Optimisation des conditions de fermentation et de stabilisation pour la production de bio-ingrédients

fonctionnels à base de Carnobacterium divergens M35

Mémoire

Laurent Dallaire

Maîtrise en sciences et technologie des aliments - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Laurent Dallaire, 2017

Optimisation des conditions de fermentation et de stabilisation pour la

production de bio-ingrédients fonctionnels à base de Carnobacterium

divergens M35

Mémoire

Laurent Dallaire

Sous la direction de :

Ismail Fliss, directeur de recherche

Denis Groleau, codirecteur de recherche

iii

Résumé du mémoire

Lors de travaux antérieurs, un bio-ingrédient permettant la bioconservation du saumon fumé

à froid et ayant une forte activité anti-Listeria fut développé et caractérisé. Il consiste en un

milieu de culture fermenté par C. divergens M35 et contenant la bactériocine produite par la

souche, soit la divergicine M35. Par contre, les conditions de production actuelles ne

permettent pas une utilisation efficace et rentable de ce bio-ingrédient. L’objectif de ce travail

est de répondre à ces problématiques.

Dans un premier temps, un milieu de culture de grade alimentaire favorisant une forte et

rapide croissance de C. divergens M35 et stimulant la production de la divergicine a été

développé. Un criblage de différentes sources d’azote, de carbone et de sels a permis de

déterminer que la mélasse de canne et le sucre de table (saccharose) sont les sources de

carbone de choix, la source d’azote préférentielle reste l’extrait de levure et que l’acétate de

sodium stimule la production en bactériocines.

Ce milieu fut testé en fermenteur de 30L afin d’évaluer l’effet de la mise à l’échelle. Le

milieu créé permet d’atteindre une biomasse de 9,04 log(UFC/mL) et une activité de 1,3X105

AU/mL en 7h. Il s’agit d’une amélioration significative quant à la performance, mais aussi

au coût du milieu de culture (0,89$/L) en comparaison à la référence, le milieu MRS (7$/L).

Dans un deuxième temps, il a été démontré que le séchage par atomisation est bien plus

efficace que la lyophilisation afin de produire un bio-ingrédient biologiquement stable. Le

séchage par atomisation permet d’obtenir un bio-ingrédient sec possédant une viabilité de

9,85 log(UFC/g) et une activité anti-Listeria de 1,6X106 AU/g. Ce procédé permet d’avoir

une production rentable du bio-ingrédient M35.

iv

Table des matières Résumé du mémoire ............................................................................................................ iii

Table des matières ............................................................................................................... iv

Liste des tableaux ............................................................................................................... vii

Liste des figures ................................................................................................................ viii

Remerciements .................................................................................................................... ix

Avant-propos ........................................................................................................................ x

Introduction générale ........................................................................................................... 1

Chapitre 1 : Revue de la littérature ...................................................................................... 3

1.1 Conservation de la qualité et de l’innocuité des aliments ........................................ 4

1.1.1 Pertes alimentaires dues aux altérations ........................................................... 4

1.1.2 Contaminations microbiologiques .................................................................... 4

1.1.3 Méthodes de conservation traditionnelle .......................................................... 6

1.2 Nouvelles tendances dans la conservation des aliments ........................................ 11

1.2.1 Bioconservation et cultures protectrices ......................................................... 11

1.2.2 Bactériocines .................................................................................................. 12

1.2.3 Les bactériocines comme nouvel additif pour la conservation des aliments .. 13

1.3 Carnobacterium divergens M35 ............................................................................ 15

1.3.1 Bio-ingrédient anti-Listeria à base de M35 .................................................... 15

1.3.1.1 Milieux de culture ....................................................................................... 17

1.3.1.2 Stabilisation du bio-ingrédient .................................................................... 21

1.3.1.3 Mise à l’échelle ........................................................................................... 24

Hypothèse ........................................................................................................................... 26

Objectifs ............................................................................................................................. 26

Chapitre 2 : Optimisation d’un milieu de culture et des conditions d’opération pour la

croissance de Carnobacterium divergens M35 ........................................................ 27

2.1 Résumé ................................................................................................................... 28

2.2 Introduction ............................................................................................................ 30

2.3 Matériel et Méthodes ............................................................................................. 32

2.3.1 Souches bactériennes et milieux de culture .................................................... 32

2.3.2 Dénombrement bactérien ................................................................................ 32

v

2.3.3 Mesure de l’activité anti-Listeria ................................................................... 32

2.3.4 Criblage des composants du milieu de culture ............................................... 33

2.3.5 Effet des conditions de culture ....................................................................... 35

2.3.6 Optimisation des concentrations par la MSR ................................................. 35

2.3.7 Effet de la co-culture entre C. divergens M35 et C. maltaromaticum CB1 ... 36

2.3.8 Effet du stress oxydatif sur l’activité de la divergicine M35 .......................... 37

2.3.9 Fermentations en bioréacteur de 30L ............................................................. 38

2.4 Résultats et discussion ........................................................................................... 39

2.4.1 Criblage des composants solubles du milieu de culture ................................. 39

2.4.2 Criblage des composants non solubles du milieu de culture .......................... 44

2.4.3 Détermination du milieu de culture ................................................................ 49

2.4.4 Effets des conditions de culture ...................................................................... 54

2.4.5 Optimisation de la concentration des composants .......................................... 58

2.4.6 L’effet de la mélasse, du sucre de table et du milieu minimum ..................... 61

2.4.7 Co-culture M35 et CB1 .................................................................................. 66

2.4.8 Résistance à l’oxydation de la divergicine M35 ............................................. 69

2.4.9 Mise à l’échelle du procédé de fermentation .................................................. 71

Chapitre 3 : Stabilisation du bio-ingrédient à base de C. divergens M35 et de sa

bactériocine par atomisation ..................................................................................... 76

3.1 Résumé ................................................................................................................... 77

3.2 Introduction ............................................................................................................ 78

3.3 Matériel et Méthode ............................................................................................... 80

3.3.1 Souches bactériennes et conditions de culture ............................................... 80

3.3.2 Conditions d’utilisation du séchoir atomisateur et MSR ................................ 80

3.3.3 Calcul des rendements (massique, biomasse et activité) ................................ 81

3.3.4 Dénombrement de C. divergens ..................................................................... 82

3.3.5 Mesure de l’activité anti-Listeria ................................................................... 82

3.4 Résultats et discussion ........................................................................................... 83

3.4.1 Choix de l’agent aidant au séchage ................................................................ 83

3.4.2 Analyse de la variance .................................................................................... 85

3.4.3 Surfaces de réponse ........................................................................................ 86

vi

3.4.4 Optimisation des conditions ........................................................................... 92

3.4.5 Caractéristiques du bio-ingrédient séché ........................................................ 94

3.4.6 Application sur le saumon fumé à froid ......................................................... 96

Conclusion générale et perspectives .................................................................................. 97

Bibliographie .................................................................................................................... 100

vii

Liste des tableaux

Tableau 1 : Constituant des diverses sources d'azotes .......................................................... 20

Tableau 2: Plan factoriel pour le criblage des composants solubles .................................... 34

Tableau 3: Plan factoriel pour le criblage des composés non solubles ................................ 34

Tableau 4: Plan expérimental de co-culture ......................................................................... 37

Tableau 5: Critères de référence pour le criblage des composés solubles............................ 39

Tableau 6: Effets statistiques des composants solubles sur le µmax, le temps pour l'atteindre

et l'activité anti-Listeria ............................................................................................ 41

Tableau 7: Critères de référence pour les composants non solubles .................................... 45

Tableau 8: Effets statistiques des composants non solubles sur la biomasse et l'activité .... 47

Tableau 9: Comparaison des conditions d'opération des bioréacteurs d'1L ......................... 57

Tableau 10: Estimations des coefficients triés pour la biomasse ......................................... 59

Tableau 11: Estimations des coefficients triés pour l'activité en microplaque .................... 59

Tableau 12: Comparaison économique des différents milieux de culture............................ 65

Tableau 13: Influence de la co-culture M35 et CB1 sur la biomasse et l'activité obtenue

après 18h ................................................................................................................... 68

Tableau 14: Évaluation de la stabilité de l'activité de la divergicine M35 lors de

l'entreposage ............................................................................................................. 70

Tableau 15: Composition finale des milieux STYA et MYA .............................................. 72

Tableau 16: Analyse de la variance de l'optimisation de l'atomisation ................................ 85

Tableau 17: Analyse de la variance de la température et de la concentration en

maltodextrine ............................................................................................................ 86

Tableau 18: Caractéristiques du bio-ingrédient séché par atomisation ................................ 94

viii

Liste des figures

Figure 1 : Causes microbiologiques de rappels alimentaires en 2016 au Canada et aux États-

Unis [1] ....................................................................................................................... 5

Figure 2: Principe des barrières en conservation alimentaire (Leistner et al. 1995) .............. 8

Figure 3: Croissance des microorganismes sur une matrice de poisson lors de sa

conservation (Gram et Huss, 1996) .......................................................................... 10

Figure 4 : Schéma du séchoir atomisateur ............................................................................ 23

Figure 5: Plan Box-Behnken pour l'optimisation des concentrations .................................. 36

Figure 6: Courbe de croissance de M35 en microplaque dans le milieu MRS .................... 39

Figure 7: Profileur de prédiction pour le criblage des composants solubles ........................ 43

Figure 8: Culture statique de M35 dans MRS dans un volume de 200mL .......................... 45

Figure 9: Profileur de prévision pour le criblage des composants non solubles .................. 48

Figure 10: Détermination des composants du milieu de culture STYA ............................... 51

Figure 11: Coût du milieu de culture en fonction du choix de composants ......................... 53

Figure 12: Établissement des conditions de culture optimale en fermenteur d'1L ............... 56

Figure 13: Profileur de prévisibilité pour les concentrations du milieu de culture .............. 60

Figure 14: Courbe de croissance du milieu à base de mélasse (MYA) ................................ 62

Figure 15: Effet de la mélasse, du sucre de table et du milieu minimum (MM) .................. 64

Figure 16: Fermentation des milieux STYA et MYA en fermenteurs de 30L ..................... 72

Figure 17: Effet de la mise à l'échelle à l'étape de fermentation .......................................... 74

Figure 18: Atomisation sans ajout d'additifs - caramélisation du bio-ingrédient entraînant

une forte adhérence sur la paroi du cyclone ............................................................. 84

Figure 19: Atomisation avec ajout de maltodextrine - très faible adhérence du bio-

ingrédient sur la paroi du cyclone ............................................................................. 84

Figure 20: Surface de réponse pour le rendement massique ................................................ 88

Figure 21: Surface de réponse du rendement en biomasse ................................................... 91

Figure 22: Surface de réponse du rendement en activité ...................................................... 91

Figure 23: Profileur des prévisions pour l'optimisation des conditions de séchage ............. 93

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ix

Remerciements

J’aimerais d’abord remercier sincèrement mon directeur de recherche, le Dr Ismail Fliss pour

l’opportunité qu’il m’a offert de développer mes compétences dans le cadre de la chaire

METABIOLAC. Je le remercie pour la confiance qu’il a eu en moi et pour la pleine liberté

qu’il m’a donné dans l’orientation de mes travaux. Vous m’avez offert tous les outils afin

que je puisse m’épanouir et je suis très heureux d’avoir participé à l’application industrielle

de vos nombreuses années de travail.

J’aimerais aussi remercier mon codirecteur de recherche Dr Denis Groleau qui est la

référence par excellence dans le domaine des biotechnologies au Québec. Vos nombreux

conseils ont toujours permis de bien enligner mes recherches et votre enthousiasme pour la

recherche était des plus contagieux.

Je tiens aussi à remercier Dr Allison Vimont et Dr Benoit Fernandez qui ont énormément

participé à l’élaboration de ce projet. Les nombreuses séances de remue-méninges que nous

avons eu ont permis de faire avancer exponentiellement ce projet. Je vous remercie aussi

pour le temps que vous avez dédié à ce projet et à répondre à mes très nombreuses questions!

Je veux aussi remercier les technicien(nes) de laboratoire Marine Béguin et Jean-Nicolas

Ouellet de l’Université Laval, ainsi qu’Isabelle Arsenault de l’Université Sherbrooke pour

leur soutien durant mes travaux.

Je veux remercier tout le groupe d’étudiants de l’AGIDSA qui ont rendu mon expérience à

l’Université Laval incroyablement enrichissant et divertissant.

Je veux finalement remercier ma copine Noémie de m’avoir épaulé depuis le début dans ce

projet et d’avoir toujours été présente dans les hauts et les bas de cette maîtrise.

x

Avant-propos

Ce projet s’inscrit à la suite de nombreuses recherches qui ont été faites sur les bactériocines

et leur application dans le domaine alimentaire afin de répondre à la demande en nouvelles

techniques de conservation biologique. Dans ce cas, ces travaux s’adressent particulièrement

à la souche C. divergens M35 dont la caractérisation et les études d’application sur des

matrices alimentaires ont été accomplies à l’Université Laval en partenariat spécial avec

Fumoir Grizzly de St-Augustin-de-Desmaures, QC, Canada. L’objectif final de ce projet est

de faire la démonstration qu’une production abordable en bio-ingrédients à base de

bactériocines est possible, et permettre son utilisation dans le domaine alimentaire.

Ces travaux ont été réalisés et financés par la chaire de recherche industrielle du CRSNG sur

les activités métaboliques et la fonctionnalité des cultures lactiques bio-protectrices

(METABIOLAC). Cette chaire regroupe plusieurs industries et partenaires dont le

Consortium de recherche et innovations en bioprocédés industriels au Québec (CRIBIQ),

l’Institut sur la nutrition et les aliments fonctionnels (INAF), le Centre de recherche en

sciences et technologie du lait (STELA), Cascades, Groupe Sani Marc, Novalait, La Coop,

Olymel, Biena et Fumoir Grizzly.

1

Introduction générale

Malgré les progrès dans le domaine de la transformation alimentaire, les contaminations

microbiologiques restent choses courantes. Au Québec, les contaminations microbiologiques

des produits Maple Leaf® et XL Food Inc. furent très médiatisés. Ajoutant à la difficulté de

garantir l’innocuité microbiologique des aliments, les consommateurs sont de plus en plus à

la recherche d’aliments sans agents de conservation chimiques. Il y a donc un besoin pour de

nouvelles barrières biologiques permettant de répondre à ces nouvelles attentes. Plusieurs

alternatives naturelles telles les cultures protectrices, les huiles essentielles et les

bactériocines sont présentement étudiées et proposés comme nouvelles barrières de

protection microbiologiques des aliments [2]. Les bactériocines sont des peptides (

2

contenant la bactérie et sa bactériocine n’est industriellement pas approprié. Tous ces facteurs

ne permettent donc pas d’obtenir un procédé de production de la divergicine M35 rentable.

Plusieurs travaux ont démontré le potentiel d’optimisation de la production de différentes

bactériocines afin d’atteindre le seuil de rentabilité. La première approche étudiée est la

réduction du coût du milieu de culture. L’utilisation de sources de carbone et d’azote

provenant de déchets de l’industrie alimentaire permettrait de réduire ces coûts [11].

Différents travaux ont d’ailleurs démontré l’obtention de rendements similaires au milieu

MRS en utilisant différentes sources d’azote alternatives (ex : hydrolysats de poissons et

peptones de patate) et de carbone (ex : mélasse de canne et extrait de malt) [12, 13].

Dans le cas d’utilisations alimentaires, la présence d’allergènes doit toujours être prise en

compte [14]. Le deuxième défi rencontré lorsque l’utilisation des bactériocines dans les

secteurs alimentaire et vétérinaire est envisagée est le conditionnement et la stabilisation

physicochimique et biologique des préparations à base de bactériocines. Le séchage du bio-

ingrédient produit et l’ajout d’agents protecteurs est nécessaire afin d’éviter sa dégradation

[15]. Enfin, une mise à l’échelle du procédé est nécessaire afin de démontrer la faisabilité

industrielle du procédé développé.

3

Chapitre 1 : Revue de la littérature

4

1.1 Conservation de la qualité et de l’innocuité des aliments

1.1.1 Pertes alimentaires dues aux altérations

En 2010, au Canada seulement, il était estimé que le gaspillage alimentaire dû à la

surproduction, aux défauts des aliments et à l’altération de ces aliments équivalait à 27

milliards de dollars canadiens [16]. Ce gaspillage nuit à la demande nutritive exponentielle

de la population mondiale causée par l’augmentation de la population. Il est estimé que d’ici

2050, la population aura atteint 9,1 milliards d’êtres humains. Afin de subvenir à cette

augmentation, l’offre alimentaire devra augmenter d’au moins 70% en comparaison à la

production mondiale offerte en 2005/07 [17]. Afin d’atteindre cette demande, le domaine

agroalimentaire devra être plus performant et efficace dans la production des denrées

alimentaires, mais aussi réduire les pertes énormes qui nuisent à cette efficacité. Dans bien

des cas, ces pertes sont causées par des méthodes de conservation, de transformation et

d’entreposage inadéquates, réduisant considérablement la durée de vie de l’aliment [18].

Les trois grands types d’altérations des aliments sont l’altération physique, l’altération

chimique et l’altération microbiologique [19]. La première altération est causée par un

dommage à la structure de l’aliment qui peut nuire à son esthétisme, mais va aussi favoriser

les deux autres types d’altérations. L’altération chimique est due à la modification du contenu

protéique, en carbone et lipidique. Ce type d’altération va de pair avec l’activité de l’eau (aw)

dans l’aliment qui favorisera l’oxydation des lipides, la réaction de Maillard, stimuler

l’activité enzymatique et la croissance de microorganismes. Dans ce dernier cas, l’altération

de l’aliment provient de la contamination microbienne de l’aliment. Il serait d’ailleurs estimé

que 25% des pertes alimentaires seraient causées par des contaminations microbiologiques

comprenant les bactéries, les levures et les moisissures [20].

1.1.2 Contaminations microbiologiques

Malgré les mesures d’hygiène de plus en plus strictes dans le domaine de la transformation

alimentaire, les contaminations microbiologiques des aliments sont toujours fréquentes. Au

Québec, les récents cas de contamination par Listeria monocytogenes de produits Maple

Leaf® et par Escherichia coli dans la viande de bœuf XL Food Inc. démontrent que

5

l’industrie de la transformation alimentaire n’est toujours pas à l’abri des contaminations

microbiologiques. Le rappel des produits contaminés est d’ailleurs très coûteux pour

l’industrie alimentaire. Une étude conjointe du FMI et du GMA démontrait récemment qu’en

moyenne aux États-Unis, le coût d’un rappel dans l’industrie alimentaire était de 10M$ [21].

En plus d’être un choc économique pour la compagnie victime du rappel, ce type de rappel

peut même tuer une marque de commerce; le consommateur ayant perdu confiance envers le

transformateur alimentaire. En 2016, le principal contaminant microbiologique fut Listeria.

Au Canada et aux États-Unis, 196 rappels alimentaires par la FDA, la FSIS ainsi que l’ACIA

ont été causés par une contamination à Listeria [1]. Au Canada seulement, il s’agit de 42

produits alimentaires différents qui ont été victime d’un rappel causé par Listeria

monocytogenes dans la même année [22].

Mondialement, 600 millions de personnes seront victimes d’une intoxication alimentaire qui

est, dans la majorité de cas, causée par une contamination microbienne. Parmi ces personnes,

420 000 vont succomber à la maladie qui peut être causée par Listeria, Campylobacter, E.

coli, Salmonella ou par des norovirus [23]. Au Canada, annuellement, les contaminations

microbiennes connues des aliments causent 4 millions de maladies, soit un canadien sur huit.

Figure 1 : Causes microbiologiques de rappels alimentaires en 2016 au Canada et aux États-Unis [1]

6

Ces maladies requièrent l’hospitalisation de 11 600 de ces malades et entraînent la mort de

238 d’entre eux. Parmi ces contaminations, les norovirus sont les plus communs en causant

à eux seuls 1 million de cas rapportés de la maladie, mais Listeria reste la maladie la plus

mortelle avec 35 cas de mortalité dû à l’ingestion alimentaire de ce pathogène [24].

Les produits marins sont particulièrement susceptibles à ce type de contamination

microbiologique. La première source de contamination sont les eaux d’où proviennent le

poisson. En Californie, Listeria est retrouvée dans 81% des eaux fraîches et dans 62% des

eaux salées [25]. La transformation de ce type de produit inclut plusieurs étapes qui

augmentent le risque de contamination. Que ce soit le filetage, le salage, le séchage, le

fumage, le découpage et l’emballage, ce sont toutes des étapes de manipulation rajoutant au

risque de contamination. Dans le cas du saumon fumé à froid, en Norvège, il a été déterminé

que jusqu’à 10% des saumons commercialisés sont porteurs de Listeria. Cette contamination

n’est pas nécessairement critique comme la concentration retrouvée en Listeria n’excède que

rarement 100 UFC/g [26].

Cette fréquence de contamination peut être expliquée par le grand nombre de manipulations

requises à la transformation, mais aussi par deux autres facteurs. Le premier facteur est la

chair du saumon fumé qui est une excellente matrice pour le développement microbiologique.

Avec une forte activité de l’eau (aw) entre 0,98 et 0,999, un pH presque neutre, entre 6,1 et

6,3, et un faible taux de sel entre 3 et 2%, le saumon est fortement propice à la croissance de

Listeria [27]. Le deuxième facteur est l’absence de traitement thermique. Avant l’arrivée du

fumage à froid, le traitement thermique imposé par le fumage à chaud permettait de réduire

la charge microbienne de l’aliment. Avec le fumage à froid, il n’y a plus de traitement

thermique permettant de réduire cette charge.

1.1.3 Méthodes de conservation traditionnelle

Actuellement, l’industrie de la transformation alimentaire se fie aux barrières physiques et

au jumelage de celles-ci afin d’éviter les contaminations microbiennes. Ce concept est illustré

par Leitsner et al [28] à la figure 2 qui propose la modulation des traitements de conservation,

par la combinaison de plusieurs traitements différents. Ces barrières représentent les

7

différentes techniques de conservation des aliments (pH, O2, température, aw, etc.) qui

permettent de réduire la charge bactérienne avec un effet bactéricide ou en limitant la

croissance de ces micro-organismes avec un effet bactériostatique. La combinaison de

plusieurs barrières permet d’augmenter leur efficacité sans pour autant altérer l’aliment. Par

exemple, la stérilisation représente la plus forte barrière permettant d’éliminer tout micro-

organisme. Par contre, son application est très limitée dans l’industrie alimentaire. La

pasteurisation est aussi un traitement thermique, mais qui représente une barrière moins

élevée que la stérilisation. Dans le cas du lait, sa combinaison avec une conservation à 4˚C

permet d’avoir deux barrières efficaces et n’altérant pas le produit.

8

Figure 2: Principe des barrières en conservation alimentaire (Leistner et al. 1995)

Légende : F : chaleur, t : froid, aw : faible activité de l’eau, pH : acidification, Eh : faible potentiel redox, pres :

agents de conservation, V : vitamines, N : nutriments.

9

Dans le cas du saumon fumé à froid, plusieurs barrières sont en place afin de tenter de limiter

la propagation des micro-organismes. Ces barrières comprennent le fumage qui ajoute une

multitude de composés ayant des effets antimicrobiens comme des formaldéhydes et des

phénols [29]. Elles comprennent aussi l’ajout de sels qui au Canada, est recommandé à une

concentration de 1% et permet de réduire l’aw du saumon, réduisant ainsi la propagation des

micro-organismes présents sur le saumon. L’ajout de nitrites permet l’inhibition des

principaux contaminants du saumon comme Listeria et Clostridium botulinum, mais devient

de plus en plus critiqué par les consommateurs [30]. L’emballage permet aussi de contrôler

l’atmosphère du produit. Au Canada, cet emballage doit être perméable à l’oxygène à un taux

supérieur à 2000 cc/m2/24h afin de limiter la croissance de Clostridium qui est un micro-

organisme anaérobique [31]. Finalement, la réfrigération et la congélation permettent de

ralentir la croissance de la majorité des contaminants microbiens. Listeria réussit tout de

même à croître à 4°C et peut se rendre à des concentrations de 100 UFC/g après 4 semaines

d’entreposage [32].

La barrière manquante au procédé de transformation du saumon fumé est le fort traitement

thermique qui permettrait de réduire la charge microbienne. Évidemment, cette barrière ne

peut être mise en place, car le traitement thermique aurait un effet de cuisson sur la chair du

poisson. Il est possible de voir la croissance microbienne lors de la conservation du poisson

à la figure 3. En fonction de ces données, la réglementation canadienne limite la conservation

des produits marins frais à 14 jours.

10

Figure 3: Croissance des microorganismes sur une matrice de poisson lors de sa conservation (Gram et

Huss, 1996)

11

1.2 Nouvelles tendances dans la conservation des aliments

1.2.1 Bioconservation et cultures protectrices

Le consommateur étant de plus en plus conscientisé par son alimentation, de nouveaux défis

se rajoutent dans le domaine de la conservation. En effet, ce consommateur préfère des

aliments ne contenant pas d’agents de conservation chimiques comme les nitrites.

Évidemment, ce retrait des agents chimiques de l’alimentation ne doit pas se faire au

détriment de son innocuité. Afin de contrôler les flores bactériennes pathogènes altérant les

aliments, des bactéries inoffensives et productrices d’agents antimicrobiens sont souvent

ajoutées aux aliments. C’est ce qui se nomme la bioconservation des aliments.

La bioconservation inclut aussi l’ajout de métabolites antimicrobiens sans la souche

productrice [33]. Les métabolites produits par ces bactéries servent d’agents antimicrobiens

permettent l’inhibition de contaminants bactériens. Dans les aliments fermentés, l’acide

lactique et acétique, le lactate de sodium, le peroxyde d’hydrogène, le CO2, le diacétyle et

l’acétaldéhyde produits par les bactéries lactiques permettent ce pouvoir inhibiteur. Ces

composants causent la perméabilisation des membranes bactériennes [34]. La production

d’acides organiques, tels l’acide propionique, l’acide sorbique, ainsi que des acides gras sont

d’autres exemples d’agents permettant le contrôle de bactéries pathogènes [35]. La

bioconservation ne mise pas seulement sur la production d’agents antimicrobiens par les

souches protectrices ajoutées, mais aussi sur l’effet de compétition exclusive. Dans bien des

produits fermentés comme les saucisses, la flore lactique aura un avantage compétitif sur la

flore pathogène et d’altération, ce qui protégera l’aliment d’une potentielle contamination

[33].

Certaines bactéries produisent aussi des peptides antimicrobiens (AMB) qui ont un potentiel

d’inhibition qui ne se limite pas aux bactéries seulement, mais peuvent aussi cibler des virus

et des parasites. Le mécanisme d’inhibition passe majoritairement par la formation de pores

dans la membrane cellulaire ou par l’inhibition de leur formation [36]. Ces peptides

proviennent aussi bien de procaryotes que d’eucaryotes et peuvent être des métabolites

primaires ou secondaires. Chez les animaux, les peptides antimicrobiens sont considérés

comme la première ligne de la défense immunitaire [37]. Les peptides antimicrobiens

12

produits chez les plantes comme les cyclotides ont aussi un rôle de défense immunitaire et

offrent un potentiel pharmaceutique [38]. Enfin, les AMB produits par les bactéries sont plus

communément référés comme des bactériocines.

La bioconservation par l’ajout de cultures protectrices permet d’ajouter une barrière de

protection biologique, mais comprend aussi ces défis. En effet, l’ajout d’une flore protectrice

qui est régulièrement composés de bactéries lactiques, va acidifier l’aliment. L’acidification

et l’activité protéolytique de ces souches peut donc entraîner une altération de la matrice

alimentaire. Par exemple, une étude de Leroi et al. [39] démontrait que l’application de

plusieurs souches lactiques sur le saumon fumé à froid entraînaient la production d’odeurs

non désirables. Il devient donc primordial d’identifier des souches ayant un faible potentiel

acidifiant et protéolytique, mais produisant d’autres composés antimicrobiens.

Une autre méthode de bioconservation est l’ajout de bactériophages sur les aliments. Les

bactériophages sont des virus qui se servent des bactéries afin de pouvoir se reproduire en

utilisant le mécanisme cellulaire de la bactérie infectée. Suite à sa reproduction, le

bactériophage entraîne la lyse cellulaire de la bactérie infectée. L’avantage de cette technique

est de cibler précisément les pathogènes à éliminer de la matrice alimentaire. Il existe

actuellement 5 produits à base de bactériophages permettant le contrôle de Listeria, E. coli,

Salmonella, X. campestris et P. syringae (ListexTM P100, ListShieldTM, EcoShieldTM,

SalmShieldTM et AgriPhageTM) [33]. Plusieurs défis restent à surmonter avec cette

technologie comme la production des phages qui nécessitent la croissance de souches

pathogènes et le besoin de créer des mélanges de phages afin de contrer les différents variants

de pathogène retrouvés dans l’industrie de la transformation alimentaire [40].

1.2.2 Bactériocines

Les bactériocines font partie de ces peptides antimicrobiens et sont des métabolites

bactériens. Ce pouvoir antimicrobien peut être bactéricide ou bactériostatique dépendamment

de la bactériocine et de sa concentration. Les bactériocines ont une taille variant entre 30 et

100 acides aminés, et sont synthétisées par voie ribosomale [41]. 99% de l’ensemble des

bactéries auraient la capacité de produire au moins une bactériocine [42]. Une minorité des

13

bactériocines est actuellement répertoriée, car le réel intérêt pour ces bactériocines est

relativement récent. Toutes les bactériocines connues à ce jour peuvent être retrouvées dans

la base de données en ligne appelée BACTIBASE avec le lien suivant :

http://bactibase.hammamilab.org/main.php [43].

À l’inverse des antibiotiques, les bactériocines ont généralement un spectre d’action précis

ciblant des souches proches de la souche productrice. De plus, à activité équivalente, une

plus grande concentration d’antibiotiques est nécessaire afin d’avoir la même activité que les

bactériocines [4]. Plusieurs avenues d’utilisation de ces bactériocines sont présentement à

l’étude. Un usage vétérinaire des bactériocines permettrait de remplacer les antibiotiques

comme promoteurs de croissance. Les bactériocines peuvent aussi être employées comme

agents de conservation dans l’industrie alimentaire, agents désinfectants pour la peau et

éventuellement comme médicaments dans le traitement des infections gastro-intestinales [3].

La grande majorité des bactériocines répertoriées et étudiées sont produites par les bactéries

Gram+. Les bactéries Gram- sont aussi productrices de bactériocines, mais elles sont moins

nombreuses et moins diversifiées [3]. La colicine produite par E. coli (Gram-) est la

bactériocine la plus étudiée [42]. Parmi les bactéries Gram+, ce sont surtout les bactéries

lactiques (LAB) qui suscitent le plus grand intérêt par leur présence courante dans

l’alimentation. Cette présence leur permet d’être généralement reconnues comme sécuritaires

(GRAS) par des organismes de santé publique comme la FDA aux États-Unis. Ce n’est pas

encore le cas pour toutes les souches de bactéries lactiques. Ailleurs qu’au Canada, ces

bactéries sont entre autres fréquemment ajoutées dans les produits laitiers comme souches

protectrices [44]. Carnobacterium maltaromaticum CB1 fait partie de ces souches

protectrices commercialisées et ayant la reconnaissance GRAS (n° GRAS 305, 2010). La

bactérie est commercialisée sous le nom de Micocin® et permet l’inhibition de L.

monocytogenes dans une large gamme d’aliments [45].

1.2.3 Les bactériocines comme nouvel additif pour la conservation des aliments

L’utilisation seule des souches productrices de bactériocines dans les aliments ne permet pas

de garantir l’élimination complète de pathogènes. L’efficacité des bactériocines comme

http://bactibase.hammamilab.org/main.php

14

agents de conservation est limitée par leur spectre d’action spécifique. Leur usage doit donc

être fait conjointement à une autre méthode de conservation afin d’assurer la sécurité de

l’aliment [46]. L’ajout de souches protectrices produisant des bactériocines permettrait tout

de même de remplacer les agents chimiques typiquement ajoutés afin de conserver

l’innocuité de l’aliment et prolonger sa durée de vie [47].

Les souches protectrices et leurs bactériocines peuvent être introduites dans les aliments de

trois façons. La première consiste à ajouter la bactériocine purifiée. Les désavantages de cette

technique sont les coûts supplémentaires afin de purifier la bactériocine et la perte d’activité

due aux conditions rencontrées dans l’aliment [6, 47]. La deuxième possibilité consiste à

remplacer les souches utilisées lors d’une fermentation par des souches productrices de

bactériocines. Par exemple, l’ajout de souches productrices de bactériocines comme

Lactobacillus plantarum 423 et Lactobacillus curvatus DF38, comme souches fermentaires,

permet d’inhiber la croissance de Listeria innocua [48]. La troisième possibilité est de sécher

un milieu de culture fermenté contenant la souche protectrice et ses bactériocines pour en

faire un ingrédient actif sous forme de poudre. Cet ingrédient pouvant ensuite être dilué à la

concentration désirée et ajouté sur différents aliments afin d’inhiber la croissance de

pathogènes. L’activité antimicrobienne est ainsi préservée et la souche ajoutée peut continuer

à produire ses bactériocines. Les différents composants du milieu de culture se retrouvant

dans cette poudre pourraient néanmoins altérer le goût de l’aliment [47].

L’ajout de cultures protectrices produisant des bactériocines est fréquente dans l’industrie

alimentaire. Dans le domaine fromager, il a été remarqué que certaines lactocoques utilisés

comme ferments produisaient de la nisine ayant un effet contre Clostridium, Bacillus et

Listeria [33]. Dans le domaine des produits carnés, il est fréquent de retrouver des souches

productrices de bactériocines dans les saucisses fermentés. La sakacine, leucocine,

mésentérocine, l’entérocine et la nisine sont toutes des bactériocines retrouvées dans

différentes saucisses fermentées et ayant un effet contre Listeria, Clostridium, Enterococcus,

Staphilococcus et Bacillus [33]. Il est aussi possible de retrouver le même genre de souches

productrices de bactériocines dans les produits marins, céréaliers, ainsi que la production de

vins.

15

Actuellement, seules deux bactériocines purifiées peuvent être ajoutées aux aliments, à savoir

la nisine (Nisaplin® par Danisco, Chrisin® par Chr. Hansen) pour le contrôle de Clostridium

butyricum dans les fromages et la viande notamment [6] et la colicine E1 pour le contrôle

d’Escherichia coli dans la viande de bœuf [7]. Toujours à l’extérieur du Canada, la nisine

produite par Lactococcus lactis est fréquemment utilisée dans l’industrie laitière, ainsi que

comme désinfectant permettant de soigner les mammites bovines [44]. Son application est

limitée par une perte d’activité lorsque le pH augmente, mais surtout par son interaction avec

les composants de la viande. Elle ne peut donc pas être utilisée seule comme agent de

conservation de produits carnés.

1.3 Carnobacterium divergens M35

Carnobacterium divergens M35 produisant la divergicine M35 présente un intérêt

particulier. Les carnobactéries font partie des LAB et sont présentes dans de nombreux

produits carnés, marins et laitiers. Cette omniprésence est particulièrement vraie pour

Carnobacterium divergens et C. maltaromaticum qui proviennent du microbiote intestinal

des poissons. Cette souche fut isolée de moules fumées commerciales lors de travaux

antérieurs de l’équipe du Dr Fliss. C. divergens M35 est caractérisée par la production d’une

bactériocine, la divergicine M35 [49]. Cette bactériocine ayant un poids moléculaire de

4517,75 Da, possède une forte activité anti-Listeria, mais aussi contre les autres

carnobactéries. C’est surtout son activité contre Listeria qui la rend très intéressante dans

l’industrie de la transformation des produits de la mer. De plus, sa faible activité

protéolytique limite le potentiel de dégradation de la matrice alimentaire si C. divergens M35

y est ajoutée. Récemment, l’équipe du Dr Ismail Fliss a homologué auprès de Santé Canada

(réf. ADDFS 11062001) l’application de C. divergens M35 sur les produits marins fumés

[50]. La divergicine M35 produite par C. divergens M35 est d’ailleurs protégée par un brevet

(US 6013-141).

1.3.1 Bio-ingrédient anti-Listeria à base de M35

Les études d’incorporation de souches de bactéries lactiques sur le saumon fumé à froid afin

de lutter contre la croissance de Listeria ont débuté aux débuts des années 2000 avec des

travaux comme ceux de Truelstrup Hansen [51]. Depuis, plusieurs travaux ont été effectués

16

avec une autre souche de carnobactéries, soit Carnobacterium divergens V41. Ces travaux

ont démontré l’inhibition de Listeria par l’addition de sa bactériocine sur le saumon fumé

[52]. Dans la majorité de ces études, la souche protectrice et sa bactériocine avaient été

purifiées avant l’application sur la matrice alimentaire. Par contre, le faible rendement de

purification des bactériocines, ainsi que la capacité réduite de production de la bactériocine

une fois sur la matrice alimentaire diminuent l’efficacité de cette technique. L’équipe du Dr

Fliss fut la première à tester l’application du milieu de culture fermenté par C. divergens M35

comprenant aussi sa bactériocine [50].

Cette nouvelle méthode permet de créer un bio-ingrédient ayant deux actions. Dans un

premier temps, la bactériocine contenue dans le milieu de culture fermenté agira contre

Listeria dès son application sur le saumon fumé à froid. L’application du milieu de culture

fermenté ajoutera aussi C. divergens M35 sur le saumon. Cette bactérie continuera donc à

produire sa bactériocine sur la matrice alimentaire afin de maintenir l’inhibition contre

Listeria. Sa présence en plus forte concentration compétitionnera avec les autres

contaminants microbiologiques pour les nutriments présents à la surface du saumon. Cette

compétition n’affectant pas la qualité finale de la matrice de saumon. L’application du milieu

de culture fermenté sur la matrice alimentaire permet de simplifier le procédé de fabrication,

en éliminant les étapes de purification.

Afin de pouvoir offrir ce bio-ingrédient actif à l’échelle industrielle, la production doit être

optimisée. En effet, les carnobactéries, ainsi que les bactéries lactiques en général, sont des

bactéries nutritionnellement très exigeantes et ont une productivité protéique faible. Les

milieux préconisés pour ce type de souches, comme le milieu de Man-Rogosa-Sharpe (MRS),

sont très dispendieux et peu adaptés pour les carnobactéries [10, 44]. Un autre facteur

affectant le rendement en bactériocines est la méthode de stabilisation. La perte de l’activité

antimicrobienne est due à la sensibilité des bactériocines à l’oxydation et aux variations de

pH lors de l’entreposage du produit [44]. Il en va de même pour la viabilité de la souche qui

est influencée par la méthode de stabilisation choisie.

17

1.3.1.1 Milieux de culture

1.3.1.1.1 Milieu de référence : MRS

Le milieu de culture de référence actuellement pour C. divergens M35 est le MRS. Ce milieu

permet une excellente croissance des bactéries lactiques (LAB) et permet de maximiser la

production des bactériocines pour une majorité de ces souches. Les LAB sont des souches

qui nécessitent des milieux complets et riches. Le MRS répond à ces demandes, mais il est

actuellement trop dispendieux pour un usage industriel. Carnobacterium divergens M35, qui

est une bactérie lactique, croît jusqu’à une densité de 3×10^8 UFC/mL en 30h, avec une

production de divergicine M35 à 2048 AU/mL, dans le milieu MRS [10]. La composition du

MRS est (g/L) : Peptone de protéose (10), extrait de bœuf (10), extrait de levure (5), dextrose

(20), polysorbate 80 (1), citrate d’ammonium (2), acétate de sodium (5), sulfate de

magnésium (0,1), sulfate de manganèse (0,05) et phosphate dipotassique (2). Ensemble, les

trois sources d’azote (peptone, extrait de bœuf et extrait de levure) fournissent près de

3,125g/L d’azote [53]. Cette quantité d’azote peut donc servir de référence lors de

l’élaboration de milieux alternatifs.

Plusieurs études portent sur l’utilisation de milieux alternatifs et moins coûteux que le MRS,

tout en utilisant ce milieu comme contrôle positif. Ce milieu doit être modifié afin d’être

adapté aux critères spécifiques de la souche étudiée. Afin de réduire les coûts associés au

milieu de culture MRS, les dispendieuses sources de carbone et d’azote sont souvent

remplacées par des sous-produits ou déchets de l’industrie alimentaire et de l’agriculture [11].

1.3.1.1.2 Sources de carbone

Dans un milieu de culture, la source de carbone sert de source d’énergie pour la bactérie,

mais sert aussi de constituant à la cellule bactérienne. Les sources de carbone ne sont

généralement pas les éléments les plus dispendieux d’un milieu de culture, mais elles peuvent

le devenir à grande échelle. Diverses sources de carbone provenant de l’industrie alimentaire

peuvent remplacer le glucose présent dans le MRS. Le sucrose est métabolisé par les

carnobactéries [54] et est la source de carbone dans le milieu CTSI (pour Cresol red Thallium

acetate Sucrose Inulin medium) servant à isoler ces carnobactéries [55]. La mélasse de canne

contient majoritairement du sucrose et est un sous-produit retrouvé en grande quantité dans

18

l’industrie du sucre. La mélasse blackstrap est le résidu de mélasse suite à l’extraction du

sucrose qu’elle contient. Elle contient généralement moins de 46% de sucres totaux, mais

contient aussi une large variété de sels et minéraux comme du potassium, du manganèse, du

magnésium, etc. [56, 57]. Ce sont d’ailleurs des sels retrouvés dans le milieu MRS. Son

abondance et son faible coût favorise son utilisation fréquente dans la fabrication de

bioéthanol [58]. L’extrait de malt est une source majoritaire de maltose, mais contient aussi

du glucose, du sucrose et d’autres sources variées de carbone. Il s’agit donc d’une source de

carbone complexe pouvant aussi contenir des protéines [59, 60]. C’est un ingrédient à faible

coût fréquemment utilisé dans l’industrie alimentaire qui pourrait se substituer au glucose

dans le MRS.

1.3.1.1.3 Sources d’azote

Les sources d’azote servent à fournir tous les acides aminés nécessaires à la synthèse de

protéines par la bactérie. Les sources d’azote sont beaucoup plus dispendieuses et plusieurs

études détaillent les diverses sources provenant des sous-produits de l’industrie alimentaire.

La croissance des bactéries lactiques est d’ailleurs souvent dictée par leur capacité limitée à

synthétiser divers acides aminés. La source d’azote du milieu de culture doit donc être

complète et en grande quantité. Les extraits de levure demeurent la source d’azote la plus

largement utilisée. En effet, l’extrait de levure est une source complexe d’azote fournissant

un mix d’acides aminés, de peptides, de vitamines, mais peut aussi servir de sources de

carbone. Cet apport très varié en fait une source d’azote pouvant être utilisé pour la croissance

d’une large gamme de micro-organismes [61]. Les autolysats de levures provenant de

l’industrie de la bière sont peu coûteux et offriraient les mêmes rendements que les extraits

de levure. Par contre, la présence de gluten dans ce produit rend son application difficile dans

les différents produits alimentaires. En effet, avec les cas de plus en plus nombreux

d’intolérance au gluten, il serait inapproprié d’en ajouter sur un produit qui n’en contient

normalement pas. Il est aussi fréquent de voir l’extrait de levure jumelé à une autre source

d’azote afin de compléter l’apport en acides aminés.

Ces sources peuvent être des extraits de viande qui contiennent des peptides, des acides

aminés, des acides organiques, des minéraux et quelques vitamines. Ce type d’extrait

19

provient de l’extraction liquide de résidus carnés qui est ensuite séché pour obtenir une

poudre [61]. Ce type de source d’azote est fréquemment utilisé en microbiologie, mais est

hautement supervisé dans l’industrie pharmaceutique afin d’éviter la transmission

d’encéphalopathies spongiformes transmissibles (TSE) ou d’encéphalopathies spongiformes

bovines (BSE). Les sources d’azote peuvent être également végétales comme les peptones

de pomme de terre [13] ou de pois [62]. Elles permettent justement d’éviter la potentielle

présence de prions qui pourraient provenir d’une infusion de viande [63]. Les hydrolysats

de poissons représentent aussi une source d’azote permettant de valoriser un déchet de

l’industrie alimentaire. De plus en plus d’études se penchent sur l’utilisation de cette riche et

complexe source d’azote dans le cadre de divers types de fermentation [11, 64]. Récemment,

la fermentation d’un milieu à base de peptones de hareng a permis la production de

bactériocines avec Pediococcus acidilactici. Cette fermentation permettant d’atteindre une

activité anti-Listeria de 32768 AU/mL [64]. Enfin, ces sources peuvent aussi provenir de

l’industrie laitière sous la forme de lactosérum et de babeurre [65]. Ce sont deux sous-

produits retrouvés en abondance au Québec et ayant tout de même une forte teneur en

protéine.

Les sources d’azote pouvant être utilisées dans un milieu de culture sont nombreuses et très

variées. Par contre, la disponibilité des acides aminés varie fortement entre ces différentes

sources. La taille des peptones va aussi avoir une influence sur la capacité d’une bactérie à

avoir accès aux acides aminés. Ainsi, une source d’azote fournissant des peptones de petite

taille sera probablement préférentielle pour la croissance de C. divergens M35 et la

production en bactériocines.

20

Tableau 1 : Constituant des diverses sources d'azotes

Extr

ait

de

levu

re2

Lact

osé

rum

non

dén

atu

ré4

Bab

eurr

e4

Pep

ton

e d

e

pom

me

de

terr

e1

Pep

ton

e d

e

via

nd

e1

Pep

ton

e d

e p

ois

1

Hyd

roly

sat

de

pois

son

3

Protéine

LECO 56,8% 32,7% - - - 40%

Azote total

(TN)

10 -

11,8% 9,7% 5,6%

10 -

11% 6,1%

13,5 -

14,5 % 6,3%

Azote aminé

(AN)

4,8 -

6,3% - - 5 - 6% 2,6%

3,8 -

4,8% -

Gras - 5,12% 7,18% - - - 14%

Distribution

poids

moléculaire

- - - - - - -

> 10 000

Daltons 0% - - 0,3% 3% - -

1000 - 10 000

Daltons 11% - - 8% 38% - -

500 - 1000

Daltons 13% - - 18% 28% - -

300 - 500

Daltons 17% - - 19% 18% - -

21

1.3.1.1.4 Sources de sels

Finalement, les sels comme le citrate d’ammonium et l’acétate de sodium semblent avoir une

influence sur la croissance de C. divergens M35 et sur sa production de divergicine. Ce sont

les deux sels en plus grande concentration dans le milieu MRS. Par contre, l’ajout d’acétate

de sodium montre des résultats contradictoires tant dans la littérature que suite aux travaux

de l’équipe du Dr Ismail Fliss [10, 66]. L’acétate aurait un effet inhibiteur sur la croissance

bactérienne tout en favorisant la production de bactériocines. Pour Carnobacterium

piscicola A9b, l’acétate serait un inducteur de la production de bactériocines. Sa

concentration aurait une influence sur la production de bactériocines [67].

1.3.1.2 Stabilisation du bio-ingrédient

Une fois que la concentration en biomasse et que l’activité antimicrobienne est atteinte, la

stabilisation du produit désiré devient essentielle. L’activité des bactériocines produites est

fortement vulnérable à l’oxydation et aux variations de pH. Cette stabilisation doit permettre

de conserver la viabilité de la souche ainsi que l’activité anti-Listeria de sa bactériocine. Le

séchage du milieu de culture fermenté représente la meilleure solution, car elle permet

d’abord de réduire la masse du bio-ingrédient en éliminant le contenu en eau. Cette réduction

de la masse facilite ainsi son transport et son entreposage. De plus, le séchage permet de

réduire l’activité de l’eau du bio-ingrédient. Les phénomènes d’altération du bio-ingrédient

comme l’oxydation sont donc fortement réduits, ce qui augmente considérablement la durée

de vie du bio-ingrédient. Le séchage permet aussi d’éliminer le risque du développement de

bactériophages dans un milieu de culture fermenté et conservé à long terme [68].

Deux méthodes de séchage peuvent être employées dans le cas présent, soit la lyophilisation

et l’atomisation. La lyophilisation est une technologie répandue dans l’industrie des

biotechnologies, car elle permet généralement de maintenir un taux de survie de la souche

bactérienne pouvant aller jusqu’à 100% [69]. Évidemment, ces taux de survie dépendent de

la souche bactérienne, mais aussi des agents cryoprotecteurs ajoutés lors du séchage par

lyophilisation. En effet, la lyophilisation est considérée comme une méthode de séchage

douce, mais la congélation requise avant le séchage peut endommager les membranes

cellulaires lors de la formation de cristaux et causer une perte de viabilité [70]. La

lyophilisation est aussi limitée par son opération en mode discontinu, ce qui limite sa capacité

22

de séchage. Le séchage peut prendre plusieurs jours en fonction de l’équipement et du volume

à sécher. De plus, cette méthode est considérée comme étant la plus dispendieuse au niveau

de l’achat de l’équipement, mais aussi lors de l’opération de l’équipement [68, 71]. En effet,

pour la même quantité d’eau à retirer, il en coûterait six fois plus cher de le faire par

lyophilisation que par atomisation [71]. Dans le cas du séchage de probiotiques, le milieu de

culture fermenté est centrifugé afin de recueillir exclusivement la biomasse. Cette biomasse

ayant un faible volume, la lyophilisation est appropriée afin de la stabiliser. Dans le cas du

bio-ingrédient à base de C. divergens M35, tout le milieu de culture doit être séché. Le

volume à traiter est donc considérablement plus élevé et rend l’usage de la lyophilisation

économiquement moins intéressant.

Le séchage par atomisation est la méthode d’intérêt dans le cadre de cette étude, car elle

permet de traiter de plus larges volumes. À l’inverse de la lyophilisation, l’atomisation est

un traitement thermique qui mise sur le séchage très rapide du liquide. Ce liquide est atomisé

en une fine bruine dans une chambre chauffée par un jet d’air à co-courant du liquide. La

bruine ayant une très grande surface de contact avec l’air chaud, le contenu en eau s’évapore

avant le contact avec la paroi de la chambre de séchage [68]. Un cyclone est installé en série

après la chambre afin de séparer la matière sèche de l’air humide. La figure 4 permet de

visualiser le fonctionnement de cet équipement. Il s’agit d’une méthode très versatile et qui

est utilisée dans plusieurs types d’industrie. Les équipements de séchage par atomisation ont

une très grande capacité de séchage pouvant même atteindre 100kg/h dans les industries

minières [72]. Malgré ses avantages, cette méthode est peu documentée dans le domaine des

biotechnologies. Le traitement thermique, bien que court, peut nuire considérablement à la

survie de la souche bactérienne. Par contre, des études récentes démontrent la faisabilité

technique de cette méthode afin de sécher des cultures bactériennes. Dans la majorité des cas,

ces études portent sur le séchage de cultures utilisées dans l’industrie laitière, ce qui inclut

souvent les lactobacilles [68, 72, 73]. Une étude démontre même la faisabilité du séchage par

atomisation de bactéries produisant des bactériocines [74].

23

Figure 4 : Schéma du séchoir atomisateur

24

Un des défis reliés à la méthode de séchage par atomisation est la perte de rendement

massique dans le procédé. Le produit devant passer par la chambre de séchage, puis par des

canalisations menant au cyclone, le produit peut coller aux parois. Ce problème d’adhérence

est particulièrement rencontré dans le domaine du séchage des jus de fruits et légumes. Le

sucre qui est en forte concentration dans ces produits va caraméliser lors du séchage et

entraîner une forte perte de rendement massique. Ceci est dû à la faible température de

transition vitreuse (Tg) de ces sucres [75]. Cette température est de 62°C dans le cas du

sucrose. La même problématique s’applique lors du séchage de milieux de culture fermentés

qui contiennent encore des sucres. Afin de pallier à cette problématique, des agents aidant au

séchage peuvent être ajoutés à la solution, augmentant ainsi la température de transition

vitreuse. La maltodextrine et la gomme arabique sont parmi les agents aidant au séchage les

plus utilisées dans l’industrie alimentaire [76, 77]. L’isolat de protéines de lactosérum (IPL)

en faible concentration (1%) peut aussi être un excellent agent aidant au séchage, mais dans

ce cas, il est considéré comme un potentiel allergène [75]. La maltodextrine fut choisie

comme agent aidant au séchage dans cette étude, car il s’agit d’un polysaccharide bien connu

et qu’il est bien moins dispendieux que la gomme arabique.

1.3.1.3 Mise à l’échelle

Afin de déterminer la viabilité du concept élaboré en laboratoire, il est primordial de faire la

mise à l’échelle du procédé de production. Les résultats obtenus en laboratoire peuvent

grandement être différents de ceux obtenus à plus grande échelle. Plusieurs variables

viennent influencer cette mise à l’échelle, mais la principale est la variation dans le transfert

de masse. Ce transfert de masse dicte la présence de gradients en nutriments dans le

fermenteur, ce qui pourrait nuire à croissance de C. divergens M35. Le transfert de masse

variera en fonction des dimensions du fermenteur, de l’agitation appliquée ainsi que des

propriétés physiques du milieu de culture. Il est donc important de s’assurer que le transfert

de masse reste optimal lors de la mise à l’échelle du procédé [78]. La distribution de

l’oxygène dans le milieu de culture est souvent le facteur le plus influencé par le transfert de

masse. Dans le cas de C. divergens M35, ce ne sera pas un facteur majeur puisque cette

bactérie est anaérobique. Par contre, la présence de zones mortes, où les nutriments sont en

faibles concentrations, vient nuire à la croissance de la souche et à sa production de

25

bactériocines. Le même stress peut être observé dans une zone où les nutriments y sont en

trop grandes concentrations [79, 80]. Cette mise à l’échelle est primordiale pour l’industrie

afin de démontrer la viabilité industrielle des travaux accomplis en laboratoire.

26

Hypothèse

L’utilisation d’un milieu de fermentation optimal à faible coût jumelé à l’optimisation des

conditions de production et de stabilisation permettraient de produire de façon rentable un

bio-ingrédient à base de Carnobacterium divergens M35 et de divergicine à forte activité

antimicrobienne.

Objectifs

1. Étudier l’effet de la supplémentation du milieu de fermentation par différentes

sources de carbone, d’azote et de sels sur la biomasse et la production de bactériocine

par Carnobacterium divergens M35;

2. Produire à l’échelle pilote une formule de grade alimentaire stable et biologiquement

active à base de divergicine M35;

3. Effectuer la mise à l’échelle du procédé de fermentation et démontrer la faisabilité

technique du séchage par atomisation.

27

Chapitre 2 : Optimisation d’un milieu de culture et des

conditions d’opération pour la croissance de

Carnobacterium divergens M35

28

2.1 Résumé

Lors de travaux antérieurs, un bio-ingrédient permettant la bio-conservation du saumon fumé

à froid et ayant une forte activité anti-Listeria a été développé. Ce bio-ingrédient consiste en

un milieu de culture fermenté par Carnobacterium divergens M35 et contenant la

bactériocine produite par la souche, soit la divergicine M35. Dans un premier temps, le but

de cette étude est de développer un milieu de culture de grade alimentaire favorisant une forte

et rapide croissance de C. divergens M35 et stimulant la production de sa bactériocine. Un

criblage de différentes sources d’azote, de carbone et de sels a permis de déterminer que les

meilleures sources de carbones sont la mélasse de canne et le sucre de table (saccharose), la

source d’azote de choix restait l’extrait de levure, que l’acétate de sodium permet

d’augmenter la production en bactériocine et que le tween 80 est nécessaire afin d’éviter

l’agrégation des bactériocines.

La méthode de surface de réponse fut employée en fermenteurs d’1L afin d’optimiser la

concentration de chacun des composants. Ce test a permis d’identifier l’influence majeure de

la concentration en extrait de levure sur la croissance de la souche et sur sa production en

bactériocine. Deux milieux furent donc créés; le premier, STYA contient 5g/L de sucre de

table, 42g/L d’extraits de levure, 5g/L d’acétate de sodium et 1g/L de Tween 80, et le

deuxième, MYA, remplace le sucre de table par 30g/L de mélasse de canne. Ces deux milieux

furent testés en fermenteurs de 30L afin d’évaluer l’effet de la mise à l’échelle. Le milieu

STYA permet d’atteindre une biomasse de 9,04 log(UFC/mL) et une activité de 131 072

AU/mL en 7h, tandis que le milieu MYA permet d’atteindre une biomasse de 9,15

log(UFC/mL) et une activité de 262 144 AU/mL en 9h. Pour ces deux milieux, il s’agit d’une

amélioration significative en comparaison avec le milieu MRS qui est normalement utilisé.

Finalement, une co-culture entre C. divergens M35 et Carnobacterium maltaromaticum CB1

fut testée afin de déterminer s’il était possible d’augmenter l’activité produite lors de la

fermentation et s’il était possible d’augmenter le spectre d’action du bio-ingrédient. Par

contre, la croissance de C. maltaromaticum CB1 fut totalement inhibée par la présence de C.

divergens M35. Aucune stimulation de l’activité ne fut possible par la co-culture de ces deux

souches. Concernant la stabilisation de la divergicine M35, il a été démontré que la

29

bactériocine n’est pas sensible à l’oxydation, mais que l’activité fut diminuée de moitié si le

bio-ingrédient est entreposé pendant 24h à température pièce dans sa forme liquide. Ce

résultat démontrant la grande importance d’une méthode subséquente de séchage du bio-

ingrédient.

30

2.2 Introduction

Comme le milieu de culture fermenté est directement appliqué sur la matrice alimentaire à

protéger, ce milieu ne doit pas contenir d’allergènes ni de peptones animales. Le milieu de

référence actuel est le MRS qui permet à C. divergens M35 d’atteindre une concentration de

3×10^8 UFC/mL en 30h, avec une production de divergicine M35 à 2048 AU/mL [10]. Afin

de développer un milieu plus performant que le MRS et répondant aux exigences de

l’industrie alimentaire, la base de ce milieu fut conservée, mais ses sources d’azote, de

carbone et de sels furent modifiées. Quatre sources de carbone furent choisies, soient le

glucose et le sucrose qui sont des sources de carbone communes, mais aussi la mélasse et

l’extrait de malt qui sont des déchets de l’industrie alimentaire et permettent de réduire le

coût de fabrication du milieu [58, 59]. Les sources d’azote sont les composants les plus

coûteux d’un milieu de culture et ayant une influence significative sur la croissance de la

souche [11]. L’utilisation de sources d’azote provenant de déchets alimentaires comme

l’hydrolysat de poisson ou le lactosérum permettent de réduire ces coûts, tout en valorisant

une matière organique normalement peu utilisée [64, 65]. Les sources de sels sont aussi à

tester afin d’évaluer leurs influences sur l’atteinte d’une forte biomasse ou d’une forte

production en bactériocines. La source d’azote pouvant déjà fournir l’apport nécessaire de

ces sels. En testant les différentes combinaisons de sources de carbone, d’azote et de sels, il

sera possible de créer un milieu plus performant que le MRS et ayant un coût beaucoup plus

faible.

Une fois les composants déterminés, l’optimisation de leur concentration respective est

nécessaire et permettra l’atteinte d’une croissance optimale de la souche. Une faible

concentration des composants permet de réduire les coûts, mais elle peut devenir l’élément

limitant la croissance et la production en bactériocines [81]. Cette optimisation par la

méthode de surface de réponse (MSR) se fera en fermenteur d’un litre afin de contrôler les

conditions de culture comme l’agitation, le contrôle du pH et de la température [10]. Cette

étape permettra aussi de faire une première étape de la mise à l’échelle nécessaire à

l’obtention de la crédibilité industrielle.

31

D’autres facteurs sont aussi à considérer dans le procédé de fabrication du bio-ingrédient. La

stimulation de la production en bactériocines peut être induite dans un milieu de culture

défavorable, imposant un stress à la bactérie [82]. Une étude de Sip et al.,1998 [83] a même

démontré que la co-culture entre une souche de C. divergens et une souche de C.

maltaromaticum permettrait l’obtention d’une activité anti-Listeria 64 fois plus élevée que

la culture seule de C. divergens. Un autre facteur à considérer lors du procédé de fabrication

du bio-ingrédient est la sensibilité de la bactériocine au stress oxydatif [4]. Cette sensibilité

peut compromettre l’entreposage à long terme du bio-ingrédient et force l’ajout d’agents

antioxydants si la divergicine M35 démontre cette sensibilité.

La dernière étape de ce chapitre consiste en la deuxième mise à l’échelle du procédé de

fermentation en bioréacteur de 30L. La principale difficulté lors de cette étape est la

différence dans le transfert de masse entre deux fermenteurs de volumes différents [84]. La

qualité de ce transfert de masse va être influencée principalement par la géométrie du

fermenteur et la force d’agitation utilisée. Un bon transfert de masse est qualifié par une

turbulence uniforme qui réduit la présence de zones mortes dans le fermenteur [79]. Il est

donc crucial de s’assurer que la mise à l’échelle du procédé de fermentation n’influence pas

à la baisse la culture de C. divergens M35. Cette mise à l’échelle dans un volume pilote

permet de démontrer la faisabilité industrielle du procédé de fermentation.

Le premier objectif de ce chapitre est de développer un milieu de fermentation à faible coût,

permettant une croissance optimale de C. divergens M35 et favorisant la production de sa

bactériocine. L’influence des conditions de culture, de la co-culture et du potentiel oxydatif

de la bactériocine seront évalués afin de maximiser le potentiel du bio-ingrédient.

Finalement, une mise à l’échelle du procédé de fermentation permettra d’obtenir une

évaluation préliminaire de la faisabilité de la production du bio-ingrédient à l’échelle

industrielle.

32

2.3 Matériel et Méthodes

2.3.1 Souches bactériennes et milieux de culture

Carnobacterium divergens M35 fut isolée à partir de moules fumées commerciales [49] et

est détenue par l’Université Laval. Listeria ivanovii HPB28 provient d’Éric Émond (Santé et

Bien-Être Social Canada). Carnobacterium maltaromaticum CB1 provient de CanBiocin,

Alberta, Canada. Toutes ces souches furent maintenues à -80°C dans des solutions

cryoprotectrices contenant du glycérol à 20%.

La culture de C. divergens M35 et de C. maltaromaticum CB1 s’est fait aérobiquement à

30°C dans le milieu MRS (Difco Laboratories, Sparks, MD, USA). 5% (v/v) d’inoculum fut

choisi pour ces deux souches, afin de reproduire les conditions d’opération en industrie. La

culture de L. ivanovii HPB28 s’est faite de façon aérobique à 30°C dans le milieu TSB (Difco

Laboratories, Sparks, MD, USA) additionné d’extrait de levure à 0,6% (m/v). L’inoculum

pour cette souche lors du repiquage était de 1% (v/v).

2.3.2 Dénombrement bactérien

Le dénombrement de C. divergens M35 et de C. maltaromaticum CB1 s’est fait à l’aide de

la méthode des gouttelettes sur gélose TSB additionnée d’extraits de levure à 0,6% (m/v),

puis incubé à 30°C pendant 48h. Une dilution en série au 1/10 de chacun des échantillons

dans l’eau peptonée 0,1% permet ensuite d’évaluer la concentration bactérienne en UFC/mL.

2.3.3 Mesure de l’activité anti-Listeria

Les mêmes échantillons utilisés pour le dénombrement bactérien furent utilisés afin de

quantifier l’activité anti-Listeria. L’activité peut être mesurée de deux façons : par diffusion

en gélose ou par microtitration. La méthode de diffusion est celle développée par Tagg et al.

[85]. L’activité anti-Listeria du bio-ingrédient fut évaluée par le cercle d’inhibition dans une

gélose TSBYE inoculée avec Listeria.

Microtitration : Listeria ivanovii HPB28 fut utilisée comme souche sensible. Un millilitre

d’échantillon fut prélevé et centrifugé pendant 10 min à 10000 g. Un traitement thermique à

33

100°C pendant 10 minutes fut ensuite appliqué afin d’inhiber C. divergens M35. Il ne faut

toutefois pas comparer cette mesure de l’activité avec celle faite sur le bio-ingrédient séché

qui n’a pas été centrifugé. L’échantillon non centrifugé possédera une activité plus forte que

celui centrifugé. L’activité de l’échantillon centrifugé (Ac) est exprimée en AU/mL en

utilisant la formule suivante, où n est le nombre de puits inhibés [86]:

𝐴𝑐 (𝐴𝑈

𝑚𝐿) = 2𝑛 ∗ (

1000

125) = 2𝑛+3

2.3.4 Criblage des composants du milieu de culture

Le but premier du test de criblage est d’éliminer les composants nuisant à la croissance de C.

divergens M35 et à sa production de divergicine. Deux tests de criblage des composants

furent effectués. Le premier test était dédié à l’évaluation des composants entièrement

solubles et permettant le suivi de la croissance de C. divergens M35 en lecteur de

microplaque TECAN (Tecan Trading AG, Switzerland, 2017) . La culture s’est faite à 30°C

pendant 18h dans des microplaques 48 puits pouvant contenir 1mL de milieu de culture et la

lecture de la croissance s’est faite à 595nm. Un plan factoriel 4X4X3 en duplicata et

randomisé fut créé avec l’aide du logiciel statistique JMP (JMP®, Version 10. SAS Institute

Inc., Cary, NC, 1989-2007) et l’analyse des résultats s’est faite avec ce même logiciel pour

un total de 96 tests. Le plan factoriel de ce premier criblage se trouve au tableau 2. L’analyse

statistique portait sur trois facteurs : le µmax de la croissance qui est la pente maximale

(ΔDO595nm/Δtemps), le temps d’atteinte du µmax et l’activité anti-Listeria après 18h. Un

contrôle en MRS a aussi été utilisé comme témoin de ces facteurs.

Les sources d’azote étaient de provenances diverses : extrait de levure (Biena, St-Hyacinthe,

QC, Canada), peptone de pois, de patate et de viande (Organotechnie, La Courneuve, France).

Le malt provenait aussi d’Organotechnie. Pour la mélasse de canne, elle est le résidu de

l’usine de transformation Redpath de Montréal, QC, Canada.

L’hypothèse que les sources d’azote auront une influence significative sur la croissance de

la souche et sur sa production en bactériocine a mené à standardiser l’apport en azote des

différentes sources [11]. Le MRS a un apport en azote de 3,125g/L [53]. Tel que montré dans

34

le tableau 2, la concentration des différentes sources d’azote varie en fonction de leur nature

afin d’avoir toujours un apport en azote de 3,125g/L. La concentration des sources de carbone

fut fixée à 20g/L, comme dans le MRS, et il en va de même pour les sources de sels. Toutes

les combinaisons de milieux étaient additionnées d’un milieu minimum (MM) qui est la base

du milieu MRS (g/L) : polysorbate 80 (1), sulfate de magnésium (0,1), sulfate de manganèse

(0,05) et phosphate dipotassique (2).

Le deuxième test de criblage porta sur l’évaluation des composants non solubles, où la

croissance bactérienne ne peut être suivie par lecture de la densité optique. Un plan

factoriel 4X3X3 a été élaboré en duplicata et randomisé avec l’aide du logiciel statistique

JMP (JMP®, Version 10. SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2007) et l’analyse des résultats

s’est faite avec ce même logiciel pour un total de 72 tests. Le plan factoriel de ce deuxième

test se trouve au tableau 3. Comme pour le premier test, la concentration des sources d’azote

fut ajustée afin d’avoir un apport en azote de 3,125g/L et toutes les combinaisons furent

additionnées de milieu minimum.

Le lactosérum et le babeurre ont été fournis par Agropur, Granby, QC, Canada. L’hydrolysat

de poisson a été fourni par Océan NutraSciences, Matane, QC, Canada.

Tableau 2: Plan factoriel pour le criblage des composants solubles

Test de criblage #1

Carbone (Xg/L) Azote (Xg/L) Sels (Xg/L)

Glucose (20) Extrait de levure (28,7) Acétate de sodium (5)

Sucrose (20) Peptone pois (22,3) Citrate d’ammonium (2)

Mélasse (20) Peptone patate (29,8) Absence

Extrait de malt (20) Peptone viande (22,5)

Tableau 3: Plan factoriel pour le criblage des composés non solubles

Test de criblage #2

Carbone (Xg/L) Azote (Xg/L) Sels (Xg/L)

Glucose (20) Hydrolysat poisson (50) Acétate de sodium (5)

Sucrose (20) Lactosérum (32,2) Citrate d’ammonium (2)

Mélasse (20) Babeurre (55,9) Absence

Extrait de Malt (20)

35

La culture s’est effectuée en fioles Erlenmeyer de 20mL avec incubation à 30°C pendant 5h.

Tel que démontré dans les résultats, il s’agit du temps d’atteinte de la phase stationnaire en

termes de biomasse et de production en bactériocine par C. divergens M35 lorsqu’inoculé à

5% dans le milieu MRS. La biomasse, ainsi que l’activité de tous les échantillons, furent

évaluées statistiquement après 5h.

2.3.5 Effet des conditions de culture

Une fois que la composition du milieu de culture fut déterminée, une première étape de mise

à l’échelle fut effectuée en bioréacteur de 1L (Biogénie, Ste-Foy, QC, Canada). Les courbes

de croissance de C. divergens M35 et sa production en bactériocine ont été analysées afin

d’évaluer les conditions d’agitation suivantes : avec agitation (100rpm), sans agitation, et

avec agitation par bullage à l’azote (0,1L/min). La meilleure condition d’agitation fut ensuite

conservée afin d’évaluer l’effet du contrôle du pH à 7 [10]. Le maintien du pH à 7 s’est fait

par ajout de KOH 10M. Tous les tests furent effectués en duplicata avec un inoculum de 5%

et permettent de déterminer le temps d’atteinte de la phase stationnaire.

2.3.6 Optimisation des concentrations par la MSR

La méthode de surface de réponse (MSR) fut utilisée afin d’étudier l’influence de la

concentration de la source de carbone, d’azote et de sels sur la biomasse et l’activité anti-

Listeria lors de l’atteinte de la phase stationnaire. Cette méthode fut développée à l’aide du

logiciel statistique JMP (JMP®, Version 10. SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2007). La

RSM utilise des données quantitatives afin de tracer la réponse de la variable dépendante en

fonction de la variable indépendante continue. Elle permet aussi d’évaluer si une variable, ou

l’interaction entre plusieurs variables, a un effet considéré significatif sur la variable

dépendante [87]. Il est ainsi possible d’obtenir un graphique en trois dimensions de la réponse

en fonction des variables indépendantes. Ce graphique permet ensuite de déterminer le point

optimal de la réponse et, donc, les valeurs des variables indépendantes permettant d’atteindre

ce point optimal.

Dans le cadre de cette étude, les variations de concentration en source de carbone (5 à 35g/L),

d’azote (15 à 45g/L) et de sels (1 à 9g/L) furent évaluées en duplicata selon le plan Box-

Behnken pour un total de 26 tests.

36

Figure 5: Plan Box-Behnken pour l'optimisation des concentrations

2.3.7 Effet de la co-culture entre C. divergens M35 et C. maltaromaticum CB1

Afin de tester l’effet de la co-culture sur la l’activité antibactérienne, C. divergens M35 et C.

maltaromaticum CB1 ont été cultivés séparément en milieu MRS pendant 18h. Ces cultures

ont servi à fournir les inoculums nécessaires aux différentes co-cultures. Le plan

d’expérimentation se trouve au tableau 4. Pour les cultures faites à partir de la biomasse seule,

les inoculums ont été lavés en centrifugeant la culture à 10 000g pendant 10 minutes, retirant

le surnageant, puis en faisant resuspendre le culot dans une solution d’eau peptonée à 0,1%.

Certains essais ont été effectués en ajoutant le surnageant d’une culture contenant sa

bactériocine respective. Pour ce faire, une centrifugation à 10 000g fut appliquée pendant 10

minutes, puis le surnageant fut récupéré et chauffé à 100°C pendant 10 minutes. D’autres

essais ont incorporé un inoculum provenant du bouillon de culture traité à 100°C pendant 10

minutes afin d’ajouter non seulement les bactériocines, mais aussi les composants cellulaires

lysés. Le décompte bactérien fut calculé par la technique des gouttelettes après 18h de culture

en milieu MRS à 30°C. L’activité fut mesurée par diffusion avec Listeria ivanovii HPB28

comme souche sensible.

37

Tableau 4: Plan expérimental de co-culture

Inoculum normal

M35 CB1

5% 0%

3,75% 1,25%

2,5% 2,50%

1,25% 3,75%

0% 5%

2,5% 2,5% surnageant

2,5% surnageant 2,50%

2,5% 2,5% lysé

2,5% lysé 2,5%

Inoculum lavé

M35 CB1

5% 0%

3,75% 1,25%

2,5% 2,5%

1,25% 3,75%

0% 5%

2.3.8 Effet du stress oxydatif sur l’activité de la divergicine M35

Afin d’évaluer si la divergicine M35 est sensible aux altérations oxydatives, la bactériocine

fut exposée à une condition oxydante, avec ou sans agents antioxydants. Le surnageant d’une

culture de 18h de M35 dans le milieu MRS fut récupéré et traité à 100°C pendant 10 minutes.

Ce surnageant fut dilué d’un facteur 1/128, ce qui représente une dilution de 7 puits lors de

la mesure d’activité en microplaque. Un échantillon fut dilué dans de l’eau distillée et les

autres échantillons furent dilués dan