日皮会誌:105 ( 5 )、74レ・745、1995 (平７）

Mｙｃｏｈａｃtｅｒiｕｍ　ｍａｒ毎ｕｍ皮膚感染症の１例

一DNA-DNA hybridization法を用いた原因菌種の同定一

大浦

荒瀬

一卜

誠治2）

野本

村山

　　　　　　　　　　要　　旨

　右第II指指尖部に潰瘍と[司指基部に皮下硬結を認め

たリンパ管型非定型抗酸菌症の58歳男性例を報告し

た．外傷の既往は明らかで海釣りに行った時，魚の背

ビレ加指尖部にささり潰瘍となった．病理組織学的に

は真皮に肉芽腫性炎症を認め，組織培養で抗酸菌集落

を認めた．抗酸菌鑑別のために従来よりの同定法と，

今1ﾛ|新たにDNA-DNA hybridization法を試みたが

いずれの同定法でも分離菌はj柏'ｏｈｄｃ tｅｒiｕｍ　ｍｍ’

lyｍｎｉと同定された. DNA-DNA hybridization法は

迅速かつ簡便で抗酸菌の同定に有用な検査法であると

考えられた．

　　　　　　　　　　緒　　言

　本邦における皮膚非定型抗酸菌感染症は, 1969年中

嶋ら1）のＭｘｃｏｂａｃtｅｒiiim（以下訂．と略す）j ｙiiiｒmiim

感染症の報告以来，多数の報告がなされている．皮膚

病変は結節，肉芽腫，膿瘍,潰瘍などを形成するが,起

因菌の培養同定のみが本症の診断を決定づける．しか

し，本菌はやや発育が遅く，従来の抗酸菌鑑別法では，

各試験に多量の菌体を必要としたので菌種の同定に通

常４～８週間を要した．今回，われわれは迅速かつ簡

便なDNA-DNA hybridization 法（以下ＤＤＨ法と略

す）を用いて起因菌をＭ。川廠川皿と同定した皮膚非

定型抗酸‾菌感染症の１例を経験したので，若干の考察

を加え報告する．

　　　　　　　　　　症　　例

　患者:58歳，男性．

　初診：平成５年４月９口

1）高知県立中央病院皮膚科（）F任　野本正志部長）

2）徳島大学医学部皮膚科学教室（主任　荒瀬誠治教

　授）

3）高知市

平成６年８月四日受付，ギ成.6年12月２［］掲載決定

別刷請求先:（〒780)高知市桜井町２丁目７番33号

　高知県立中央病院皮田村　:大浦　　一

正志1）浦野　芳夫2）

　力3）

　主訴：右第II指指尖部の潰瘍，同指基部の硬結

　家族歴・既往歴：杵記すべきことなし．

　現病歴：平成４年10月，海釣りに行き右第II指末節

骨指腹部に黒鯛の背ビレがささった．１ヵ月後より同

部位は潰瘍となり，一時的に痴皮を形成したが治癒す

ることはなかった．さらに平成５年２月頃より同指基

部に２個の皮下硬結が出現し,徐々に増大してきた為，

近医にて皮膚非定型抗酸菌感染症を疑われ当科を紹介

された．

　現症：右第II指末節骨指腹部にｵ）ずかに溶出液をみ

る潰瘍を認めた．また，同指基部には直径10mmの比

較的境界明瞭な弾性硬の皮下結節を２個認めた（図

１）．圧痛，自覚症状なく，肘郷および瞼高の表在リン

パ節腫脹もみられず，全身状態は良好であった．

　　　　　　　　病理組織学的所見

　右第II指基部の皮下結節より生検しか．表皮には著

変なく，真皮上層から皮下組織にかけておもに類上皮

細胞, Langhans型巨細胞，リンパ球よりなる肉芽腫性

病変を認めた．その中心にEosin好性の無構造物を見

る部もあったが，明らかな乾酪壊死像は認められな

かった（図2a, b). Ziehl-Neelsen染色では組織内に

抗酸菌は証明されなかっか，組織の塗抹標本では抗酸

図１　初診時臨床像．右第II指末節骨指腹部の潰瘍と

　同指基部の皮下結節

742 大浦　　一ほか

図２　皮下結節の病理組織像．真皮中層に類上皮細胞, Langhans型巨細胞，リンパ球

　よりなる肉芽腫性病変を認める．（ａ：弱拡大像，ｂ：強拡大像, HE染色）

菌を認めた（図３）．

　　　　　　　　　細菌学的所見

　皮膚生検組織を１％小川培地に接種し，30で，37で

にて暗所培養した．２週間後に30てで培養した培地に

乳白色の表面平滑なＳ型菌集落が得られた．分離菌

は，光発色性陽性，ナイアシン試験陰性，硝酸塩環元

①　②　③　④　⑤　⑥　⑦　⑥　１

皮膚非定型抗酸菌感染症

図３　塗抹標本のZiehl-Neelsen染色

対照

TB complex

M. Kansasii

M. marinum

M. simiae

M. scroful【】ceum

M. gordonae

M. szulgai

⑨　⑩　ｏ　ｃ

＠

Ｒ

ｃ

Ｒ

Ｍ

M､avium

M.intracelluk】re

M. gastri

M. xenopj

M.nonchromogenicum

Ｍ､terroe

M. triviale

M. fortuitum

０　⑩　⑩　○　○　○　○　０　３

M.chelonae subsp. chelon【】ｅ

M. chelonae subsp. abscessue

M. fortuitumC'M. peregrinum")

図４　DNA-DNA hybridization 法で同定可能な抗酸菌属18菌種（右）と自験例の結

　果，肘.ｙｎａｒi^']ｕｍのウェルが青色に発色（左）

試験陰性, Tween ８０水解試験陰性，ピクリン酸培地，

ＥＢ培地では菌の発育はみられなかったが, PNB培地

にて菌の発育が認められた．この結果より本分離菌を

Ｍ.　ｍａｒｉｎｕｍと同定した.

　DNA-DNA hybridization法による起因菌の同定

　起因菌と思われる菌集落が得られた段階（培養２週

間後）で，ＤＤＨ法による同定を試みた．これは, DDH

743

マイコバクテリア‘極東’キット（極東製薬工業株式会

社）を用いた．具体的な起因菌の同定方法は, 1) DNA

の抽出, 2) DNAの標識と一本鎖化, 3) hybridiza-

tion, 4)検出，5）判定の５段階よりなる. 1) 1白金

耳量の被検菌をガラスビーズ入りＤＮＡ抽出用試験管

にとり，チューブミキサーで粉砕し, DNA抽出試薬

(Phenol-chloroform-isoamyl alcohol) 2mlを加え混

744 大浦　　－ほか

和後, 3,000回転で５分間遠心する．上層500μ1を別の

スピッツチューブに移し,エタノール1mlを添加,遠心

後，液層を除去する. 2) DNA標識試薬(photobiotin

solution) 100μIを加え混和後，水銀灯または写真撮影

用ライトで10分間光照射し, DNA変性試薬(0.6N

ＮａＯＨおよび0.9N ＮａＨ２Ｐ０，)をそれぞれ50μ1添加

混合する. 3) hybridization液(50%formamide) 3ml

を加え，マイクロプレートの各ウェルに100μ1ずつ分

注し，60°Ｃで２時間hybridizationを行う.4)プレー

トを洗浄後(Saline-sodium citratesolution)で３回洗

浄後，発色酵素(Streptoavidin-horseradish　perox-

idase) 100μ1を各ウェルに分注し，37°Ｃで10分間イン

キュペートする．次に洗浄操作後，発色基質液

(tetra血ethylbenzldine, H。02)100μ1を加え，室温で

放置し発色させる.5)最も強く発色したウェルの吸光

度が対照ウェルの吸光度の1.9倍以上であり，２番目に

強く発色したウェルの吸光度の相対類似度が70％以下

のウェルを同定菌種とする．なお，肉眼的に明らかな

発色が確認できる場合は吸光度を測定する心要はな

く，そのウェルの菌種と同定してもよい．自験例では

本法で同定可能な抗酸菌属18菌種のうちＭ.　ｍａｒ･

ｍｕｍ.のウェルのみが青色に発色し，Ｍ.　ｍａｒｉｎｕｍと

同定した(図４)．

　　　　　　　　　治療および経過

　皮膚生検後，魚による外傷の既往と塗抹標本で抗酸

菌が証明された事より非定型抗酸菌感染症を疑い，薬

剤耐性試験の結果を待たず直ちに塩酸ミノサイクリン

(200mg/日)を内服させた．内服３ヵ月後に指尖部の潰

瘍は治癒したが，皮下結節に変化はなかった．そこで

薬剤耐性試験で感受性を示したリファンピシン(450

mg/日)４ヵ月間投与したが,皮下結節はわずかに縮小

したものの消退しなかったので外科的に切除した．

　　　　　　　　　　考　　按

　皮膚非定型抗酸菌感染症の起因菌は，訂.ｍ.ｎ.ｎｎｕ竹l

が大部分を占めるが，他にもＭ．知加itｕｍ, Ｍ･

ｃｈｅｌｏｎａｅ,　Ｍ. I砥ｗｓｏｓii,　Ｍ.ｇｏｒｄｏｎａｅ，Ｍ，intｒａｃｅｌｌｕlaｒｅ

などの報告もみられる2)3)いずれの症例においても起

因菌の培養同定のみが本症の診断を確定する．抗酸菌

の鑑別および同定には，生物学的性状，生化学的性状，

抗結核剤耐性などの総合的な検査を必要とするが，一

定の同定法は確立されておらず，各施設により各様の

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文

　1)中嶋　弘,冨岡健作,佐藤直行：非定型抗酸菌(Ｍ.

　　　marinumまたはbalnei)症の２例，第１報．日皮

方法でなされているのが現状である.今回われわれは，

起因菌の同定にあたり従来より用いられている日本結

核病学会抗酸菌分類委員会試案にしたがった同定

法゛)にくわえ, DDH法を試みた．本法は，被検菌の全

ＤＮＡを用いた新しい種の同定法である6)7)その原理

は，被検菌株から抽出したＤＮＡをbiotinで標識し一

本鎖ＤＮＡとした後，抗酸菌18種の基準株のＤＮＡが

一本鎖状態でそれぞれ固定されたマイクロプレートの

各ウェル内でDNA-DNA hybridization を行い，各ウ

ェル内で形成されたhybrid　ＤＮＡをbiotin-

streptavidin反応で青色に発色させ，その吸光度より

被検菌のＤＮＡと最も反応したウェルの菌種を被検菌

の菌種と同定するものである．但し，自験例のように

肉眼的に明らかに発色を確認できる場合は，吸光度を

測定せずそのウェルの菌種と同定してもよいとされて

いる8).本法の全操作に必要な時間は４～５時間で，必

要な試薬および器具はキットに含まれており，特殊な

設備を必要とせず一般の施設で十分に使用できると考

える．従来の日本結核病学会抗酸菌分類委員会試案に

したがった同定法では，小川培地上の可視集落出現ま

でに２～３週を要し，さらに各試験のために多量の菌

体を必要としたので菌種の同定に通常４～８週間を要

し，自験例でも約５週間かかったが, DDH法では小川

培地上の菌集落から直接検出可能で被検菌の分離培養

後，数時間で同定が可能である．また，生化学的菌種

同定法との相関ではＭ。細細ｒｃｕloｓiｓ, Ｍ. ｋａｎｓａｓii,　Ｍ.

ｍａｒｍｗｍ, Ｍ.　ｓｏｒｄｏｎａｚ,　Ｍ.　ａｖiｕｍ ｃｏｍｔleｘ, Ｍ.れｏル

ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ, Ｍ.　ｃｈｅｌｏｎｏｅ ｓｕhｓｐ,　ｃｈｅｌｏｎａｅ， Ｍ.

ｃｈｅｌｏｎａｅｓｕhｓｂ. abｓｃｅｓｓＭＳの８菌種は100％一致し，肛.

ｓｃｒｏ血ｌａｃｅｕｍ　J3よびＭ.かｒiｕitｕｙｎでは,若干のばらつ

きがみられたが再現性，感度において良好な結果が得

られたとする報告がある8).自験例では両同定法とも

Ｍ，■ｍａｒｉｎｕｍで一致した．

　皮膚非定型抗酸菌感染症の報告のほとんどは上記の

７菌種(M. tubりｒｃｕloｓiｓを除く)が起因菌であり, PCR

法による迅速診断が不可能な現在，皮膚科領域におい

てもこのＤＤＨ法は従来の生化学的同定法に比べて遜

色なく極めて有用な起因菌の同定法であると考える．

　本論文の要旨は日本皮膚科学会第22回高知地方会にて報

告した．

献

　　会誌，80 : 137-138, 1970.

2）新井裕子，中嶋　弘，高櫛泰英，黒沢伝枝，永井隆

皮膚非定型抗酸菌感染症

　　吉：わが国における皮膚非定型抗酸菌感染症，皮

　　膚臨床，25 : 521-528, 1983.

3）大郷典子，上村寛行，土井　顕，宋　義郎：皮膚非

　　定型抗酸菌症の１例，皮膚紀要，86 : 263-269,

　　1991.

4）日本結核病学会抗酸菌分類委員会：臨床材料に見

　　出される抗酸菌とその鑑別，同定法,結核,51:247

　　-256, 1976.

5）斎藤　肇：抗酸菌の分離と同定，臨床と微生物，

　　13 : 656-669, 1986.

6) Ezaki T， Hashimoto Ｙ， Yabuuchi E :　Fluor-

　　omet r i c　deoxyribonucleic　acid-

　　deoxyribonucleic　acid　hybridization　in　mi-

　　crodilution wells as an alternative to membrane

745

　　filter hibridization in which radioiotopes are

　　used to determine genetic relatedness among

　　bacterial strains.バ址JS吋泌ｄ出所,39 : 224-

　　229, 1989.

7) Kusunoki Ｓ， Ezaki T， Tamesada Ｍ， et al :

　　Application of colorimetric microdilution plate

　　hybridization for rapid genetic identification of

　　22 mycobacterium species,r ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｈｉｏｌ,

　　29 : 1596-1603, 1991.

8)長沢光章，荒井恵子，森　真一，玉井誠一，関口

　　進，根岸昌功：ＤＮＡ-ＤＮＡマイクロプレートハイ

　　ブリダイゼーション法による抗酸菌同定(ＤＤＨマ

　　イコバクテリア‘極東')の基礎的検討，臨床検査機

　　器・試薬，16 : 141-145, 1993.

　　　　　　　　　　Ａ Case of Cutaneous Mycoろacteriuni marinum Infection

　　　　　　　　　　　　　　　　Detected by DNA-DNA Hybridization

　　　　　　　　　　　　　Hajimu Oura", Masashi Ｎｏｍｏto1)，ＹＯＳｈｉｏｕrａｎ０２)，

　　　　　　　　　　　　　　　　Se示ＡｒａＳｅ２)and Chikara Ｍｕｒａｙａｍａ３)

　　　　　　　　　　　1)DiｖｉＳｉｏｎ of Dermatology, Kochi Municipal Central Hospital

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(Chief: Dr. M. Nomoto)

　　　　　　　　2)Ｄｅｐａrtｍｅｎt of Dermatology, Tokushima University School of Medicine

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(Director: Prof. S. Arase)

　　　　　　　　　　　　　　　　3)Ｍｕｒａｙａｍａ Clinic of Dermatology, Kochi

　　　　　　　　　(Received Ausust 29， 1994; accepted for publication December 2，1994)

　　We report ａ case of a 58-year-old man with ａ cutaneous Ｍｙｃｏｈａｃtｅｒiｕf

choid type). In an attempt to identify Ｍｙｃｏｈａｃtｅｒiｕｍspecies, we used DNA-DNA hybridization and

succeeded in identifying the causative agent. This new method has two advantages in the genetic

identification of this organism. l)It is possible to identify 18 kinds of Ｍｙｃｏｈａｃtｅｒｉｕni　ｓpeciesat ａ time

within 4 to 5 hours, 2) We can confirm the species optically by the biotin-streptavidin reaction.

　　For these reasons, the DNA-DNA hybridization method seems more useful than other conventional

means.

　　(Jpn J Dermatoに05: 741～745, 1995)

Key words:　cutaneous Ｍｙｃｏｈａｃtｅｒiｕ常川ａｎｎｕｍ　ｉnfection,DNA-DNA hybridization method