phÂn lẬp, tuyỂn chỌn vÀ ĐÁnh giÁ khẢ nĂng cỐ ĐỊnh...

Kỷ yếu kỷ niệm 35 năm thành lập Trường ĐH ng nghiệp Th c ph m T h Minh 98 -2017)

38

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM

CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN NỐT SẦN Ở RỄ CÂY ĐẬU PHỘNG

(ARACHIS HYPOGAEA. L)

Trần Ánh Nguyệt1, *

, Trần Minh Trí1, Hà Thanh Đạt

1,

Trần Thu Thảo1, Hồ Viết Thế

2

1Viện Lúa Đ ng Bằng S ng ửu Long

2Trường Đại học ng nghiệp Th c ph m Thành phố h Minh

*Email: [email protected]

TÓM TẮT

Vi khuẩn nốt sần được phân lập từ rễ cây đậu phộng (Arachis hypogaea. L) thông qua việc định

danh về đặc điểm, hình thái, sinh lý, sinh hóa thì chỉ có hai chủng đạt yêu cầu. Vi khuẩn phân lập được

phát triển tốt trên môi trường YEMA, gram âm, hình que, hiếu khí, có khả năng di động, không bắt màu

trên môi trường có bổ sung Congo red, không phát triển trên môi trường Glucose-Peptone-Agar, có khả

năng chịu được nồng độ muối 2% và phát triển rất tốt trên môi trường kiềm pH từ 7-10. Về khả năng tạo

gum (polysaccharide được chiết xuất từ vỏ màng của tế bào vi khuẩn) cả hai đều tạo gum cao 0,91 mg và

0,89 mg. Hai chủng vi khuẩn cho khả năng cố định đạm cao thông qua phân tích khả năng hình thành nốt

sần và đạm tổng số của thí nghiệm trong nhà lưới. Nghiệm thức sử dụng vi khuẩn nhiễm hạt trước khi

gieo đều có số lượng và khối lượng nốt sần, trọng lượng 100 hạt, chiều cao cây và trọng lượng tươi, phần

trăm của đạm tổng số của cây được chủng cao hơn một cách rõ rệt so với đối chứng. Kết quả là tuyển

chọn được hai chủng vi khuẩn nốt sần cộng sinh có khả năng cố định đạm cao góp phần nâng cao năng

suất cây trồng và giảm chi phí sản xuất.

Từ khóa: vi khuẩn nốt sần, đậu phộng, YEMA.

1. GIỚI THIỆU

Đậu phộng (Arachis hypogaea. L) là cây thực phẩm, cây công nghiệp ngắn ngày dùng để lấy dầu

trong nhóm cây trồng cạn. Nó được biết đến mang lại nhiều nguồn lợi về kinh tế, dinh dưỡng, đồng thời

cũng là cây cải thiện môi trường nhờ vào khả năng cộng sinh với các vi khuẩn cố định đạm. Mặc dù, diện

tích trồng và sản lượng thu được từ cây đậu phộng ít hơn lúa và cây đậu nành nhưng để đưa vào cơ cấu

chuyển dịch luân canh nhằm giảm áp lực sản xuất cây lúa liên tục 3 vụ như hiện nay bồi dưỡng đất giúp

cải thiện độ phì nhiêu, cắt đứt nguồn lây lan dịch bệnh của cây lúa. Mặt khác, những vùng đất không có

khả năng canh tác lúa thì việc nghiên cứu nâng cao diện tích canh tác cây trồng cạn nói chung và cây đậu

phộng nói riêng cũng là điều cần thiết trong tình hình sản xuất nông nghiệp như hiện nay.

Sử dụng phân bón sinh học là một trong những biện pháp cũng góp phần nâng cao năng suất, phẩm

chất cây trồng. Mục đích khảo sát đánh giá, khắc phục những tác hại do lạm dụng quá nhiều phân đạm

hóa học thì việc sử dụng phân bón sinh học có chứa các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, là một

trong những biện pháp có hiệu quả mà không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí, cân bằng hệ sinh

thái nhưng vẫn đảm bảo góp phần vào việc gia tăng năng suất, chất lượng nông sản và đồng thời góp phần

xây dựng một nền nông nghiệp bền vững và ổn định.

Hiện nay vi khuẩn cố định đạm trên rễ cây họ đậu như đậu nành, đậu xanh, bắp đã được phát triển và

áp dụng. Bên cạnh đó cũng có những chủng vi khuẩn cố định đạm khác như: vi khuẩn Azospirillum có

khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và các chất dinh dưỡng khác (Bilal và ctv, 1990;

Somers ctv, 2005; Dậu và ctv, 2007). Một số chế phẩm vi khuẩn nốt sần được sử dụng cho cây họ đậu để

hân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng cố định đạm của một số chủng vi khu n nốt sần ở...

39

tăng cường khả năng cố định đạm đã được tập trung nghiên cứu nhiều trên cây đậu nành, bắp (Sơn và ctv,

2006). Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng của vi khuẩn cố định đạm trên

cây đậu phộng. Chính vì những lý do trên mục tiêu của nghiên cứu này là bước đầu phân lập, tuyển chọn

và đánh giá khả năng cố định đạm một số chủng vi khuẩn nốt sần ở rễ cây đậu phộng nhằm tìm ra những

chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm làm nguồn nguyên liệu cho việc tạo ra phân đạm sinh học, giúp

bảo vệ môi trường và góp phần bảo đảm cho sự phát triển nông nghiệp bền vững trong khu vực.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

Vật liệu nghiên cứu sử dụng trong đề tài là các chủng (nòi 1-6) vi khuẩn nốt sần được phân lập từ rễ

cây đậu phộng OMĐP13 ở giai đoạn 50 ngày tuổi. Ngoài ra, còn có sử dụng 6 giống đậu phộng (OMĐP1,

OMĐP13, OMĐP15, OMĐP16, OMĐP18, OMĐP23). Các thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí

nghiệm, nhà lưới, sử dụng các trang thiết bị, hóa chất, giống đậu phộng của bộ môn Di Truyền và Chọn

Giống-Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

Thí nghiệm hoàn thiện quy trình phân lập vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần của rễ cây đậu phộng đã

được trồng 50 ngày, tiến hành phân lập trên môi trường YEMA, làm thuần, quan sát hình dạng, thử

nghiệm sinh hóa, kiểm tra sự hình thành nốt sần trong nhà lưới, xác định khả năng cố định đạm của vi

khuẩn với cây đậu phộng, đánh giá hiệu quả cố định đạm.

2.2.1. Chu n bị m i trường phân lập, quan sát hình dạng, định danh, thử nghiệm sinh hóa

Trong các thí nghiệm chúng tôi thử nghiệm các môi trường YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar)

dùng để phân lập vi khuẩn (Fred và ctv, 1932), YEMA cũng sử dụng môi trường trên thạch đứng để quan

sát khả năng tăng trưởng yếm hay kỵ khí, hoặc bổ sung sung từ 0 đến 4% muối NaCl thử nghiệm khả

năng tăng trưởng. Môi trường chọn lọc cho vi khuẩn nốt sần như: YEMA có bổ sung Congo red (Hahn và

ctv, 1966), và môi trường (GPA) glucose-peptone-agar (Kleczkowska và ctv, 1968). Chuẩn bị môi trường

dinh dưỡng có chứa 0,2% tinh bột (Xu và ctv,1995) và môi trường Hofer đánh giá sự tăng trưởng trên

môi trường có pH = 4-12 (Hofer và ctv, 1935). Đối với các thí nghiệm tăng trưởng trên môi trường

YEMA có bổ sung 0-4% muối và môi trường kiềm Hofer có pH = 4-12, mỗi nghiệm thức lập lại 3 ống,

mỗi thí nghiệm lập lại hai lần độc lập.

2.2.2. Thu mẫu và các bước phân lập vi khu n cố định đạm

Đào nhẹ nhàng rễ giống cây đậu phộng OMĐP13 được 50 ngày tuổi và chọn rễ có chứa nốt sần có

màu hồng, khỏe mạnh. Dùng kéo cắt nốt sần từ khối u, sau đó đem đi khử trùng bề mặt của nốt sần bằng

dung dịch CaOCl2 (4%) trong 3 phút. Tiếp theo các nốt sần được rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng

mục đích là để loại bỏ CaOCl2 còn bám trên bề mặt. Sau đó đặt chúng vào dung dịch cồn 70% trong vòng

3 phút, tiếp tục lặp lại các bước rữa với nước cất vô trùng. Lần lượt các nốt sần sạch được nghiền trong

eppendort có chứa nước cất vô trùng tạo thành dịch huyền phù. Dung dịch huyền phù trên được pha loãng

theo bậc 10 và nồng độ từ 10-2

đến 10-6

được cấy vào 3 đĩa petri môi trường YEMA. Các đĩa sau khi cấy

được ủ ở nhiệt độ phòng từ 2-3 ngày, quan sát thấy khuẩn lạc mọc ghi nhận kết quả và tiếp tục cấy

chuyền và làm thuần.

2.2.3. ác phương pháp sử dụng để phân biệt, định danh và quan sát s tăng trưởng

Các phương pháp được dùng để phân biệt, quan sát các đặc điểm nuôi cấy và các hình thái của vi

khuẩn cố định đạm như nhuộm Gram (Vincent và ctv, 1970) và quan sát gram, hình dạng dưới kính hiển

vi, cũng như khả năng tăng trưởng trên môi trường thạch đứng. Khảo sát sự tăng trưởng trên môi trường

có bổ sung glucose, manitol và laclose.

2.2.4. S sản xuất gum

Chuẩn bị môi trường YEMA lỏng, sau đó cho vào bình arlen mỗi arlen tương ứng 100 mL môi

trường. Trước đó đã chuẩn bị môi trường nhân sinh khối của vi khuẩn như sau: Cho 10 mL môi trường

Trần Thị nh Ngu ệt, Trần Minh Tr , à Thanh Đạt, Trần Thu Thảo, Viết Thế

40

YEMA lỏng vào 2 ống nghiệm tương ứng hai nòi, cấy vi khuẩn vào để qua đêm lắc trong 24h ở nhiệt độ

phòng. Sau đó hút 1mL dung dịch vi khuẩn cho vào arlen tương ứng đã chuẩn bị trước còn lại đối chứng.

Ủ liên tục 15 ngày trên máy lắc. Kế tiếp cho 250 µl cồn 95% và 100 mL aceton vào để yên trong 24 h,

tránh sự di chuyển. Tiếp tục lọc dung dịch bằng giấy lọc, sau đó sấy khô ở 37 ºC từ 2-3 ngày. Quan sát,

cân số lượng gum được tạo ra của chủng vi khuẩn và ghi nhận kết quả.

2.2.5. Thử nghiệm catalase bằng phản ứng với oxi già 3%)

Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi của vi khuẩn phân lập được.

Chuẩn bị thành phần môi trường YEMA có bổ sung Congo red. Cấy mỗi chủng vi khuẩn đã phân lập vào

3 đĩa môi trường YEMA, ủ từ 2-3 ngày nuôi cấy. Khi khuẩn lạc đã mọc hoàn chỉnh, thử với H2O2 (3%),

quan sát và ghi nhận có sự sủi bọt hay không sủi bọt của 3 khuẩn lạc trên 3 đĩa môi trường lập lại của

từng dòng vi khuẩn.

2.2.6. S phân hủ m i trường tinh bột theo Xu và ctv 995)

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng có chứa 0,2% tinh bột, thành phần 1l môi trường như sau: Peptone

(5 g), Yeast extract (3 g), NaCl (5,0 g), bột gạo (2 g), agar (15 g). Cấy lần lượt mỗi chủng vi khuẩn vào 3

đĩa petri môi trường, ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 ngày. Sau đó nhỏ dung dịch nhuộm gram Iod vào 3 khuẩn

lạc/mỗi đĩa petri. Quan sát, đánh giá sự hiện diện quầng sáng xung quanh khuẩn lạc.

2.2.7. Kiểm tra s hình thành nốt sần sau khi chủng vi khu n cố định đạm bằng phương pháp chậu

plastic trong nhà lưới

Mục đích kiểm tra vi khuẩn phân lập được có khả năng hình thành nốt sần, cố định đạm ở quy mô

nhà lưới. Quy trình được tiến hành như sau: Lấy đất ngoài ruộng cộng thêm cát, phơi khô, đập nhỏ đem

thanh trùng ở 121 ºC trong 30 phút. Rửa, lau cồn và phơi khô các chậu plastic, cho đất vào và tiến hành

gieo đậu phộng. Các giống đậu phộng trước khi gieo khử trùng bề mặt bằng cồn 70%, rửa thật sạch lại

với nước cất vô trùng, thấm khô. Tất cả các quá trình đều thực hiện trong điều kiện vô trùng tránh sự xâm

nhiễm của các vi sinh vật khác.

Sau 5 ngày đậu phộng bắt đầu nảy mầm khỏi mặt đất, tổng số 22 chậu của mỗi giống OMĐP được

gieo, 6 chậu đối chứng không chủng (K), 8 chậu chủng 1 (C1), 8 chậu chủng 2 (C2). Một mL dịch vi

khuẩn nuôi cấy sau 24 h có nồng độ 2x107 được xác định bằng phương pháp hộp đĩa bơm đều vào các

gốc đậu phộng, sau đó dán bề mặt chậu với màng phủ plastic trong khoảng 1-2 ngày. Tiếp theo, chờ đậu

phộng lớn lên ta đục lỗ cho cây ra khỏi bên ngoài. Thí nghiệm được tưới nước cất vô trùng và quan sát sự

hình thành nốt sần sau 60 ngày gieo.

Rễ cây từ mỗi chậu được đào một cách cẩn thận, rửa sạch với nước và đếm số lượng nốt sần được

hình thành từ mỗi chậu. Các chỉ tiêu khác như trọng lượng tươi của nốt sần, trọng lượng khô, đường kính

của nốt sần, màu sắc nốt sần, số quả trên cây, trọng lượng 100 hạt, sự sinh trưởng và phát triển của cây

cũng được ghi nhận.

2.2.8. Xác định nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo Bremner, 960)

Thân và lá của sáu giống đậu phộng 60 ngày tuổi, trên hai nghiệm thức chủng và không chủng được

cắt và chuyển mẫu phân tích đạm tổng số ở bộ môn Khoa Học Đất - Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

theo phương pháp Kjeldahl.

2.3. Xử lý kết quả và tính toán số liệu

Số liệu được thu thập xử lý trên máy tính bằng chương trình Excel và Cropstat 7.2 (IRRI, 1996).

Mỗi nhóm thí nghiệm khác nhau tính toán hệ số biến thiên (CV%) và LSD (5%).

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Quá trình phân lập vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần của rễ cây đậu phộng

Sau khi chọn được nốt sần khỏe có màu hồng từ rễ cây họ đậu chúng tôi đã tiến hành phân lập và

làm thuần được 6 chủng vi khuẩn. Qua kết quả sơ tuyển cho thấy 6 chủng đều sinh trưởng nhanh, khuẩn

lạc mọc sau 2 ngày nuôi cấy, và kích thước khuẩn lạc đạt được 5,5-6,5 mm sau 7 ngày nuôi cấy. Màu sắc


41

của khuẩn lạc từ trắng nhạt đến trắng trong, hình dạng khuẩn lạc từ tròn đến bầu dục, bề mặt có chủng thì

lồi, dẹt nhầy nhớt, màu sắc khuẩn lạc trắng trong, có đường viền trong suốt, hoặc trắng sữa quanh khuẩn

lạc, kích thước tăng nhanh sau 72 giờ nuôi cấy. Khi quan sát dưới kính hiển vi, vi khuẩn có khả năng di

động, hiếu khí, hình que ngắn, là vi khuẩn gram âm bắt màu hồng khi nhuộm.

Để loại bỏ những chủng không thuộc nhóm cộng sinh nốt sần, 6 chủng tiếp tục thử nghiệm trên môi

trường YEMA có bổ sung Congo red bởi vì đây là chất chị thị đặc biệt hữu hiệu và là môi trường chọn

lọc tốt nhất để phân biệt hay kiểm tra độ thuần của vi khuẩn nốt sần (Hình 1). Kết quả ở là khuẩn lạc vi

khuẩn có hình dạng trắng tròn, mờ sáng lấp lánh, màu trắng hoặc màu hơi đỏ nguyên nhân là do sự hấp

thụ của loài này với thuốc nhuộm rất yếu, tiếp tục loại bỏ những chủng có khả năng hấp thụ mạnh với

thuốc nhuộm Congo red (Hình 1).

ình . Hình dạng của khuẩn lạc trên môi trường YEMA bổ sung Congo red chủng hấp thụ yếu (B),

hấp thụ mạnh (A)

Dựa trên nguyên tắc vi khuẩn cố định đạm không sử dụng peptone cho quá trình sinh trưởng. Do

vậy, môi trường chọn lọc GPA dùng để phân biệt vi khuẩn phân lập từ nốt sần sau khi ủ từ 2-3 ngày. Kết

quả cho thấy rằng các chủng phân lập này không phát triển hay phát triển rất yếu trên môi trường này vì

đơn giản các nòi vi khuẩn này không thể sử dụng peptone làm nguồn nguyên liệu cho sự nhân đôi tế bào,

cũng như phát triển (Hình 2).

Qua hai thử nghiệm trên môi trường chọn lọc trên chúng tôi lựa chọn được 2 chủng đáp ứng hai điều

kiện không tăng trưởng trên môi trường GPA, và hấp thụ yếu đối với Congo red. Hai chủng C1 và C2 này

tiếp tục các thử nghiệm sinh lý sinh hóa và khả năng hình thành nốt sần và cố định đạm.

ình . Quan sát sự mọc của khuẩn lạc trên môi trường thử nghiệm GPA

(glucose- peptone-agar).

3.2. Quan sát đặc điểm sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn nốt sần

Khi quan sát khả năng tăng trưởng trên môi trường YEMA thạch đứng của hai chủng chúng tôi ghi

nhận rằng vết cấy mọc tốt từ đáy ống nghiệm đến bề mặt thạch sâu sau hai ngày cấy đều đó chúng tỏ rằng

hai chủng có khả năng di động. Ngoài ra, xác định khả năng hiếu khí bằng các nhỏ dung dịch H2O2 (3%)

vào các khuẩn lạc quan sát thấy hầu hết đều có hiện tượng sủi bọt xảy ra chứng tỏ cả hai chủng trên đều

hiếu khí.

Để quan sát tính tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn cố định đạm chúng tôi cũng quan sát khả năng

tăng trưởng trên môi trường YEMA có bổ sung muối NaCl 0,5-4% và môi trường Hofer pH=4-12. Sau

hai ngày cấy hai chủng vi khuẩn vào môi trường lỏng nhận thấy rằng có sự khác biệt giữa các nghiệm

thức: ở nồng độ muối đối chứng là không cấy vi khuẩn thì không có sự phát triển môi trường vẫn trong. Ở

các nồng độ muối 0,5-2% 2 chủng phát triển rất tốt làm đục cả môi trường, bắt đầu phát triển yếu ở nồng

độ 2,5% và nồng độ từ 3-4% không phát triển (Hình 3). Kết quả quan sát trên 2 lần thiết kế thí nghiệm

độc lập và cho kết quả tương tự là chủng phân lập được có thể chống chịu mặn được ở 2% và hy vọng

rằng chủng này có thể đáp ứng với những loại đất có các nồng độ cation và anion cao. Quan sát sự sinh

A B


42

trưởng và độ đục của hai chủng vi khuẩn trên môi trường YEM lỏng có sự khác biệt về pH từ 4-12. Ở các

ống nghiệm có pH từ 4-5 không phát triển được, pH = 6 phát triển nhưng rất yếu, còn ở các ống nghiệm

có pH từ 7-10 phát triển rất tốt, riêng ở pH bằng 11 có sự phát triển nhưng yếu và pH = 12 là không phát

triển (Bảng 1).

ình 3 Sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn số 2 ở các nồng độ muối NaCl từ 0,5 - 4%.

Bảng 1. Sự tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn nốt sần ở các độ pH 4-12

Độ pH

Chủng 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Chủng 1 - - + + + + + + -

Chủng 2 - - + + + + + + -

Ngoài ra, chúng tôi cũng tập trung quan sát sự sản xuất gum (polysaccharide được chiết xuất từ vỏ

màng của tế bào vi khuẩn) và tiêu thụ các nguồn đường carbon. Khi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng,

ủ ở nhiệt độ 37 ºC trong 15 ngày, kết tủa rồi sấy khô cho thấy chủng thứ nhất tạo được khối lượng gum

nhiều nhất đạt 0,91 mg/100 mL và chủng thứ hai thấp hơn chỉ đạt 0,89 mg/100 mL trong khi đó thì đối

chứng chỉ đạt 0,3 mg/100 mL (Bảng 2). Đều đó cho thấy rằng cả hai nòi đều phát triển và cho kết quả cao

hơn so với đối chứng không có hiện diện của vi khuẩn. Thí nghiệm sử dụng các nguồn đường carbon cho

thấy rằng chỉ có manitol cho sự phát triển mạnh đục hoàn toàn môi trường sau hai ngày nuôi cấy trong khi

đó đối với các nguồn glucose và lactose thì phát triển rất yếu đều này được thể hiện bởi mật độ quang của

môi trường có chứa manitol cao hơn so với glucose và lactose (Bảng 2). Kết quả này cũng phù hợp bởi vì

môi trường dùng để phân lập ban đầu YEMA có chứa nhiều đường manitol.

Bảng 2. Sự sản xuất gum và tiêu thụ các nguồn đường carbon

Chủng Manitol Glucose Lactose Sản xuất Gum (mg/100 mL)

Chủng 1 Rất mạnh Rất yếu Rất yếu 0,91

Chủng 2 Rất mạnh Rất yếu Rất yếu 0,89

Do mỗi loại vi khuẩn có khả năng tăng trưởng và phát triển trên môi trường nhất định bằng cách sử

dụng các nguồn đường làm vật liệu. Với mục đích xem hai chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng sử

dụng tinh bột như một đường phức được cấu tạo từ glucose như là nguồn năng lượng của carbon và năng

lượng cho sự phát triển. Đây là môi trường quyết định vi khuẩn có khả năng tạo ra enzyme amylase, vì

chính enzyme này sẽ phân cắt các phân tử glucose có trong tinh bột.


43

Giống

Số lượng nốt sần

(Nốt)

Trọng lượng tươi

nốt sần

(g)

Trọng lượng khô

nốt sần

(g)

C1 C2 K C1 C2 K C1 C2 K

OMĐP1 10,0 11,5 1,8 0,21 0,36 0,009 0,06 0,06 0,004

OMĐP13 14,6 14,1 1,0 0,51 0,47 0,004 0,13 0,11 0,0003

OMĐP15 13,0 16,1 1,0 0,54 0,35 0,01 0,12 0,08 0.004

OMĐP16 8,0 13,8 2,9 0,3 0,77 0,02 0,08 0,06 0,005

OMĐP18 12,1 13,9 1,0 0,36 0,42 0,001 0.05 0,09 0,0001

OMĐP23 13,3 16,1 2,8 0.5 0,54 0,02 0,11 0,12 0.005

Cv (%) 70,1 100,9 103,4

LSD (5%) 6,4 0,3 0.07

ình 4. Thử nghiệm thủy phân tinh bột ở hai chủng vi khuẩn

Sau khi cấy hai chủng trên môi trường YEMA và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm

Iod được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của tinh bột và quan sát thấy rằng không có vòng sáng xung

quanh khuẩn lạc, chứng tỏ có sự thủy phân tinh bột là âm tính tức là hai chủng vi sinh vật không thể tạo

ra enzyme amylase. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Bảng 2.

3.3. Kiểm tra sự hình thành nốt sần và khả năng cố định đạm trong chậu khi chủng vi khuẩn cố

định đạm đã phân lập

Qua quá trình phân lập, đánh giá mối quan hệ giữa chủng vi khuẩn phân lập được ở rễ cây họ đậu.

Chúng tôi đã xác định mối liên hệ về sự tăng trưởng và cộng sinh của chúng, nhận thấy rằng việc chọn

đúng cây chủ và nòi vi khuẩn tương hợp có vai trò quan trọng trong hệ thống cố định nitơ cộng sinh. Vì

thế đây là một trong những biện pháp quan sát sự hình thành nốt sần khi chủng và không chủng với vi

khuẩn phân lập được trong chậu plastic ở giai đoạn 55-60 ngày sau khi gieo hạt. Trong điều kiện kiểm

soát sự nhiễm của các vi sinh vật khác, chúng tôi quan sát khả năng hình thành nốt sần của 6 giống đậu

phộng trong nghiệm thức có chủng số lượng nốt sần khác nhau tùy thuộc vào giống, kích thước bé (từ

0,5-1 mm), và nốt sần không màu đến màu hồng (Bảng 3). Nhưng khi quan sát giữa hai nghiệm thức

chủng và không chủng chúng tôi nhận xét có sự khác biệt rất lớn về màu sắc của giống đối chứng không

chủng cây phát triển còi cọc, màu lá vàng trong khi đó ở tất cả các giống có chủng hai chủng vi khuẩn thì

cây phát triển rất khỏe trong cùng điều kiện chăm sóc hạn chế tạp nhiễm và không có bón phân.

Sau khi quan sát sự sinh trưởng và phát triển chúng tôi nhận thấy hai chủng tiêm vào 6 giống đậu

phộng (các giống này được trồng thử nghiệm ở nhiều địa phương) cho thấy cả hai chủng đều đem lại hiệu

quả hơn so với đối chứng, đặc biệt hiệu quả chủng thứ hai cho các yếu tố như số lượng nốt sần, trọng

lượng tươi, trọng lượng khô của nốt sần, số trái/cây, trọng lượng trăm hạt và hàm lượng đạm tổng số

trong cây đậu đều cao hơn hẳn so với đối chứng không nhiễm và các công thức nhiễm với chủng thứ nhất

(Bảng 3 và 4).

ình 5 Sự phát triển của giống OMĐP1 bên trái, OMĐP13 bên phải trong điều kiện chủng và không

chủng trong nhà lưới

Bảng 3. Khả năng hình thành nốt sần và trọng lượng của nốt sần trong điều kiện chậu plastic

A B


44

Bảng 4. Quan sát khả năng hình thành nốt sần và khả năng cố định đạm của hai chủng vi khuẩn

): chủng hạt với chủng thứ nhất, ): chủng hạt với chủng thứ hai, K: kh ng chủng

Năng suất và thành phần năng suất của các giống cũng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Trọng

lượng khô của quả và trọng lượng 100 hạt là chỉ tiêu phản ánh đầy đủ nhất hiệu quả của việc chủng vi

khuẩn nốt sần cho cây đậu phộng. Ngoài ra, cũng đã chứng minh được vai trò của việc chủng vi khuẩn

trong việc nâng cao năng suất đậu phộng. Phần trăm lượng đạm tổng số có sự khác biệt rất lớn ở nghiệm

thức có chủng và không chủng đặc biệt ở chủng thứ hai (Hình 6). Khả năng cố định đạm của giống

OMĐP18 cao nhất (2,29%), kế tiếp là OMĐP13 (2,05%) có lượng đạm tổng số cao và nhỏ nhất ở giống

OMĐP16 (1,37%) ở nghiệm thức có chủng số hai. Tuy nhiên, ở nghiệm thức chủng 1 giống OMĐP13 có

% đạm tổng số cao nhất (1,66%) và nhỏ nhất là giống TLĐP1 (Bảng 6). Số liệu trong (Bảng 5 và Hình 6)

thì giống OMĐP13 và OMĐP18 là giống có hiệu lực cố định đạm cao nhất thể hiện bằng các số liệu %

đạm tổng số, trọng lượng quả khô và trọng lượng 100 hạt. Số quả trên cây của sáu giống đậu quan sát ở

giai đoạn 90 ngày cũng có sự khác biệt rất rõ rệt giữa hai nghiệm thức chủng và không chủng. Giống

OMĐP18 có số quả trên cây cao nhất đạt 13,1 quả và giống OMĐP13 nhỏ nhất chỉ có 8,8 quả ở chủng số

1. Khi nhiễm với chủng thứ hai OMĐP23 cho số quả cao nhất, kế tiếp là OMĐP18, OMĐP13 cùng đạt

14,3 quả. Số quả trên cây của các giống đều cao và có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức không chủng.

Tương tự trọng lượng 100 hạt cũng giống như các đặc điểm khác, đối chứng vẫn thấp hơn so nghiệm thức

chủng vi khuẩn nốt sần (C1, C2). Trọng lượng 100 hạt của giống TLĐP18 nặng nhất (135,5 g) và nhẹ

nhất TLĐP1 (91,7 g) khi chủng với chủng vi khuẩn thứ nhất và cũng là hai giống nặng nhất và nhẹ nhất

khi chủng với chủng thứ hai. Hầu hết là nốt sần của các giống đều có màu hồng và tập trung thành chùm

ở rễ cái và gần rễ phụ khi quan sát ở giai đoạn 60 ngày (Hình 7).

Bảng 5. Đánh giá hiệu quả của việc nhiễm các chủng vi khuẩn đến sinh trưởng và trọng lượng khô

của trái

Đạm tổng số

(%)

Quả/cây Trọng lượng quả tươi

(g)

Giống C1 C2 K C1 C2 K C1 C2 K

OMĐP1 1,15 1,70 1,14 10,4 11,9 7,6 12,6 14,5 11,6

OMĐP13 1,66 2,05 1,16 8,8 14,3 10,9 12,5 17,7 10,9

OMĐP15 1,49 1,52 1,01 11,4 11,4 7,5 14,4 14,0 11,6

OMĐP16 1,30 1,37 1,19 10,1 13,9 8,8 12,1 14,9 12,5

OMĐP18 1,36 2,29 1,21 13,1 14,3 8,5 19,3 22,2 15,2

OMĐP23 1,28 1,46 1,28 10,0 15,5 6,8 12,4 21,6 10,0

Cv (%) 6,0 21,5 27,0

LSD (5%) 0,19 2,3 3,9

Cao cây

(cm)

Trọng lượng quả khô

(g)

Trọng lượng 100 hạt

(g)

Giống C1 C2 K C1 C2 K C1 C2 K

OMĐP1 48,1 50,9 51,9 9,1 11,1 7,6 91,7 90,8 69,7

OMĐP13 49,0 56,4 43,3 12,5 17,7 10,9 102,5 102,6 82,9

OMĐP15 48,7 46,9 53,9 14,4 14,0 11,7 111,9 119,9 100,0

OMĐP16 44,9 45,1 41,3 10,0 12,2 9,2 124,8 125,1 89,2

OMĐP18 48,5 58,5 42,0 19,3 22,2 15,2 135,5 149,8 114,0

OMĐP23 47,5 51,8 40,8 9,2 16,1 6,5 111,5 111,2 108,5

Cv (%) 6,0 24,1 2,5

LSD (5%) 0.19 2,67 5,9


45

Năng suất và thành phần năng suất của các giống cũng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Trọng

lượng khô của quả và trọng lượng 100 hạt là chỉ tiêu phản ánh đầy đủ nhất hiệu quả của việc chủng vi

khuẩn nốt sần cho cây đậu phộng. Ngoài ra, cũng đã chứng minh được vai trò của việc chủng vi khuẩn

trong việc nâng cao năng suất đậu phộng. Phần trăm lượng đạm tổng số có sự khác biệt rất lớn ở nghiệm

thức có chủng và không chủng đặc biệt ở chủng thứ hai (Hình 6). Khả năng cố định đạm của giống

OMĐP18 cao nhất (2,29%), kế tiếp là OMĐP13 (2,05%) có lượng đạm tổng số cao và nhỏ nhất ở giống

OMĐP16 (1,37%) ở nghiệm thức có chủng số hai. Tuy nhiên, ở nghiệm thức chủng 1 giống OMĐP13 có

% đạm tổng số cao nhất (1,66%) và nhỏ nhất là giống TLĐP1 (Bảng 6).

ình 6. Phần trăm đạm tổng số cố định được của chủng 1 và chủng 2 so sánh với nghiệm thức không

chủng của 6 giống đậu phộng có triển vọng.

Số liệu trong (Bảng 5 và Hình 6) thì giống OMĐP13 và OMĐP18 là giống có hiệu lực cố định đạm

cao nhất thể hiện bằng các số liệu % đạm tổng số, trọng lượng quả khô và trọng lượng 100 hạt. Số quả

trên cây của sáu giống đậu quan sát ở giai đoạn 90 ngày cũng có sự khác biệt rất rõ rệt giữa hai nghiệm

thức chủng và không chủng. Giống OMĐP18 có số quả trên cây cao nhất đạt 13,1 quả và giống OMĐP13

nhỏ nhất chỉ có 8,8 quả ở chủng số 1. Khi nhiễm với chủng thứ hai OMĐP23 cho số quả cao nhất, kế tiếp

là OMĐP18, OMĐP13 cùng đạt 14,3 quả. Số quả trên cây của các giống đều cao và có ý nghĩa thống kê

so với nghiệm thức không chủng. Tương tự trọng lượng 100 hạt cũng giống như các đặc điểm khác, đối

chứng vẫn thấp hơn so nghiệm thức chủng vi khuẩn nốt sần (C1, C2). Trọng lượng 100 hạt của giống

TLĐP18 nặng nhất (135,5 g) và nhẹ nhất TLĐP1 (91,7 g) khi chủng với chủng vi khuẩn thứ nhất và cũng

là hai giống nặng nhất và nhẹ nhất khi chủng với chủng thứ hai. Hầu hết là nốt sần của các giống đều có

màu hồng và tập trung thành chùm ở rễ cái và gần rễ phụ khi quan sát ở giai đoạn 60 ngày (Hình 7).

ình 7. Khả năng hình thành nốt sần của giống TLĐP 13 và TLĐP 16

4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Phân vi sinh có nhiều ưu điểm như phân hóa học như tăng năng suất, cải thiện chất lượng của cây

0

0.5

1

1.5

2

2.5

OMĐP1 OMĐP13 OMĐP15 OMĐP16 OMĐP18 OMĐP23

Đạ

m t

ổn

g số

(%

)

Giống

Phân tích đạm tổng số của 6 giống đậu phộng

C1

C2

K


46

trồng, giảm chi phí sản suất, ngoài ra còn góp phần bảo vệ sinh thái môi trường và nông nghiệp bền vững.

Tuy nhiên, tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng của nhu cầu thực tiển do nhiều

nguyên nhân, trong đó người tiêu dùng chưa mạnh dạn sử dụng là do chất lượng sản phẩm vẫn chưa ổn

định. Để hoàn thiện nâng cao chất lượng chế phẩm phân vi sinh cố định đạm thì việc phân lập, tuyển chọn

chính xác là khâu quan trọng nhất thì nghiên cứu này đã cung cấp được ý nghĩa khoa học cơ bản.

Đã hoàn thiện được các bước phân lập, tuyển chọn và xác định nhanh vi khuẩn nốt sần trong rễ cây

đậu phộng. Trong số các chủng phân lập được bước đầu xác định được 6 chủng (NS1-NS6) có đặc điểm

và hình dạng khuẩn lạc tương đối điển hình. Qua quá trình sàng lọc bằng các phản ứng sinh lý, sinh hóa,

đã sơ tuyển chỉ được hai chủng có khả năng phát triển mạnh, thuộc nhóm mọc nhanh, hiếu khí, có khả

năng chịu được pH cao, chịu mặn. Khuẩn lạc này không bắt màu với thuốc nhuộm Congo red, không phát

triển trên môi trường peptone và kháng sinh. Khi quan sát dưới kính hiển vi có khả năng di động, hình

que và là vi khuẩn gram âm.

Tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn có khả năng tăng trưởng trên môi trường YEMA có bổ sung

thêm nồng độ muối 2% và phát triển rất tốt trên môi trường kiềm pH từ 7-10. Mặt khác cả hai nòi cho kết

quả âm tính khi thử nghiệm tinh bột, chỉ có khả năng phát triển và tiêu thụ trong môi trường có chứa

nguồn đường manitol, phát triển rất yếu trong môi trường có chứa glucose và lactose. Về khả năng tạo

gum, chủng thứ nhất có khả năng tạo gum cao nhất 0,91 mg và thấp hơn ở chủng thứ hai 0,89 mg. Khi

chủng hai dòng vi khuẩn này riêng lẻ cho từng giống đậu phộng được trồng invitro trong nhà lưới, kết

luận rằng hai chủng vi khuẩn tiếp tục cho khả năng cố định đạm cao, và khả năng hình thành nốt sần so

với nghiệm thức không chủng. Các nghiệm thức dùng vi khuẩn nhiễm hạt đều có số lượng, khối lượng

nốt sần, trọng lượng 100 hạt, trọng lượng quả tươi, trọng lượng khô lớn hơn một cách rõ rệt so với đối

chứng.

Về ý nghĩa thực tiển kết quả của đề tài là cơ sở cho việc phân lập và chọn lọc các dòng vi khuẩn cố

định đạm trong rễ của cây lạc, có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất chế phẩm vi sinh.

4.2. Đề nghị

Do thời gian tiến hành nghiên cứu còn ngắn và giới hạn chỉ trong một vụ, nên để có kết quả chính

xác và đầy đủ hơn, đề nghị tiếp tục tiến hành thí nghiệm ở các vụ tiếp theo, và trên các chân đất khác

nhau để có kết luận hoàn thiện hơn.

Sử dụng sự hỗ trợ của sinh học phân tử để giúp sàn lọc, định danh vi khuẩn cố định đạm nhanh

chóng, chính xác giúp rút ngắn thời gian.

Quan sát khả năng hình thành nốt sần với cây đậu phộng trồng thử nghiệm trong điều kiện tự nhiên

có bổ sung lượng phân bón thích hợp.

Dựa vào chủng vi khuẩn phân lập được tiếp tục nghiên cứu các chế phẩm phân bón vi khuẩn nốt sần

ở dạng rắn, lỏng hay bán rắn cho đậu phộng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bilal R; Rarul G; Queshi J. A; Malik K.A. - Characterization of Azospirillum and related

diazotrophs associated with roots of plants growing in saline soils. World J Microbiol 6 (1990) 46-

59.

2. Somers E. D; Patcek P; Gysegom M. Srinivasan and J. Vanderleyden. - Azospirillum brasilense

produces the auxin-like phenylacetic acid by using yhe key enzyme for indole-3-acetic acid

biosynthesis. App Environ Microbiol 71 (2005) 1803-1810.

3. Lăng Ngọc Dậu, Nguyễn thị Xuân My, Cao Ngọc Diệp. - Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và

sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillum lipoferum. (2007) Viện công nghệ sinh hoc, Đại học

cần thơ.

4. Tran Thi Ngoc Son; Cao Ngoc Diep and Truong Thi Minh Giang. -Effect of Bradyrhizobia and

Phosphate solubilizing bacteria application on soybean in rotational system in the Mekong Delta.

Omon Rice 14 (2006) 48-57.


47

5. Fred E.B., Baldwin I.L; McMoy E. -Root nodule bacteria and leguminous plants. Univ of

Wisconsin Studies in Science 5 (1932) 343-356.

6. Hahn NJ. -The congored raction in bacteria and its use-fulness in the identification of rhizobia. Can

J Microbiol 12 (1996) 725-33.

7. Kleczkowska Nutman PS. -The identification and classification of rhizobia ‘Identification methods

for mi-crobiologists; Part B ed. B.M. Gibbs and D.A. Shapton Academic press, London and New

York, (1968) pp 51.

8. Hofer AW. - Method for distinguishing between legume bacteria amd their most common

contaminant. J Amer Soc Agron 27 (1935) 228-30.

9. Vincent J.M. A manual for the practical study of the root nodule bacteria. IPB Handbook 1970 no.

15. England; Black Well Scientific Publications Ltd., Oxford.

10. Xu L. M., Ge C., Cui Z., Li J., Fan H. Bradyrhizobium liaoningense sp. nov., isolated from the

root nodules of soybean. Int J Syst Evol Microbiol 45 (1995) 706-711.

11. Bremner J.M. - Determination of nitrogen in soil by the Kjeldahl method. The Journal of

Agricultural Science 55 (1960) 11-33.

ABSTRACT

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF NITROGEN FIXING BACTERIA COLLECTED

FROM ROOT NODULES OF PEANUT (Arachis hypogaea. L)

Tran Anh Nguyet1, *

, Tran Minh Tri1, Ha Thanh Đat

1, Tran Thu Thao

1, Ho Viet The

2

1Cuu Long Delta Rice Research Institute,

2HCM University of Food Industry

*Email: [email protected]

Six isolated strains of nitrogen fixing bacteria isolated from root nodules of peanut (Arachis

hypogaea. L). Through identifying of characteristics, morphology, physiology, biochemistry, only two

isolates meet the above requirements. Fixing nodules bacteria grow well on YEMA medium, gram

negative, rod shape, aerobic, mobility ability, showed good growth on Congo red yeast extract mannitol

agar (YEMA) medium and did not produce chromo genesis on Congo red medium, not formed colonies

on Glucose-Peptone-Agar medium, they able to grow in NaCl 0.5- 2% and growing Hofer’s alkaline

broth (pH 7-10). On the other hand, two isolates gave negative results for intrinsic antibiotic resistance

and starch hydrolysis. Isolate 1 produced maximum gum production 0.91 mg and minimum isolate 2

produced 0.89 mg. Glucose and lactose consumption were very weak compared with mannitol carbon

source. Two strains of bacteria continue to demonstrate a high nitrogen-fixing ability through the ability

to form nodules and percentage total nitrogen in net house condition. The treatments used infectious

bacteria showed the significance difference with without treatments the number of nodules, 100 seeds

weight, plant height and plant fresh weight significantly greater than compared to without treatment. On

the basis of result obtained in the present observation it can be concluded that isolate two strains were

found to be the best isolate of nitrogen fixing bacteria and can be exploited as bio-fertilizers for better

peanut yield production and reduced cost production.

Keywords: nitrogen fixing bacteria, peanut, root nodules, YEMA.

phÂn lẬp, tuyỂn chỌn vÀ ĐÁnh giÁ khẢ nĂng cỐ ĐỊnh...

Documents