ms. romeu moreira dos santos - faculdade de ciências ... · testes de ligaÇÃo primÁria testes...

2015

Ms. Romeu Moreira dos Santos

2017

2Questions & feedback? Email me – [email protected]

More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com

LOGO

INTRODUÇÃO

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

• As respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar uma

doença:

• Inicialmente Acs específicos podem ser utilizados para detectar ou

identificar um Ag de interesse.

• Ou por meio de detecção de Acs específicos no soro, é possível determinar

se um animal foi previamente exposto a um agente infeccioso.

• A mensuração das interações Ag x Ac com o propósito de diagnóstico é

denominada sorologia.



LOGO

INTRODUÇÃO


• As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandes

categorias:

• Testes de ligação primária

• Mensura diretamente a ligação do Ag x Ac

• Testes de ligação secundária

• Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.



LOGO

REAGENTES UTILIZADOS EM TESES SOROLÓGICOS


• Soro

• Antiglobulinas

• Anticorpos monoclonais

• Anticorpos específicos



LOGO

TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA


• Teste que detectam diretamente o Ag ou Ac de interesse.

• Permitem o reconhecimento do Ag pelo Ac e os complexos imunes

formados são, então, mensurados.

• Para mensuração desta reação, um dos reagentes deve estar

quimicamente marcado



LOGO

TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA


• Radioimunoensaios

• Ensaios de imunofluorescência

• Ensaios imunoenzimáticos

• Dispositivos descartáveis para imunoensaios

• Citometria de fluxo



LOGO

HISTÓRICO


• Utilização de anticorpos em Ensaios Sorológicos - 1954: Teste de

Imunofluorescência (Weller & Coons); 1959: Radioimunoensaio

(Yallow & Berson).

• Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Avrameas &

Uriel; Nakane & Pierce, 1966).

• Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de anticorpos

monoclonais (Kohler & Milstein, 1975) - desenvolvimento de novos

testes (kits comerciais).

• Métodos colorimétricos, radioativos, fluorescentes,

quimioluminescentes, etc.



LOGO

RADIOIMUNOENSAIOS


• São ensaios que utilizam como marcadores radioisótopos

• (Trício H3, carbono 14 ou iodo 125)

• Possuem vantagem de serem altamente sensíveis

• Desvantagens: alto custo, manipulação do isótopo

• Aplicabilidade: quantificação de hormônios, drogas, marcadores tumorais,

alérgenos, anticorpos e antígenos microbianos.

• Radioimunoensaios para anticorpos

• Radioimunoensaios para antígenos



LOGO

RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTICORPOS


• Teste radioalergossorbente (RAST) – mensura IgE no soro de animais alérgicos.

Discos de celulose

+ antígeno

Soro teste

Lavagem

Discos de celulose

+ antígeno +

anticorpos

Sol.

Antiglobulina

marcada

Anti-IgE

Anti-IgE se liga

a IgE + Ag

Presença de

radioatividade



LOGO

RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS


• Imunoensaios de competição são baseados no princípio de que o Ag não

marcado irá deslocar o Ag radiomarcado dos imunocomplexos.

Ac específicos

Radioatividade no

sobrenadante

Precipitado

proteico

• Quantidade de reagente marcado (Ag ou

Ac) quantifica o Ag ou Ac não-marcado na

amostra - competição



LOGO

RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS




LOGO

ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)


Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a

uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV,

emite luz no espectro visível.

A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um

microscópio com luz UV (microscópio de fluorescência)

Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –

FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos:

direta, indireta ou sanduíche.



LOGO



Teste direto - pesquisa de antígenos (células ou tecidos)

Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos

Referência para sorodiagnóstico de várias doenças.

• Vírus, bactérias e protozoários



LOGO



Teste direto - pesquisa de antígenos

• Ex. – Raiva, Vírus da leucemia felina (FELV)



LOGO



Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos



LOGO



Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução;

determinação de classes e subclasses de anticorpos

Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescência

sob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação.

Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor

Fluoresceína 495 525 Verde

Rodamina 552 570 Vermelho

Vermelho Texas 596 620 Vermelho

Ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja



LOGO

ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS


Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (ELISA) Um dos mais importantes imunoensaios empregados na medicina veterinária

Utillizado para detectar e mensurar tanto Acs como Ags.



LOGO

ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS - ETAPAS


–Revista a superfície das cavidades de uma microplaca apropiada com Ags do agente

infeccioso que você está interessado em detectar Acs específicos.

–Adicione as amostras de soro de indivíduos a serem testados, se houver anticorpos

na amostra, eles vão se ligar aos Ags adsorvidos à superfície plástica

–Lave as cavidades da microplaca a fim de remover todos os anticorpos que não

forem específicos para o Ag em questão

–Adicione um outro tipo de Ac anti-Ig da espécie que você está pesquisando se as

amostras de soro têm ou não que deve ter sido previamente marcado com uma

enzima

–Adicione o substrato específico para a enzima e deixe a reação de degradação

enzimática prosseguir e conferir cor às cavidades da microplaca

–A intensidade da cor (DO) deve ser mensurada em leitor-fotômetro, sendo que as

leituras são proporcionais aos níveis dos Acs presentes nas amostras originais de

soro contra o Ag em questão.



LOGO



Método direto – Ags

Método indireto – Acs

Sandwich e Competitivo –Ags e Acs



LOGO

ELISA INDIRETO

Lavagens

Antígeno

Fonte de proteínas

estranhas ao sistema

LavagensLavagens

Soro anti

Conjugado anti

Lavagens




LOGO



•Sandwich-ELISA (S-ELISA) / Duplo Ac-ELISA

–As amostras são adicionadas às cavidades de uma microplaca previamente

revestidas com Acs de captura específicos para Ag que se deseja detector

–As cavidades da microplaca são lavadas p/ remover o excesso de substâncias

ou Ags que não se ligaram especificamente aos Acs de captura

–Uma preparação de Ac secundário conjugado com uma enzima apropriada é

adicionada

–O substrato enzimático é então adicionada e haverá, no caso de presença de Ag

na amostra uma mudança de cor, que pode ser mensurada em leitor-fotômetro

apropriado. A intensidade de DO é proporcional à quantidade de Ag presente na

amostra.



LOGOELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA

Lavagens

Antígeno

Fonte de proteínas

estranhas ao sistema

LavagensLavagensLavagens

Conjugadoanti

Soro anti




LOGOELISA




LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)

Transferência de proteínas separadas por eletroforese do gel de

poliacrilamida para membranas ELISA

Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura de proteínas +

especificidade de anticorpos usados como sondas para a detecção de Ags

Suportes: membrans de nitrocelulose (interações hidrofóbicas); nylon,

polyvinyldifluoide (PVDF) alta capacidade de ligação a proteínas

Quantificação de bandas por densitometria.




LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA

Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais.

Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolor

em produto colorido (deposição pode ser observada diretamente ao

microscópio óptico).

Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -Galactosidase

e Glicose Oxidase.

Método direto Acs primários conjugados (antígenos).

Método indireto Acs secundários conjugados (antígenos ou anticorpos).

Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento

inadequado dos conjugados.




LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA




LOGOImunocromatografia


• O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de

nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a

visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na

forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com

proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA).



LOGOCitometria de Fluxo


• Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz e

fluorescência sob feixe de laser

• Estudo de populações de leucócitos - luz dispersa - tamanho e forma da célula

• Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B

• FACS (fluorescence-activated cell sorter) - separação de uma única célula



LOGO

Obrigado!

REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE

[email protected]

mailto:[email protected]

ms. romeu moreira dos santos - faculdade de ciências ... · testes de ligaÇÃo primÁria testes...

Documents