microbilles cytometrie

Mini-symposium sur les microbilles et cytométrie

Microbilles, nanobilles et cytométrie : applications à l’analyseet à la purification cellulaire et moléculaire

Microbeads, nanobeads and cytometry: applications to the analysisand purification of cells and biomolecules

G. Lizarda,*, L. Duvillard a, N. Wedemeyerb, C. Mullerc, F. Ghiringhellid, A. Cesbrone,P. Ponceletf, F. Galletg, E. Kahnh, P. Gamberta, W. Göhdei

a Laboratoire de biochimie médicale, CHU/hôpital du Bocage, Inserm U498, IFR 100, BP 77908, 21079 Dijon cedex, Franceb Praenadia GmbH, Hafenweg 46–48, 48155 Münster, Allemagne

c UFR de sciences pharmaceutiques, université Louis-Pasteur, UMR CNRS 7034, 74, route du Rhin, BP 24, 67401 Illkirch cedex, Franced Faculté de médecine, Inserm U517, IFR 100, 7, boulevard Jeanne-d’Arc, 21000 Dijon, France

e Laboratoire HLA, EFS Pays de la Loire, 34, boulevard Jean-Monnet, BP 91115, 44011 Nantes cedex 1, Francef BioCytex, 140, chemin de l’Armée-d’-Afrique, 13010 Marseille, France

g Université Paris VII, UMR CNRS 7057, FR 2438, case 7056, 2, place Jussieu, 75251 Paris cedex 05, Franceh CHU, Pitié-Salpétrière, Inserm U494, 91, boulevard de l’Hôpital, 75634 Paris cedex 13, France

i Institut für Strahlenbiologie, Westfälische Wilhelms-Universität Münster, Domagkstr. 11, 48149 Münster, Allemagne

Reçu le 14 mars 2003 ; accepté le 17 avril 2003

Résumé

Les nanobilles et les microbilles sont des outils importants en cytométrie. Les microbilles ont d’abord été utilisées pour optimiser lessignaux de diffraction et de fluorescence analysés par cytométrie en flux ainsi que pour évaluer la phagocytose. Couplées de façon covalenteà des anticorps, les nanobilles ont servi à révéler des antigènes cellulaires. Actuellement, des microbilles particulières permettent de quantifierde manière absolue des sites antigéniques. Par ailleurs, les nanobilles et les microbilles magnétiques constituent un outil important depurification cellulaire et moléculaire. Les méthodes analytiques faisant appel aux microbilles se sont étendues à la détection de protéines,d’acides nucléiques et d’ions. Pour cela, des microbilles de fluorescences différentes sont couplées à des anticorps, des oligonucléotides ou deschélatants. Les applications de ces méthodes multiplexées qui permettent l’identification et la quantification simultanée de plusieurs ions oumacromolécules concernent aussi l’identification d’activités enzymatiques et les analyses de polymorphisme. Avec les microbilles utiliséescomme support réactionnel, les domaines d’application de la cytométrie en flux vont ainsi de l’analyse cellulaire à l’analyse moléculaire. Lesmicrobilles sont aussi utilisées comme outil de calibration en microscopie confocale mais aussi pour la micromanipulation d’objetsbiologiques à l’échelle cellulaire ou moléculaire. Des innovations méthodologiques importantes associées aux nano et aux microbilles sontprévisibles en biologie, médecine, agro-alimentaire et environnement.

© 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Abstract

Nano and microspheres are important tools in cytometry. They have been used in first to optimize fluorescent signals detected by flowcytometry and to evaluate phagocytosis. Some antigens were also detected by using nanospheres covalently coupled to antibodies. Specificallydedicated microspheres are now widely used for antigenic quantitation by flow cytometry, and magnetic nano and micropheres are very usefullfor cellular and molecular purifications. To date, analytical methods based on the use of microspheres are developed to detect proteins, nucleicacids, and ions. To this end, antibodies, oligonucleotides, or chelating agents are bound to microspheres characterized by differentfluorescences. The applications of these multiplexed microspheres assays allow to identify and quantify simultaneously some macromoleculesand ions, but they also permit to analyze enzymatic activities and to perform polymorphism analyses. With microspheres used as reactive

* Auteur correspondant.Adresse e-mail : [email protected] (G. Lizard).

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www.elsevier.com/locate/patbio

© 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.doi:10.1016/S0369-8114(03)00127-5

support, molecular analyses are therefore possible by flow cytometry. Nano and microspheres are also usefull tools for calibration in confocalmicroscopy as well as for micromanipulations of biomolecules and of living cells. Inovative methods based on the use of nano andmicrospheres are expected in the fields of biology, medicine, food industry, and environmental sciences.

© 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Microbilles ; Nanobilles ; Quantification ; Tri ; Analyse multiplexée ; Cytométrie

Keywords: Microspheres; Nanospheres; Quantification; Purification; Multiplexed analysis; Cytometry

1. Introduction

Les progrès de la cytométrie, en particulier de la cytomé-trie en flux, sont difficilement concevables sans prendre encompte les technologies associées aux microbilles et auxnanobilles. En effet, ces dernières sont non seulement néces-saires pour s’assurer du bon fonctionnement des cytomètresen flux et des microscopes confocaux en permettant d’opti-miser la détection des signaux de diffraction et de fluores-cence [1] mais elles constituent aussi des outils indispensa-bles dans de nombreux domaines de la biologie pour laquantification antigènique [2], la purification cellulaire et lapurification moléculaire [3]. Grâce à l’élaboration de micro-billes fluorescentes couplées à des anticorps, à des protéinesou à des oligonucléotides, des méthodologies conduisant àquantifier simultanément par cytométrie en flux plusieursprotéines ou nucléotides émergent actuellement et laissentenvisager le développement de techniques d’analyses multi-plexées performantes (simples, rapides et sensibles) dans denombreux domaines : biologie (bactériologie, génétique, pa-rasitologie, virologie), médecine humaine (médecine infan-tile, médecine d’urgence, cancérologie, endocrinologie,transplantation, transfusion) et vétérinaire, agro-alimentaire(contrôle qualité), environnement (qualitéde l’eau et de l’air)[4–7].

2. Utilisation des microbilles pour l’optimisationdes signaux en cytométrie en flux et en microscopieconfocale

Afin d’obtenir par cytométrie en flux des résultats repro-ductibles et comparables, fondés sur la quantification defluorescence, la détermination de la taille et l’évaluation desstructures internes (définies sous le terme de granularitécellulaire), il est nécessaire d’optimiser régulièrement lefonctionnement des cytomètres en flux utilisés. Une despremières applications des microbilles a donc été l’optimisa-tion des signaux de fluorescence et de diffraction aux petitsangles et aux grands angles mesurés par l’ intermédiaire descytomètres en flux [8]. Pour cela, des microbilles fluorescen-tes de diamètres de l’ordre de 3 à 5 µm sont généralementutilisées (www.polysciences.com ; www.probes.com ; www.spherotech.com ; www.dukescientific.com). Elles permet-tent simplement et rapidement d’évaluer les capacités et lesperformances d’un cytomètre en flux à différents niveaux :système fluidique (écoulement laminaire), source d’excita-

tion lumineuse (stabilité), chemin optique (filtres, miroirs),photomultiplicateurs et système d’exploitation des données.Mélanger à l’échantillon à analyser, les microbilles peuventaussi servir de standard interne pour du dénombrement afinde déterminer une quantité de cellules par unité de volume[9].

En microscopie confocale, l’utilisation des billes permetaussi de bien caractériser chacun des éléments de la chaîned’acquisition (objectifs, filtres, miroirs, source d’excitation)tant en terme de fluorescence qu’en terme de résolutionspatiale. Les billes fluorescentes sont des outils qui modéli-sent les fluorochromes et permettent de vérifier leur détecta-bilitéet de conditionner les caractéristiques de leur détection(choix des longueurs d’onde d’excitation, des filtres d’émis-sion, de l’amplification et de la sensibilité des détecteurs,analyse de la vitesse de blanchiment, présence d’autofluores-cence, perte de spécificité, altérations de balayage, décalagesdans les chemins optiques). En microscopie confocale, lesmicrobilles permettent ainsi de vérifier que les appareils demesure sont optimisés et que les images conduisant à jugerde colocalisation et d’analyse 3D ou 4D sont pertinentes[10].

3. Microbilles, cytométrie en flux et quantificationantigénique

Les cytomètres en flux sont couramment utilisés pourétudier une population cellulaire hétérogène et pour y détec-ter des cellules particulières sur la base d’ informations qua-litatives (positivité d’un ou plusieurs marqueurs) ainsi quepour en établir le dénombrement. Mettre la métrie dansl’ immunocytométrie, c’est utiliser au mieux les performan-ces de mesure des intensités de fluorescence que les cytomè-tres peuvent effectuer sur chaque cellule prise indépendam-ment. C’est, au-delà du dénombrement des cellules, réaliserle dénombrement des molécules présentes sur ces cellules.Classiquement, ces mesures d’ intensité de fluorescence dé-terminées par cytométrie en flux sont établies de façon rela-tive (unités arbitraires de fluorescence) : telle sous-population est plus fortement marquée que telle autre issuedu même échantillon ou d’une même série. À l’ instar dudosage immunologique d’une molécule soluble (rendu parexemple en ng/ml), le résultat d’un dosage moléculaire surcellules devrait être exprimé en unités physiques tangibles(nombre de molécules par cellule). Pour arriver à ce moded’expression de résultats par cytométrie en flux, on a recours

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à des systèmes de calibrage qui relient, plus ou moins direc-tement, l’ intensité de fluorescence mesurée par l’ instrumentau nombre de molécules d’anticorps monoclonaux fixées surl’antigène cellulaire. Ces calibrants doivent fournir une sériede niveaux différents en intensité et correspondent aux stan-dards de type III A, B ou C selon la nomenclature suggéréepar A. Schwartz [11]. Les points-clefs de ces dosages d’anti-gènes cellulaires se situent au moins autant dans la maîtrisedes réactifs immunologiques que dans le calibrage de l’ ins-trument. Il est donc justifié de les classer par type de billes :billes de calibrage fluorescentes dans la masse ou en surface,billes de calibrage immunologiques (Schéma 1).

Les billes fluorescentes dans la masse fournissent des picsde fluorescence très fins, d’une excellente stabilité et d’uneproportionnalitéparfaite entre les divers niveaux d’ intensité,ces systèmes sont d’excellents outils pour le contrôle de lalinéarité en fluorescence d’un instrument ainsi que dans lecontrôle de sa stabilité dans le temps. Leurs limitations pourdes applications d’ immunodosages cellulaires sont toutefoisnombreuses : pas de cohérence spectrale avec les réactifs[12] ce qui signifie que le calibrage dépend des filtres opti-ques de chaque instrument, de la nature des fluorochromessensibles ou non à l’environnement (pH, fixateurs, etc.) maisaussi de paramètres immunologiques (taux de couplage F/P,valence de l’anticorps monoclonal utilisé). Une erreur fonda-mentale consisterait à utiliser directement en immunocyto-métrie quantitative les valeurs de calibration fournies, pourinformation seulement, en molécules d’équivalent fluoro-chrome (MEF).

Avec les billes fluorescentes en surface, le fluorochromegrefféen surface est (en théorie au moins) le même que celuides anticorps monoclonaux conjugués. Il présente la même

sensibilité au pH (important dans le cas de l’ isothiocyanatede fluorescéine (FITC)) et un spectre de fluorescence identi-que [11,12]. La réalitéest parfois décalée de la théorie. Ainsi,la phycoérythrine (PE), dont la brillance change selon lapureté et les lots de production, n’est pas toujours identiquesur les billes et les anticorps monoclonaux–PE et les tandemsPE–Cy5, déjà variables d’un conjugué àl’autre. Pour quan-tifier les molécules d’anticorps monoclonaux fixées sur descellules en immunofluorescence directe avec de tels cali-brants, il faut impérativement maîtriser le taux de couplage(rapport F/P) des réactifs [13]. Hormis le cas des conjuguésanticorps monoclonaux–PE garantis, vendus pour utilisationavec les billes QuantiBrite®, cette information est rarementdisponible et sa maîtrise délicate [13].

Pour ce qui est des calibrants immunologiques, ilscontiennent des billes non fluorescentes dotées d’une capa-cité de fixation des anticorps fluorescents (ABC pour Anti-body Binding Capacity ou Antibody Bound per Cell). Dansle système Quantum Simply Cellular® (Bang’s Laborato-ries, États-Unis), les billes fixent les anticorps monoclonauxconjugués par une anti-immunoglobuline. Ces calibrantssont adaptés à l’ immunofluorescence directe et sont étalon-nés en nombre de molécules d’anticorps monoclonaux fixéespar billes (ABC) à saturation complète. À ce titre, ils neréclament pas la maîtrise du F/P et garantissent l’utilisationdu même fluorochrome que celui porté par les anticorpsmonoclonaux. Ce concept à la fois simple et générique aattiré de nombreux utilisateurs. Cependant, sa fiabilité a étéremise en cause par des utilisateurs experts, du fait de 2 limi-tations techniques majeures [14,15] : d’une part, les concen-trations d’anticorps monoclonaux et les temps de contactavec les billes sont très supérieurs aux conditions pratiquées

Schéma 1 : différents types de billes de calibration.

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avec les cellules ; ce décalage aboutit à des surcoûts impor-tants et/ou àdes surévaluations artéfactuelles des ABC mesu-rés sur cellules ; d’autre part, les valeurs ABC mesurées avecle même anticorps monoclonal conjugué FITC, PE ou PE–Cy5 étant différentes, les calibrations ne peuvent être consi-dérées comme fiables. Par ailleurs, une technique de quanti-fication par immunofluorescence indirecte [15] est à la basede plusieurs générations de calibrants, progressivement amé-liorés dans leur utilisation pratique et leurs performances[16]. Ces derniers sont composés de billes chargées d’ IgG desouris qui miment les cellules marquées àdifférents niveauxpar un anticorps monoclonal. Ces calibrants ont été étalonnéspar comparaison à des techniques radio-immunologiques.Après le Qifikit®, outil de calibration pour les grosses cellu-les dans des techniques avec lavages, des calibrants adaptés àl’exploration des plaquettes par leur taille (3 µm), leurgamme de calibration (1000–100 000 ABC) et l’absence delavage, ont été proposés, soit sous forme de kits completsorientés vers des applications précises (gamme Platelet, Bio-Cytex), soit sous forme de kits de calibration ouverts à tousles anticorps monoclonaux de souris (Platelet Calibrator). LeCellquant Calibrator, optimisépour l’analyse des leucocytesen sang total, permet la calibration immunologique sur lafluorescence verte du FITC avec contre-marquages dans lesautres couleurs. Ces systèmes allient une série d’avantages :

• sensibilité : le marquage indirect apporte une amplifica-tion permettant la mesure de 500 molécules d’anticorpsmonoclonal par cellule ;

• aspect générique : un calibrage unique sert à l’ensemblede tous les anticorps monoclonaux d’une même série,aussi grand soit le panel d’anticorps monoclonaux ;

• contrôles de bruit de fond : alors qu’en immunofluores-cence directe les contrôles négatifs sont quasiment irréa-lisables du fait des F/P très disparates cette approched’ immunofluorescence indirecte permet de mesurer lemarquage non spécifique avec un contrôle isotypique[17]. La correction ainsi permise est particulièrementsignificative pour les cellules àfort bruit de fond (mono-cytes, macrophages, cellules myéloïdes, cellules dendri-tiques ou endothéliales, etc.) et les antigènes faiblementreprésentés (< 3000 ABC pour des plaquettes,< 10 000 ABC pour des lymphocytes) ;

• fiabilité : garantie par la reproductibilité lot à lot main-tenue sur de longues années [15] et, pour les approchesavec contre-marquage, par la priorité donnée à l’anti-corps monoclonal de mesure (évite les inhibitions stéri-ques apportées par les conjugués PE) et le choix du canalFITC (le moins perturbé par les fuites optiques et lesproblèmes de compensation de fluorescence).

Ainsi, l’utilisation des microbilles comme outils de cali-brage illustre la portée de la dimension « mesure » disponibledans l’ immunocytométrie, et permet d’envisager largement(grâce aux valeurs absolues fournies) l’accès à la biologieclinique. Au laboratoire, cette méthode de quantification an-tigénique par cytométrie en flux a été appliquée avec succèschez des patients diabétiques de type 2 pour évaluer les effets

de l’ insuline au niveau de l’expression des récepteurs deslipoprotéines de faible densité exprimés par les monocytescirculants [18].

4. Nanobilles et microbilles : applications au tricellulaire et moléculaire

Depuis longtemps, les phénomènes magnétiques ont étéutilisés pour isoler les substances magnétiques. L’applicationde ces techniques en biologie pour séparer des cellules ou desmolécules non magnétiques s’est développée ces dernièresannées grâce à l’apparition de nouvelles particules magnéti-ques. La séparation cellulaire par billes magnétiques a denombreux avantages par rapport aux autres techniques deséparation. En effet, cette technique permet d’ isoler des cel-lules provenant directement d’échantillons non traitéscomme le sang ou la moelle osseuse. Comparée aux autrestechniques de séparation cellulaire, cette technique est sim-ple et rapide. De plus, contrairement au tri par cytomètrie enflux, il n’y a pas d’ interférence avec les mouvements d’ ionset la sélection d’une population de cellules viables en grandequantité est effectuée très rapidement.

Actuellement, 2 méthodes de séparation magnétique fon-dées sur le phénotype cellulaire existent :

• la première consiste à séparer des cellules contenantassez de substances magnétiques pour être retenues parl’aimant ; cela n’est possible que pour 2 types cellulai-res : les érythrocytes, dont l’hémoglobine contient uneforte concentration d’une substance paramagnétique etles bactéries magnétotactiques contenant de petites par-ticules magnétiques [19] ;

• la deuxième consiste à marquer avec une particule ma-gnétique un ligand, la plupart du temps un anticorps,reconnaissant une structure cellulaire de surface.

Le principe du tri par billes magnétiques repose sur unmarquage de la sous-population à isoler (ou à éliminer) parun anticorps spécifique couplé àune bille magnétique. Aprèsmarquage avec cet anticorps spécifique, les cellules sontintroduites dans une colonne qui traverse le champ magnéti-que créépar un aimant. Les cellules, qui sont entourées debilles métalliques, sont retenues sur la colonne par cetaimant, alors que les cellules non marquées sont éluées etrécupérées dans un premier tube à essai. Les cellules mar-quées par les billes sont ensuite récupérées par gravité aprèsavoir retiré l’aimant dans le deuxième tube (Fig. 1). Il estainsi possible d’effectuer une sélection positive en marquantles cellules d’ intérêt, celles-ci étant alors retenues dans lacolonne. L’autre alternative consiste àeffectuer une sélectionnégative lorsqu’ il y a un risque de modification de la fonctioncellulaire par l’anticorps ou qu’ il n’existe pas de marqueur dece type cellulaire. On utilise alors une technique de déplétionen marquant toutes les cellules non désirées, celles-ci étantalors retenues dans la colonne.

Un exemple d’utilisation courante du tri cellulaire dans ledomaine médical est l’utilisation pour les greffes de moelleosseuse ou de précurseurs hématopoïétiques du sang péri-


phérique. Les techniques de sélections sont utilisées pour lesautogreffes de sauvetage chez les patients atteints de canceret bénéficiant d’une chimiothérapie intensive. La sélectionnégative sert alors à éliminer les cellules tumorales du gref-fon. Les techniques de sélection positive sont utilisées pourles allo- et les autogreffes et servent à la sélection des progé-niteurs hématopoïétiques exprimant la molécules de surfaceCD34 [20].

Les techniques de sélections négatives ont 3 objectifs :• éliminer toutes les cellules cibles non désirées de la

suspension cellulaire de départ ;• récupérer toutes les cellules non marquées dans un état

viable ;• éliminer toutes les microbilles de la suspension cellu-

laire.

Ces 3 objectifs nécessitent d’utiliser un excès de micro-billes et d’anticorps reconnaissant les cellules à éliminer puisl’exposition à un champ magnétique intense pour s’assurerqu’aucune cellule non désirée ou bille reste dans la suspen-sion cellulaire.

Quant aux techniques de sélections positives elles ontégalement 3 objectifs :

• récupérer toutes les cellules marquées ;• éliminer toutes les cellules non désirées ;• éliminer les microbilles des cellules sélectionnées.L’élimination des billes peut être obtenue par méthode

physique ou enzymatique. Les billes colloïdales sont sponta-nément biodégradables.

À ce jour, 2 méthodes de tri cellulaire monoparamètriqueexistent présentant chacune des avantages et des inconvé-nients (Schéma 2).

La première méthode de tri cellulaire par méthode immu-nomagnétique a été décrite au début des années 1980 parJohn Ugelstad et John Kemshead [21]. Elle utilise des parti-cules de polystyrène poreux de 1 à4 µm contenant de l’oxydede fer. Le polymère de surface protège les cellules de lapossible toxicité du fer. Ces particules sont des élémentssuperparamagnétiques, c’est-à-dire qu’ ils ne présentent despropriétés magnétiques que lorsqu’ ils sont soumis à unchamp magnétique.

Pour permettre un tri cellulaire efficace, ces billes doiventremplir des critères importants [22] : rester stables et ne pass’agréger dans le milieu de sélection ; rester magnétiquesaprès avoir été soumis au champ magnétique ; ne pas se lierde manière aspécifique aux cellules ; permettre une rapide etquasi-totale séparation des cellules ayant fixé les billes ; êtred’une taille qui limite au maximum la phagocytose. Cesbilles magnétisables sont bloquées par le champ magnétiqueet se dispersent librement sans agrégation quand le champ

Fig. 1. Schéma du tri cellulaire phénotypique monoparamètrique(www.miltenyibiotec.com).

Schéma 2 : avantages et inconvénients des microbilles et des nanobilles magnétiques utilisées pour le tri cellulaire.


magnétique est retiré. Cette interaction entre la bille et lacellule peut alors être responsable d’une dépression de lamembrane plasmique et ainsi de la formation de pseudopodes.

Le second procédéde tri cellulaire par microbilles magné-tiques a étédéveloppé àl’universitéde Cologne par Miltenyi[23] et est devenu la technique la plus utilisée. Cette techni-que est fondée sur l’utilisation de billes colloïdales consti-tuées de petites particules paramagnétiques (100 nm) et d’unpuissant champ magnétique. Cette technique permet l’ isola-tion de 108 cellules en 15 min. L’enrichissement est de plusde 100 fois et on obtient une déplétion d’un facteur 1000.

Ces billes sont 1 million de fois plus petites que lescellules eucaryotes et sont à peine visibles en microscopieélectronique. Leur faible taille limite le stress cellulaire. Cesbilles restent en suspension dans le milieu de culture et leurcomposition (oxyde de fer et polysaccharide) les rend rapi-dement biodégradables. La plupart du temps, les billes nemodifient pas la fonction ni la viabilité cellulaire, il n’y adonc pas besoin de les détacher des cellules récupérées parsélection positive. Ce système permet d’obtenir une puretécellulaire de plus de 95 % et de récupérer plus de 90 % descellules exprimant l’antigène.

Les 2 types de techniques utilisant soit des billes de grandetaille (microbilles), soit des billes de petite taille (nanobilles),ont étéutilisés avec succès, mais les nanobilles semblent êtred’un intérêt supérieur pour la sélection positive car elles nedéforment pas la surface des cellules et il n’est pas nécessairede les enlever de la surface des cellules triées pour pouvoirles utiliser. Les microbilles nécessitent d’être agitées en per-manence lors de l’ incubation avec les cellules pour éviterleur sédimentation ; au contraire les nanobilles diffusent ensuivant les mouvements browniens des fluides et se distri-buent dans la suspension cellulaire sans agitation. Les micro-billes ont l’avantage de ne pas nécessiter un champ magnéti-que intense et donc le matériel de séparation reste d’un faiblecoût contrairement au matériel de séparation pour les nano-billes. Le tri par billes magnétiques permet de purifier unesous-population cellulaire avec une bonne efficacité, et d’ob-tenir plusieurs centaines de millions de cellules en une di-zaine de minutes, ce qui est donc beaucoup plus rapide qu’untri par cytomètrie en flux. En revanche, un unique critère detri peut être pris en compte avec cette technique standard etseuls les marquages de surface sont utilisables.

Toutefois, une techniques de séparation multiparamètri-que a été développée depuis peu [24]. Cette dernière permetde sélectionner positivement des cellules en fonction de2 critères phénotypiques. Cette technique est utile lorsqu’unepartie des cellules que l’on veut éliminer expriment l’anti-gène utilisé pour la sélection positive. Cette technique estaussi utile lorsque l’on cherche àsélectionner une populationde cellules très rares. Cette technique de double sélectionpositive s’effectue en 2 étapes. Tout d’abord les cellulessubissent une première sélection positive permettant d’élimi-ner les cellules non désirées. Les billes magnétiques sontensuite détachées de la fraction positive. Et enfin la fraction

cellulaire désirée est récupérée par une deuxième sélectionpositive pour obtenir un pool cellulaire très pur.

Le tri magnétique a aussi abouti à la purification de cellu-les transfectées et à l’ isolement de cellules produisant descytokines (tri cellulaire fonctionnel). Pour sélectionner lescellules transfectées par tri magnétique, on utilise un plas-mide vecteur contenant une séquence codant pour une pro-téine membranaire (par exemple une molécule CD4 tron-quée). Il est alors nécessaire qu’ il y ait entre le gène d’ intérêtet le marqueur de sélection une séquence Ires (internal ribo-somal entry site) permettant alors l’expression des 2 gènes[25]. Dans le cadre du tri fonctionnel, des procédés permet-tant de séparer les cellules en fonction de leur sécrétion decytokines ont étédéveloppés. Ceux-ci permettent de récupé-rer des fractions enrichies en cellules sécrétant un type decytokine. Le tri par billes magnétiques présente alors unavantage essentiel par rapport au cytomètre en flux ; en effetcette technique permet de disposer de cellules viables utili-sables pour des tests fonctionnels.

Enfin, les billes magnétiques offrent aussi la possibilitédepurifier des macromolécules. Ainsi, il a été développé destechniques permettant de sélectionner par tri magnétique desprotéines notamment pour des immunoprécipitations ou desco-immunoprécipitations [26]. Pour cela, des microbillesmagnétiques conjuguées àune protéineA de 42kDa (protéinede la membrane des staphylocoques) ou une protéine G de33kDa (protéine de la membrane des streptocoques) sontutilisées. Ces protéines ont la propriétéde se lier au fragmentFc des IgG. Pour purifier une protéine dans le but d’effectuerune immunoprécipitation, les cellules sont lysées puis lesprotéines cellulaires sont incubées avec un anticorps spécifi-que de la protéine recherchée et avec les billes. La solutionest ensuite passée sur une colonne magnétique. La protéined’ intérêt est ensuite éluée de la colonne. Par ailleurs, desméthodologies sont aussi disponibles pour la purificationd’ARNm cellulaires ou tissulaires [27]. Le principe consisteà lyser les cellules. Ensuite l’ARNm est hybridé avec desbilles magnétiques porteuses d’une sonde constituée d’unoligo-dT qui a la propriétéde s’hybrider àla queue polyA desARNm. La solution est ensuite passée sur une colonne ma-gnétique et seuls les ARNm hybridés avec les billes magné-tiques restent fixés sur la colonne.

En raison des nombreuses méthodes de purification asso-ciées aux nanobilles et aux microbilles, ces dernières sontdevenues des outils importants et souvent incontournables enbiologie cellulaire et moléculaire.

5. Microbilles, cytométrie en flux et analysesmultiplexées

L’ identification des macromolécules d’ intérêt biologique(protéines, lipides, glucides et acides nucléiques) fondée surleurs propriétés physicochimiques fait appel àdes techniquesd’électrophorèse mono- ou bidimensionnelle, de chromato-graphie et de spectrométrie qui permettent une détection etune caractérisation simultanée de plusieurs constituants mais


qui en raison de leurs degrés de sophistication et des coûtsélevés de l’équipement requis ne sont accessibles que dansdes laboratoires extrêmement spécialisés. Grâce au dévelop-pement de technologies utilisant des anticorps monoclonauxet des oligonucléotides, certaines de ces macromolécules(protéines, acides nucléiques et éventuellement lipides) de-viennent facilement identifiables et quantifiables dans desliquides (biologiques ou autres) mais aussi dans des extraitscellulaires ou tissulaires. Ainsi, pour les analyses de protéi-nes (ou de lipides lorsque des anticorps sont disponibles), lestechniques Elisa sont largement utilisées. Pour la détectiond’acides nucléiques (présents même en faible quantité),l’amplification génique est devenue une méthode facile àmettre en œuvre. Toutefois, en Elisa, les capacités analyti-ques sont limitées à une protéine (ou un lipide) par échan-tillon, et avec les techniques d’amplification génique multi-plexées disponibles la détection simultanée de plusieursnucléotides par échantillon demeure difficile. En raison deces limites, des méthodes multiplexées prometteuses utili-sant la cytométrie en flux et des microbilles fluorescentes surlesquelles sont fixées de façon covalente des protéines (anti-corps, antigènes, substrats) ou des oligonucléotides se déve-loppent actuellement [4–7,28].

En cytométrie en flux, une application d’analyse multi-plexée assez aisée à mettre en œuvre concerne le dosaged’ interleukines développé par la société BD BiosciencesPharmingen (www.bdbiosciences.com). Avec ce système(Cytometric Bead Array : CBA), qui est utilisable sur descytomètres équipés d’une source d’excitation lumineuseémettant à488 nm, 6 interleukines sont simultanément iden-tifiées dans un faible volume d’échantillon (5–50 µl), enutilisant 6 types de microbilles de tailles homogènes qui sontdistinguées en fonction de leurs différences d’ intensités de

fluorescence rouges et qui portent chacune des anticorps decapture dirigés contre des interleukines différentes. Aprèsincubation avec l’échantillon, les interleukines présentes quise sont fixées à l’anticorps de capture sont détectées avec desanticorps de révélation couplés à de la phycoérythrine(Fig. 2). Grâce à des standards, les interleukines mises enévidence peuvent être quantifiées.

Cette possibilitéde détecter simultanément plusieurs mo-lécules a conduit à la mise au point de cytomètres en flux etde microbilles spécifiquement dédiés aux analyses multi-plexées (www.luminexcorp.com ; www.lincoresearch.com ;www.biosource.com ; www.bendermedsystems.com) quiprésentent un intérêt majeur dans de nombreux domaines dela biologie, en particulier en biologie de la transplantationdans le cadre de typage HLA et en endocrinologie. Actuelle-ment, le système Luminex fait office de référence dans ledomaine. Ce système est équipéde 2 lasers et permet d’ iden-tifier simultanément 100 billes ce qui rend une identificationet une quantification simultanée de 100 macromolécules.Parmi les 2 lasers, l’un émet à532 nm et l’autre à633 nm. Lepremier laser est destiné àexciter des fluorochromes émet-tant vers 575 nm (comme la phycoérythrine : PE), le second àidentifier les microbilles distinguées selon leurs fluorescen-ces rouges à 675 nm et au-delà de 712 nm. Ces microbillessont couplées soit à des antigènes, des anticorps ou desoligonucléotides ce qui permet la quantification respectived’anticorps, d’antigènes ou de nucléotides (Fig. 3). Les nu-cléotides sont alors analysés en faisant ou non appel à uneamplification génique [5,29,30].

Par ailleurs, l’évolution rapide des techniques d’analysesmultiplexées dans le domaine de la biologie moléculaire aabouti àdes méthodologies originales appliquées aux études depolymorphismes (OLA : Oligonucleotide Ligation Assay ;

Fig. 2. Analyse multiplexée d’ interleukines par cytométrie en flux. Exemple du système CBA (Cytometric Bead Array). Les microbilles homogènes en taille(Forward scatter : FSC) et en diffraction à90° (Side scatter : SSC) se distinguent en fonction de leurs fluorescences rouges (FL3). Dans le contrôle négatif, les6 populations de microbilles identifiées selon FL3 (au-delàde 670 nm), ne génèrent aucune fluorescence en FL2 (575 ± 10 nm). Dans l’essai, en fonction de laquantité d’ interleukines présentes, la fluorescence des microbilles en FL2 est plus ou moins importante.


SBCE : Single Base Chain Extension) (Figs. 4 et 5) [31,32] età la détection d’agents infectieux [33–35]. Actuellement, lesdivers avantages des méthodes multiplexées (faible volumed’échantillon, facilité et rapidité d’exécution, fiabilité) condui-sent aux développement de nombreuses applications. En biolo-gie clinique, les plus récentes concernent le dosage simultanéd’ ions sodium et potassium par l’ intermédiaire de microbilles enpolychlorure de vinyl couplées à des ionophores sélectifs [36].

6. Pinces optiques, microbilles et applications àla manipulation de cellules et de macromoléculesbiologiques

Les pinces optiques constituent un outil bien adapté pourla micromanipulation d’objets biologiques à l’échelle cellu-laire ou moléculaire [37,38]. Le principe consiste à utiliserles forts gradients de champ électrique au voisinage du point

Fig. 3. Illustration du principe Luminex permettant l’analyse simultanée de 100 macromolécules. Le système d’analyse Luminex utilise 2 sources d’excitationlaser (532 nm, 633 nm) et fait appel à des billes à la fois colorées par 2 fluorochromes rouges et couplées soit à des antigènes, des anticorps ou desoligonucléotides ce qui conduit à détecter respectivement des anticorps, des antigènes ou des nucléotides (résultant ou non d’amplification génique). PE,phycoérythrine ; SA, streptavidine.

Fig. 4. Principe d’analyse de polymorphisme ponctuel par la méthode OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) et l’utilisation de microbilles (Kellar KL etIannone MA Exp Hematol 2002, 30, 1227–1237). Dans cette méthode, le dernier nucléotide de la sonde de capture est alignéavec la base polymorphe. La sonde« reporter » n’est liée par la ligase que s’ il y a complémentarité totale entre la sonde de capture et la séquence d’ADN amplifiée contenant le polymorphismeponctuel. Par ailleurs, chaque microbille est associée àune séquence cZip spécifique et àune fluorescence unique ce qui confère d’une part une spécificité àlaréaction d’hybridation et d’autre part une spécificité àla détection. La séquence luciférase est utilisée afin de s’assurer au préalable que toutes les billes portentla même quantité de séquences cZip.


de convergence d’un faisceau laser pour piéger un petit objetdiélectrique, en général une bille micrométrique en silice ouen latex. Pour une bille de taille et de nature donnée, il estpossible de réaliser un étalonnage des forces appliquées. Uneou plusieurs billes, fixées à la membrane cellulaire ou auxextrémités d’une molécule biologique, servent de « poi-gnées » pour appliquer à l’objet étudiédes forces calibrées etdonc mesurer sa réponse mécanique àune contrainte contrô-lée. Les forces exercées sont de l’ordre de la centaine depiconewtons pour une puissance laser de quelques centainesde mégawatts. Ceci correspond aux échelles des forces d’ori-gine physiologique à l’échelle cellulaire ou subcellulaire.

Parmi les applications possibles à la biologie, les pincesoptiques sont utilisées pour réaliser des expériences quanti-tatives sur des molécules uniques : étude de l’élasticité despolymères biologiques ou mesure de la force exercée par unmoteur moléculaire se déplaçant le long d’un filament. Demême, à l’échelle cellulaire, les pinces optiques permettentde sonder les propriétés de la membrane et du cytosquelettesous-jacent, qui constitue l’architecture dynamique de lacellule. À l’aide des pinces optiques, on peut caractériser laréponse visco-élastique du cytosquelette à une contraintebien définie, en régime statique ou dynamique.

7. Conclusions et perspectives

Les possibilités offertes par la cytométrie en flux et par lesméthodologies associées aux microbilles et aux nanobillesont évoluéde manière parallèle et complémentaire. Ces tech-niques offrent aux biologistes de nombreux outils pour ré-pondre à des questions fondamentales non seulement enbiologie cellulaire mais aussi en biologie moléculaire. Laconsécration de ces méthodes rapides et fiables est associée

au développement d’une nouvelle génération de cytomètres.Ces derniers à l’ interface de plusieurs disciplines font appelaux progrès les plus récents de la physique des lasers, de lachimie des fluorochromes, de l’ immunologie, de la biologiemoléculaire et de l’ informatique. Ces appareils conçus pourfonctionner en utilisant des microbilles vont amener àconce-voir des analyses biologiques multiplexées qui aboutiront àdes innovations importantes dans divers domaines de la bio-logie médicale (transplantations, endocrinologie, médecined’urgence, médecine infantile, microbiologie, virologie, pa-rasitologie), de l’agro-alimentaire (contrôle qualité) et del’environnement (contrôle des eaux et de l’air associés auxrisques chimiques et biologiques).

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Fig. 5. Principe d’analyse de polymorphisme ponctuel par la méthode SBCE (Single Base Chain Extension Assay) et l’utilisation de microbilles (Kellar KL etIannone MA Exp Hematol 2002, 30, 1227–1237). Dans cette méthode, le dernier nucléotide de la sonde de capture est positionné juste avant le nucléotide dupolymorphisme ponctuel présent sur l’ADN amplifié. Dans ces conditions, le didésoxynucléotide fluorescent n’est liépar la ligase à la sonde de capture que s’ ilest complémentaire du nucléotide de la séquence d’ADN amplifiée correspondant au polymorphisme ponctuel. Chaque microbille est associée àune séquencecZip spécifique et àune fluorescence unique ce qui confère d’une part une spécificité àla réaction d’hybridation et d’autre part une spécificité àla détection. Laséquence luciférase est utilisée afin de s’assurer au préalable que toutes les billes portent la même quantité de séquences cZip.


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microbilles cytometrie

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