flow cytometrie bij lage cytoses in lumbaal vocht

Flow cytometrie bij lage cytoses in lumbaal vocht Veerle Compernolle Supervisor: Nancy Boeckx

Principe van Flow CytometrieFluorescence detectorsSide scatterForward scatterLaserStream of fluid containing antibody-labeled cells

Onderwerp van critical appraised topic= Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op cerebrospinaal vocht

Onderwerp van critical appraised topic= Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op vochten

Beperking:De verstrekkingen 555730-555741 en 555752-555763 mogen enkel worden aangerekend aan de ZIV voor het typeren van hematologische maligniteiten, of in geval van congenitale of levensbedreigende verworven immunodeficinties, of in geval van sarcodose. Identificatie van een receptor of een membraan- of cytoplasma- of nucleair antigeen van hematopoetische cellen, exclusief de antigenen van het HLA systeem

Onderwerp van critical appraised topic= Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op vochten

Voornamelijk: Opsporen metastasen van hematologische maligniteiten in cerebrospinaal vocht

Klinische gegevens bij aanvraag

totalen Geann-uitgev

282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

proc Geann-uitgev

282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

proc result

10-11

112

12>5-10

>10-151>10-15

>15-201>15-20

>20-5031

8102

IF positief

IF negatief

? Of niet betrouwbaar

Primairediagnose-resultaat

11153

011

022

IF positief

IF negatief


Resul-primdiag

1100

1512

312

Maligniteit

Geen maligniteit

Geen diagnose bekend

Grafiek6

111IF positiefIF positiefIF positief8

IF negatief1211310

12? Of niet betrouwbaar? Of niet betrouwbaar? Of niet betrouwbaar12

0-1

>1-5

>5-10

>10-15

>15-20

>20-50

>50

cord-discor

000-1

20>1-5

30>5-10

10>10-15

10>15-20

21>20-50

1324

2234

cordant

discordant

twijfel

lymfomen

5-10

2>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

3>20-50>20-50

55>50

Negatief

Positief

twijfel

leukemien

1-5

>5-10>5-10>5-10

>10-15>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

>20-50>20-50>20-50

13>50

Negatief

Positief

twijfel

totalen

Verwerking eigen data.

Stalen: geannuleerd versus uitgevoerdResultaten uitgevoerde stalenPrimaire diagnoseCordante en discordante data

cytose (/l)geannuleerd (N)uitgevoerd (N)cytose (/l)IF positiefIF negatief? Of niet betrouwbaarcytose (/l)IF positiefIF negatief? Of niet betrouwbaarCordantDiscordantTwijfel

0-12820-1112Maligniteit11153negatiefpositiefcytologie postiefIF positief

>1-5144>1-51124Geen maligniteit011167124Cyto neg en IF+?: 2X: reden: (licht) gestoorde kappa/lambda verhouding

>5-1033>5-10123Geen diagnose bekend022Cyto +?, IF negatief (grootcellig)

>10-1521>10-1511Cyto +? (atypische cellen), IF positief (monoclonaal, B-NHL)

>15-2021>15-2011

>20-5024>20-50314Cytosecordantdiscordanttwijfel

>50220>508102200-100

>1-520

>5-1030

totaal5335>10-1510

>15-2010

11186>20-50211 resultaat ontbreekt bij cordante!!!

>501324

Totaal2234

Onbetrouwbaar owv lage cytose?

Ofwel geen maligniteit ofwel geen diagnose gekend

lymfomen-leuk

Lymfomen

cytoseNegatiefPositieftwijfeltotaal

1-5123

>5-10213

>10-1522

>15-200

>20-5033

>505510

Leukemien


1-511

>5-100

>10-150

>15-200

>20-500

>50134

welkeaanvragen

39

21

8

8

4

9

Aantal

Blad3

LymfoomLeukemieAndere hematologische maligniteitNeurologischGeenAndere

uitgevoerd2262224


niet uitgevoerd17156625


totaal39218849

Belang opsporen hematologische metastasen in cerebrospinaal vochtPrognostischIntensificatie van de therapieIntrathecale chemotherapie & RadiotherapieNevenwerkingen: oa. -secundaire maligniteiten -verminderde cognitieve capaciteit -groeiretardatie...

Diagnostic testAbnormal finding% of patients with abnormal findingsLumbar punctureElevated CSF proteinElevated CSF pressureLow CSF glucosePositive CSF cytology on initial lumbar puncturePositive CSF cytology after three lumbar punctures75%50%40%50% 85%Neuro-imaging studiesAbnormal findings50%Laboratory and imaging findings in patients with leptomenigeal carcinomatosis (ref. Grossman et al. Cancer treatment reviews, 1999: 25:103-119)

Diagnostic testAbnormal finding% of patients with abnormal findingsLumbar punctureElevated CSF proteinElevated CSF pressureLow CSF glucosePositive CSF cytology on initial lumbar puncturePositive CSF cytology after three lumbar punctures75%50%40%50% 85%Neuro-imaging studiesAbnormal findings50%Laboratory and imaging findings in patients with leptomenigeal carcinomatosis (ref. Grossman et al. Cancer treatment reviews, 1999: 25:103-119)Gouden standaard

Gouden standaard: cytologieSensitiviteit: 50-70%Goede specificiteit1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?-het aantal vals negatieve resultaten verminderen? -Quid specificiteit?2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal

Overzicht van uitgevoerde en geannuleerde stalen(2002-2003) (cellen/l)


282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

Cytose

Aantal stalen

proc Geann-uitgev

282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

proc result

10-11

112

12>5-10

>10-151>10-15

>15-201>15-20

>20-5031

8102

IF positief

IF negatief



11153

011

022

IF positief

IF negatief


Resul-primdiag

1100

1512

312

Maligniteit

Geen maligniteit


Grafiek6


IF negatief1211310


0-1

>1-5

>5-10

>10-15

>15-20

>20-50

>50

cord-discor

0-10-10-1

2>1-5>1-5

3>5-10>5-10

1>10-15>10-15

1>15-20>15-20

21>20-50

1324

cordant

discordant

twijfel

lymfomen

5-10

2>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

3>20-50>20-50

55>50

Negatief

Positief

twijfel

leukemien

1-5

>5-10>5-10>5-10

>10-15>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

>20-50>20-50>20-50

13>50

Negatief

Positief

twijfel

totalen








>15-2021>15-2011


>50220>508102200-1

>1-52

>5-103

totaal5335>10-151

>15-201


>501324

Onbetrouwbaar owv lage cytose?22


lymfomenresultaatIF

5-10

2>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

3>20-50>20-50

55>50

Negatief

Positief

twijfel

Cytose

Percentage

lymfomen-leuk

Lymfomen


1-5123

>5-10213

>10-1522

>15-200

>20-5033

>505510

22

Leukemien

Immunofenotypering


1-511

>5-100

>10-150

>15-200

>20-500

>50134

Blad3

Vragen1.Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?-het aantal vals negatieve resultaten verminderen? -Quid specificiteit?2.Wat zijn de condities voor een geschikt staal3.Zijn deze annulaties terecht?Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?

1.Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?

Guidelines:Flow cytometrische immunofenotypering van cerebrospinaal vocht kan klinisch nuttig zijn bij patinten met een vermoeden van maligne lymfomen of leukemie

MoriartyValdezRomaSubiraFernandezFinnUrbanitsFrenchKlinische F.U.ReferentietestOnafh+blind?ReferentietestReferentieteststeeds uitgevoerd?Test onafh. van andere info uitgevoerdGeenNeeNeenvtnvt???2x niet2x nietJaJaCNS invasie ??JaJa?CNS invasie ?CytologieValidatie in 2onafh groep?JaValiditeitstudiesJaJa ?NeeJa

Patintenspectrum

RomaSubiraFernan- dezFinnUrbanitsFrenchAantal patintenAantal CSV-stalen-totaal-Valide cyto+IF-Concordante-Discordante-OnduidelijknegatiefpositiefCyto+/IF-Cyto-/IF+Cyto?/IF-Cyto-/IF?4331511832535140 78% 2812112916816815894%147119361135229128397%2691481 * + 1 *2 * + 1 *36251768%1165+ 13 3 3 31271970%14587 6 5 11 35231369%9432 1

Roma et al.Subira et al.Urbanits et al.PrevalentieAantal stalenSensitiviteitSpecificiteitCytoIFCytoIF0,4120,1020,48551167270,570,650,461,001,000,920,930,981,001,001,001,00Sensitiviteit/specificiteit werd berekend -met klinische follow-up als gouden standaard-met gebruik van aantal stalen

Resultaten 2002-200377%

Concordante en discordante resultaten in functie van de cytose(cellen/l)


282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

Cytose

Aantal stalen

proc Geann-uitgev

282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

proc result

10-11

112

12>5-10

>10-151>10-15

>15-201>15-20

>20-5031

8102

IF positief

IF negatief



11153

011

022

IF positief

IF negatief


Resul-primdiag

1100

1512

312

Maligniteit

Geen maligniteit


Grafiek6


IF negatief1211310


0-1

>1-5

>5-10

>10-15

>15-20

>20-50

>50

cord-discor

0-10-10-1

2>1-5>1-5

3>5-10>5-10

1>10-15>10-15

1>15-20>15-20

21>20-50

1324

concordant

discordant

twijfel

Cytose

Aantal stalen

lymfomen

5-10

2>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

3>20-50>20-50

55>50

Negatief

Positief

twijfel

leukemien

1-5

>5-10>5-10>5-10

>10-15>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

>20-50>20-50>20-50

13>50

Negatief

Positief

twijfel

totalen








>15-2021>15-2011

>20-5024>20-50314Cytoseconcordantdiscordanttwijfel

>50220>508102200-1

>1-52

>5-103

totaal5335>10-151

>15-201


>501324



lymfomenresultaatIF

5-10

2>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

3>20-50>20-50

55>50

Negatief

Positief

twijfel

Cytose

Percentage

leukemieresultIF.

1-5

>5-10>5-10>5-10

>10-15>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

>20-50>20-50>20-50

13>50

Negatief

Positief

twijfel

Cytose

Percentage

lymfomen-leuk

Lymfomen


1-5123

>5-10213

>10-1522

>15-200

>20-5033

>505510

22

Leukemien

Immunofenotypering


1-511

>5-100

>10-150

>15-200

>20-500

>50134

Blad3

BesluitEr is een grote concordantie tussen immunofenotypering en cytologisch onderzoekCombinatie van immunofenotypering en cytologisch onderzoek kan het aantal vals negatieve resultaten verminderen.De specificiteit van immunofenotypering dmv flow cytometrie is zeer goed 1.Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?

Houding t.o.v. discordante resultaten?Quid: Negatief (of twijfelachtig) resultaat bij cytologie en positieve immunofenotyperingHematologie: Beschouwen als positief resultaat. Aanpassen therapiePediatrische hemato-oncologie: geen aanpassing therapie.

2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal?

- Geen anticoagulans; geen fixatie OK- Onmiddelijk transport naar labo- Beschikbare klinische of diagnostische informatie moet samen met het staal opgestuurd worden- Bewaring op kamertemperatuurOK- Analyse binnen de : -3 uur (Subira)-8 uur (Australasian group)-24 uur (Finn)Stalen worden soms pas na 24 uur geanalyseerd!

2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal?-Lysis van erythrocyten door externe lyserende reagentia is aanvaardbaarGlobaal voor immunofenotypering: Idealiter: 500000-1000000 cellen per tube. Bij cytose van 50 cellen/l: 10 ml nodig !!! Ideale aantal cellen wordt dus zelden gehaald.

3.Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?Guidelines-There is a strong consensus among all conference participants that every attempt should be made to derive useful information from any specimen submitted for analysis. -Flagging criteria intrinsiek aan staal: hypocellulariteit(US-Canadian Consensus)

-Welke verwerpingscriteria worden gehanteerd in originele studies?

-Is het detecteren van zeer kleine aantallen blasten/lymfoomcellen zinvol?

3.Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?

Resultaat immunofenotyperingen bij lymfomen in functie van de cytose

(cellen/l)


282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

proc Geann-uitgev

282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

proc result

10-11

112

12>5-10

>10-151>10-15

>15-201>15-20

>20-5031

8102

IF positief

IF negatief



11153

011

022

IF positief

IF negatief


Resul-primdiag

1100

1512

312

Maligniteit

Geen maligniteit


Grafiek6


IF negatief1211310


0-1

>1-5

>5-10

>10-15

>15-20

>20-50

>50

cord-discor

0-10-10-1

2>1-5>1-5

3>5-10>5-10

1>10-15>10-15

1>15-20>15-20

21>20-50

1324

cordant

discordant

twijfel

lymfomen

5-10

2>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

3>20-50>20-50

55>50

Negatief

Positief

twijfel

leukemien

1-5

>5-10>5-10>5-10

>10-15>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

>20-50>20-50>20-50

13>50

Negatief

Positief

twijfel

totalen








>15-2021>15-2011


>50220>508102200-1

>1-52

>5-103

totaal5335>10-151

>15-201


>501324



lymfomenresultaatIF

5-10

2>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

3>20-50>20-50

55>50

Negatief

Positief

twijfel

Cytose

Percentage

lymfomen-leuk

Lymfomen


1-5123

>5-10213

>10-1522

>15-200

>20-5033

>505510

22

Leukemien

Immunofenotypering


1-511

>5-100

>10-150

>15-200

>20-500

>50134

Blad3

Resultaat immunofenotyperingen bij leukemie in functie van de cytose

(cellen/l)


282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

Cytose

Aantal stalen

proc Geann-uitgev

282

144

33

21

21

24

220

geannuleerd (N)

uitgevoerd (N)

proc result

10-11

112

12>5-10

>10-151>10-15

>15-201>15-20

>20-5031

8102

IF positief

IF negatief



11153

011

022

IF positief

IF negatief


Resul-primdiag

1100

1512

312

Maligniteit

Geen maligniteit


Grafiek6


IF negatief1211310


0-1

>1-5

>5-10

>10-15

>15-20

>20-50

>50

cord-discor

0-10-10-1

2>1-5>1-5

3>5-10>5-10

1>10-15>10-15

1>15-20>15-20

21>20-50

1324

cordant

discordant

twijfel

lymfomen

5-10

2>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

3>20-50>20-50

55>50

Negatief

Positief

twijfel

leukemien

1-5

>5-10>5-10>5-10

>10-15>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

>20-50>20-50>20-50

13>50

Negatief

Positief

twijfel

totalen








>15-2021>15-2011


>50220>508102200-1

>1-52

>5-103

totaal5335>10-151

>15-201


>501324



lymfomenresultaatIF

5-10

2>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

3>20-50>20-50

55>50

Negatief

Positief

twijfel

Cytose

Percentage

leukemieresultIF.

1-5

>5-10>5-10>5-10

>10-15>10-15>10-15

>15-20>15-20>15-20

>20-50>20-50>20-50

13>50

Negatief

Positief

twijfel

Cytose

Percentage

lymfomen-leuk

Lymfomen


1-5123

>5-10213

>10-1522

>15-200

>20-5033

>505510

22

Leukemien

Immunofenotypering


1-511

>5-100

>10-150

>15-200

>20-500

>50134

Blad3

Is het opsporen van kleine aberrante populaties zinvol ?LeukemieCNS leukemie wordt meestal gedefinierd als de aanwezigheid van leukemische blasten (na cytocentrifugatie) in cerebrospinale vochten met meer dan 5 leukocyten per microliter. Klinisch belang van blasten bij cytose

Gilchrist et al.: geen verhoogd risico voor CNS-relapse of andere relapse dan CNS-negative patinten. (ALL) Tubergen et al. : De disease free survival is na 5 jaar niet verschillend.Brger et al.: goede prognose en hebben geen intensificatie van CNS-gerichte therapie nodig. (ALL) Abott et al.: geen prognostisch belang. (AML)Mahmoud et al.: een verhoogd risico op relapse en hebben mogelijks een meer intensieve intrathecale therapie nodig. (ALL)

CAVE: Sommige studies (oa Brger et al. ,Abott et al.) patinten met blasten in cerebrospinaal vocht met normale cytose, een meer intensieve behandeling kregen dan patinten zonder blasten in het cerebrospinaal vocht.

Houding kliniek t.o.v. blasten bij lage cytose?Zowel op hematologie als op pediatrische hemato-oncologie wordt er weinig onderscheid gemaakt tussen:Blasten aanwezig in CSV met een cytose onder de 5/l ENBlasten in CSV met cytose boven de 5/l.

LymfomenBelang van detectie van zeer kleine populaties onduidelijk

BesluitOok bij een gering aantal cellen zullen soms maligniteiten kunnen gediagnosticeerd wordenBij minder dan 10000 cellen zullen sommige analyse resultaten niet meer betrouwbaar kunnen genterpreteerd wordenOp basis van klinische praktijk in UZ: onvoldoende argumenten om stalen onder een bepaalde cytose te annuleren.3.Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?

TO DOIndien een staal minder dan 10000 cellen bevat: enkel immunofenotypering uitvoeren indien diagnostisch fenotype van lymfoom/leukemie gekend is.Indien na analyse blijkt dat er minder dan 200 events hebben plaatsgevonden in de diagnostische populatie: te weinig events aanwezig voor betrouwbare analyse aan protocol toevoegenBij toekomstige stalen: nagaan met hoeveel events 10000 cellen overeenkomt

TO DONu: voor B-cell lymphoma:minstens 2 panels van antistoffen, nl: CD45/CD19/kappa lichte keten CD45/CD19/lambda lichte ketenInvestigeren of we kunnen overschakelen naar 1 panel, nl: CD19/kappa lichte keten/lambda lichte keten (drie-kleuren analyse) CD45/CD19/kappa lichte keten/lambda lichte keten (vier-kleuren analyse)

TO DOOp stalen die ouder zijn dan 24 uur: geen immunofenotypering meer uitvoeren.Stalen die voor 15u00 op het laboratorium toekomen nog dezelfde dag analyseren.

TO DOAanpassen op intranet:Aanpassen afname-instructies:Minimum 2 ml cerebrospinaal vocht opvangen in een steriel buis met schroefdop.Op vrijdag moet staal voor 12 uur op laboratorium toekomenAanpassen uitvoeringsfrequentie:Geen Immunofenotyp. Diagn & MRD in cerebrospinaalvocht tijdens het week-end.

flow cytometrie bij lage cytoses in lumbaal vocht

Documents

hematologische metastasen

hematologische maligniteiten

if negatief grootcellig10

critical appraised topic

diagnose gekendlymfomen

diagnose bekend022cyto

if positief monoclonaal

de verstrekkingen