phÂn lẬp trÊn cÁ rÔ phi giỐng (oreochromis spp.)
TRANSCRIPT
1
KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT QUẾ (Cinnamomum
verum) VÀ GỪNG (Zingiber officinale Rose) TÁCH CHIẾT BẰNG
ETHANOL ĐỐI VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus agalactiae
PHÂN LẬP TRÊN CÁ RÔ PHI GIỐNG (Oreochromis spp.)
Đoàn Văn Cường1*, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh1, Mã Tú Lan1, Nguyễn Thành Nhân1
TÓM TẮT
Vi khuẩn Streptococcus agalactiae được biết đến như là tác nhân gây bệnh và gây chết nghiêm trọng trên nhiều loài
cá nước ngọt và nước mặn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát hiệu quả kháng khuẩn đối với hai chủng vi
khuẩn Streptococcus agalactiae được phân lập từ cá rô phi bị bệnh lồi mắt, xuất huyết thu tại thành phố Hồ Chí
Minh bởi cao chiết quế và gừng, được tách chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol ở 3 nồng độ
riêng rẻ (96%, 72%, 48%) và liên tục (96% tiếp đến 72% và 48%). Kết quả cho thấy cao chiết quế trong dung môi
ethanol 96% cho đường kính vòng kháng khuẩn 29-34 mm, giá trị MIC = 2 mg/ml, MBC = 8 mg/ml; cao chiết gừng
trong dung môi ethanol 96% cho đường kính vòng kháng khuẩn 14-17 mm, giá trị MIC = 1 mg/ml, MBC = 2
mg/ml. Cao chiết quế và gừng trong ethanol 96% là hai loại cao thảo dược tiềm năng có khả năng ứng dụng để
phòng trị bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi.
Từ khóa: cá rô phi, cao chiết gừng, cao chiết quế, phương pháp ngấm kiệt, Streptococcus agalactiae.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trên cá rô phi, bệnh lồi mắt, xuất huyết thường xuất hiện vào mùa mưa và các tháng giao mùa ở
Đồng bằng sông Cửu Long và Đông Nam Bộ, với tỷ lệ chết cao (gần như 100% từ khi phát hiện
bệnh), gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi, bệnh này được xác định do vi khuẩn
Streptococcus agalactiae gây ra (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2012). Vi khuẩn Streptococcus
agalactiae được biết đến như là tác nhân gây bệnh và gây chết nghiêm trọng trên nhiều loài cá
nước ngọt và nước mặn như: cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá rô phi (Oreochromis sp), cá
cam (Seriola quinquerodiata), cá phèn (Upeneus moluccensis), cá chim (Stromateoides). Tháng
7-9/2009, dịch bệnh xảy ra gây chết với tỷ lệ cao 86,5-100% tại Hà Nội, Hưng Yên, Hải Dương,
Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Ninh và Hà Giang (Viện NCNT Thuỷ sản I, 2017). S. agalactiae là
một trong hai loài vi khuẩn chính ảnh hưởng đến việc sản xuất cá rô phi trên thế giới, loài còn lại
là S. iniae (Evans và ctv., 2006). Nghiên cứu của Brian cho thấy, bệnh do vi khuẩn Streptococcus
gây ra trên cá rô phi ở các nước Châu Á như: Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia, Philippines,
Thái Lan là S. agalactiae type 2 (Brian Sheehan và ctv., 2009). Chủng vi khuẩn S. agalactiae
1 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II
*Email: [email protected]
2
type 2 cũng được phân lập từ các mẫu cá rô phi đỏ có dấu hiệu xuất huyết và phù mắt tại Việt
Nam (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2012).
Hiện nay, giải pháp phổ biến để phòng trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá là sử dụng kháng sinh hay
hóa chất. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh, hóa chất vẫn còn bộc lộ nhiều bất cập, gây nên
hiện tượng kháng kháng sinh ở các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản, và truyền các
gene kháng kháng sinh cho các loài vi khuẩn trong môi trường và vi khuẩn gây bệnh trên người.
Ngoài ra, việc tích lũy kháng sinh trong động vật thủy sản có thể gây hại cho môi trường và cho
người tiêu thụ. Vì vậy, các nhà khoa học đang tìm kiếm các giải pháp thay thế (vaccine,
probiotic…) trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Trong thời gian
gần đây, việc sử dụng thảo dược trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn đang ngày càng trở nên phổ
biến do những ưu điểm: dễ tìm kiếm, giá thành thấp, hoạt tính kháng khuẩn cao, có khả năng
kích thích hệ miễn dịch tự nhiên của vật chủ, thân thiện với môi trường, không gây nên hiện
tượng đề kháng thuốc và đặc biệt đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm đối với con người
(Rattanachaikunsopon và ctv., 2009).
Một số nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của các loại thảo dược: cây xương cá
(Stella aquatic), hoa móc tay (Impatiens biflora), cây anh thảo (Oenothera biennis), cây ngải cứu
(Artemisia vulgaris) và cây kim ngân (Lonicera japonica) giúp kháng lại các bệnh do vi khuẩn
và virus ở cá (Shangliang, 1990). Dịch chiết của cây ổi (Psidium guajava) có thể kiểm soát bệnh
xuất huyết do Aeromonas hydrophila gây ra trên cá nước ngọt (Pachanawan và ctv., 2008). Các
nghiên cứu về cây dược liệu cũng cho thấy rằng, củ hành tím (Allium ascalonicum) có tác dụng
kháng viêm và tiêu diệt các vi khuẩn lây nhiễm (bao gồm cả vi khuẩn E.coli và Salmonella), giúp
tăng cường miễn dịch và được xem như là loại thảo dược chứa các chất kháng sinh tự nhiên cực
kỳ an toàn và hiệu quả. Đối với nhóm vi khuẩn Streptococcus, đã có nhiều nghiên cứu tìm ra một
số loại thảo dược có tác dụng kháng Streptococcus cũng như xác định được loại dung môi tạo
dịch chiết đạt hiệu quả kháng Streptococcus mạnh nhất. Dịch ép của cỏ lào (Eupatorium
odoratum) đã được đánh giá là có khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococcus sp. gây
bệnh trên cá rô phi vằn. Dịch chiết lá hẹ (Allium tuberosum) có khả năng kháng vi khuẩn
Streptococcus sp. cao, trong đó nước, ethanol và methanol là các loại dung môi cho dịch chiết có
tác dụng kháng S.agalactiae cao (Trương Thị Mỹ Hạnh, 2008). Dịch chiết lá cây hương thảo
(Rosmarinus officinalis) có hiệu quả trị bệnh nhiễm khuẩn do Streptococcus sp. trên cá rô phi
(Oreochromis spp.) (Abutbul và ctv., 2004). Nghiên cứu thực hiện trên cá rô phi lai (O. niloticus
3
x O. aureus) trong 4 tuần với khẩu phần ăn có 0,5% tỏi (Allium sativum) cho thấy có tác dụng
nâng cao miễn dịch và tính đề kháng bệnh của cá (Ndong và ctv., 2007). Dịch chiết bằng nước
của lá chùm ngây (Moringa oleifera) có tác dụng kháng vi khuẩn S. agalactiae type 2 mạnh nhất,
theo sau là chiết xuất bằng dung môi Chloroform của lá sầu đâu (Azadirachta indica) (Kamble
và ctv., 2014). Dịch chiết vỏ quế (Cinnamomum verum), củ tỏi (Allium sativum), hoa đinh hương
(Eugenia caryphyllus), cỏ xạ hương (Thymus vulgaris) cũng có tác dụng kháng S. agalactiae
(Alsaid và ctv., 2010). Tác dụng kháng S. agalactiae của 6 loại dịch chiết thảo dược muồng trâu
(Cassia alata L), măng cụt (Garcinia mangostana), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata),
ổi (P. guajava), duối nhám (S.asper), tỏi (Allium sativum) trong 3 dung môi khác nhau (nước,
95% ethanol, methanol) trên cá rô phi, kết quả cho thấy dịch chiết bởi dung môi nước của xuyên
tâm liên (Andrographis paniculata) có tác dụng kháng S. agalactiae mạnh nhất trong số 6 loại
thảo dược, với đường kính vòng vô khuẩn đạt 27,5 mm và giá trị MIC đạt 31,25 µg/ml. Bên cạnh
đó, dịch chiết bởi ethanol của ổi (P. guajava) và dịch chiết bởi nước của cây duối nhám (S.
asper) cũng có tác dụng kháng S. agalactiae mạnh. Kết quả thí nghiệm in vivo cho thấy khi cá rô
phi ăn thức ăn có bổ sung bột lá xuyên tâm liên tách chiết bằng dung môi nước, đã giúp làm
giảm tỉ lệ chết của cá khi gây nhiễm với S. agalactiae (Rattanachaikunsopon và ctv., 2009).
Trước đây nhóm đã khảo sát trên mười loại dược liệu bằng phương pháp ngâm trong dung môi
nước, ethanol 96% và methanol 96%, trong đó quế và gừng ngâm trong ethanol và methanol có
tác dụng kháng Streptococcus agalactiae cao nhất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục
khảo sát tính kháng khuẩn của 2 loại cao chiết thảo dược (gừng và quế) tách chiết bằng phương
pháp ngấm kiệt trong dung môi ethanol với các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra nồng độ tối ưu
cho tách chiết đối với hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae CC-2.1 và Q9-8.1 thu từ cá
rô phi có biểu hiện xuất huyết, lồi mắt ở thành phố Hồ Chí Minh.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Phương pháp thu mẫu, phân lập và định danh vi khuẩn
Thu mẫu gan, thận, lách trên cá rô phi giống đang bị bệnh lồi mắt, xuất huyết nuôi ao ở Trung
tâm Giống thủy sản và cây trồng tại xã Tân An Hội, huyện Củ Chi và bè nuôi tại phường Long
Trường, quận 9, Tp. Hồ Chí Minh. Thu những con cá còn sống, có các triệu chứng bệnh tích: lồi
mắt, xuất huyết (hậu môn, thân, đầu, nắp mang,…), mổ cá và ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý bên
trong cơ thể cá. Dùng que cấy để lấy mẫu bệnh phẩm trên các nội tạng gan, thận, lách. Mẫu bệnh
phẩm được cấy trên đĩa môi trường Brain-Heart Infusion Agar (110493, Merck) để phân lập vi
4
khuẩn và Blood Agar (110886, Merck) để xác định các dạng tan huyết, trong đó tan huyết dạng β
là tan huyết hoàn toàn xung quanh khuẩn lạc, tan huyết dạng α là chỉ tan huyết một phần và có
màu xanh hoặc nâu xung quanh khuẩn lạc (Buxton, 2005). Đĩa cấy được ủ ở nhiệt độ 35°C trong
tủ ấm (Memmert-UFB 400) trong 24-48 giờ. Hình dạng, kích thước của các khuẩn lạc phân lập
từ mẫu bệnh được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (11885, Merck). Sử dụng test kit
API 32 Strep (BioMerieux, Pháp) để test sinh hóa và xác định kết quả bằng phần mềm APIweb
(bio Mérieux SA, France). Bên cạnh đó, vi khuẩn được gửi đến Công ty TNHH Thương mại &
Dịch vụ Nam Khoa, quận 7, Tp. Hồ Chí Minh định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S
rRNA và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen NCBI.
2.2. Phương pháp chiết xuất dược liệu
Sử dụng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol để chiết xuất dược liệu (Nguye ̂̃n Thượng
Dong và ctv., 2008). Hai loại thảo dược: Vỏ quế (mua ở Viện Y Học Dân Tộc Tp. Hồ Chí Minh)
và củ gừng (mua ở chợ Bà Chiểu, quận Bình Thạnh, Tp. Hồ Chí Minh), được sơ chế, thái lát
mỏng và sấy lạnh ở 40oC (Tủ sấy lạnh, sản xuất ở Việt Nam) cho đến khi đạt độ ẩm < 12%, được
xay mảnh nhỏ bằng máy xay khô (Xinganbangle-880Y) và làm ẩm bằng loại dung môi ngấm
kiệt, sau đó cho vào bình ngấm kiệt ngâm 24 giờ, sau 24 giờ sử dụng 30 lít ethanol (Công ty CP
dược phẩm OPC) cho ngấm kiệt 1kg thảo dược khô, tốc độ rút dịch chiết 5 ml/phút. Hai phương
pháp thu dịch chiết khác nhau được thực hiện.
+ Mỗi loại thảo dược được ngấm kiệt với ethanol 96%, dịch chiết thu được để riêng ra, bã
thảo dược tiếp tục ngấm kiệt với ethanol 72% rồi ethanol 48%. Cô quay dịch chiết của từng phân
đoạn và tổng của 3 phân đoạn, thu được 4 loại cao chiết khác nhau đối với mỗi loại thảo dược.
+ Mỗi loại thảo dược được ngấm kiệt riêng rẽ với ethanol 96%, ethanol 72%, và ethanol
48% ("Assessment report on Hypericum perforatum L., herba," 2018). Cô quay dịch chiết thu
được từ mỗi nồng độ ethanol và tổng của 3 phân đoạn, thu được 4 loại cao chiết khác nhau đối
với mỗi loại thảo dược.
Các cao chiết được cô bằng máy cô quay (Haake Phoenix II - C25P - Thermo) ở nhiệt độ 60oC
các dịch chiết tương ứng cho đến khi 99% dung môi được loại bỏ. Các cao chiết dạng sệt được
bảo quản lạnh ở -200C để sử dụng cho các thí nghiệm thử khả năng kháng khuẩn bằng phương
pháp đĩa giấy khuếch tán, cũng như xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Yasuko Sekita và ctv.,) và
nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC).
5
Hình 1: Hệ thống ngấm kiệt.
2.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của các cao chiết thảo dược
2.3.1. Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (Ahn và ctv., 1994)
Tẩm 20 µl cao chiết thảo dược (0,33 g/ml) vào các đĩa giấy vô trùng có đường kính 6 mm, ở
nghiệm thức đối chứng âm tẩm ethanol 96%, 72% và 48%, mỗi loại được tẩm vào 6 đĩa giấy, đặt
các đĩa giấy này vào tủ vô trùng trong 15 phút cho cao chiết khuếch tán vào đĩa giấy. Ở nghiệm
thức đối chứng dương, các đĩa giấy được tẩm ba loại kháng sinh thương mại là amoxillin (10
µg), doxycycline (30 µg) và florfenicol (30 µg) (Nam Khoa). Chủng S. agalactiae được nuôi cấy
trong môi trường Brain Heart Infusion Broth (110493, Merck) trong 24 giờ, sau đó so với ống
Mc Farland để được mật độ 108 CFU/ml (tương ứng ống 0,5), tiếp tục pha loãng 100 lần với
nước muối sinh lý để đạt mật độ 106 CFU/ml. Hút 1000 µl dịch khuẩn 106 CFU/ml, tráng đều
bằng que thủy tinh tam giác trên mặt thạch BHI agar (110886, Merck) trong 30 giây cho vi
khuẩn thấm đều vào mặt thạch. Sau đó dùng micropipet hút bỏ lượng dung dịch còn dư. Lật úp
các đĩa thạch và để trong tủ cấy vô trùng trong 5 phút cho khô. Đặt các đĩa thạch vào tủ mát ở
4oC trong 15 phút để cao chiết có thời gian khuếch tán ra đĩa thạch. Sau đó chuyển tất cả các đĩa
thạch vào ủ trong tủ ấm ở 30oC, đo đường kính vòng vô khuẩn tạo thành xung quanh các đĩa giấy
sau 24 giờ (nếu có). Vi khuẩn mẫn cảm với dịch chiết nếu vòng vô khuẩn ≥ 7 mm, vi khuẩn
kháng với dịch chiết nếu vòng vô khuẩn <7mm (Nascimento và ctv., 2000).
6
2.3.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Yasuko Sekita và ctv.,) và nồng độ diệt khuẩn tối
thiểu (MBC) của các cao chiết thảo dược
Sử dụng đĩa 96 giếng (thể tích giếng 200 µl) để xác định các giá trị MIC và MBC (Nagi A Al-
Haj và ctv., 2018) của các loại cao chiết có hiệu quả kháng khuẩn mạnh bằng phương pháp đĩa
giấy khuếch tán. Các cao chiết thảo dược được pha loãng với dung môi tương ứng theo dãy 08
nồng độ bao gồm 32.000, 16.000, 8.000, 4.000, 2.000, 1.000, 500 và 250 µg/ml, mỗi nồng độ lập
lại trong 4 giếng. Dịch khuẩn S. agalactiae được pha trong ống nghiệm chứa nước muối sinh lý
0,85% để đạt mật độ 108 CFU/ml (tương ứng với Mc Farland 0,5), sau đó được pha loãng trong
nước muối sinh lý để đạt mật độ cuối cùng là 104 CFU/ml, sau khi pha loãng sẽ trải đĩa BHI agar
(110886, Merck) để kiểm tra nồng độ vi khuẩn thực tế. Cho vào các giếng 100 µl dịch khuẩn +
100 µl thảo dược để đạt nồng độ cuối cùng theo dãy nêu trên, mật độ vi khuẩn cuối cùng trong
mỗi giếng là 5 x 103 CFU/ml. Các giếng đối chứng âm chỉ chứa 200µl môi trường BHI Broth
(110493, Merck). Các giếng đối chứng dương chứa 100 µl BHI + 100 µl dịch khuẩn S.
agalactiae. Ủ các đĩa 96 giếng này ở 300C, sau 48 giờ cho 20 µl thuốc thử resazurine (0,01%)
(RM125-1G, Himedia) vào mỗi giếng. Thuốc thử resazurine có màu xanh trong dung dịch, các
giếng có vi khuẩn phát triển sẽ chuyển màu thuốc thử từ xanh sang hồng (Faikoh và ctv., 2014).
Giá trị MIC là nồng độ thấp nhất của thảo dược tại đó thuốc thử resazurine không chuyển màu.
Để xác định giá trị MBC, lấy 100 µl mẫu ở các giếng thuộc 4 dãy nồng độ liên tiếp, bao gồm dãy
nồng độ tại đó xác định giá trị MIC và 3 dãy nồng độ cao hơn liền kề, và trải trên đĩa BHIA. Giá
trị MBC là nồng độ thấp nhất của thảo dược tại đó không có sự phát triển của vi khuẩn trên môi
trường BHIA sau khi trải đĩa. Các loại cao chiết có giá trị MBC/MIC ≥ 4 được cho là có khả
năng kìm khuẩn, MBC/MIC < 4 được cho là có khả năng diệt khuẩn.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Giá trị trung bình đường kính vòng vô khuẩn tạo xung quanh các đĩa giấy ở các nghiệm thức
được so sánh bằng trắc nghiệm One-way ANOVA và Tukey's post hoc test ở mức ý nghĩa 0,05,
sử dụng phần mềm SPSS (version 22.0).
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi
Nghiên cứu đã thực hiện thu 5 mẫu cá rô phi giống (cá rô phi vằn) nuôi ao tại Trung tâm giống
và cây trồng, xã Tân An Hội, huyện Củ Chi vào tháng 04/2019 và 11 cá rô phi giống (cá rô phi
vằn) nuôi bè tại phường Long Bình, quận 9 vào tháng 05/2019. Các cá thể này đều thể hiện các
7
dấu hiệu bệnh tích điển hình như lồi mắt và xuất huyết ở vây hậu môn, vây lưng (Hình 2, 3),
được thu thận cho phân lập và định danh vi khuẩn bằng test sinh hóa và giải trình tự gen 16S
rRNA. Kết quả kiểm tra bằng test API 32 strep (Bảng 1) và xác định kết quả bằng phần mềm
APIweb (bio Mérieux SA, France) tất cả 16 mẫu cá bệnh đều bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus
agalactiae (Hình 3). Trên môi trường thạch BA, khuẩn lạc Streptococcus agalactiae có hình
tròn, lồi, màu kem, kích thước khoảng 1 mm, dung huyết dạng β (Hình 5, 6), vi khuẩn nhuộm
gram bắt màu xanh tím (Gram dương), hình tròn, liên kết với nhau tạo thành chuỗi dạng liên cầu
khuẩn xen kẽ với những tế bào đơn lẻ. Chúng tôi chọn hai chủng vi khuẩn CC-2.1 (phân lập từ
cá 25 gr nuôi ao ở Củ Chi) và Q9-8.1 (phân lập từ cá 20 gr nuôi bè ở Quận 9) để thực hiện các
thí nghiệm tiếp theo của nghiên cứu.
Bảng 1: Kết quả phân lập mẫu cá bệnh
STT Nơi thu mẫu Số mẫu Số mẫu nhiễm
Streptococcus agalactiae
1 Củ Chi 5 5
2 Quận 9 11 11
Hình 2: Cá thu ở Củ chi bị lồi mắt, xuất huyết Hình 3: Cá thu ở quận 9 bị lồi mắt, xuất huyết
8
Hình 4. Kết quả xác định sinh hóa với API 32 Strep test
Hình 5: Dạng khuẩn lạc của chủng CC-2.1,
dung huyết dạng β trên môi trường BA.
Hình 6: Dạng khuẩn lạc của chủng Q9-8.1,
dung huyết dạng β trên môi trường BA.
9
3.2. Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của thảo dược bằng đĩa giấy khuếch tán
Kết quả khảo sát trước đây của nhóm về hiệu quả kháng khuẩn của 10 loại cao chiết thảo
dược tách chiết bằng ethanol 96% và methanol 99,8%, cho thấy cao chiết quế và gừng tách chiết
bằng ethanol 96% cho hiệu quả kháng khuẩn cao nhất đối với vi khuẩn Streptococcus agalactiae
(Nguyễn Thị Trúc Quyên và ctv., 2019).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng kháng khuẩn của hai loại cao
chiết quế và gừng, tách chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol ở 3 nồng độ
khác nhau (96%, 72% và 48%). Ở thí nghiệm 1, quá trình tách chiết được thực hiện chỉ với
ethanol 96% hoặc lần lượt với 2 hoặc 3 nồng độ khác nhau của ethanol. Qua Bảng 2 cho thấy cao
chiết của quế với ethanol 96% có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất đối với cả hai chủng vi khuẩn
với đường kính vòng vô khuẩn từ 32-34 mm, giá trị này là tương đương so với đường kính vòng
vô khuẩn tạo ra bởi ba loại kháng sinh (35,48 mm đối với amoxillin, 22,47 mm đối với
doxycillin và 35,08 mm đối với florfenicol). Kế đến là cao chiết gừng với ethanol 96% cho
đường kính vòng vô khuẩn 14-15 mm. Ngoài ra, cả hai loại cao chiết quế và gừng tách chiết
bằng ethanol 96% đều cho đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất và cao hơn có ý nghĩa thống kê
(p < 0,05) so với tách chiết bằng ethanol ở các nồng độ thấp hơn và so với cao tổng.
Bảng 2. Đường kính vòng vô khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết thảo
dược, lần lượt tách chiết với ethanol ở các nồng độ khác nhau và sau 24 giờ tiếp xúc với vi khuẩn
S. agalactiae, chủng CC-2.1 và Q9-8.1.
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Dung môi S. agalactiae CC-2.1 S. agalactiae Q9-8.1
Gừng Quế Gừng Quế
Ethanol 96% 15,12 ± 0,9c 34,23 ± 1,9b 14,88 ± 1,3b 32,67 ± 2,3b
Ethanol 96% và 72% 12,65 ± 1,2b 10,73 ± 1,1a 11,20 ± 0,8a 8,5 ± 0,5a
Ethanol 96%, 72% và 48% 9,67 ± 0,84a 7,53 ± 3,72a 10,05 ± 0,8a 9,33 ± 1,3a
Cao tổng từ 3 phân đoạn
trên (tỉ lệ 1:1:1)
12,17 ± 0,9b 9,62 ± 1,2a 10,30 ± 1,0a 9,52 ± 0,7a
Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Trong cùng một cột, các nghiệm thức có các
chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Ở thí nghiệm 2, quá trình tách chiết được thực hiện riêng rẽ với một trong ba nồng độ của
ethanol (96%, 72% và 48%). Qua Bảng 3 cho thấy cao chiết của quế với ethanol 96% có tác
dụng mạnh nhất đối với cả hai chủng vi khuẩn với đường kính vòng vô khuẩn từ 29-34 mm, kế
10
tiếp là cao chiết gừng với ethanol 96% có đường kính vòng vô khuẩn 16-17 mm. Ở thí nghiệm
này, cả hai loại cao chiết quế và gừng tách chiết bằng ethanol 96% cũng cho đường kính vòng vô
khuẩn lớn nhất và cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với tách chiết bằng ethanol ở các
nồng độ thấp hơn và so với cao tổng.
Bảng 3. Đường kính vòng vô khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết thảo
dược tách chiết với ethanol ở các nồng độ khác nhau và sau 24 giờ tiếp xúc với vi khuẩn S.
agalactiae, chủng CC-2.1 và Q9-8.1.
Dung môi
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
S. agalactiae CC-2.1 S. agalactiae Q9-8.1
Gừng Quế Gừng Quế
Ethanol 96% 16,47 ± 1,3c 33,45 ± 1,8b 16,7 ± 0,9c 29,87 ± 0,3b
Ethanol 72% 13,77 ± 0,7ab 9,05 ± 0,6a 13,58 ± 0,6b 9,47 ± 0,3a
Ethanol 48% 12,58 ± 1,1a 8,53 ± 0,6a 11,85 ± 0,6a 8,95 ± 1,2a
Cao tổng từ 3
phân đoạn trên
(tỉ lệ 1:1:1)
14,83 ± 0,6b 8,50 ± 1,0a 15,0 ± 1,1c 10,1 ± 0,4a
Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Trong cùng một cột, các nghiệm thức có các
chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Hình 7: Vòng vô khuẩn của cao chiết gừng
đối với chủng CC-2.1
Hình 8: Vòng vô khuẩn của cao chiết quế đối
với chủng Q9-8.1
11
Hình 9: Vòng vô khuẩn của ba loại kháng sinh đối với chủng Q9-8.1
3.3. Kết quả xác định giá trị MIC và MBC của các cao chiết thảo dược
Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các cao chiết thảo dược ở điều kiện in vitro,
chúng tôi xác định được cao chiết vỏ quế và gừng trong ethanol 96% có khả năng kháng khuẩn
mạnh đối với chủng vi khuẩn CC-2.1 và chủng vi khuẩn Q9-8.1, chúng tôi chọn hai loại cao
chiết này để xác định giá trị MIC và MBC. Kết quả được thể hiện trong Bảng 4.
Bảng 4. Kết quả xác định giá trị MIC và MBC của các cao chiết vỏ quế đối với chủng
Streptococcus agalactiae CC-2.1 và Q9-8.1
Loại cao chiết/dung môi Chủng
Vi khuẩn
MIC
(µg/ml)
MBC
(µg/ml)
Vỏ quế, ethanol 96% CC-2.1 2.000 8.000
Q9-8.1 2.000 8.000
Gừng, ethanol 96% CC-2.1 1.000 2.000
Q9-8.1 1.000 2.000
12
Hình 10: Đĩa 96 giếng xác định giá trị MIC
của cao chiết quế (hàng 1-4) và cao chiết gừng
(hàng 5-8) đối với chủng CC-2.1.
Hình 11: Đĩa 96 giếng xác định giá trị MIC
của cao chiết quế (hàng 1-4) và cao chiết gừng
(hàng 5-8) đối với chủng Q9-8.1.
IV. THẢO LUẬN
Qua 16 mẫu vi khuẩn thu được từ cá rô phi giống bị bệnh lồi mắt, xuất huyết nuôi tại ao
và bè tại Tp. Hồ Chí Minh, sau nhuộm gram, test sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA đều có
kết quả dương tính với vi khuẩn Streptococcus agalactiae. Khuẩn lạc của vi khuẩn Streptococcus
agalactiae hình tròn, lồi, màu kem, kích thước khoảng 1-2mm, dung huyết dạng β, đây là tan
máu hoàn toàn, vòng tan máu trong suốt và có đường kính gấp 2-4 lần đường kính của khuẩn lạc.
Những Streptococci có khả năng gây tan máu β phần lớn có khả năng gây bệnh, hầu hết các
chủng vi khuẩn Streptococci không gây tan huyết thu từ cá bệnh đều là vi khuẩn S. difficae
(Alsaid và ctv., 2010; Buller, 2004). Tuy nhiên, nghiên cứu của (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv.,
2012) phân lập vi khuẩn gây bệnh lồi mắt, xuất huyết trên cá rô phi nuôi năm 2010 ở huyện Cai
Lậy – tỉnh Tiền Giang phân lập được vi khuẩn Streptococcus agalactiae nhưng các chủng vi
khuẩn này không gây dung huyết khi nuôi cấy trên môi trường BA.
Trong nghiên cứu này chiết xuất với ethanol 96%, khả năng kháng khuẩn Streptococcus
agalactiae (106 CFU/ml) của gừng (330 mg/ml) cho vòng kháng khuẩn 29-34 mm và quế (330
mg/ml) cho vòng kháng khuẩn 14-17 mm, khả năng ức chế và diệt vi khuẩn Streptococcus
agalactiae (mật độ 5 x 103 CFU/ml) của gừng có giá trị MIC = 1 mg/ml, MBC = 2 mg/ml và của
quế có giá trị MIC = 2 mg/ml, MBC = 8 mg/ml, giá trị MBC/MIC ≤ 4 chứng tỏ hai loại thảo
dược này có khả năng diệt khuẩn cao.
13
Giá trị MIC xác định bởi nghiên cứu này là tương đồng với kết quả nghiên cứu của một
số tác giả khác. Nghiên cứu dịch chiết bằng nước từ gừng trên 18 chủng vi khuẩn A. hydrophila
có vòng kháng khuẩn từ 7 - 13,67 mm (10 mg/đĩa), MIC = 0,05 – 0,20 mg/ml và MBC = 0,78-50
mg/ml (Snuossi và ctv., 2016). Nghiên cứu dịch chiết bằng nước từ gừng trên 6 chủng vi khuẩn
Staphilococcus sciuri có vòng kháng khuẩn từ 8,67 - 15,33 mm (10 mg/đĩa), MIC = 0,05 – 0,20
mg/ml và MBC = 1,26 - 25 mg/ml (Snuossi và ctv., 2016). Nghiên cứu dịch chiết bằng nước
lạnh, nước nóng và ethanol (95%) từ gừng (200 mg/ml) trên chủng vi khuẩn Streptococcus sp có
vòng kháng khuẩn lần lượt 14, 11 và 28 mm (Nader, 2010). Chiết xuất gừng với ethanol 95%
(100 mg/ml) cho vòng kháng khuẩn 15,5 mm với vi khuẩn Streptococcus pneumonia (Suleiman
AG và ctv., 2019). Chiết suất vỏ quế với nước (1 g/ml) cho vòng kháng khuẩn 21,5 mm với vi
khuẩn Streptococcus iniae (105 CFU/ml), MIC = 0,04 mg/ml (Rattanachaikunsopon và ctv.,
2010). Nghiên cứu chiết xuất bằng ethanol 95% trên tỏi, nguyệt quế, muồng trâu, măng cụt, ổi và
cây duối (10 mg/ml) khả năng kháng khuẩn Streptococcus agalactiae (108 CFU/ml) cho đường
kính vòng kháng khuẩn từ 20-22 mm, khả năng ức chế vi khuẩn Streptococcus agalactiae (108
CFU/ml) trên muồng trâu, ổi, cây duối có giá trị MIC ≤ 0,125 mg/ml (Rattanachaikunsopon và
ctv., 2009). Nghiên cứu của chiết xuất bằng ethanol 95% trên lá sầu đâu (100 mg/ml) có khả
năng kháng khuẩn Streptococcus agalactiae (108 CFU/ml) cho đường kính vòng kháng khuẩn
10,5 mm, trên lá cây tông dù (100 mg/ml) cho đường kính vòng kháng khuẩn 10,9 mm, khả năng
ức chế vi khuẩn Streptococcus agalactiae (108 CFU/ml) của sầu đâu có giá trị MIC = 1,25
mg/ml, của lá cây tông dù có giá trị MIC = 0,6 mg/ml (Kamble và ctv., 2014).
V. KẾT LUẬN
Vi khuẩn phân lập được từ cá rô phi giống bị bệnh lồi mắt, xuất huyết thu tại Tp. Hồ Chí Minh là
Streptococcus agalactiae. Khả năng kháng khuẩn Streptococcus agalactiae của cao chiết quế
trong ethanol 96% (nồng độ cao chiết 330 mg/ml) cho đường kính vòng kháng khuẩn 29-34 mm
và cao chiết gừng trong ethanol 96% (nồng độ cao chiết 330 mg/ml) cho đường kính vòng kháng
khuẩn 14-17 mm, khả năng ức chế và diệt vi khuẩn Streptococcus agalactiae (5 x 103 CFU/ml)
của cao chiết gừng có giá trị MIC = 1 mg/ml, MBC = 2 mg/ml và của cao chiết quế có giá trị
MIC = 2 mg/ml, MBC = 8 mg/ml.
14
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, 2012. Phân lập và xác định đặc điểm của vi khuẩn S. agalactiae từ
cá điêu hồng (Oreochromis sp.) bệnh phù mắt và xuất huyết. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 22C, 203-
212.
Nguyễn Thượng Dong, Vietnam, Bộ giáo dục và đào tạo, Vietnam, Bộ y tế, Viện dược liệu, 2008. Kỹ thuật chiết
xuất dược liệu. Hà Nội: Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật.
Trương Thị Mỹ Hạnh, 2008. Nghiên cứu tính kháng khuẩn và kháng nấm của một số loại thảo mộc. Báo cáo đề tài
khoa học – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, Bắc Ninh.
Nguyễn Thị Trúc Quyên, Lê Linh Chi, Đoàn Văn Cường, Nguyễn Diễm Thư, Mã Tú Lan, Trần Hoàng Bích Ngọc,
Nguyễn Thành Nhân, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 2019. Khả năng đối kháng vi khuẩn streptococcus agalactiae
phân lập trên cá rô phi (Oreochromis spp.) bởi một số cao chiết thảo dược. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy
sản, 3, 124-132.
Viện NCNT Thuỷ sản I, 2017. Các bệnh thường gặp trên cá rô phi nuôi tại Việt Nam, tình hình nghiên cứu bệnh do
TiLV trên cá rô phi. Báo cáo hội nghị phòng chống bệnh mới do TiLV trên cá rô phi nuôi tại Việt Nam,
10/2017.
Tài liệu tiếng Anh
Abutbul S., Golan Avi, Barazani Oz, Zilberg Dina, 2004. Use of Rosmarinus officinalis as a treatment against
Streptococcus iniae in tilapia (Oreochromis sp.). Aquaculture, 238, 97-105.
doi:10.1016/j.aquaculture.2004.05.016
Ahn Y. J., Kwon J. H., Chae S. H., Park J. H., Yoo J. Y., 1994. Growth-inhibitory Responses of Human Intestinal
Bacteria to Extracts of Oriental Medicinal Plants. Microbial Ecology in Health and Disease, 7(5), 257-261.
doi:10.3109/08910609409141363
Alsaid Milud, Mohd Daud Hassan, Bejo Siti, Abuseliana Ali, 2010. Antimicrobial Activities of Some Culinary
Spice Extracts against Streptococcus agalactiae and Its Prophylactic Uses to Prevent Streptococcal Infection in
Red Hybrid Tilapia (Oreochromis sp.). World Journal of Fish and Marine Sciences, 2.
Assessment report on Hypericum perforatum L., herb, 2018. Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC).
European Medicines Agency.
Brian Sheehan Ph.D. , L. Labrie, DVM , Y.S. Lee, B.S. , F.S. Wong, B.S. , J. Chan, B.S. , C., Komar DVM , N.
Wendover, B.S. and L. Grisez, Ph.D, 2009. Streptococcosis in tilapia. Global Aquaculture Advocate.
Buller Nicky B., 2004. Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals. A Practical Identification Manual.
Buxton Rebecca, 2005. Blood Agar Plates and Hemolysis Protocols. American Society for Microbiology.
Evans Joyce, Klesius P. H., Shoemaker Craig, 2006. An overview of Streptococcus in warmwater fish. Aquaculture
Health International, 7, 10-14.
Faikoh E.N., Hong Y.H., Hu S.Y., 2014. Liposome-encapsulated cinnamaldehyde enhances zebrafish (Danio rerio)
immunity and survival when challenged with Vibrio vulnificus and Streptococcus agalactiae. Fish & shellfish
immunology, 38, 15-24.
15
Kamble Manoj, Gallardo Wenresti, Yakupitiyage Amararatne, Chavan Balasaheb, Rusydi Rachmawati, Rahma
Aulia, 2014. Antimicrobial Activity of Bioactive Herbal Extracts Against Streptococcus agalactiae Biotype
2. International Journal of Basis and Applied Biology, 2, 152-155.
Nader Mohammed & Kassim, Kais & Ali, Safaa & Azhar, Dalia, 2010. Antibacterial activity of ginger extracts and
its essential oil on some of pathogenic bacteria. Baghdad Science Journal, 7, 1159-1165.
Nagi A Al-Haj, Khadija Zedan Hassan, Alabed Ali A Alabed, Abdullah Y Al Mahdi, Rasheed Abdsalam,
Albawani. Sami Mohammed, 2018. Antibacterial Assays of Malaysian Medicinal Plant Polygonum minus
Using Different Extraction Methods** Nagi A. Al-Haj," Khadija Zedan Hassan,“Alabed Ali A.
Alabed,“Abdullah Y. Al Mahdi.
Nascimento Gislene G. F., Locatelli Juliana, Freitas Paulo C., Silva Giuliana L., 2000. Antibacterial activity of plant
extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, 31, 247-
256.
Ndong Diegane, Chen Yu-Yuan, Lin Yu-Hung, Vaseeharan Baskaralingam, Chen Jiann-Chu, 2007. The immune
response of Mozambique tilapia Oreochromis mossambicus (Peters) and its susceptibility to Streptococcus
iniae under stress in low and high temperatures. Fish & shellfish immunology, 22, 686-694.
doi:10.1016/j.fsi.2006.08.015
Pachanawan A., Phumkhachorn P., Rattanachaikunsopon P., 2008. Potential of Psidium guajava Supplemented Fish
Diets in Controlling Aeromonas hydrophila Infection in Tilapia (Oreochromis niloticus). Journal of
bioscience and bioengineering, 106(5), 419-424.
Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P., 2009. Prophylactic effect of Andrographis paniculata extracts against
Streptococcus agalactiae infection in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Journal of bioscience and
bioengineering, 107, 579-582. doi:10.1016/j.jbiosc.2009.01.024
Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P., 2010. Potential of cinnamon (Cinnamomum verum) oil to control
Streptococcus iniae infection in tilapia (Oreochromis niloticus). Fisheries Science, 76, 287-293.
Shangliang T., Hetrick, F. M., Roberson, B. S., and Baya, A., 1990. The antibacterial and antiviral activity of herbal
extracts for fish pathogens. J. Ocean. Uni. Qingdao, 20, 53-60.
Snuossi Mejdi, Trabelsi Najla, Ben Taleb Sabrine, Dehmeni Ameni, Flamini Guido, De Feo Vincenzo, 2016. Laurus
nobilis, Zingiber officinale and Anethum graveolens Essential Oils: Composition, Antioxidant and
Antibacterial Activities against Bacteria Isolated from Fish and Shellfish. Molecules (Basel, Switzerland),
21(10), 1414. doi:10.3390/molecules21101414
Suleiman A.G., Hamisu M., Adamu M.D., Rabiu S., Abdulrazak M.H., Mujaheed A., Usman A.H., I and
Marwan, 2019. In Vitro Antibacterial Activity and Phytochemical Analysis of Zingiber officinale L.
Rhizome Extracts. Med Chem (Los Angeles), 9(4), 056-059.
Yasuko Sekita, Keiji Murakami, Hiromichi Yumoto, 2016. Preventive Effects of Houttuynia cordata Extract for
Oral Infectious Diseases. Department of Pharmacognosy, Tokushima - Japan, 770-8505.
16
ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF CINNAMON BARK (Cinnamomum
verum) AND GINGER (Zingiber officinale rose) ETHANOL EXTRACT
AGAINST Streptococcus agalactiae ISOLATED FROM TILAPIA
FINGERLINGS (Oreochromis spp.)
Doan Van Cuong1*, Nguyen Thi Ngoc Tinh1, Ma Tu Lan1, Nguyen Thanh Nhan1
ABSTRACT
Streptococcus agalactiae is known as an important pathogen that causes high mortality in many freshwater and
marine fish species. In this study, Streptococcus agalactiae was isolated from tilapia with haemorrhage and eye-
protrusion symptoms colected in Ho Chi Minh city. Extraction of two herbs namely cinnamon bark (Cinnamon
verum), ginger (Zingiber officinale Rose) by exhaustion method with ethanol solvent at three separate concentrations
(96%, 72%, and 48%) or three consecutive concentrations (96%, then 72% and 48%, respectively). The results
showed that cinnamon extract in 96% ethanol demonstrated a highest antibacterial activity, with the diameter of
inhibition zone ranging from 29-34 mm, MIC value = 2 mg/ml, and MBC value = 8 mg/ml; while Ginger extract in
96% ethanol showed the diameter of inhibiton zone ranging from 14-17 mm, MIC value = 1 mg/ml, and MBC value
= 2 mg/ml. In sum, cinnamon and ginger extract in 96% ethanol are considered two potential herbal extracts that can
be applied to prevent and to treat diseases caused by Streptococcus agalactiae in tilapia.
Keywords: Cinnamon bark extract, ginger extract, Streptococcus agalactiae, tilapia.
Người phản biện: TS. Nguyễn Ngọc Du
Ngày nhận bài: 18/10/2019
Ngày thông qua phản biện: 02/11/2019
Ngày duyệt đăng: 25/12/2019
Người phản biện: TS. Ngô Huỳnh Phương Thảo
Ngày nhận bài: 18/10/2019
Ngày thông qua phản biện: 10/11/2019
Ngày duyệt đăng: 25/12/2019
1 Research Institute for Aquaculture II
*Email: [email protected]