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Les mycorhizes : agents de réhabilitation durable

des sols contaminés par les HAP?

JOURNEE « SANTE- ENVIRONNEMENT/SANTE » LILLE 30 NOVEMBRE 2010

IRENI

Axe 2 : Impacts Sanitaires

Action 3 : Écotoxicologie

Université du Littoral Côte d’Opale

CALAIS

Unité de Chimie Environnementale et Interactions sur le vivant (UCEIV)

Anissa Lounès-Hadj Sahraoui

Maître de Conférences-HDR

INTRODUCTION

Evolution du nombre de sites pollués recensés en France

Introduction

3047

35483782 3905

4031

4845

4000

5000

No

mbre

de

site

s p

oll

ués

www.basol.environnement.gouv.fr

107 200553 669

894

0

1000

2000

3000

No

mbre

de

site

s p

oll

ués

1985

1989

1992

1994

1996

2001

2002

2004

2006

2007

2008

Répartition des sites pollués en France

6%

8%

10%

12%

14%

16%

Introduction

0%

2%

4%

6%


Schéma conceptuel général d’exposition humaine à un sol pollué

Introduction

(Ineris, 2001)

Types de polluants rencontrés sur les sites pollués

Introduction


totaux

CH2

C H2

C

H2

naphtalène acénaphtène acénaphtylène fluorène

phénanthrène anthracène fluoranthène

� Polluants Organiques Persistants (POPs)

� formées d’au moins 2 cycles benzéniques

Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP)

Introduction

� Origine principalement anthropique

pyrène benzo(a)anthracène chrysène

benzo(a)pyrène benzo(b)fluoranthène benzo(k)fluoranthène

dibenzo(ah)anthracène indéno(1,2,3-cd)pyrène benzo(ghi)pérylène

benzéniques

� récalcitrants à la biodégradation

� Toxiques : mutagènes et/ou cancérigènes

ToxicitéHomme Environnement

Méthodes de dépollution des sols contaminés par les HAP

Biologiques

Physico-chimiques

Introduction

� Ecologiques

� Economiques

� Adaptées aux polluants organiques

� Bactéries

� Champignons

Agents de la bio-dépollution

Introduction

� Plantes

� Champignons

� Algues

� Bactéries

�Champignons


Introduction

� Plantes

�Champignons

� Algues

Avantages des champignons

� Propagation rapide et

en profondeur dans les sols

Introduction

� Enzymes à large spectre d’action

� Bactéries

� Champignons


Saprophytes

Introduction

� Plantes

� Champignons

� Algues

Mycorhiziens

Association symbiotique

Mycorhize

Rappel : Structure des champignons endomycorhiziens

Champignon extraracinaire

Champignon intraracinaire

Introduction


Phytoremédiation

�

Introduction

AccumulationVolatilisation� Ecologique

� Economique

Méthode utilisant la capacité naturelle des plantes à contenir, biodégrader ou minéraliser les polluants

DégradationStabilisation

� Economique

� Facile à mettre en œuvre

� Bonne acceptation

par l’opinion publique

Intérêt des mycorhizes à arbuscules

Su

bstan

cescarb

on

ées

Bénéfices pour le champignon Bénéfices pour la plante

• Meilleure nutrition

hydrique et minérale

• Meilleure résistance

Introduction

Su

bstan

cescarb

on

ées Eau

Min

érau

x

• Meilleure résistance

aux stress

biotiques abiotiques

Salinité

Sècheresse

Froid

Pollution

Espèces Réactives de l’Oxygène (ERO)

Introduction

Pathogènes

Choc thermique

SècheresseOzone

Pesticides

Sénescence

StressOxydant

Métauxlourds

Sénescence

Parent et al, 2008

Radical Superoxyde : O2-

Peroxyde d’ Hydrogène : H2O2Radical Hydroxyle : OH•

ERO

Introduction

Plante en absence de stress environnemental

ERO Antioxydants

Equilibre entre production et élimination d’ERO

Introduction

Plante en présence de stress environnemental

StressEnvironnemental

Surproduction d’ERO Déséquilibre entre production et élimination d’ERO

ERO

Antioxydants

Dommages oxydatifs des biomolécules

Introduction

Lipides

Acides Nucléiques

Protéines

Noyau

Vacuole

Systèmes enzymatiques et non enzymatiquesde détoxification des ERO chez les plantes

Peroxysome

PODPOD

SOD, POD, CAT,

AA, GSH

Cytosol

SOD, POD,

AA, GSH

Mitochondrie

Vacuole

Chloroplaste

Paroi

MembraneApoplaste

SOD, POD, AA,

GSH, Caroténoïdes

SOD, POD,

AA, GSH

PODPOD

SOD, POD,

AA, GSH

α-tocophérol

OBJECTIFS

Les mycorhizes à arbuscules : Agents de réhabilitation durable

des sols contaminés par les HAP?

1. Effet des HAP sur les deux partenaires la symbiose mycorhizienne ?

Objectifs

symbiose mycorhizienne ?

2. Rôle de la mycorhization dans la tolérance à la toxicité des HAP ?

3. Rôle des mycorhizes à arbuscules dans la dissipation des HAP ?

DEMARCHE EXPERIMENTALEDEMARCHE EXPERIMENTALE

Matériel biologique: Cultures in vitro

+ =

Matériel biologique

+

Intérêts :

=

� Obtention de matériel biologique dans des conditions contrôlées

� Sans limitation de quantité

� Pas d’organismes contaminants ou telluriques

Colonisées par un champignon mycorhizien

à arbuscules :

Glomus irregulare

Racines transformées par Agrobacterium rhizogenes

cultivées in vitro

Racine mycorhizée

HAPprioritaires

PM (g/mol)

Solubilitéµg/l

Toxicité

Bio

dég

rad

atio

n

+

Critères de choix des deux HAP testés

� Fréquemment rencontrés dans les sites et sols pollués� Figurant dans la liste des HAP prioritaires de l’EPA

Matériel chimique

- -

- - +Lourd

Léger

ANTHRACÈNE

BENZO[a]PYRÈNE

Bio

dég

rad

atio

n

_

Démarche expérimentaleRacines de chicorée colonisées ou non

Cultivées en absence (Témoin) et en présence

Démarche expérimentale

Anthracène Benzo[a]pyrène

0 – 35 – 70 – 140 – 280 µM n=5

AltérationsMorphologiques

Altérationscellulaires

DissipationDes HAP

Incubation : 9 semaines

Altérations morphologiques

Champignon extraracinaire

• Longueur hyphale

• Taux de sporulation

Effet des HAPs sur le développement de la racine et du champignon

Biomasseracinaire


• Taux de Mycorhization

Peroxydationlipidique

Dosage du

Adduits oxydatifs

à l’ADN

Dosage de la

Enzymes Antioxydante

Dosage de la

Altérations cellulaires


Dosage du malondialdéhyde

(MDA)

HPLC-UV ELISA

Dosage de la 8-Hydroxy-2’-

desoxy-guanosine(8-OHdG)

Dosage de la Superoxydedismutase

(SOD)

Spectrophotomètre

Evaluation du stress oxydant

HAP Résiduel dans le milieu

de culture

HAP accumulé dans les racines

Dissipation des HAP


Extraction

au SoxhletExtraction

HPLC HPLC

QUELQUES RESULTATS

Impact des HAP sur le développement fongique (CMA) et racinaire

Principaux résultats: altérations morphologiques

fongique (CMA) et racinaire

Effet des HAP sur la germination des spores du CMA


Control

Inhibition (25%) de la germination en présence d’anthracène

Mode de germination modifié en présence d’anthracène

Effet des HAP sur le développement du CMA


Colonisation hyphale Colonisation vésiculaire

Hyphes extraracinaires Formation des spores

Bilan: Impact des HAP sur le développement de G. irregulare


Capacité de G. irregulare à accomplir un cycle de développement complet in vitroen présence d’HAP A. Verdin et al., (2006) Mycorrhiza 16:397-405

RacineChampignon

Effet des HAP sue la croissance racinaire


Effet négatif moins prononcé sur la croissance des racines mycorhizées

Effet négatif des HAP sur la croissance racinaire

Altérations cellulaires induites par les HAP sur la symbiose mycorhizienne :

Principaux résultats: altérations cellulaires

symbiose mycorhizienne : G. irregulare/racines de chicorée

Induction du stress oxydant par les HAP

Peroxydation lipidique Altération de l’ADN Enzyme antioxydante


(En collaboration de l’UCEIV-Toxicologie, Pr P. Shirali)

Malondialdéhyde 8-Hydroxy-2’-desoxy-guanosine Superoxyde dismutase

D. Debiane et al., (2009) Phytochemistry 70 : 1421-1427

Augmentation en présence d’HAPAugmentation moins importante dans les RC Induction dans les RC

HAP

� Induction d’un stress oxydant

Bilan : Stress Oxydant


� Atténuation du stress oxydant par la mycorhization

Effet protecteur de la symbiose mycorhizienne contre la toxicité des HAP

Dissipation des HAP par la mycorhize à arbuscules

Principaux résultats: dissipation des HAP

par la mycorhize à arbusculesG. irregulare/racines de chicorée

Dissipation des HAP du milieu de cultureEx : l’anthracène


Dissipation de l’anthracène du milieu de culture

= 50% quantité initiale

60

µm25 µm25 µm

Accumulation de l’anthracène dans les globules lipidiques des racines et des structures fongiques

A

30 µm

30 µm


A 1 C 1B 1

A 2

60 µm

C 2

25 µm

B 2

25 µm

B

30 µm

C

30 µm

Coloration au Soudan III

Bilan : Dissipation de l’anthracène par les mycorhizes à arbuscules

10%24%

Racines non colonisées (RNC) Racines colonisées (RC)


54%36%

Residual anthracene Bioaccumulation Biodegradation

47%29%

Residual antharcene Bioaccumulation Biodegradation

Amélioration de la biodégradation de l’anthracène par la mycorhization en absence de la flore tellurique

A. Verdin et al., (2006) Mycorrhiza 16:397-405

Rappel : Dissipation des HAP par les mycorhizesin situ (Leyval et al., 1998, 2002)

Mycorhization


2

Dissipation des HAP + Dissipation des HAP + +

Mycorhization

CONCLUSIONS

HAP / Mycorhizes à Arbuscules / Dépollution

Hyp

hes

ex

trar

acin

aire

s

raci

nes

myc

orh

izat

ion

spo

rula

tio

n

Développement racinaire et fongique

Conclusions

Mycorhization

Outil potentiel de dépollution des sols contaminés par les HAP

Mécanismes impliqués?

MDA : protection des membranes

8-OHdG : protection de l’ADN

SOD : système antioxydant

1. Meilleure tolérance des racines à la toxicité des HAP

Mycorhization

2. Amélioration de la dissipation/biodégradation des HAP

PERSPECTIVES

Etude du prélèvement et du transfert des HAP du milieu de culture vers la partie aérienne

Perspectives

HAP dansle milieu

Racines colonisées ou non feuilles

Mesure des HAP contenus dans chacun des compartiments

Perspectives Appliquées

Perspectives

� Utilisation des plantes endomycorhizées « in situ » pour la dépollution des sols contaminés par les HAP

� Développement d’un test d’écotoxicité basé sur G. irregularecomme bioindicateur de toxicité des sols contaminés par les HAP

� Paramètres de mycorhization� Marqueurs biologiques de peroxydation lipidique

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