perspectives and limits in enology research levaduras genéticamente modificadas como vectores de...

Perspectives and Limits in Enology ResearchPerspectives and Limits in Enology Research

Levaduras genéticamente modificadas como Levaduras genéticamente modificadas como vectores de ingeniería enológica durante la vectores de ingeniería enológica durante la

fermentación. Perspectivas de nuevos productosfermentación. Perspectivas de nuevos productos

• Sergi FerrerSergi Ferrer: Towards the future of oenological microbiology: Towards the future of oenological microbiology• Ramón GonzálezRamón González: Filling the gap between fundamental yeast research and : Filling the gap between fundamental yeast research and

applied wine biotechnologyapplied wine biotechnology• Sylvie DequinSylvie Dequin: : Metabolic engineering of wine yeasts to reduce the ethanol Metabolic engineering of wine yeasts to reduce the ethanol

yield: challenges and perspectivesyield: challenges and perspectives

http://benasque.ecm.ub.es/2008wine/2008wine.htm

http://benasque.ecm.ub.es/general/information/home.html

Sylvie Dequin: Sylvie Dequin: Metabolic engineering of Metabolic engineering of wine yeasts to reduce the ethanol yield: wine yeasts to reduce the ethanol yield:

challenges and perspectiveschallenges and perspectives

Research Director at the Sciences For Enology unit at INRA, Montpellier.

Since her recruitment at INRA in 1986, she became interested in physiology and genetics of wine yeasts, from both fundamental and applied perspectives.

As early as in the 1990s, she developed innovative work in the field of metabolic engineering of wine yeasts.

More recently, she pursued her research in the field of genomics and systems biology applied to wine strains.

Her team has, in particular, recently completed the sequencing of the genome of a first commercial wine strain.

Ramón González: Filling the gap between Ramón González: Filling the gap between fundamental yeast research and applied fundamental yeast research and applied

wine biotechnologywine biotechnologySe inició en el Departamento de Microbiología de la Universitat de València con

Sergi Ferrer y Daniel Ramón, desarrollando métodos de transformación para hongos (1989).

Tesis Doctoral en el IATA (CSIC), entre el 90 y el 93, desarrollando métodos de transformación para levaduras industriales, construyendo una de las primeras levaduras vínicas transgénicas (y la primera encaminada a mejorar una propiedad sensorial del vino).

Postdoc de más de cuatro años en París, más biología molecular de hongos.Investigador del CSIC en el IFI desde 1999 a 2008. Autofagia y autolisis, y mejora

genética de levaduras de segunda fermentación.Actualmente está en el Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (centro mixto del

CSIC, la U. de La Rioja y el Gobierno de La Rioja). Genética de la liberación de manoproteínas y construcción de levaduras mejoradas para esta . Metabolismo de las levaduras durante la fermentación alcohólica.

Además de artículos científicos, es coautor de varias patentes sobre métodos de mejora genética de levaduras vínicas, tanto convencionales como por ingeniería genética.

Sergi Ferrer: Towards the future of Sergi Ferrer: Towards the future of oenological microbiologyoenological microbiology

Comencé en el Departamento de Microbiología de la Universitat Autònoma de Barcelona en genética de Salmonella. Profesor Ayudante hasta 1981.

Becario predoctoral y Tesis en la Universitat de València en 1984, sobre mutagénesis, fusión de protoplastos y métodos de manipulación genética en hongos. Premio extraordinario de Doctorado

Profesor Titular en la Universitat de València desde 1986.Administrador de la lista de correo “Gienol” y miembro fundador.Formo parte del grupo ENOLAB, que se ocupa de aspectos microbiológicos

relacionados con la enología en varias vertientes: caracterización de la microbiota, selección de microorganismos, taxonomía, FML, acidificación biológica, genética, aminas biógenas.

He participado en 21 Proyectos de I+D nacionales y europeos financiados en Convocatorias públicas (9 de ellos como Investigador Principal), en 10 contratos de I+D de relevancia con empresas (liderando 8 de ellos.




• Sergi FerrerSergi Ferrer: Towards the future of oenological microbiology: Towards the future of oenological microbiology



Métodos genéticos para la mejora de levaduras de vinificación

• Selección de variantes: debida a mutación espontánea. Requiere métodos de selección. No se han logrado mejoras importantes.

• Mutagénesis: aumenta la frecuencia de mutantes. Efecto de la ploidía de las cepas. Mejoras limitadas, pero evitan los OMG.

• Hibridación: incluye distintas variantes (“rare mating”, citoducción, fusión de protoplastos, etc.). Método efectivo de mejorar y combinar caracteres poligénicos. Se pueden evitar los OMG.

• Transformación: empleo de la ingeniería genética para cambiar propiedades específicas. Modificación o introducción de nuevas características. Supone el término OMG.

Guidici et al. 2005

• Mutagénesis al azar

• Ingeniería evolutiva (evolución dirigida)

• Ingeniería metabólica

• Estrategias metagenómicas

• Barajado de genomasGuidici et al. 2005

OBJETIVOS DE LA MEJORA GENÉTICA DE LEVADURAS ENOLÓGICAS

Propiedades deseadas

Áreas Ejemplos

Mejora de la fermentación

Resistencia y tolerancia al estrés

Respuesta al estrés. Acumulación de glucógeno, esteroles y trehalosa

Mejora de la utilización de azúcares

Transportadores de hexosas

Mejora de la asimilación de nitrógeno

Genes de catabolismo de aminoácidos

Mejora de la tolerancia al etanol

Formación de esteroles, actividad ATPasa

Aumento de la tolerancia a antimicrobianos

Resistencia a SO2, killer, agroquímicos

Reducción de la formación de espuma

Proteínas de superficie celular


Áreas Ejemplos

Mejora de procesos

Clarificación de proteínas Sobreexpresión de proteasas

Clarificación de polisacáridos

Sobreexpresión de glucanasas, pectinasas, etc.

Sedimentación y floculación de células

Expresión de floculinas

Flotación y formación de flor

Proteínas hidrofóbicas de membrana



Áreas Ejemplos

Mejora de aspectos saludables

Aumento resveratrol Síntesis estilbeno

Reducción etil carbamato Metabolismo aminoácidos

Reducción aminas biógenas

Bacteriocinas y enzinas bacteriolíticos

Capacidades de biopreservación

Enzimas y péptidos antimicrobianos. Sulfitos

Bajos niveles de etanol Flujo de carbono (glicerol)



Áreas Ejemplos

Mejora de aromas y cualidades sensoriales

Liberación terpenoides de la uva

Glucanasas, glicosidasas, arabinofuranosidasas

Aumento producción ésteres volátiles

Esterasas

Producción optimizada alcoholes fusel

Metabolismo aminoácidos

Aumento producción glicerol

Metabolismo glicerol

Acidificación biológica Producción ácidos

Desacidificación Fermentaciones maloláctica y maloalcohólica

Reducción producción sulfitos

Metabolismo del azufre (y del nitrógeno)


La Fermentación Maloláctica La Fermentación Maloláctica “Transgénica”“Transgénica”

Williams S.A., Hodges R.A., Strike T.L., Snow R. & Kunkee R.EWilliams S.A., Hodges R.A., Strike T.L., Snow R. & Kunkee R.E. . 1984.1984. Cloning the Gene for the Malolactic Fermentation of Wine from Cloning the Gene for the Malolactic Fermentation of Wine from Lactobacillus delbrueckiiLactobacillus delbrueckii in in Escherichia coliEscherichia coli and Yeasts and Yeasts. Appl. . Appl. Environ. Microbiol. 47: 288–293.Environ. Microbiol. 47: 288–293.

Snow, R. Snow, R. 19851985. Genetic engineering of a yeast strain for malolactic . Genetic engineering of a yeast strain for malolactic fermentation of wine. Food Technol. 39: 98-101.fermentation of wine. Food Technol. 39: 98-101.

Clonan un gen de Clonan un gen de Lactobacillus delbrueckiiLactobacillus delbrueckii en el plásmido en el plásmido pBR322, obteniendo dos clones de pBR322, obteniendo dos clones de E. coliE. coli capaces de capaces de convertir L-malato en L-lactato.convertir L-malato en L-lactato.

Y logran transferir el gen a un vector para levaduras…..Y logran transferir el gen a un vector para levaduras…..

PERO……PERO……'Plasmid instability seems to be one problem that affects 'Plasmid instability seems to be one problem that affects gene expression, as our strains of gene expression, as our strains of E. coliE. coli and yeast rapidly and yeast rapidly lose the malolactic function upon transfer'lose the malolactic function upon transfer'

Lautensach, A. & Subden, R.E. Lautensach, A. & Subden, R.E. 19841984. Cloning of malic acid assimilating . Cloning of malic acid assimilating activity from activity from Leuconostoc oenosLeuconostoc oenos in in E. coliE. coli. Microbios 39: 29-39.. Microbios 39: 29-39.

'low probability of religation, instability, and transient expression of genes from 'low probability of religation, instability, and transient expression of genes from Leuconostoc oenosLeuconostoc oenos in in E. coli'E. coli'

‘‘Our results show that genes from Our results show that genes from Leuconostoc oenosLeuconostoc oenos can be transiently can be transiently expressed in expressed in E. coliE. coli. Whether the instability is due to insert size, host restriction . Whether the instability is due to insert size, host restriction or other events will be subject to further studies.or other events will be subject to further studies.

Clonan un gen de asimilación de malato mediante el vector Clonan un gen de asimilación de malato mediante el vector pTR262 (derivado de pBR322).pTR262 (derivado de pBR322).

Los transformantes (que crecen solamente con malato) Los transformantes (que crecen solamente con malato) resultan genéticamente inestables.resultan genéticamente inestables.

Los plásmidos quedan alterados por procesos Los plásmidos quedan alterados por procesos recArecA independientes.independientes.

El clon se pierde.El clon se pierde.

Renault P. Renault P. 19851985. Clonage de l'enzyme malolactique de bactéries lactiques . Clonage de l'enzyme malolactique de bactéries lactiques et son transfert dans une souche de et son transfert dans une souche de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae. . Journée de Rencontres Œnologiques. Montpellier, 25 Janvier.Journée de Rencontres Œnologiques. Montpellier, 25 Janvier.

Renault P., Gaillardin C. & Heslot H. Renault P., Gaillardin C. & Heslot H. 19891989. Product of the . Product of the Lactococcus Lactococcus lactislactis gene required for malolactic fermentation is homologous to a gene required for malolactic fermentation is homologous to a family of positive regulators. J. Bacteriol. 171: 3108-3114.family of positive regulators. J. Bacteriol. 171: 3108-3114.

Clonan un presunto gen FML de Clonan un presunto gen FML de Lactococcus lactis Lactococcus lactis en pIL725 en pIL725 (derivado de pAMß1), pero resulta ser un regulador.(derivado de pAMß1), pero resulta ser un regulador.

Zúñiga M. & Ferrer S. (resultados sin publicar). Ese regulador Zúñiga M. & Ferrer S. (resultados sin publicar). Ese regulador no hibrida con DNA de no hibrida con DNA de Oenococcus oeniOenococcus oeni ( (L. oenosL. oenos).).

Ansanay V., Dequin S. & Barre P. Ansanay V., Dequin S. & Barre P. 19931993. Clonage et expression du gène de . Clonage et expression du gène de l’enzyme malolactique de l’enzyme malolactique de Lactococcus lactisLactococcus lactis. Eur Patent 0656056.. Eur Patent 0656056.

Ansanay V., Dequin S., Blondin B. & Barre P. Ansanay V., Dequin S., Blondin B. & Barre P. 19931993. Cloning, sequence and . Cloning, sequence and expression of the gene encoding the malolactic enzyme from expression of the gene encoding the malolactic enzyme from Lactococcus lactisLactococcus lactis. FEBS Lett. 332: 74–80.. FEBS Lett. 332: 74–80.

Ansanay V., Dequin S., Camarasa C., Schaeffer V., Grivet J.P., Blondin B., Ansanay V., Dequin S., Camarasa C., Schaeffer V., Grivet J.P., Blondin B., Salmon J.M. & Barre P. Salmon J.M. & Barre P. 19961996. Malolactic fermentation by engineered . Malolactic fermentation by engineered Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae as compared with engineered as compared with engineered Schizosaccharomyces pombeSchizosaccharomyces pombe. Yeast 12: 215–225.. Yeast 12: 215–225.

Denayrolles M., Aigle M. & Lonvaud-Funel A. Denayrolles M., Aigle M. & Lonvaud-Funel A. 19941994. Cloning and sequence . Cloning and sequence analysis of the gene encoding analysis of the gene encoding Lactococcus lactisLactococcus lactis malolactic enzyme: malolactic enzyme: relationships with malic enzymes. FEMS Microbiol. Lett. 116: 79–86.relationships with malic enzymes. FEMS Microbiol. Lett. 116: 79–86.

Denayrolles M., Aigle M. & Lonvaud-Funel A. Denayrolles M., Aigle M. & Lonvaud-Funel A. 19951995. Functional expression . Functional expression in in Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae of the of the Lactococcus lactis mleS Lactococcus lactis mleS gene gene encoding the malolactic enzyme. FEMS Microbiol. Lett. 125: 37–44.encoding the malolactic enzyme. FEMS Microbiol. Lett. 125: 37–44.

Clonaje y expresión eficiente del gen maloláctico de Clonaje y expresión eficiente del gen maloláctico de L. lactisL. lactis en en S. cerevisiaeS. cerevisiae..

Labarre C., Guzzo J., Cavin J.F. & Diviès, C. Labarre C., Guzzo J., Cavin J.F. & Diviès, C. 19961996. Cloning and . Cloning and characterization of the genes encoding the malolactic enzyme and the characterization of the genes encoding the malolactic enzyme and the malate permease of malate permease of Leuconostoc oenosLeuconostoc oenos. Appl. Environ. Microbiol. 62: . Appl. Environ. Microbiol. 62: 1274-1282.1274-1282.

Clonaje del gen maloláctico de Clonaje del gen maloláctico de O. oeniO. oeni ( (L. oenosL. oenos). Genes ). Genes organizados en organizados en clustercluster..

Coexpresión del enzima maloláctico junto con la malato Coexpresión del enzima maloláctico junto con la malato permeasa de permeasa de Schizosaccharomyces pombeSchizosaccharomyces pombe..

Grobler J., Krizus A., Osothsilp-De-Eknamakul C., Pretorius I., van Vuuren Grobler J., Krizus A., Osothsilp-De-Eknamakul C., Pretorius I., van Vuuren H.J.J. & Subden R.E. H.J.J. & Subden R.E. 19951995. A method and nucleotide sequence for . A method and nucleotide sequence for transforming microorganisms. Int Patent WO 96/36715transforming microorganisms. Int Patent WO 96/36715

Bony M., Bidard F., Camarasa C., Dulau L., Barre P. & Dequin S. Bony M., Bidard F., Camarasa C., Dulau L., Barre P. & Dequin S. 19971997. . Complete malolactic fermentation by Complete malolactic fermentation by S. cerevisiae S. cerevisiae strains expressing strains expressing heterologous genes for malolactic enzyme and malate transport. FEBS heterologous genes for malolactic enzyme and malate transport. FEBS Lett. 410: 452–456.Lett. 410: 452–456.

Volschenk H., Viljeon M., Grobler J., Bauer F., Lonvaud-Funel A., Volschenk H., Viljeon M., Grobler J., Bauer F., Lonvaud-Funel A., Denayrolles M., Subden R.E. & van Vuuren H.J.J. Denayrolles M., Subden R.E. & van Vuuren H.J.J. 19971997. Malolactic . Malolactic fermentation in grape musts by a genetically engineered strain of fermentation in grape musts by a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae. Am. J. Enol. Vitic. 48: 193–197.. Am. J. Enol. Vitic. 48: 193–197.

ÉXITO!ÉXITO!

¿Y en bacterias?¿Y en bacterias?

La genética en La genética en Oenococcus oeniOenococcus oeni

O'Sullivan T. & Daly C. O'Sullivan T. & Daly C. 19821982. Plasmids in . Plasmids in LeuconostocLeuconostoc species. J. Appl. species. J. Appl. Bacteriol. 64: 379-387.Bacteriol. 64: 379-387.

Esta especie posee pocos plásmidos, y son crípticos.Esta especie posee pocos plásmidos, y son crípticos.

Tiene características “extrañas”: taquitélico, no repara Tiene características “extrañas”: taquitélico, no repara apenas mutaciones, sus fagos son relativamente abundantes apenas mutaciones, sus fagos son relativamente abundantes y muy semejantes (¿una especie de fago solamente?), y es y muy semejantes (¿una especie de fago solamente?), y es bastante refractaria a la manipulación genética convencional.bastante refractaria a la manipulación genética convencional.

La conjugación en La conjugación en Oenococcus Oenococcus oenioeni: transposones: transposones

Zúñiga M., Pardo I. & Ferrer S. Zúñiga M., Pardo I. & Ferrer S. 19961996. Transposons . Transposons Tn916Tn916 and and Tn925Tn925 can can transfer from transfer from Enterococcus faecalisEnterococcus faecalis to to Leuconostoc oenosLeuconostoc oenos. FEMS . FEMS Microbiol Lett 135: 179-185.Microbiol Lett 135: 179-185.

Mating Frequency per donor cell Frequency per recipient cellCG180 x 840 2.3x10-8 2.4x10-8

CG180 x 841 9.7x10-9 1.1x10-8

CG180 x 866 2.2x10-6 9.5x10-6

CG110 x 866 4.8x10-6 1.9x10-6

CG180 x 872 ND 1.9x10-8

CG180 x 873 ND 1.2x10-6

CG180 x 874 ND 1.3x10-6

CG110 x 874 1.6x10-5 ND

Los transposones son estables en Los transposones son estables en O. oeniO. oeni..

La conjugación en La conjugación en Oenococcus Oenococcus oenioeni: plásmidos: plásmidos

Zúñiga M., Pardo I. & Ferrer S. Zúñiga M., Pardo I. & Ferrer S. 20032003. Conjugative plasmid pIP501 . Conjugative plasmid pIP501 undergoes specific deletions after transfer from undergoes specific deletions after transfer from Lactococcus lactis Lactococcus lactis to to Oenococcus oeni. Oenococcus oeni. Arch. Microbiol.Arch. Microbiol. 180: 367-373.180: 367-373.

Primera transferencia de plásmidos a la especie.Primera transferencia de plásmidos a la especie.

Pero……Pero……

La transformación en La transformación en Oenococcus Oenococcus oenioeni: una larga historia: una larga historia

Muchos años, muchos grupos, pocos éxitos…..y alguna que Muchos años, muchos grupos, pocos éxitos…..y alguna que otra “sorpresa”otra “sorpresa”

¿Hacia dónde vamos ¿Hacia dónde vamos ahora?ahora?




Propuestas de discusiónPropuestas de discusión



El “problema” de la falta de control El “problema” de la falta de control microbiológico en los vinosmicrobiológico en los vinos

• No se aíslan normalmente microorganismos No se aíslan normalmente microorganismos patógenos en el vinopatógenos en el vino

• No existe legislaciónNo existe legislación• ¿Falta formación de los técnicos?¿Falta formación de los técnicos?• ¿Falta de confianza en los científicos y en los ¿Falta de confianza en los científicos y en los

resultados?resultados?• Creencia de que son análisis caros e innecesariosCreencia de que son análisis caros e innecesarios• No es un problema de sustitución de No es un problema de sustitución de

metodologías, sino de introducción en el sectormetodologías, sino de introducción en el sector

BARRERAS CONTRA LA COMERCIALIZACIÓN DE LEVADURAS Y BACTERIAS ENOLÓGICAS RECOMBINANTES

• Científicas y tecnológicas: complejidad del vino y de las cepas, requerimientos de los productores y consumidores.

• Legales y regulatorias: aprobación OMG, definición completa de las secuencias de DNA.

• Propiedad intelectual y patentes: las patentes pueden restringir la “libertad de operación”. La liberación de OMGs puede ir en detrimento de la comercialización (de las cepas y los vinos).

• Políticas y económicas: interferencia de los proteccionismos. Establecimiento de barreras.

• Tradicionales y culturales: Etiquetados específicos. Posibilidad del marcaje como “libre de OMGs”.

• Percepción pública: Miedo a efectos en un futuro, daños en el medio ambiente y pérdida de la biodiversidad.

• ¿Necesitamos los OMG?• ¿Necesitamos más herramientas de manipulación

genética?• Las administraciones y organismos oficiales, ¿están o

estarán implicadas en este tema? ¿Deberían estarlo?• ¿Cómo puede esta tecnología llegar a las bodegas?• ¿Podemos impulsar la aceptación y la regulación de

estas tecnologías? ?Cómo hacerlo?• ¿Existe realmente una diferente visión para los viejos

y nuevos países productores?• ¿Puede llegar algún día la “Revolución Microbiana”?

Algunas propuestas…Algunas propuestas…

http://www.scienceinafrica.co.za/winefull.htm

Successful application of recombinant DNA technology in the wine industry will depend on assuring commercial users of genetically modified wine yeasts that existing desirable characteristics have not been damaged, that the requirements of beverage legislation are met, and that the engineered strain will be stable in practice, with suitable procedures for monitoring. The first recombinant wine products should unequivocally demonstrate organoleptic, hygienic and economic advantages for the wine producer and the consumer.

ENOLABENOLAB

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