molecular biology seminary

By Diana Grecco Herrera

& Daniel Gallego González Pontificial Bolivarian University

Faculty of Medicine

Molecular Biology

III Semester

2013 - I

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST30-SCCmec IVc clone as the major

cause of community-acquired invasive infections in Argentina

ORIGINAL ARTICLE

• S. Fernandez;

• L. de Vedia;

• M. Lopez;

• N. Gardella;

• S. Di Gregorio;

• M. Ganaha; et al.

Authors:

ORIGINAL ARTICLE

Short communication.

Article history:

• Received 5 October 2012.

• Received in revised form

18th December 2012.

• Accepted 19th December 2012.

• Available online January 20th.

• Published by Elsevier.

INTRODUCTION

STAPHYLOCOCCUS

• Genus of Gram-positive

bacteria.

• 32 species most of wich

are animal pathogens or

commensals.

• Aerobic and facultative

anaerobic.

• 1μm in diameter.

INTRODUCTION

STAPHYLOCOCCUS

• Catalase +, oxidase -,

nonmotile, nonsporing,

noncapsulated.

• Solid media: Grape-like

clustering.

• Liquid media: Short

chains.

• Smears taken from pus:

Singly, pairs, clusters,

short chains of 3 or 4 cells.

INTRODUCTION

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

• Is the most virulent of all the S.

• Coagulase-positive.

• Found mainly on the skin and

mocous membranes of animals.

• Normal microbial flora.

• Produce toxins and virulent

enzymes.

Cause: Foliculitis, osteomielitis,

necrotizing pneumonia, endocar-

ditis, meningitis and others.

INTRODUCTION

METHICILLIN

A B

A: β-Lactam Ring

B: Thiazolidine Ring

• Narrow-spectrum β - lactam

antibiotic used against

Gram-positive bacteria.

• Inhibits the synthesis of

bacterial cell walls.

• Semisynthetic derivate of

penicillin.

• Penicillinase resistance.

• It is no longer manufactured.

INTRODUCTION

METHICILLIN-RESISTANT

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

• Methicillin-resistant bacteria appeared at 1960’s in UK.

• Nowadays is a worldwide pandemic.

MECHANISM OF RESISTANCE IN MRSA:

mecA gene Encodes PBP2a Low affinity for β -

lactams RESISTANCE TO METHICILLIN

INTRODUCTION

METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS

AUREUS ST30-SCCmec IVc CLONE.

Staphylococcus: Genus.

Aureus: Species.

Methicillin-resistant: Strain.

ST30: Sequence type number 30.

SCC: Staphylococcal Cassette Chromosome.

mec: Gene mecA.

IV: Type of SCCmec.

c: Subtype of IV SCCmec.

Clone: Identical copy of a gene

GENERAL OBJECTIVE

To describe the clinical and molecular

epidemiology of current invasive infections

caused by CA-MRSA in adolescent and

adult patients in Argentina.

MATERIALES & MÉTODOS

DISEÑO DEL ESTUDIO:

• Estudio de tipo prospectivo, multicéntrico,

observacional.

• Diseñado para evaluar las características

clínicas y moleculares de las infecciones

invasivas por CA-MRSA.

• Argentina, marzo de 2010 - diciembre de

2011.

• 11 hospitales participantes, situados en

la región central del país.


SELECCIÓN DE PACIENTES:

CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Pacientes ≥ 14 años con infección masiva de MRSA

diagnosticada al ser admitido en el hospital o en 48 horas.

CRITERIOS DE EXCLUSIÓN

Si cumplían con alguno de los siguientes ítems

en los últimos 12 meses:

Hospitalización.

Diálisis.

Residencia en centro de atención durante

mucho tiempo.


RECOLECCIÓN DE DATOS: Historias clínicas

• Variables socio-económicas.

• Comorbilidades.

• Uso de antibiótico previo.

• Presentación clínica.

• Resultados principales de laboratorio al inicio del estudio.

• La fuente de aislamiento (Ej: sangre, líquido articular, pleura).

Los datos de seguimiento se pretendieron obtener 90 días

después de finalizar el tratamiento.


ESTUDIOS MICROBIOLÓGICOS:

• Identificación de S. aureus = procedimientos

de diagnóstico convencionales.

• Almacenamiento a -20°C.

• Llevados a un laboratorio de la U. de Buenos

Aires.

• Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos

= Métodos de difusión de acuerdo con las

directrices del Instituto de Normas Clínicas y

de Laboratorio. (CLSI, 2009).

MÉTODO

KIRBY-BAUER

Agar

Müller-Hinton


McFarland: 1. 4-5 colonias de 16-24 h de cto en

una placa de agar.

2. Se suspenden en caldo en o

suero fisiológico al 0,85%.

3. Se compara la turbidez de la

suspensión con el estándar 0,5 de

McFarland.

Usado en la preparación del inóculo

para la prueba de sensibilidad a

antimicrobianos o antibiogramas.

Inóculo suspendido VS.

Ácido sulfúrico 1% +

cloruro de bario 1,175%


AMPLIFICACIÓN POR PCR:

De una región de ADN que

corresponden a un gen o parte de él.

Las porciones molde de ADN

son flanqueadas por dos

oligonucleótidos que inician la

reacción de polimerización.

Con la DNA polimerasa, Mg como

cofactor, un buffer y dNTP.


MÉTODOS DE TIPIFICACIÓN:

Electroforesis en gel de

campo pulsado (PFGE).

Endonucleasas de restricción

de ADN infrecuentes. (SmaI)

Fragmentos de gran tamaño.

(>20kb).

Pulsos alternos de corriente

multidireccional.

RESULTADOS

Características

clínicas

RESULTADOS

SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA:

• Las pruebas de sensibilidad antibiótica

revelaron resistencia a la oxacilina (100%),

la eritromicina (9%), clindamicina (6%),

gentamicina (11%), y quinolonas (4%)

RESULTADOS

SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA:

• Todos los aislamientos de MRSA fueron

sensibles a vancomicina, teicoplanina,

linezolid, rifampicina, doxiciclina y trimetoprim /

sulfametoxazol.

Ninguna de las cepas fue multirresistente.

RESULTADOS

Caracterización

molecular de los

aislados de MRSA:

• MRSA fue aislado del

70% de los pacientes

y la clona ST30 fue

predominante en el

68%.

C1 C3

RESULTADOS

Caracterización molecular de los aislados de MRSA:

En los últimos 6 años la clona que predominó en Argentina fue: CAA clone: ST5-

SCCmec IV-spa t311. Fue reemplazada por la clona ST30- SCCmec IVc-spa t019.

DISCUSSION

AUTHORS PHRASE YES NO

Amorim et al.

(2007); Gardella

et al. (2005)

“Spread of some epidemic clones into

other regions has produced some

displacement of previously circulating

strains indicating that successful

lineages may have competitive

advantages which may be key in the

evolution of this pathogen”.

x

Klevens et al.

(2007)

“Skin and skin structure infections were

the most common primary source for

invasive CA-MRSA infection. This finding

is in agreement with both recent and old

studies”.

x

DISCUSSION

Ma et al. (2002);

Naimi et al.

(2003)

“Antimicrobial resistance patterns have

been used to distinguish between CA-

MRSA and HA-MRSA strains, with CA-

MRSA strains showing greater

susceptibility to several antimicrobial

agents (usually gentamicin,

clindamycin, and trimethoprim-

sulfamethoxazole) than HA-MRSA”.

x

Deresinski

(2009)

“Suggest the use of monotherapy with

vancomycin to treat serious MRSA

infections there are concerns regarding

a diminished efficacy of this agent”. x

AUTHORS PHRASE YES NO

PERSONAL CONCLUSIONS

The main factor which has allowed to the massive

proliferation of this bacterial strain is the antibiotics

indiscriminate use. This explains the resistance to

oxacillin, erythromycin, clindamycin, gentamicin and

quinolones, presented by this bacterial strain.

Knowing the clinical and molecular features of bacterial

infections is very important to the development of a

health plan and an appropriate treatment, because

these microorganisms are constantly mutating and

becoming resistant to different antibiotics.

PERSONAL CONCLUSIONS

The knowledge of the genetic variability involved in the

virulence and antibiotic resistance determined by PCR

and PFGE methods can provide molecular targets for

antibiotic treatment.

By means of this research it was possible to verify that

the new clones of CA-MRSA have a better capacity to

expand, because they possess more virulence factors

and are better able to survive on the skin of human

beings, which gives them an advantage over existing

clones.

REFERENCES

Fernandez S, de Vedia L, Lopez Furst MJ, Gardella N, Di Gregorio S,

Ganaha MC. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST30-SCCmec

IVc clone as the major cause of community-acquired invasive infections in

Argentina. Infect Genet Evol. 2013:14C:401-405.

Rogers K. Methicillin. Encyclopædia Britannica, Inc. 2013.

Chen L, Chopra T, Kaye K. Pathogens Resistant to Antibacterial Agents.

Med Clin N Am 95, 2011:647-676.

Chandra S. Textbook of Microbiology and Inmunology. Elsevier. 2009:181 –

182.

Forbes, Sahm, Weissfeld. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology.

Editorial Medica Panamericana. 12th edition. 2007:255p.

Jiménez J, Correa M. Staphylococcus aureus resistente a meticilina: bases

moleculares de la resistencia, epidemiología y tipificación. Iatreia. 2009:22

(2):147-158.

Dufour, Philippe. Jarraud, Sophie. Et al. High Genetic Variability of the agr

Locus inStaphylococcus Species. J Bacteriol. 2002 Feb;184(4):1180-6.

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