas, seguido de un de-caimiento del peciolo (epinastia) y amarillamiento que inició en las hojas basales y avanzó a las hojas jóvenes; finalmente se observó marchitez y muerte de la planta; al realizar el corte del tallo se evidenció pardeamiento de las células vasculares.

pueden ser determinada por la combinación de estos genes (Inami et al., 2012). Por lo tanto, la amplificación de los genes de avirulencia en el aislamiento HEI 11, indicarían la presencia de F. oxysporum f. sp. lycoper-sici. Ya que, numerosas investigaciones, reportan estos genes SIX1, SIX3, SIX4 como parte exclusiva de ais-lamientos de F. oxysporum f. sp. lycopersici y no en otras formas especiales o aislamientos no patogénicos (Lievens et al., 2009). Los resultados manifiestan que el aislamiento HEI 11 pertenece a la raza 1; ya que, fue el único aislamiento que amplificó el gen de aviru-lencia AVR1, que solo es detectada en la raza 1, pero no en la raza 2 y 3 (Houterman et al., 2009; Inami et al., 2014). Además, amplificaron para los genes de avi-rulencia AVR2 y AVR3. Inami et al. (2012), describen que basados en los genes AVR, la presencia de los tres genes de avirulencia: AVR1 (SIX4), AVR2 (SIX 3) y AVR3 (SIX1) corresponderían a la Raza 1 de F. oxysporum f. sp. lycopersici.

PCR para detección de genes de la poligalacturonasa Con oligonucleótidos específicos diseñados a partir de genes de la poligalacturonasa para discriminación de razas de Fol empleados para la corroboración de la forma especial del aislamiento HEI 11. Los resulta-dos mostraron la amplificación para el juego de oligo-nucleótido “uni”, con tamaño de banda de 672 bp. Así también, amplificó para el set de oligonucleótidos “sp13” con un tamaño de banda de 445 bp y no se evidenció ningún producto amplificado para el set de oligonucleótidos “sp23 “(Figura 3). Los tamaños de amplicones mencionados se ajustan a los reportados

Figura 3. Productos de PCR de electroforesis en gel de agarosa usando los juegos de oligonucleótidos uni f/r, sp13, sp23 especí-ficos para detectar Fol. M: marcador molecular. R1: Fol raza 1. R2: Fol raza 2. R3: Fol raza 3.11: aislamiento HEI 11. HEI 11 con banda de tamaño esperado al control positivo R1 con los oligonucleótidos uni f/r y sp13.

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Figura 4. Síntomas de la prueba de patogenicidad en el cultivo de tomate, a la cuarta semana de inoculación con F. oxysporum f. sp. lyco-persici. A-B: amarillamiento de las hojas basales, epinastia. C: muerte total de la planta. D-E: decoloración vascular.


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Para los aislamientos HEI 1, HEI 2, HEI 3, HEI 5, HEI 6, HEI 9, HEI 10, si bien estos fueron obtenidos de tomate. Sin embargo, no mostró síntomas en el cultivar suscepti-ble a las tres razas; ni en ningún otro cultivar, por lo que no fueron identificadas como razas de F. oxysporum f. sp. lycopersici. Aunque, estos aislamientos son capaces de parasitar plantas de tomate, ya que fueron aislados de este cultivo; no obstante, el análisis molecular de-mostró que carecen de genes de patogenicidad que les permita causar síntomas en el cultivar susceptible (Ne-grete, 2013). Algunas investigaciones manifiestan que estos F. oxysporum no patogénicos aislados de tomate pudieron originar a las formas de F. oxysporum f. sp. lycopersici patogénicos durante su asociación saprofí-tica en el inicio de la domesticación del tomate (Arie, 2010). En la prueba de patogenicidad la determinación del aislamiento HEI 11 como F. oxysporum f. sp. lyco-persici raza 1, fue establecida cuando éste, mostró sín-tomas en el cultivar que carecía de genes de resistencia (Ponderosa) y no se evidenció síntomas en los cultivares: Momotaro (I, i2,i3), Momotaro 8 (I,I2,i3) y Block (I, I2,I3); los cuales poseían genes de resistencia I (Balogun et al., 2008; Inami et al., 2012; Negrete, 2013). Así mismo, en base al análisis molecular se demostró que el aislamien-to HEI 11 posee los genes de avirulencia (AVR1, AVR2, AVR3), los cuales pudieron ser reconocidos por al me-nos uno de los genes de resistencia de los cultivares diferenciales (Momotaro, Momotaro 8 y Block), estable-ciéndose una relación incompatible entre el patógeno y el hospedante, evidenciándose en la ausencia de la en-fermedad en los cultivares resistentes. Por el contrario, en el cultivar susceptible (Ponderosa) al no poseer genes de resistencia se estableció una relación compatible, es decir presencia de la enfermedad. Finalmente, el re ais-lamiento del aislamiento HEI 11 en el medio selectivo KOMADA y medio PDA de raíces y tallos con síntomas de decoloración vascular y la corroboración de la identi-dad morfológica y molecular confirmó que se trata de la misma cepa inicial empleada para la inoculación, lo que permitió establecer una relación entre el aislamiento y la enfermedad, completando así el postulado de Koch.

CONCLUSIÓN

El presente estudio permitió identificar al aislamiento HEI 11 como Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 1 y corroborar que las pruebas moleculares ba-sadas en el empleo de oligonucleótidos específicos,

son herramientas útiles para la determinación de la F. oxysporum f. sp. lycopersici y de su patogenicidad. Esta investigación servirá de base para futuras inves-tigaciones con fines de estudios del comportamiento poblacional de este patógeno en el país.

AGRADECIMIENTOSAl laboratorio de Plant Pathology in Tokyo University of Agriculture and Technology (TUAT) Clínica de Diagnosis de Fitopatología y al Departamento de Fitopatología de la UNALM. M. Huarhua agrade-ce al personal de TUAT, pero en especial Akai Kotaro, Seon Mi Jo, Hasegawas Ryo, Daichi Kawakami, Reiko Shindo, Nanako Takase y Rin Tsuzuki por el soporte durante su estancia en Japón y finalmente al programa La-CEP y MINEDU-Perú.

LITERATURA CITADAAlanis-Martínez, I., C. Medina-Mendoza, N. Marbán-Mendoza., E.

Valadez-Moctezuma, 2015. Técnicas moleculares clásicas para la diferenciación de formas especiales de Fusarium oxysporum. Revista Mexicana de Fitopatología 42:1-7.

Appel, D., T.R. Gordon, 1995. Intraspecific Variation within Popula-tions of Fusarium oxysporum Based on RFLP Analysis of the In-tergenic Spacer Region of the rDNA. Experimental Mycology 19: 120-128. Doi: 10.1006/emyc.1995.1014

Arie, T., 2010. Phylogeny and phytopathogenicity mechanisms of soilborne Fusarium oxysporum. Journal of General Plant Patho-logy 76: 403-405. Doi: 10.1007/s10327-010-0264-z

Balogun, O.S., Y. Hirano, T. Teraoka, T. Arie, 2008. PCR-based analy-sis of disease in tomato singly or mixed inoculated with Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races 1 and 2. Phytopathologia Me-diterranea 47: 50-60.

Baysal, Ö., M. Siragusa, H. Ikten, I. Polat, E. Gümrükcü, F. Yigit, F. Carimi, J.A. Teixeira da Silva, 2009. Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and their genetic discrimination by molecu-lar markers in West Mediterranean region of Turkey. Physiolo-gical and Molecular Plant Pathology 74: 68-75. Doi: 10.1016/j.pmpp.2009.09.008

Blancard, D., 2011. Enfermedades del tomate - identificar, conocer y controlar. Mundi-Prensa, México. D.F.

Booth, C., 1970. Fusarium oxysporum. CMI Descriptions of Pathoge-nic Fungi and Bacteria 211: 1-2.

Bravo, G., 2013. Sistemas hidrolíticos de componentes vegetales en el patógeno de tomate Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici: lipasas y poligalacturonasas. Tesis Doctoral, Universidad de Cór-doba.

Carrillo-Fasio, J.A., T.J. Montoya-Rodríguez , R.S. Garcia- Estrada, J.E. Cruz-Ortega, I. Márquez-Zequera, A.J. Sañudo- Barajas, 2003. Razas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Snyder y Hansen, en tomate ( Lycopersicon esculentum Mill .) en el Valle de Culiacán , Sinaloa , México. Revista Mexicana de Fitopatolo-gía 21: 123-127.

Ciampi, L., J. Nissen, E. Venegas, R. Fuentes, M. Costa, R. Schöbitz, E. Alvarez, P. Alvarado, 2009. Identification of two species of Fusarium link that cause wilting of colored callas (Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng.) cultivated under greenhouse conditions

11

(2020) Vol. 50: e1257

in Chile. Chilean Journal of Agricultural Research 69: 516-525. Doi: 10.4067/S0718-58392009000400006

Çolak, A., M. Bicici, 2013. PCR detection of Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and races of F. oxysporum f. sp. lycopersici of tomato in protected tomato growing areas of Eastern Medi-terranean Region of Turkey. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 37: 457-467. Doi: 10.3906/tar-1203-71

Dhingra, O.D., J.B. Sinclair, 1995. Basic plant pathology methods. 2 ed. CRC Press, Boca Raton.

Duarte Y., A. Echevarría, B. Martínez, 2016. Identificación y caracteri-zación de aislamientos de Fusarium spp. presentes en garbanzo (Cicer arietinum L.) en Cuba. Revista de Protección Vegetal 31: 173-183.

Gómez, E.D., 2008. Caracterización de cepas toxigénicas del género Fusarium mediante técnicas de biología molecular. Tesis Docto-ral, Universidad Politécnica de Valencia.

González, I., Y. Arias, B. Peteira, 2012. Aspectos generales de la inte-racción Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici - tomate. Revista de Protección Vegetal 27: 1-7.

Hafizi, R., B. Salleh, Z. Latiffah, 2013. Morphological and molecular characterization of Fusarium solani and F. oxysporum associated with crown disease of oil palm. Brazilian Journal of Microbiology 44: 959-968. Doi: 10.1590/S1517-83822013000300047

Hirano, Y., T. Arie, 2006. PCR-based differentiation of Fusarium oxys-porum f. sp. lycopersici and radicis-lycopersici and races of F. oxysporum f. sp. lycopersici. Journal of General Plant Pathology 72(5): 273-283. Doi: 10.1007/s10327-006-0287-7

Hoog, G.S., 2000. Atlas of clinical fungi. CBS, Utrecht.Houterman, P.M., L. Ma, G. Van Ooijen, M.J. De Vroomen, B.J.C.

Cornelissen, F.L.W. Takken, M. Rep, 2009. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activa-tes the tomato resistance protein I-2 intracellularly. Plant Journal 58: 970-978. Doi: 10.1111/j.1365-313X.2009.03838.x

Houterman, P.M., D. Speijer, H.L. Dekker, C.G. De Koster, B.J.C. Cornelissen, M. Rep, 2007. The mixed xylem sap proteome of Fusarium oxysporum-infected tomato plants: Short communica-tion. Molecular Plant Pathology 8: 215-221. Doi: 10.1111/j.1364-3703.2007.00384.x

Inami, K., T. Kashiwa, M. Kawabe, A. Onokubo-Okabe, N. Ishikawa, E.R. Pérez, T. Hozumi, L. Aragón, F. Cáceres De BaLdarrago, M. Jiménez, K. Madadi, T. Peever, T. Teraoka, M. Kodama, T. Arie, 2014. The tomato wilt fungus Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici shares common ancestors with nonpathogenic F. oxysporum isolated from wild tomatoes in the Peruvian Andes. Microbes and Environments 29: 200-210. Doi: 10.1264/jsme2.ME13184

Inami, K., C. Yoshioka-Akiyama, Y. Morita, M. Yamasaki, T. Teraoka, T. Arie, 2012. A genetic mechanism for emergence of races in Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici: Inactivation of avirulence gene AVR1 by transposon insertion. PLoS ONE 7(8): 1-10. Doi: 10.1371/journal.pone.0044101.

INEI (Instituto Nacional de Estadística e Informática), 2018. Agrario. En Compendio estadistico del Perú 2018. Pp. 951-1037. https://www.inei.gob.pe/media/MenuRecursivo/publicaciones_digita-les/Est/Lib1483/cap13/cap13.pdf.

Kashiwa, T., T. Suzuki, A. Sato, K. Akai, T. Teraoka, K. Komatsu, T. Arie, 2016. A new biotype of Fusarium oxysporum f. sp. lycoper-sici race 2 emerged by a transposon-driven mutation of aviru-lence gene AVR1. FEMS Microbiology Letters 363(14): 1-6. Doi: 10.1093/femsle/fnw132

Kawabe, M., Y. Kobayashi, G. Okada, I. Yamaguchi, T. Teraoka, T. Arie, 2005. Three evolutionary lineages of tomato wilt pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, based on sequences of IGS, MAT1, and pg1, are each composed of isolates of a single mating type and a single or closely related vegetative compatibi-lity group. Journal of General Plant Pathology 71: 263-272. Doi: 10.1007/s10327-005-0203-6

Kimura, S., N. Sinha, 2008. Tomato (Solanum lycopersicum): A model fruit-bearing crop. Cold Spring Harbor Protocols 3(11): 1-9. Doi: 10.1101/pdb.emo105

Komada, H., 1975. Development of a selective medium for quantita-tive isolation of Fusarium oxysporum from natural soil. Review of Plant Protection Research 8: 114-125.

Kumar, S., G. Stecher, K. Tamura, 2016. MEGA7: Análisis genéti-co evolutivo molecular versión 7.0 para conjuntos de datos más grandes. Molecular Biolology and Evolution 33: 1870-1874.

Leslie, F., B. Summerell, 2006. The Fusarium Laboratory Manual (First). Blackwell Publishing, Oxford.

Lievens, B., P.M. Houterman, M. Rep, 2009. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters 300: 201-215. Doi: 10.1111/j.1574-6968.2009.01783.x

Liu, D., S. Coloe, R. Baird, J. Pedersen, 2000. Rapid mini-preparation of fungal DNA for PCR. Journal of Clinical Microbiology 38: 471.

Negrete, L., 2013. Prevalencia de razas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en predios tomateros de Villa de Arista, San Luis Potosí, posibles fuentes de resistencia y forma de herencia. Tesis de Maestría, Universidad Autónomoa Agraria Antonio Narro.

Piontelli, E., M.A. Toro, 1992. Micromorfología de algunas especies de Fusarium en PDA modificado III. Boletín Micológico 7(1-2): 85-91. Doi: 10.22370/bolmicol.1992.7.0.1285

Platt, A.R., R.W. Woodhall, A.L. George, 2007. Improved DNA sequencing quality and efficiency using an optimized fast cycle sequencing protocol. BioTechniques 43: 58-62. Doi: 10.2144/0112499

Rep, M., H.L. Dekker, J.H. Vossen, A.D. De Boer, P.M. Houterman, C.G. De Koster, B.J.C. Cornelissen, 2003. A tomato xylem sap protein represents a new family of small cysteine-rich proteins with structural similarity to lipid transfer proteins. FEBS Letters 534(1-3): 82-86. Doi: 10.1016/S0014-5793(02)03788-2

Rep, M., H.C. Van Der Does, M. Meijer, R. Van Wijk, P.M. Houterman, H.L. Dekker, C.G. De Koster, B.J.C. Cornelissen, 2004. A small, cysteine-rich protein secreted by Fusarium oxysporum during colonization of xylem vessels is required for I-3-mediated resis-tance in tomato. Molecular Microbiology 53: 1373-1383. Doi: 10.1111/j.1365-2958.2004.04177.x

Saitoh, K., K. Togashi, T. Arie, T. Teraoka, 2006. A simple method for a mini-preparation of fungal DNA. Journal of General Plant Pathology 72: 348-350. Doi: 10.1007/s10327-006-0300-1


12

SIEA (Sistema Integrado de Estadística Agraria), 2017. Boletín es-tadístico de producción agrícola y ganadera. IV Trimestre. Ed. MINAGRI, Cercado de Lima. Doi: 10.2139/ssrn.1920472

Silva, F.P., M.H. Vechiato, R. Harakava, 2014. EF- 1α gene and IGS rDNA sequencing of Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum and F. oxysporum f. sp. phaseoli reveals polyphyletic origin of strains. Tropical Plant Pathology 39: 64-73. Doi: 10.1590/S1982-56762014000100008

Srinivas, C., D. Nirmala, K. Narasimha, C. Mohan, D. Chakrabhavi, T. Lakshmeesha, S. Bhim, N. Kalagatur, S. Niranjana, A. Has-hem, A. Alqarawi, B. Tabassum, E. Abd Allah, S. Chandra, 2019.

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici causal agent of vascular wilt disease of tomato: Biology to diversity- A review. Saudi Journal of Biological Sciences 26: 1315-1324. Doi: 10.1016/j.sjbs.2019.06.002

Van Der Does, H.C., B. Lievens, L. Claes, P.M. Houterman, B.J.C. Cornelissen, M. Rep, 2008. The presence of a virulence locus discriminates Fusarium oxysporum isolates causing tomato wilt from other isolates. Environmental Microbiology 10: 1475-1485. Doi: 10.1111/j.1462-2920.2007.01561.x

Walker, J., 1971. Fusarium wilt of tomato. Monograph, Vol. 6. The American Phytopathological Society, St.Paul, Minesota.

primer reporte de fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

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