les granulocytes neutrophiles : morphologie, fonctions et ... · morphologie, fonctions et...
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To cite this version:
Dupont, Christophe . Les granulocytes neutrophiles : morphologie, fonctions et méthodes de quantification dans l’espèce bovine. Thèse d'exercice, Médecine vétérinaire, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse – ENVT, 2018, 78 p.
ANNEE 2018 THESE : 2018 – TOU 3 – 4061
LES GRANULOCYTES NEUTROPHILES :
MORPHOLOGIE, FONCTIONS ET METHODES DE
QUANTIFICATION DANS L’ESPECE BOVINE
_________________
THESE pour obtenir le grade de
DOCTEUR VETERINAIRE
DIPLOME D’ETAT
présentée et soutenue publiquement devant l’Université Paul-Sabatier de Toulouse
par
DUPONT Christophe
Né, le 27 décembre 1992 à RIO DE JANEIRO (Brésil)
___________
Directeur de thèse : M. Gilles FOUCRAS
___________
JURY
PRESIDENT : M. Gérard CAMPISTRON
ASSESSEURS : M. Gilles FOUCRAS
M. Renaud MAILLARD
Professeur à l’Université Paul-Sabatier de TOULOUSE Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire de TOULOUSE Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire de TOULOUSE
2
Mise à jour au 03/04/2018
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1
Remerciements
Amonprésidentdethèse,
MonsieurleProfesseurGérardCAMPISTRON
Professeurdesuniversités
Praticienhospitalier
Physiologie–Hématologie
Quim’afaitleplusgrandhonneurd’accepterlaprésidencedemonjury
dethèse,
Hommagesrespectueux.
Amonjurydethèse,
MonsieurleProfesseurGillesFOUCRAS,
Professeuràl’EcoleNationaleVétérinairedeToulouse
Pathologiedesruminants
Quim’afaitl’honneurdeproposerceprojetetm’asoutenutoutaulong
desonélaboration.
Veuillezaccepterl’expressiondemonentièrereconnaissanceet
remerciements.
AMonsieurleProfesseurRenaudMAILLARD
Professeuràl’EcoleNationaleVétérinairedeToulouse
Pathologiedesruminants
Pourm’avoirfaitl’honneurd’accepterdeparticiperàmonjurydethèse.
Sincèresremerciements.
2
TabledesmatièresRemerciements..................................................................................................................1
Tabledesmatières.............................................................................................................2
Listedesfigures..................................................................................................................4
Listedestableaux...............................................................................................................5
Introduction.......................................................................................................................6
1 Lesgranulocytesneutrophiles.....................................................................................81.1 Présentationgénérale.....................................................................................................8
1.1.1 Morphologie......................................................................................................................8 Al’échellecellulaire...............................................................................................................8 Contenusubcellulaire:granulesetvésicules........................................................................9
1.1.1.2.1 Lesgranulesprimaires.....................................................................................................101.1.1.2.2 Granulessansperoxydase...............................................................................................111.1.1.2.3 Lesvésiculessécrétoires.................................................................................................11
Hématopoïèseetdifférenciation.........................................................................................12 Contrôledeladifférenciationcellulaireenneutrophile......................................................14 Distributiondesneutrophilesentretissus...........................................................................17
1.1.2 Migrationlorsd’inflammationaigüe...............................................................................19 Recrutement........................................................................................................................19
1.1.2.1.1 Lescytokines...................................................................................................................201.1.2.1.2 Leschimiokines...............................................................................................................201.1.2.1.3 Lesmoléculesvaso-actives..............................................................................................21
Rollingetadhésion...............................................................................................................22 Diapédèse............................................................................................................................23 Productionetlibérationdecytokines..................................................................................24
1.2 Lesneutrophilescommeeffecteursdel’immunité........................................................251.2.1 Rôledansl’immunitéinnée.............................................................................................25
Phagocytoseetexplosionrespiratoire.................................................................................261.2.1.1.1 Internalisationdesagentspathogènes...........................................................................261.2.1.1.2 L’environnementoxydatifdesphagosomes...................................................................26
Labactéricidienonoxydative:lerôledesgranulesspécialisés..........................................30 Nétose..................................................................................................................................30 Recrutementcellulaire.........................................................................................................31
1.2.2 Immunitéadaptative:présentationd’antigènesparlesPNN........................................331.2.3 ApoptoseetsurviedesPNNlorsd’infection...................................................................331.2.4 Propriétésanti-tumorales...............................................................................................35
1.3 Spécificitésrelativesàl’espècebovine..........................................................................361.3.1 Lesmédiateursdel’inflammationchezl’espècebovine.................................................371.3.2 Lesmécanismesdedéfensepermisparlesneutrophileschezlesbovins......................39
1.4 Lesmarqueursdel’inflammationchezlesbovins..........................................................411.4.1 Leucogramme..................................................................................................................42
Valeursusuelles...................................................................................................................42 Variationsphysiologiques....................................................................................................42 Variationslorsd’étatsinflammatoires.................................................................................43
1.4.2 Lesprotéinesdelaphaseaigüe.......................................................................................45 L’Haptoglobine(Hp).............................................................................................................45 SAA.......................................................................................................................................46 a1-AGP................................................................................................................................47
3
1.4.3 Myélopéroxydase............................................................................................................47 Structureetlocalisation.......................................................................................................47 Rôlebiologique....................................................................................................................48 Techniquesdemesureetlienaveclaquantitédeneutrophiles.........................................52
2 Analysesystématiquedesmoléculesspécifiquesdesneutrophiles...........................542.1 Introduction..................................................................................................................542.2 Matérieletméthodes...................................................................................................552.3 Résultats.......................................................................................................................56
2.3.1 Méthodesdécritespourlesespècesmurineethumaine:.............................................56 AutomatisationaveccolorationGiemsa..............................................................................57 Lesprotéinesmembranairesdesurface..............................................................................57 Lesmoléculesintracellulaires..............................................................................................61
2.3.2 Chezlesbovins................................................................................................................642.4 Discussionetpossiblesapplications..............................................................................66
3 Conclusion................................................................................................................72
Références:.....................................................................................................................73
4
ListedesfiguresFigure1:Morphologied'unneutrophileenmicroscopieoptique2etmicroscopie
électroniqueàtransmission.............................................................................................9
Figure2:Hématopoïèsedescellulessanguines......................................................................13
Figure3:Etapesdelagranulopoïèseneutrophilique..............................................................14
Figure4:Mécanismesdeladifférenciationetdelalibérationdesneutrophilesauseindela
moelleépinière3..............................................................................................................16
Figure5:ActivationetassemblagedelaNADPHoxydase24..................................................28
Figure6:interactiondesneutrophilesaveclesmacrophages(d’aprèsKumar31).................32
Figure7Dynamiquedelaréponseleucocytaireauxinfectionsbactérienneschezles
bovins35,60........................................................................................................................44
Figure8:StructuredunoyauhémiquedelaMPOhumaine69................................................48
Figure9:ProduitsformésparactionoxydantedeHOCletréactionsd'HOClavecd'autres
espècesactivéesdel'oxygèneetdel'azote.67................................................................50
Figure10:Schémad'uncytomètredeflux75..........................................................................58
5
ListedestableauxTableau1:Moléculeseffectricesdanslagranulopoïèse……………………………………………………17
Tableau2:LigandsdeMac-1etleurseffetssurl'apoptosedesneutrophiles(d'aprèsKebiret
Filep34)………………………………………………………………………………………………………………………………35
Tableau3:Numérationetformulesanguinechezlebovinadulte58…………………………………42
Tableau 4 : Récapitulatif des Antigènes Neutrophiliques humains et leurs caractéristiques
d'aprèsFungetal.(2011)76………………………………………………………………………………………………59.
Tableau 5 : Caractéristiques et fonctions des sous-types de neutrophiles (d'après
ChristoffersonetPhillison105)………………………………………………………………………………………………67
6
Introduction
Du point de vue didactique, le système immunitaire est décomposé en deux systèmes
complémentaires:lecompartimentinnéetlecompartimentadaptatif.Cettesubdivisionest
loind’êtretranchéecommenouspourronslevoirultérieurement
Les cellules épithéliales au contact avec le milieu extérieur, les neutrophiles et les
macrophagesrésidentsdanslestissu,lescellulesNaturalKiller(NK)pourlapartiecellulaire
lesanticorpsainsiquelesystèmeducomplémentetdiversesprotéinessolublespourlapartie
moléculairesontclasséscommeacteursdel’immunitéinnée.Ils’agitdel’immunitélaplus
rudimentaire,présenteégalementdanslesorganismeslesplussimples,elledevientdeplus
enplusélaboréeaucoursdel’évolution.Ellepermetuneréponsenon-spécifiquedel’agent
agresseur, même si elle est particulière à chaque catégorie d’agents susceptibles de la
mobiliser,rapideetspontanée,c’est-à-direqu’iln’yapasd’apprentissagenécessaire.Elleest
principalementunhéritagegénétique,mêmesi lestravauxlesplusrécentsmontrequ’une
forme d’apprentissage et de mémoire existe aussi pour ce versant de l’immunité. La
coévolutionentrelesmicro-organismesetlesorganismessupérieursapermisdesélectionner
des récepteursetdesmécanismescapablesde reconnaître lesmicro-organismesetde les
différencierdusoiimmunologique,étapeindispensableàl’initiationd’uneréponse1.
L’immunitéinnéeestcaractériséeparuneréponserapidementmobilisableetquiestprésente
partoutdansl’organisme,ycomprisauxbarrières,constituantainsiunedéfensedepremière
ligne dont lesmodes d’action sont relativement invariables pour tout organismeétranger
détectéaucoursdelaviedel’organisme.
L’immunitéadaptative,aucontraire,reposesurunprincipedebrassagedegènespermettant
laformationaléatoirederécepteurs,lesquelssontamplifiéslorsqu’ilsreconnaissentl’agent
étranger.L’immunorécepteursélectionnépermetainsiunedéfenseadaptéeetspécifiquede
l’intrusdétecté.L’immunitéadaptativeprésentedoncdeseffecteursspécifiquesdecetagent
étranger à l’organisme, qui s’acquièrent et permettent son élimination. Ces mécanismes
acquissontconservéssousformedecellulesàmémoirelesquellessontconservéespendant
despériodesplusoumoinslonguesdelaviedel’individu,créantainsiunrépertoirepropreà
chaqueorganismeetfonctiondesexpériencesantigéniquesrencontrées.
7
Parmilesacteursdel’immunitécellulaire,lesneutrophilesjouentunrôlecentralcarproduits
entrèsgrandnombre,ilsontlacapacitédetueretdégraderdesagentsinfectieuxdanstous
les tissus. Ce rôle de soldat n’est cependant pas dépourvu de risques, car leur contenu
cellulairericheenmédiateursinflammatoiresetenzymesprovoquedeslésionscellulaireset
tissulairesparfoissévèreset irréversibles.C’estpourquoi leurétudeet laconnaissancedes
mécanismesdel’immunitéquilesmobilisentestessentielleàlacompréhensiondelaréponse
anti-infectieuseetdel’inflammationassociée.
8
1 Lesgranulocytesneutrophiles1.1 Présentationgénérale1.1.1 Morphologie
A l’échelle cellulaire
Lesgranulocytesneutrophilesappartiennentàlalignéegranulocytairequiestcaractériséepar
laprésencedenombreuxgranules au seinde leur cytoplasme,d’oùdécoule leurnom. Ils
possèdentenoutreunnoyauplurilobé,cequiaconduitàlesdésignerpendantlongtemps
commedespolynucléaires.Lescaractéristiquesdeleursgranulescytoplasmiquespermettent
delesdiviserentroisgroupes:lesgranulocytesneutrophiles,lesgranulocytesbasophileset
lesgranulocyteséosinophiles,carlesgranulesontdesaspectsdifférentsenfonctiondeleur
affinitépourlescolorantsutilisésencytologie.Onemploisouventlenomdeneutrophilespar
simplification,etc’estcettedénominationquenousutiliseronsdanslasuitedutexte.
Lesneutrophilessontdescellulesarrondiesde10à15µmdediamètre,dontlenoyau
matureprésentedeuxàcinqlobesavecunechromatinedense.Lesgranulocytesneutrophiles
constituent50à70%deslymphocytesdusangchezlaplupartdesespècesmonogastriques;
lesruminantsontuneproportiondeneutrophilescirculantsplusfaiblesavecseulement30-
40%decescellulesparmilesleucocytessanguins.Lamoitiéd’entreeuxsontmarginaux,c’est-
à-direqu’ilssontattachésàlaparoidesvaisseaux,particulièrementdanslesorganescomme
larate,lefoieetlespoumons.Leurduréedeviedanslesvaisseauxsanguinsestgénéralement
brève,d’environ24heuresdansdesconditionsphysiologiques.Ilssurviventenmoyenne3
joursaprèsdiapédèsedans les tissus.Ceciexplique le fort tauxde renouvellementdeces
cellulesavecuneproductionquotidienneestiméeà1011neutrophiles.
Les neutrophiles jouent un rôle central dans la défense de l’hôte vis-à-vis des agents
pathogènes,notammentbactérienetenconséquencedanslaréactioninflammatoire.
9
Figure1:Morphologied'unneutrophileenmicroscopieoptique
2etmicroscopieélectroniqueàtransmission.
Contenu subcellulaire : granules et vésicules
Les neutrophiles possèdent des granulations distinctes morphologiquement et
biochimiquement de celles des autres granulocytes. Leurs granules contiennent une large
panopliedeprotéinesantimicrobiennes,ainsiquedesprotéases,desmoléculesparticipantà
l’explosion respiratoire et un grand réservoir de protéines membranaires de liaison à
l’endothélium, à la matrice extracellulaire, aux bactéries, et des médiateurs solubles de
l’inflammation.L’acquisitiondesgranulesestséquentielleaucoursdeladifférenciationdes
neutrophiles,avectroistypesdegranules:
- Les granules primaires ou azurophiles (à cause de l’affinité pour l’azur de
méthylène)sontprésentsdèslestadepromyélocyteparfusionàpartirduGolgi
contenantdelamyélopéroxydaseengrandequantitédontlaproductions’arrête
àlatransitiondupromyélocyteverslemyélocyte.
- Les granules secondaires apparaissent au stade de myélocyte et de
métamyélocyte ; elles contiennent de grandes quantités de lactoferrine et de
faiblesquantitésdegélatinase.Ilssontégalementappelésgranulesspécifiques.
10
- Les granules tertiaires différent peu des précédents mais contiennent des
concentrationsplusélevéesdegélatinasemaisplusfaiblesdelactoferrine,formés
au stade de neutrophile immature (band cells), ainsi que dans les cellules
polylobées.
Acesgranules,s’ajoutentdesvésiculessécrétoiresforméesdanslesneutrophilessegmentés;
ils contiennent des protéines plasmatiques, ce qui indiquerait une formation par le
mécanismed’endocytosedecesvésicules.
Toutes ces composants cytoplasmiques ont une structure commune avec une bicouche
phospholipidiqueetunematricegranulairecontenantdesprotéinesdestinéesàl’exocytose
oubienàlafusionauphagosome.
1.1.1.2.1 Lesgranulesprimaires
Les granules primaires contiennent des hydrolases acides ainsi que des protéines
antimicrobiennes, ce qui les a faits considérer pendant plusieurs années comme des
lysosomes primaires. Cependant, ils n’expriment pas les protéines LAMP-1 et LAMP-2
caractéristiques des lysosomes, ce qui leur confère plutôt un rôle de granules à sécrétion
contrôlée.
Les granules azurophiles peuvent être subdivisés en deux groupes en fonction de leur
apparitionaustadepromyélocyte:lespremiersproduitssontpauvresendéfensinestandis
queceuxformésàlafindustadepromyélocytesontplusriches.Lesgranulesazurophilessont
peusensiblesauxstimuli;ilssontdoncpeusécrétésetjouentmajoritairementunrôledans
ladestructiondesmicro-organismesauseinduphagolysosome.Lamyélopéroxydase(MPO)
peutquantàelleêtredéverséeauseinduphagosome,maisaussidanslemilieuextracellulaire
provoquant ainsi une suite de réactions pouvant à terme altérer la membrane des
microorganismes et conduire à leur destruction. Les alpha-défensines constituent en
moyenne5%desprotéinescontenuesauseindesneutrophileshumainsetpossèdentune
activitéantimicrobienneenversunlargepaneldebactéries,champignons,virusenveloppés
ainsi qu’envers les protozoaires. Elles provoquent également un rôle de chimioattractants
enverslesmonocytesainsiquepourleslymphocytesTCD4+ouCD8+aprèsexocytose.On
retrouveégalementdanslesgranulesprimairesdesBPI(bactericidal/permeabilityincreasing
11
proteins)quiontuneactivitébactéricideenplusdepouvoirselierauxneutrophilesetaux
macrophagesafindedéclencherlaphagocytosedesbactériesGram-négativesreconnuesvia
leurLPS.
Enfin,sontégalementprésentes:i)desserprocidinescapablesdelyserdescomposantsdela
Matriceextracellulaire(MEC)etderéagiraveclescellulesdel’endothélium,del’épithélium,
lesplaquettes,ainsiqu’avecdeseffecteursdelaréponseinflammatoire;etii)l’azurocidine
qui peut exercer une action chimioattractive sur lesmonocytes, les lymphocytes T et les
fibroblastes,ainsiquestimulerlavasodilatationlorsdel’extravasationdesneutrophiles.
1.1.1.2.2 Granulessansperoxydase
Commeditplushaut,laproductiondeMPOs’arrêtelorsdeladifférenciationenmyélocyte,
cequipermetdoncderegrouperlesgranulessecondairesettertiaires,carleursynthèsese
faitdemanièrecontinueentrelesstadesmyélocyte,métamyélocyte,neutrophileimmature
puissegmenté.Cependant,lesprotéinescontenuesdanslesgranulesspécifiquesettertiaires
fontqu’ilsexercentdesfonctionsdifférentes.D’unepart,lesgranulesàgélatinasesemblent
opéreressentiellementlorsdel’extravasationdesneutrophilesetdeladiapédèse,avecdes
protéinesdedégradationde laMECainsiquedesrécepteursessentielsàcesétapesde la
réponse inflammatoire. D’autre part, les granules spécifiques ont un arsenal protéique
antimicrobienutilelorsdel’éliminationdesmicro-organismesaussibiendanslephagosome
quedans lemilieuextracellulaire.Onretrouvedesmoléculesà fortpouvoirantimicrobien
dans ces granules telles que la lactoferrine, le CAP-18 humain (hCAP18) appartenant au
groupe des cathélicidines, la lipocaline associée à la gélatinase neutrophilique (NGAL), le
lysozymeetlaprotéineNaturalresistant-associatedmacrophage1(Nramp-1),ainsiquedes
métalloprotéases.
1.1.1.2.3 Lesvésiculessécrétoires
Ces vésicules de localisation cytoplasmique contiennent essentiellement des récepteurs
membranairesnécessaireslorsdespremièresphasesdelaréactioninflammatoirerégiepar
les neutrophiles. La fusionde ces vésicules à lamembraneplasmique répond à différents
stimulietpermetnotammentl’expressiondesb2-intégrinesCD11b-CD18,etdediversautres
12
récepteurs. L’exocytose des vésicules sécrétoires est accompagnée de l’apparition des L-
sélectinessurlamembranedesneutrophiles.Cesdifférentschangementsvontpermettrela
liaison fermedes neutrophiles aux cellules endothéliales activées par divers signaux de la
réponseinflammatoireauseindutissu.
Cesdifférentsgranulescytoplasmiquesvontjouerunrôleimportantenfonctiondesstimuli
delaréponseinflammatoireaigüequiestrégieparlesneutrophilesendéversantleurcontenu
danslemilieuextérieuroubiendanslephagosome.
Hématopoïèse et différenciation
L’hématopoïèseestl’ensembledesmécanismesquiconcourentàlaproductiondeséléments
figurés du sang. Till et McCulloch ont mis en évidence en 1960, les cellules souches
hématopoïétiquesprésentesdanslamoelleosseuseàpartird’expériencesréaliséeschezdes
souris.Parlasuite,laculturedecescellulesapermisdedifférencierdifférentesunitésformant
colonies(CFU)àl’originedegrandstypesleucocytaires:
- CFU-Gàl’originedesgranulocytesneutrophiles
- CFU-Mpourlesmonocytes
- CFU-Eoquigénèrentleséosinophiles
- CFU-GEMMcapablesdeproduirelesprincipalescellulesmyéloïdes
Ces cultures ont également permis de mettre en évidence une dépendance vis-à-vis des
facteursdecroissance,nommésFacteursstimulantdescoloniesouCSF,quiconduisentàla
productiondeprécurseursouCFUvariésàpartird’unemêmecellulesouchehématopoïétique
(HSC).
13
Figure2:Hématopoïèsedescellulessanguines
L’hématopoïèsesedérouleauseindelamoelleosseusechezlenouveau-néetl’adulte,dans
lesoslongs,certainsosplatsetlesvertèbres,alorsquechezlefœtus,cetteproductionest
assuréed’abordparlesacvitellinpuisparlefoie.Ils’agitd’unedifférenciationàpartird’une
HSC très peu différenciée et capable d’auto renouvellement. La différenciation suit un
programmemorphogénétiqueprécisetdonne lieuàuneorganisationpyramidaleavecau
sommet la cellule souche hématopoïétique et à sa base les différents types cellulaires
différenciésformantleslignéesmyéloïdeetlymphoïde.
Lorsdelagranulopoïèse,unprogéniteurmultipotentsedifférencieraenprogéniteurmyéloïde
commun,lequelalacapacitédedonnerunprogéniteurmégacaryocyte-érythrocytaireouun
progéniteur granulocyte-macrophage. Ce dernier va poursuivre la différenciation via des
stadessuccessifsallantdumyéloblastejusqu’auneutrophilemature.Laproductiontotaledes
neutrophiles peut atteindre jusqu’à 2.1011 cellules par jour. Seul le neutrophile mature
présenteunnoyaucaractéristiqueplurilobé;àcestade,cesontalorsdescellulestotalement
différenciées, incapables de se diviser, et de subir des changements majeurs de leur
phénotypeunefoisqu’ellesontquittélamoelleosseuse.
14
Contrôle de la différenciation cellulaire en neutrophile Auseindelamoelleosseuse,s’établitunmicroenvironnementoptimalappeléniche,oùsont
présentslesdifférentssignauxquivontguiderladifférenciationdescellulessouchesversle
phénotype neutrophile. En effet les cellules stromales présentent des caractéristiques
d’adhérence, permettant le contact et le lien avec les cellules en maturation. Elles vont
produiredeschimiokinesdeguidageetdelocalisation,ainsiquedesfacteursdecroissanceet
descytokinesquipromeuventladifférenciationetlamultiplication.Ilexistedoncdifférentes
nichesresponsablesdeladifférenciationdedifférenteslignées,avecdessignauxspécifiques,
provenantdedifférentescellules(fibroblastesspécialisés,cellulesendothéliales,ostéoblastes
etadipocytes).LescelluleslesmoinsdifférenciéesdontlaHSCsontsituéesprèsdelaparoi
avecunfluxsanguinbasainsiqu’unepressionpartielleenO2faible,tandisquelescellulesles
plusdifférenciéessetrouventplusprèsdusinuscentraletdoncde lacirculationsanguine
qu’elles rejoindront à la fin du processus de différenciation. Ainsi dans chaque
microenvironnement est mis en place une signalisation par contact entre cellules
hématopoïétiquesetcellulesstromales.Outrecetterégulationintrinsèque,ladifférenciation
de ces cellules est également sous la dépendance de facteurs diffusibles sécrétés par les
cellulesstromalesoubienprovenantdusang.Cela introduitdoncuncontrôleàdistanceà
l’échellede l’organisme.Demanièregénérale, laproductiond’IL-1, IL-6etdeGM-CSF lors
d’uneréponseinflammatoirestimulel’hématopoïèse.
Laproductiondesneutrophilescorrespondàlamajeurepartdelaproductiondelamoelle
osseuse(environ30%).Ils’agitessentiellementd’unéquilibreentredessignauxconstantsau
sein de la niche à l’équilibre, et des signaux de différenciation et de libération dans la
circulationsystémiquelorsd’inflammation.LerécepteurCXCR4joueunrôlemajeurdansla
Figure3:Etapesdelagranulopoïèseneutrophilique
15
rémanencedescellulessouchesmaisaussidescellulesplusdifférenciéesauseindelamoelle.,
LachimiokineCXCL12,expriméàlamembranedescellulesstromales,selieàcerécepteur.Le
signalinduit,provoquelarétentiondescellulesdanslamoellevial’interactionVLA4/VCAM1.
L’expressiondeCXCR4,ainsiquecelledeVLA4àlamembranedesneutrophiles,diminueau
cours de leur maturation, permettant in fine la libération des cellules matures dans les
vaisseauxsinusoïdes.Parailleurs,lerelargagedesneutrophilesestréguléparlesligandsde
CXCR2, parmi lesquels on trouve CXCL1, CXCL2, CXCL5 et CXCL6. Les deux premiers sont
synthétisésparlescellulesendothélialesdelamoelleosseuse,tandisquelesCXCL12présent
danslesnicheshématopoïétiques,provientessentiellementdesostéoblastes3.
Le facteur G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) est un stimulant essentiel de la
productiondesgranulocytes.Iln’estcependantpasnécessaire,lorsd’inflammation4.Lesignal
est responsablede la libérationdesneutrophilesmaturesàpartirde lamoelle,enplusde
stimuler la prolifération des cellules souches de la lignée et d’accélérer la maturation
nécessaire avant le relargage. G-CSF aurait un effet inhibiteur sur la production de
CXCR4/CXCL12,enréduisantrespectivementl’expressionsurlescellulesmyéloïdes,ainsique
lasécrétionparlescellulesstromales.
Lamoelleosseuseétantégalementunlieud’épurationdesneutrophilesâgés,unchangement
duniveaud’expressiondesrécepteursmembranairesseproduit,àl’origined’uneplusgrande
sensibilitéauxsignaux,etfavorisantainsiunretouràlamoelle,ou«homing».
Parailleurs,laproductiondeneutrophilesestlargementréguléeparletauxd’apoptosedes
neutrophiles matures, ceux-ci étant phagocytés par des macrophages et des cellules
dendritiquesdanslestissus.Cephénomèneestconnusouslenomd’efferocytose.Ceciestà
l’origined’uneréductiondelaproductionparlescellulesphagocytairesd’IL-23,interleukine
quistimulelaproductiond’IL-17A,elle-mêmeàl’origined’unestimulationdelaproduction
deG-CSF.Ainsi,uneaugmentationde laquantitédeneutrophilesdans lestissusengendre
une diminution de la production de G-CSF. Ainsi CXCR-4 joue un rôle primordial dans la
rétentiondesneutrophilesauseindelamoelle,créantainsiuneréservedisponiblelorsqu’un
signalpourlalibérationdanslacirculationsanguineestdétecté.CXCL-12présentàlasurface
descellulesstromalesdelamoelleosseuse(ancienSDF-1)estinhibéparG-CSF,alorsquece
facteurdecroissancestimulel’expressiondeKC/CXCL8etGrob/CXCL2,quisontdesligandsde
16
CXCR-2, inversant ainsi la balance de signalisation et favorisant ainsi la libération des
neutrophilesdanslacirculationsystémique.
Plusieursmoléculesparticipentàlarégulationdel’hématopoïèse,avecencoredenombreux
paramètresinconnus.Différentesétudesontainsipudémontrerlerôledecertainescytokines
dans le maintien des HCS au sein de la moelle ou bien la libération dans la circulation
périphérique.
Figure4:Mécanismesdeladifférenciationetdelalibérationdesneutrophilesauseindelamoelleépinière
3
CXCL1 (growth-regulated protein Į [GROĮ]), CXCL2 (macrophage inflammatory protein-2Į [MIP-2Į]), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 [ENA78]), and CXCL6 (granulocyte chemotactic protein-2 [GCP-2]) (1,23). CXCL1 and CXCL2 are constitutively expressed on endothelial cells of the BM (21,23), whereas osteoblasts are the major source of CXCL12 in this tissue (24,25). Reciprocal interactions between CXCR2/CXCR2-ligands and CXCR4/CXCL12 signaling are considered to play a major role in the trafficking of neutrophils from the BM to the systemic circulation (21,23).
Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is not only a primary regulator of granulopoiesis but also a disruptor of neutrophil retention (14). Under physiologic conditions, G-CSF induces the proliferation and differentiation of CD34+ granulocytic progenitors and reduces the transmit time through each differentiation stage (17). It also enhances the egress of mature neutrophils from the BM (15,17,26). The effect of G-CSF on the
300https://doi.org/10.4110/in.2017.17.5.298
Neutrophil Heterogeneity
https://immunenetwork.org
Stromal cells
Endothelial cells
Aged neutrophils
Sinusoidalblood vessls
Aged neutrophils are destroyedby BM macrophages
induce egressby inhibition of CXCR4/CXCL12
induce proliferation of CD34+ granulocytic progenitor cells
BM macrophage
G-CSF
CXCR1CXCR2
CXCR2
CXCR1
CXCR4VLA-4
CXCR2CXCR1
CXCR4
CXCR4
VLA4
VLA-4
VCAM
-1CX
CL12
Immature neutrophils
Mature, naive neutrophils
Dendritic cell
Osteoclast
Osteoblast
LT-HSC ST-HSC MPP LMPP GMP Myeloblast Pro-myelocyte
Myelocyte Meta-myelocyte
Band cell MatureNeutrophil
Mitotic pool Post mitotic poolStem cell pool
Bone marrow
Systemiccirculation
CXCR1 -CXCR2CXCR4CD62L
CXCL1CXCL2CXCL5CXCL6
Homing back
Retention
Egress
Figure 1. Trafficking of neutrophils in the BM. The granulopoietic compartments of neutrophils are divided into 3 different pools. Neutrophils express and shed various receptors according to their different developmental stages. CXCR2 is upregulated whereas CXCR4 and VLA-4 are downregulated. CXCR1 is constitutively expressed during neutrophil maturation. Retention of neutrophils is mediated by CXCR4/CXCL12 and VLA-4/VCAM-1 pathways. Immature neutrophils adhere to the marrow endothelial cells and stromal cells via the CXCR4/CXCL12 and VLA-4/VCAM-1 axes. The CXCR2/CXCL2-ligands induces neutrophil egress from the BM. Mature CXCR2hi CXCR4low neutrophils preferentially egress from the BM depending on CXCR2-ligands. G-CSF orchestrate s the trafficking of neutrophils in the BM. G-CSF induces the proliferation of granulocytic progenitors and enhances the egress of neutrophils by inhibiting CXCR4/CXCL12. DCs regulate G-CSF production in the BM. Aged neutrophils are cleared by the BM. Senescent neutrophils show decreased expressions of CXCR2 and CD62L with increased expressions of CXCR4 and CCR5. This surface marker profile of aged neutrophils ensures homing back to the BM where BM macrophages destroy the aged neutrophils.
17
Tableau1:Moléculeseffectricesdanslagranulopoïèse
Molécule Fonction
Angiopoïétine1,Tie2etN-cadhérine MaintienHSCquiescentedanslaniche,lienavec
contrôlecyclecellulaire
G-CSF RégulationdeSDF-1(CXCL-12)
SDF-1(CXCL-12) Expriméedanslescellulesstromales,attireHSC
CXCR-4 ExprimédansHSC,récepteurdeSDF-1
VLA-4,LFA-1,Opn,Intégrines,autrescellules
d’adhésiondesurface
Leuractivationestnécessairepourlamobilisation
deHSC
MMP-9,MMP-2etsKitL InduitesparG-CSFetSDF-1pourlamobilisationde
HSC
FGF-4 Formengradiententrelescellulesstromalesetle
réseauvasculairepourrecruterHSC
VEGF4,PLGF,,autresfacteursdecroissance MobilisationetrecrutementdeHSC
5D’aprèsZ.Li(2006)
D’aprèsFrenetteetal6lesystèmenerveuxsympathiqueparticipeàlamobilisationdesHSC
danslaniche.Cesmécanismesrestentcependantmalconnus6.Demême,ilaétémontréchez
des souris axéniques, qui ne possèdent pas de flore microbienne commensale, qu’une
neutropéniemarquéeétaitprésente.Celasignifiequelescellulesprogénitricesrépondentà
des stimuli spécifiques provenant directement de la flore ou du tube digestif lorsqu’il est
normalementcoloniséparlafloremicrobienne7.
L’équilibre entre renouvellement et différenciation des HSC est donc finement régulé par
différents mécanismes intrinsèques et extrinsèques au microenvironnement, avec une
participationcentraledescellulesstromalesdelamoelleosseuse.
Distribution des neutrophiles entre tissus
Al’étatphysiologique,lesneutrophilesmaturessontprésentsdanslacirculationsanguineou
biendanslestissus.Ilssontnormalementtransportésparlefluxsanguin.Ilsconstituententre
18
60et70%des leucocytescirculantschez lescarnivoresetenviron20-30%chez lesbovins.
Cependant,seuls1à2%dupooltotalsetrouventeffectivementdans lacirculationet les
vaisseauxsanguins,lavastemajoritéétantaucontactdel’endothéliumdescapillairesausein
delarate,dufoie,despoumonsetdanslamoelleosseuse.Desétudesontmontréqueles
neutrophiles résident plus longtemps au sein du parenchyme pulmonaire sans que les
mécanismesquiyprésidentsoientexactementdéterminés:ilsembleraitqueletempsaccru
ne soitpasuniquement imputableau faitque lespoumons reçoivent l’intégralitédu sang
éjectéparlecœur.Desdonnéessuggèrentquelesneutrophilespassentplusdetempsentant
que«sentinelles»danslesvaisseauxpulmonairesparrapportauxautresorganes,sansque
celasoitvraimentexplicité8.
La réserve de neutrophiles permet, dans le cas d’une infection par un ou plusieurs
microorganismes, demobiliser une grande quantité de neutrophiles, avec un nombre de
neutrophilescirculantsquipeutêtremultipliépar10.
Malgré l’idée communément admise que les neutrophiles constituent une population
homogène dans la circulation sanguine, plusieurs études ont montré qu’il existe des
différencesnonnégligeablesauseindecettepopulation.Ceciestretrouvédanslesconditions
physiologiques avec des changements dus à l’âge, ainsi que dans diverses conditions
pathologiques, avec une libération accrue de neutrophiles immatures. On retrouve ces
différencesauniveaufonctionnelainsiqu’auplanphénotypique9.Ceschangementsseront
détaillés par la suite. La quantité de neutrophiles circulants est un équilibre entre les
neutrophileslibérésparlamoelleépinièreetlaséquestrationdesneutrophilesâgésdansles
tissuspériphériques,oùilsvontêtreéliminés.Dansl’espècehumaine, lesneutrophilesont
uneespérancedeviemoyennede6à8heures 10.Cesontdescellulescapablesde fortes
pressions,enadaptantleurmorphologieetenmodulantleurinteractionavecl’endothélium,
afin de couvrir une large distribution au sein de l’organisme. Les neutrophiles sont
susceptiblesdemigrerlorsd’inflammation,àlasuited’uneinfectionoud’untraumatissulaire,
afind’yexercer leur rôle. Le caséchéant, ils vont subirdes changementsmorphologiques
traduisantlevieillissementcellulaire,ainsiqu’unepertedeleursfonctionscellulaires.
19
1.1.2 Migrationlorsd’inflammationaigüe
Dans sa forme classique, l’inflammation aigüe peut être décrite par cinq signes locaux
majeurs : chaleur, rougeur, douleur, tuméfaction et altération des fonctions. Ces singes
cliniquessontlaconséquencedelavasodilatationdespetitsvaisseauxpériphériquescausant
unebaissedudébitquilestraverse.Outrecommeconséquenced’uneinfection(bactérienne
notamment),celle-cipeutêtreégalementapparaîtreà la faceendothélialeà lasuitede la
mortdecellulesoudelésionstissulairesstériles. Ilestdifficiledesavoirsi lesneutrophiles
sontcapablesdedifférencieruneinflammationstériled’uncontexteinfectieux.Cependant,
dans les conditions décrites, les neutrophiles sont ralentis et ils peuvent s’arrêter à
l’emplacementoùlareconnaissancedesignauxinflammatoiresalieu,etmigrerensuitedans
lestissusaffectésouausiègedel’infection1,11.
Recrutement Lesmacrophagesetlesmastocytessontmajoritairementprésentsauseindestissusetontun
rôle de sentinelles. Ces cellules initient le recrutement des neutrophiles, ainsi que divers
processus tels que l’augmentation de la perméabilité vasculaire et la production de
chimiokines.Ceciestprovoquéparlareconnaissancedemotifsmoléculairesassociéssoità
aux micro-organismes (MAMPs pour Microbial Associated Molecular Patterns) soit à des
moléculesintracellulaires(DAMPspourDamageAssociatedMolecularPatterns,appelésaussi
alarmines). Ces motifs moléculaires particuliers sont reconnus par des récepteurs
membranaires ou intracellulaires dits PRR (pour Pathogen-Related Receptors) qui sont
exprimés dans ou sur les cellules sentinelles (macrophages, cellules dendritiques et
mastocytes)auseindes tissus.Cette interactionprovoque la libérationdecytokinesetde
chimiokines,quivontdéclencherdesmodificationsdel’expressiondemoléculesàlasurface
desendotheliaquisontalorsactivés.EnquelquesminutesilvayavoirexpositiondesP-etE-
sélectines,quiétaientauparavantprésentesdansdesvésiculescytoplasmiques;leursynthèse
estégalementstimuléeauseindescellulesdel’endothélium.Troiscytokinesmajeuressont
également synthétisées : le facteur de nécrose TNF-a (TumorNecrosis Factor alpha) , les
interleukine IL-1 et IL-6. Récemment, un rôle aussi été attribué aux plaquettes qui
interviendraientdansl’extravasiondesneutrophiles8,12.
20
1.1.2.1.1 LescytokinesTNF-aestproduitenonseulementparlescellulessentinellesactivéesparlesrécepteursTLR
(pourToll-likereceptors),maiségalementparl’endothéliumlésé.Sasécrétiondanslemilieu
extracellulairevaprovoquerlalibérationdecytokinesetchimiokinesparlescellulesvoisines
etparlasuitel’adhérence,lamigration,l’attractionetl’activationdesleucocytes,commeles
neutrophiles. Sa sécrétion peut également être stimulée par des neurotransmetteurs
(neurokin-1).Auniveausystémique,TNF-apeutdiminuerledébitcardiaque,augmenterla
perméabilité capillaire ainsi que provoquer la formation des thrombi. Son action sur les
neutrophilesvapermettredelesattireraulieudel’infection,d’augmenterleuradhérenceà
la paroi de l’endothélium, et promouvoir la phagocytose par ces cellules. TNF-a agit
égalementsurd’autresleucocytes,notammentenstimulantsaproprelibérationenplusde
celledel’IL-1parlesmacrophages,toutcommed’autresmédiateursdel’inflammation.
Enassociationavec l’IL-1,cettecytokinevaagirauniveaude l’endothéliumdescapillaires
sanguins,quisontessentielspourl’arrêtpuisl’adhérencedesneutrophiles.Cetteassociation
auniveausystémiquedéclenchelafièvre,laléthargieetlaperteplusoumoinsmarquéede
l’appétittandisqu’elleinduitlasynthèsedesprotéinesdelaphaseaigüeparlefoie.
Enfin,l’IL-6estproduitepardeslymphocytesT,desmacrophagesainsiquedesmastocytes,
notammentenprésenced’endotoxinesbactériennes.Cettecytokinejoueunrôleprimordial
dans la résistance aux infections bactériennes et semble être responsable de la transition
d’une inflammation précoce dominée par l’action des neutrophiles vers les phases plus
tardives de l’inflammation où les macrophages prédominent. Elle joue un rôle anti-
inflammatoirepar inhibitionduTNF-aet lastimulationde lasynthèsed’IL-10,quiestune
interleukinedontl’actionestprincipalementanti-inflammatoire.
1.1.2.1.2 LeschimiokinesIls’agitd’unefamilledepetitescytokinesauxpropriétéschimioattractives.Ellessontlibérées
par les cellules sentinelles activées. Elles vont guider lamigration des leucocytes et ainsi
l’initiationdelaréponseimmunitaireinnée.Différentesinfectionsvontprovoquerdesprofils
dechimiokinessécrétéesdifférents,conduisantaurecrutementdepopulationsvariablesde
leucocytes.Ainsi,CXCL-8quiestproduitepardesmacrophagesetdesmastocytes,vastimuler
ladégranulationdesneutrophilesainsiquel’explosionrespiratoire.
21
1.1.2.1.3 Lesmoléculesvaso-activesLesmolécules vaso-actives agissent au niveau des vaisseaux sanguins en provoquant leur
dilatation, avec pour conséquence une diminution du flux sanguin et l’extravasation, en
facilitantleralentissementdufluxcellulaire,l’adhésiondescellulesinflammatoiresàlaparoi
depetitscapillaires,puis ladiapédèse.Ceciprovoque l’apparitiondessignesclassiquesde
l’inflammationtelsquelarougeuretlegonflement.Deschangementscellulairesàlasurface
del’endothéliumontlieuenparallèle.Encasderupturedecedernier,l’agrégatplaquettaire
quiseformelibèreégalementdesmoléculesvaso-activesetpro-coagulantes.Lesmolécules
vaso-activesontdifférentesorigines,tellesquelestissuslésés,desprécurseurssanguins,des
moléculeslibéréespardescellulescirculantes,ainsiquedesneurotransmetteurs.
Parmi lesaminesvaso-actives, l’histamine,quiest libéréepar lesmastocytes,est l’unedes
plus importantes. Elle est à l’origine de la libération de l’oxyde nitrique, un puissant
vasodilatateuragissantsurlescellulesendothéliales.Latransductiondusignalpasseparles
récepteursH1.L’histamineprovoqued’autrepartunefuitedeliquideàtraversl’endothélium
quisedistend.
Laprotéolysedeprécurseurssanguinsinactifsgénèredespeptidesvaso-actifs.Desprotéases
agissantsurlesfacteursC3etC5ducomplémentconduisentàl’apparitiondesfacteursC3a
etC3b.Cesmoléculessontdesanaphylatoxines,c’est-à-direqu’ellessontcapablesd’agirsur
les mastocytes, pour provoquer la libération d’histamine et de C5a qui est un puissant
attractantdesneutrophiles.Onretrouveégalement leskinines,desmoléculesvaso-actives
responsablesdeladouleur,avecunrôlesemblableàceluidecertainsneurotransmetteurs
telsquelasubstanceP.
Enfin les leucotriènes qui font partie des lipides vaso-actifs sont formés à partir d’acide
arachidoniquelibéréàpartirdelamembranedediversescellulesdontlescellulessentinelles,
aprèsactiondel’enzyme15-lipoxygénase,tandisquelacyclooxygénaseproduitàpartirde
cette mêmemolécule, des prostaglandines vaso-actives. Les leucotriènes agissent sur les
neutrophilespermettantleurrecrutementainsiqueleuractivationetleursurvie.Onretrouve
parmi les leucotriènes, le LTD4 dont la libération est stimulée par l’IL-13 tandis que la
productiond’Il-13estelle-mêmestimuléeparlaprésencedeLTD4.Ils’agitdoncd’uneboucle
d’amplificationdontlerôleestcentrallorsd’inflammationsévère.
Parmilegrandnombredeprostaglandinesquetouteslescellulesnuclééespeuventproduire,
quatregroupesdesprostaglandinespro-inflammatoiresontétédécrits:lesPGE2,PGF2,les
22
thromboxanesetlesprostacyclines.Leureffetauseindedifférentssitesinflammatoiresest
complexe et variable. Cependant, au fur à mesure qu’ils infiltrent les tissus infectés, les
neutrophiles produisent de la lipoxine. En retour, la lipoxine inhibe la migration des
neutrophiles.Ilyaainsiuneaugmentationprogressivedelaconcentrationdecesmolécules
anti-inflammatoires,audépendduLTB4àl’actionpro-inflammatoire.
OnretrouveégalementunphospholipidenomméPAF(pourPlateled-activatedFactor).Ilest
produitpar lesneutrophilesetagit luiaussisur l’endothélium, lequeldevientplusépaiset
favorise ainsi l’adhésion des neutrophiles, leur chimiotactisme, la dégranulation avec la
libération d’oxydants. Il permet également l’agrégation des plaquettes et la libération de
moléculesvaso-actives,demêmequelasynthèsedethromboxane.
Lesproduitslibérésparlescellulessentinellesactivéesvontdoncaugmenterlaperméabilité
vasculaireetattirer les leucocytes,aupremier lieudesquels, lesneutrophiles.Cesderniers
vontdoncjouerunrôleessentieldanslaluttecontrelesagentsinfectieux,afindeleséliminer
leplusrapidementetefficacementpossible.Pourcelailsdoiventparveniràêtreencontact
decesmicroorganismesausitemêmedel’infection.
Rolling et adhésion Lorsquedesprotéinesbactériennestelque le lipopolysaccharide(LPS)oubiendesDAMPS
agissent sur les cellules endothéliales des capillaires, celles-ci surexpriment en quelques
minutesdesglycoprotéinesàleurmembrane:laP-sélectine(expriméeségalementparles
plaquettes)etlaE-sélectine13.Cesprotéinesexposéesàlasurfacecellulairesontcapablesde
se lieràuneL-sélectineexpriméeà lasurfacedesneutrophilescirculants.Cette liaisonest
transitoire, mais permet progressivement de ralentir les neutrophiles jusqu’à les arrêter
complètementàlasurfacedel’endothéliumdescapillaires.
L’interaction avec l’endothélium va provoquer, via le PAF d’origine endothéliale et une
protéineGtransmembranaire,l’expressiondeprotéinesd’adhésiontellesqueCD11a/CD18à
leurmembraneàpartirde l’exocytosedesvésiculessécrétoires.Cesprotéinespermettent
quantàellesdereconnaitredesintégrinesICAM-1surlescellulesendothélialesetd’établir
uneliaisonforteentrelesdeuxcellules,conduisantainsiàunarrêtcompletdesneutrophiles
collésàl’endothéliumenregarddutissud’oùproviennentlespremierssignaux.Lasécrétion
d’élastaseneutrophiliqueaugmenteencorelaforced’adhésion.
Sousl’influencedecytokinestellesquel’IL-1,IL-17oubienleTNF-a,lescellulesendothéliales
23
vontexprimerdesE-sélectinesàfortpouvoird’adhésion;enoutre,lasécrétiondeCXCL-8par
lesneutrophilesrecrutésprovoquel’attractiondenouveauxneutrophiles,amplifiantainsile
phénomène, et la libération d’IL-1 va intensifier le pouvoir d’adhésion ainsi que la
vasodilatationetl’attractiondescellulesdel’immunité14.
Ilsemblecependantqued’autresmécanismesprovoquentaussil’adhésiondesneutrophiles.
Danslescapillairespulmonairesdontlediamètreestinférieuràceluidesneutrophiles,ceux-
cisontcapablesdes’attacheretdes’infiltrersansqu’ilyaitexpressiondesintégrinesetdes
sélectines, mais uniquement par une action mécanique. Le contact avec l’endothélium
vasculairevapermettrel’activationdesneutrophilescommedéveloppéplusloin.
Diapédèse L’adhésion forte aux cellules endothéliales et l’influence des cytokines va permettre aux
neutrophiles de traverser la paroi vasculaire. Ce phénomène nommé diapédèse (« saut à
travers»dugrecancien)estfinementguidépardesagentschimiotactiques.Lecytosquelette
desneutrophilespermetunepolarisationde lacellule,avec la formationd’un lamellipode
concentrantlesrécepteursdechimiokinesetinducteursdephagocytose.Ceciestengendré
par des voies de transduction incluant des protéines G sensibles au phosphoinositol 3
Phosphate (PiP3) et à la RhoGTPase (Rac), qui provoquent unemodification de l’actine-F
intracellulaire13.
Alasuitedecesignal,leneutrophiles’immisceentredeuxcellulesendothélialesàtraversune
jonctionserréegrâceàuneinteractionentrelesmoléculesdeCD31,expriméed’unepartsur
les cellules endothéliales, et d’autre part à la membrane des neutrophiles. Les filaments
d’actine et de myosine vont donc profiter de l’appui permis par ces liaisons fortes pour
propulser les neutrophiles dans le tissus infecté ou lésé. Sont également nécessaires des
intégrinesetdesprotéinesd’adhésioncellulaire(CAM),dontICAM-1etICAM-2,ainsiquedes
moléculesd’adhésionjonctionnelles(JCAM)8.Desétudesontpermisdemontrerlerôledes
protéinesdeliaisonentredeuxcellulesépithéliales.Eneffet,lesVE-cadhérinesmembranaires
joueraientunvrairôledecontrôledupassagedesneutrophiles,ensedissociantsuiteàleur
phosphorylation et en permettant le passage des neutrophiles en restaurant l’étanchéité
aprèsleurpassage15.
Le passage à travers la membrane basale est facilité par le déversement dans le milieu
extracellulairedemétalloprotéasescollagéno-lytiques(collagénases,protéases…)contenues
24
dans les granulesàgélatinase. Lamajoritédesneutrophiles va traverser l’endothéliumde
cettemanière.Cependant,environ20%utilisentlavoietranscellulaire12,13.
Les neutrophiles nouvellement arrivés au sein du tissu doivent suivre un gradient, avant
d’entrerencontactavec lesmicro-organismes, lequeldoitdépasser legradientprécédent.
Ainsi,denouvellesmoléculesd’attractionvontcréercegradientauxalentoursdestissuslésés.
Le peptide N-formyl-methionyl-leucyl-phénilalanine dérivé des bactéries et le C5a du
complémentsontresponsablesduchimiotactismeauseindutissu.Lesneutrophilesvontalors
migrerverslesbactériesenprojetantleurslamellipodes8.
Production et libération de cytokines Le passage à travers la matrice basale permet l’activation des neutrophiles avec un
changementduphénotypeetdeleuractivitéoptimiséedanslestissus.Afindepromouvoir
l’attraction d’autres cellules inflammatoires, les neutrophiles sécrètent également des CC-
chimiokines, responsables du recrutement desmonocytes capables d’éliminer les cellules
mortesouapoptotiquesdans letissuaprèsdifférenciationenmacrophages.Laproduction
d’IL-8(CXCL-8),IFN-getG-CSFvastimuleretorienterlaréponseinflammatoire.Lalibération
d’IL-17 induit la libération de facteurs pro-inflammatoires par les cellules myéloïdes et
mésenchymateuses permettant le recrutement ainsi que l’activation de nouveaux
neutrophiles. De plus, la production de Leucotriène B4 (LTB4) attire de nouveaux
neutrophiles.Leschimiokinessontdesmoléculeschargéespositivementquivontselieràdes
héparanessulfateschargésnégativementquiserventd’ancresetpermettentlacréationd’un
gradientlelongdel’endothélium16.
Lorsqu’ilssontactivés,lesneutrophilesvontégalementlibérerdescytokines(MIP-1a,MIP-
1b, INF-g)agissantsur le recrutementdemacrophages.Réciproquement, lesmacrophages
activésvontagirsurlesneutrophilesensécrétantduTNF-a,G-CSFetGM-CSF,produisantune
augmentation des synthèses, du recrutement neutrophilique, ainsi que l’inhibition de
l’apoptose,accroissantdumêmecouplasurviedescellulesdanslesiteinflammatoire.
Cependant, ilaétémontréquelesneutrophilesmurinsproduisentpréférentiellementune
cytokineanti-inflammatoire,L’IL-10plutôtquedescytokinespro-inflammatoires17lorsqu’ils
sontstimuléspar laprésencedebactéries,via laco-activationdeTLR-2etd’unCLR/Syk.A
25
l’inversedesmonocytes, lesneutrophilesnesontpassensiblesà l’IL-10,cequienfaitune
cellulerégulatricedel’inflammationaprèslecontactavecunebactérie.
Lesneutrophilesontétéassociésà l’inductionde l’inflammationetsontcapablesd’influer
directementsurlescellulesdendritiques.Cependantlesneutrophilesactivéssupprimentles
fonctions des lymphocytes T, ainsi que la production de cytokines via la production de
péroxyded’hydrogène18.Zhangetal17ontmontrélerôlecentraldesneutrophilesactivés
danslarégulationdel’inflammationlorsd’infectionbactérienne,encontrebalançantlaforte
activité pro-inflammatoire des autres cellules effectrices de l’immunité (monocytes,
macrophagesetcellulesdendritiques).Lorsd’inflammationaigue,l’activitédesneutrophiles
correspondàunéquilibreentrel’éliminationdirectedesbactériesetl’inductiond’unprofil
anti-inflammatoire,sansexercerd’influencemajeuresurlacroissancebactérienne.
1.2 Lesneutrophilescommeeffecteursdel’immunité1.2.1 Rôledansl’immunitéinnéeL’activationdesneutrophilesvapermettreàl’organismedecombattrelesmicro-organismes
qui l’infecte.Celaa lieuà lasuitedudoublesignalproduitpar la liaisonauxintégrinesdes
cellules endothéliales, et à la stimulation par les facteurs TNF-a, CXCL-8 ou bien C5a. Les
vésiculessécrétoiressontlespluspropicesàladégranulation,suivisdesgranulesàgélatinase,
desgranulesspécifiquesetenfindesgranulesazurophiles.Lesvoiesdesignalisation,menant
àlalibérationdesgranulesetdesvésicules,sontcomplexesetencoreassezmalcomprises.
Lorsqu’ils sont au contact de bactéries, les neutrophiles activent divers systèmes anti-
microbiens(dépendantounondel’oxygène),enlibérantlecontenudesgranulesazurophiles
etdesgranulesspécifiquesdanslemilieuextérieuroudanslesphagosomes.Lessubstances
contenues dans ces granules permettent une variété d’activités envers les bactéries. Elles
agissentsurtoutendéstabilisantlamembranebactérienne,d’autrestellesqueleNGAL,les
lactoferrines,etNramp1perturbentlemétabolismebactérienquidépenddufer.Ilproduisent
égalementdesradicauxoxygénésouROSgrâceaucytochromeb558etàlaMPO19.
26
Phagocytose et explosion respiratoire
1.2.1.1.1 InternalisationdesagentspathogènesL’activationdesrécepteursTLRparlaprésencedebactériesdéclenchedifférentssignaux.Les
neutrophiles possèdent l’intégralité des récepteurs TLR connus, ce qui permet d’affiner la
réponse selon qu’il s’agit d’une bactérie à Gram positif ou bien à Gram négatif. Les
neutrophilesémettentdeslamellipodesendirectiondeszonescontenantuneconcentration
supérieurede chimio-attractants.Ce sontdifférentesmoléculesqui forment cegradientà
l’endroit où se trouvent des agents pathogènes, parmi lesquelles on retrouve le C5a, le
fibrinopeptide provenant du fibrinogène, et du peroxyde d’hydrogène, ainsi que des
chimiokines,desleucotriènesetd’autresmoléculeslibéréesparlesbactéries.
Lesneutrophilesvontdecettefaçonparveniràproximitédesbactéries.Laphagocytose la
plus efficace a lieu lorsque les bactéries sont préalablement opsonisées par des anticorps
permettant ainsi la liaison à des récepteurs membranaires présents à la surface des
neutrophiles.D’autresrécepteursmembranairespeuventparailleursreconnaîtrelafraction
C3bducomplément,liéeauxbactéries.Ilpeutaussiyavoirunereconnaissancedirectegrâce
auxPRRs20.
S’ensuit alors un recouvrement du corps étranger représenté par la bactérie par deux
pseudopodes composéesd’actineetdemyosinepar stimulationde leurpolymérisation. Il
s’agitdelaphagocytosedetypeIlorsdelaliaisonàdesanticorpsliésauxbactéries.Lorsd’une
interactiondirecteautraversd’unpudeplusieursPRR,oubienvialecomplément,labactérie
aurait tendance à s’infiltrer progressivement au sein du neutrophile. Il s’agit alors de la
phagocytosedetypeII.Enfinunetroisièmesorted’internalisationsembleexisterparémission
d’ununiquepseudopodequienglobel’agentpathogène.Ceciestfonctiondespropriétésde
surfacedelabactérierencontrée.Danstouslescasdefigure,ilyaformationd’unphagosome
àlasuiteduprocessusconduisantàl’internalisation.
1.2.1.1.2 L’environnementoxydatifdesphagosomesUnphagosomenéoforméne possède pas un contenupropice à la destruction desmicro-
organismes initialement. Il doit donc auparavant subir un processus appelé maturation
pendantlequelilyafusionavecd’autresorganitescellulaires.Cecipermetlaconcentration
d’une machinerie enzymatique, au niveau de la membrane ainsi que de la lumière du
phagosome,quiestpropiceàl’éliminationdel’agentpathogène.Ceprocessusdematuration
27
estmoinsbienconnupourlesneutrophilesquepourlesmacrophages,carcescellulessont
plusfacilementmanipulablesaulaboratoireetdoncmieuxétudiées.Ilestcependantconnu
que lamaturationduphagosomepermet l’acquisitiondu complexeNicotinamide adénine
dinucléopeptide phosphate hydrogène (NADPH) oxydase et d’ATPases. Le phagosome
acquiert notamment ses capacités bactéricides par fusion avec les différents granules
spécifiques des neutrophiles, qui contiennent différentes protéines et enzymes comme
détailléesplushaut.Cettefusionalieuàlasuitedusignaldéclenchantl’internalisationdes
éléments extracellulaires. On retrouve alors une augmentation du calcium intracellulaire,
libéréparleréticulumendoplasmiqueouprovenantdumilieuextérieur.L’augmentationdu
calciumlibredanslecytosolpermetunefusionvésiculaireséquentielle,étantdonnéquele
seuilvariepourchacundesquatretypesdegranules.Ainsi,lesvésiculessécrétoirespossédant
leseuildéclencheurleplusbassontlespremiersàêtrelibérésdanslephagosome,tandisque
selon le même principe, les granules azurophiles sont les derniers. Il semblerait qu’un
isoforme de la synaptotagmine soit impliqué dans cette réponse différentielle selon les
vésicules21.Lesvariationsdelaconcentrationcalciquedanslecytosolinfluentégalementsur
lestramesd’actine.Lesprotéineskinasesjouentvraisemblablementlerôled’uneancremal
connudanslafusiondesdifférentesvacuoles,enplusdeprobablesautresmécanismesencore
inconnus.
Les granules secondaires sont considérés comme ceux amenant l’essentiel des complexes
NADPH-oxidaseprésentsdanslephagosomesuiteàl’activationduneutrophile.Cecomplexe
enzymatiqueestforméenpartiepardesstructuresinitialementprésentessurlamembrane
cellulaire et qui sont assimilés à des structures contenues dans des compartiments
intracellulaires.Cecomplexehétéromériquepermetletransfertd’unélectronprovenantde
laNADPHversunemoléculed’O2donnantnaissanceàunanionsuperoxyde,quiestparla
suiteutilisédanslaformationdesdifférentsradicauxlibresoxygénés.
Lorsqu’ilssontstimulés,lesneutrophilessontdonccapablesdeproduiredesionssuperoxydes
(O2-) par consommation d’oxygène au sein des phagosomes. Il s’agit du processus appelé
explosionrespiratoireou«burstoxydatif»,médiéparlecomplexeNADPH-oxydasecatalyseur
delaréaction:NADPH+2O2->NADP++2O2-+H+.Cetteréactionjoueunrôleprépondérant
dans la réponse immunitaire assuréepar les neutrophiles, comme lemontre la sensibilité
accruedes individusatteintsde lamaladiegranulomateusechronique.Cespersonnessont
porteusesd’unemutationgénétiqueàl’origined’uneinactivationdelaNADPHoxydase22.
28
Ils’agitlàducomplexeenzymatiqueàl’originedetouteslesréactionsd’oxydo-réductionqui
ontlieuàl’intérieurduphagosome.L’essentieldelaproductiond’ionssuperoxydeetH2O2
danslesneutrophilesalieuàl’intérieurdesphagosomes.Laproductionàl’extérieurdeces
organitespourraitêtreimpliquéedanslatransmissiondemessagescellulaires,commeceux
quisontobservésdansd’autrescellulesavecdesmoléculesdelafamilledesNOXàlaquelle
appartientaussilaNADPHoxydase23.Celle-ciestpolariséedanslamembraneduphagosome
etpermetlalibérationdesuperoxydeàl’intérieurdel’organite,tandisquelaconsommation
deNADPHsefaitdanslecytosolduneutrophile.Lavoiedeshexosesmonophosphatespermet
decourt-circuiterlavoieglucidiqueetainsideformerànouveauduNADPHessentielpourle
maintiendelaproductiondesuperoxyde.
Figure5:ActivationetassemblagedelaNADPHoxydase
24
Le différentiel de charges créé par la formation d’ions superoxyde est compensé par le
transport de protons à l’intérieur du phagosome via des canaux voltage-dépendants. Les
protonsréagissentalorsaveclesionssuperoxydelorsdelaréactiondedismutation:2O2-+2
H+->O2+2H2O2.
D’autresthéoriesproposentuneentréedepotassiumdanslephagosomepourlemaintiende
l’électroneutralité,cequifaciliteraitparailleurslasolubilisationd’autresgranules25.
Dans les conditions à l’intérieur du phagosome, il est reconnu que les ions superoxyde
donnentnaissanceàduperoxyded’hydrogènelequeldonneessentiellementduHOCletdes
chloraminesgrâceàl’activitédelaMPOetmalgréunegrandevariétéderéactionschimiques
superoxide generation is also seen with stimuli that do notinduce phagosomal formation (121), and as reviewed by By-lund et al. (33), likely sites include vesicles or endosomes. Thenonphagosomal intracellular oxidase activity is apparentlynot involved in antimicrobial activity and it is possible that, asin other cell types, it has a signaling role that contributes to theinflammatory response (24, 33).
Enzymology, directionality, and electrogeniceffect of NADPH oxidase
A key feature of the NOXs is that the reaction they catalyzeis directional across the membrane (111, 119). The complex isoriented such that NADPH is consumed in the cytosol and theelectrons are transferred to FAD, then sequentially via the twohemes to oxygen (Fig. 2). As the external surface becomesinternalized during particle ingestion, superoxide is releasedinto the phagosome.
The Km for oxygen is only *10 lM, which enables the ox-idase to function at the low oxygen tensions present in tissue(67). At maximum capacity the isolated enzyme can transfer*160 electrons/(heme$s- 1) (111). It can be calculated that thefully activated oxidase would consume the basal concentra-tion of NADPH in the neutrophil (*50 lM) in less than asecond (45). Thus, NADPHmust be regenerated continuouslyfrom NADP + to maintain the oxidative burst. This occurs viathe hexose monophosphate shunt pathway (26, 214), withglycogen breakdown providing most of the glucose required(181). Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) is the firstenzyme in the hexose monophosphate shunt. G6PD defi-
ciency affects millions of the world’s population and occurswith differing severity depending on the specific mutation inthe protein (35). Although neutrophil function is in most casesunaffected, the most severe cases (with < 1% normal G6PDactivity) have CGD-like symptoms due to the inability of theirneutrophils to mount an effective oxidative burst (15, 72).
Because it is directional, the oxidase is electrogenic andtransfers electrons out of the cytoplasm into the phagosome(or surroundings if it is on the external surface). This creates acharge imbalance that needs to be counteracted to preventdepolarization of the membrane and shutdown of the oxi-dase. Charge compensation is provided primarily by hydro-gen ions transported by voltage-gated proton channels (44,47). The VSOP/HV1 channel appears to be primarily re-sponsible (55, 148, 155). With the balancing flow of protons,the negative charge in the phagosome is dissipated by su-peroxide dismutation (Reaction 2) and cytoplasmic acidifica-tion due to NADPH oxidation is overcome.
2O!"2 þ 2Hþ/O2 þH2O2 (2)
The neutrophil NADPH oxidase is viewed predominantlyas a source of toxic oxidants. However, an alternative functionhas been proposed (156, 157, 169) in which some of the neg-ative charge is counterbalanced by transport of potassiumions into the phagosome thus increasing the ionic strengthand aiding solubilization of antimicrobial granule proteins.While the proposed potassium transport mechanism has beendiscounted (59, 129, 133), other consequences of the electro-genic effect are theoretically possible (152). For example, there
FIG. 2. Activation and assembly of NOX2 on the phagosomal membrane. In the resting neutrophil, flavocytochrome b558,consisting of gp91phox and p22 phox, resides in the plasma and specific granule (sg) membranes. A complex of p47phox,p67phox, and p40 phox, and Rac2 (a member of the Rho family of small GTPases) in its GDP state associated with a Rho-dissociation inhibitor (GDI) are present in the cytoplasm. Ingestion of a particle (not shown) creates a phagosome (pink)formed by fusion of plasma and granule membranes and stimulates the cell to phosphorylate p47 on multiple Ser residues.This results in translocation of the p47/p67/p40 complex that binds to the gp91/p22 complex in the membrane. Rac2undergoes GDP-GTP exchange and also translocates in its prenylated form. The assembled oxidase complex is then activatedto oxidize cytoplasmic NADPH and shuttles electrons through FAD and the two stacked heme groups to molecular oxygen inthe lumen of the phagosome. Not shown is the concomitant activation of proton channels to transfer hydrogen ions into thephagosome and maintain charge balance. For more detail see Leto et al. and Nauseef (119, 135). (To see this illustration incolor, the reader is referred to the web version of this article at www.liebertpub.com/ars.)
REDOX REACTIONS IN NEUTROPHIL PHAGOSOME 3
29
possibles en théorie. Alors que l’essentiel de l’activité est couramment associé aux ions
superoxyde,celan’estpasréellementobservédanslesconditionsaqueusesdelacellule,dans
laquelleiln’estpasunfortoxydantniunfortnucléophile.Ainsisonactivitéconsiste-elleen
unréducteurfaible,unebasefortedeBronstedetunligandpourlescomplexesmétalliques.
C’estcelaquiluiconfèreuneréactivitéélevéepourlaMPOàl’originedeladismutationdu
superoxyde,libérantdupéroxyded’hydrogène.Laréactiondedismutationpeutégalement
avoir lieu spontanément. H2O2 est une molécule bactéricide efficace. Cependant, la
concentration dans le phagosome réduit cette activité, compte tenu d’une énergie
d’activationélevéepourpouvoiroxyderd’autresmolécules26.Ainsileperoxyded’hydrogène
élimine les bactéries surtout en agissant rapidement au niveau des déshydratases
bactériennes.Dans le phagosomeH2O2 réagi plus largement avec laMPOpar affinité aux
protéines héminiques. Les caractéristiques et réactions catalysées par la MPO seront
développéesdansunepartieultérieure,maisilsembleraitquedanslephagosome,laMPO
réagitavecleperoxyded’hydrogèneformantuncationradicalaire(appeléComposéI)capable
d’oxyderdifférentsélémentsàhauteurde1ou2électrons.Comptetenudesconcentrations
desdifférentscomposésdanslephagosomependantl’explosionrespiratoire,lesionschlorure
semblentêtreleprincipalsubstratdelaMPOavecH2O2.LaforteconcentrationdeMPOdans
lephagosomepermetderéagir rapidementavecH2O2,cequiévitesaconcentrationetsa
diffusionàl’extérieurduphagosomequipourraitêtredélétèrepourleneutrophile.
L’influxdeprotonsetd’ionschlorurepermetdonclaformationdeHOCl.Celui-ciseraitdirigé
versl’agentpathogènephagocytéafindel’éliminer.Desétudesontmontréquelesprotéines
du phagosome seraient également oxydées (sur les résidus méthionine et cystéine).
Aujourd’hui,malgré lapreuvequelesphagosomesdesneutrophilesproduisentduHOCl, il
n’est pas complètement déterminé si ces derniers sont entièrement responsables de la
destructiondesbactériesoubiens’ilyaformationdechloraminesàpartirdesprotéinesdu
phagosome,quiontelles-mêmesuneactivitébactéricide.
Ilrestetoutdemêmeétabliquel’acidehypochloreuxestproduitauseindesphagosomeset
qu’il permet l’élimination des bactéries, de façon directe ou indirecte. L’examen des
personnesatteintesd’undéficitdeNOX2oubiendelaMPOmontrequel’activitéoxydasique
auseindesphagosomesreprésenteunepremièredéfenserapideetimportante,coupléeà
d’autresmécanismesagissantàpluslongstermes.Eneffet,alorsquelessujetssouffrantd’un
défautdelaMPOsemblentplusrésistantsqueceuxsoufrantdeCGD, lespremiersrestent
30
tout de même largement sensibles à de fortes expositions à des bactéries pathogènes,
notamment lorsqueplusieursbactériessont impliquées27.L’activitéoxydasiquedureraiten
moyenneplusieursminutesaprès la formationduphagosome, tandisque lemécanismeà
l’originedesoninterruptionresteencoremalcompris24.
La bactéricidie non oxydative : le rôle des granules spécialisés Commedécritprécédemment,lesneutrophilessecaractérisentnotammentparunéventail
de granules dont le contenu est riche en molécules propices à l’élimination des agents
pathogènes. Il est soutenu que les neutrophiles expulsent rarement leur contenu
intracytoplasmique, et que l’équipement enzymatique est plutôt déversé au sein du
phagosome.Danslesdifférentesvésicules,onretrouvedescathepsines,desdéfensines,dela
lactoferrineetdu lysozymeparmid’autresmoléculesàpouvoirantimicrobien13.Cecivient
compléterlaproductionderadicauxoxydatifsprésentéedansleparagrapheprécédent.Ceci
explique que des individus ayant de déficiences des enzymes oxydatives ne sont pas
entièrementimmunodéprimésparlaprésencedecesmoléculeségalementbactéricides.Ils
restentcependantplusauxagentsinfectieux.
Nétose Au-delà de leur capacité à éliminer les agents pathogènes en les phagocytant ou bien en
libérantlecontenuenzymatiquedecertainesvésiculesdanslemilieuextérieuràleurcontact,
lesneutrophilespossèdentégalementuneautrepropriétépourl’éliminationextracellulaire
desagentspathogènes:lanétose,labactéricidieextracellulairedoitêtrecontrôléeafinde
minimiseraumaximuml’atteintedestissusenvironnants.Suiteàl’activationdesneutrophiles
par la présence de bactéries ou de chimiokines, il est possible d’observer l’émission d’un
réseaudefibrescapablesdelierdesbactériesquelquesoitleurtype.Ils’agitd’unprocessus
rapidequiapparaîtenunedizainedeminutes.Ceréseauestcomposéd’ADN,d’histonesainsi
que d’enzymes contenues dans certaines vacuoles des neutrophiles parmi lesquelles des
enzymescontenuesdanslesgranulesprimaires(élastases,cathepsinesGetMPO)ainsique
des protéines des granules secondaires et tertiaires (lactoferrine et gélatinase) 28. Suite à
l’inefficacitédesNETenprésenced’ADNase,ilaétédéduitqu’ils’agitd’unestructurefaite
principalementdechromatineetd’histones.Sasécrétionpar lesneutrophilesactivésreste
encoreincomprise.Eneffetils’agitd’unprocessusplusrapidequel’apparitiondel’apoptose
31
suiteà l’émissiondesignauxadaptés. Ilsepourraitcependantquecelasoitunévènement
précocedansl’évolutionapoptiquedelacellule.Ilsembleraitquedesneutrophilesayantémis
desNETspuissentcontinueràmigrerenréponseàungradientchimiotactique.Ilesttoutde
mêmeadmisquecesstructuresextracellullairespermettentuneconcentrationdesagents
pathogèneset leurdestruction,ainsiquel’inactivationdeleursfacteursdevirulencegrâce
notammentàl’élastaseetauxhistones.Desétudesontpumettreenévidenceavecclartéles
propriétés antimicrobiennes des histones même à des concentrations faibles29. Ceci est
efficacefaceàunegrandevariétédepathogènes.Eneffetlemaillagedensedechromatine
permetlaconcentrationdesagentspathogènesaucontactdesmoléculesdedéfenseetdes
agents chimiotactiques. Cela permet non seulement une réelle efficacité de la lutte
antimicrobiennemaisaussiunmoindreeffetsurlestissussituésautour.
Malgrélacapacitédeprotectionvis-à-visdespathogènesconféréeparlaformationdesNETs,
ilrestecependantplusieursquestionsconcernantleurmiseenplace.Ilestdifficiledeconcilier
lamigrationdesneutrophilesactivésaveclaformationd’unréseaudecapturedesbactéries,
ainsiquelerelaisamplificateurpourl’attractiond’autrescelluleseffectricesdel’immunité.Il
resteaussiàcomprendrecommentceréseaudensedechromatineestdéfaitunefoisque
l’infectionestcontrôlée30.
Recrutement cellulaire Lesneutrophilesjouentunrôleimportantauseindusiteinflammatoirepourlerecrutement
etl’activationd’autrescellulescommelesmacrophages.Lesneutrophilesactivéssont
capablesdelibérerunegrandequantitédechimiokines,quisontelles-mêmescapables
d’attiresdesmacrophages,aussibienquedesmonocytesetdescellulesdendritiques.En
effetdesneutrophilesactivésvontlibérerdanslemilieuextracellulaireMIP-1b(Macrophage
InflammatoryProtein)etMIP-1a.Cesmoléculespluripotentessontcapablesd’activerdes
macrophagesetdesmonocytes,aussibienquedescellulesdendritiquesimmaturesetdes
cellulesNK(NaturalKiller).TNF-a,IL-8etIL-17seraientaussilibérésparlesneutrophileset
influeraientsurl’activationdesmacrophagesetdescellulesdendritiques,aussibienquesur
lamaturationdesmacrophagesversunprofilantioupro-inflammatoire.Enfinles
macrophageslibèrentdesMMRs(MacrophageMannoseReceptors)capablesd’interagir
aveclaMPOproduiteparlesneutrophiles,cequistimuleégalementlalibérationde
cytokinespro-inflammatoires31.
32
Parailleurs,lesneutrophilesvontlibérerdesmoléculesquivontpromouvoirleurpropre
recrutementdanslesiteinflammatoire.Ceciestpermisparlalibérationd’IL-17déjàcitée
précédemmentquiagitindirectementenstimulantlaproductionduG-CSFquistimulela
productiondeneutrophiles.D’autrepart,lalibérationd’IL-8etdeGROα(Growth-related
geneproduct-a)créeungradientchimioattractantpourd’autresneutrophiles32.Ilconvient
enfinderappelerqu’enagissantsurlesmacrophages,ilyalibérationparcesderniersde
moléculesquivontégalementstimulerlamigrationdesneutrophilesverslesite
inflammatoireainsiqueprolongerlasurviedesneutrophilesprésents31.
Lelienentrecellulesdendritiquesetneutrophilesadéjàétélargementétudiéafindemontrer
que la réponse immunitaire Th1 est dépendante de l’activation des neutrophiles au site
inflammatoire 33.Eneffet lorsd’activationdesneutrophiles,plusieursmolécules sécrétées
danslemilieuontlepouvoirdedéclencherlamaturationdescellulesdendritiquesimmatures
etainsiconduireàl’apparitiondesversantsaussibieninnéqu’adaptatifdelaréponse31.
Figure6:interactiondesneutrophilesaveclesmacrophages(d’aprèsKumar
31)
immunity [100]. α-Defensins, human neutrophil peptide-1 and -2(HNP-1 and -2) secreted by human neutrophils exhibit chemotacticproperties for T cells and immature DCs only [101].
LL-37, a cathelicidins in humans and mouse cathelin-relatedantimicrobial peptide (mCRAMP) in mouse, encourage both activa-tion as well as differentiation of monocyte-derived DCs [102–104].Cathelicidin-mediated differentiation of monocytes into DCsinvolves the activation of mitogen-activated protein kinase(MAPK) pathway in vitro [102,105]. Cathelicidins in the presenceof self DNA potentially activate plasmacytoid DCs, increase theexpression of co-stimulatory molecules, type-1 interferon synthesisand exacerbate autoimmune diseases like psoriasis by stimulating
TLR-9 [106]. However, a recent study has shown that cathelicidinshave the potential to block DC TLR-4 activation and may inhibitallergic contact dermatitis [107]. Based on these observations, itremains to elucidate the exact role of cathelicidins in DC stimulationand maturation. Lactoferrin at higher concentrations (10–100 μg/ml) effectively stimulates monocyte-derived DCs and peripheralblood DCs [108,109]. This action of lactoferrin on DCs can stimulateadaptive immune response and may be responsible for the anti-tumor effect of lactoferrin [110–112]. The stimulatory effect oflactoferrin on DCs may be TLR-4-dependent as their activation isinhibited when TLR-4 is absent (i.e. DCs from C3H/HeJ mice) or isblocked by anti-TLR-4 antibodies [113]. HMG-B1is another alarmin
Infection or
Inflammation
Increase in neutrophil survival
through G-CSF1-
PIM α and MIP-
β
Macrophages, NK Cells and
immature DCs activation
IL-17 Increased Neutrophil Survival
MPO Blockade
TNF-α IL-8 IFN-
MMR Interaction
Macrophage Activation
PMN
Activation
Release of ROS (i.e. O2., H2O2), and TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8 and
GM-CSF
Macrophages attraction at the site of infection or inflammation
Activation andrecruitment ofMacrophages
Increased neutrophil survival through G-CSF
Fig. 1. Activation and interaction of neutrophils with macrophages at the site of infection or inflammation. MIP-1α and MIP-1β activate monocytes, macrophages, NK cells andimmature DCs. IFN-γ released from neutrophils also causes activation of macrophages. MPO released from neutrophils binds to MMR expressed on macrophages leads to activationof pro-inflammatory function of macrophages, which in turn increases neutrophil survival. IL-17 released by neutrophils increases their survival through G-CSF (for details see text).
1328 V. Kumar, A. Sharma / International Immunopharmacology 10 (2010) 1325–1334
33
1.2.2 Immunitéadaptative:présentationd’antigènesparlesPNN
Lesneutrophilesjoueraientégalementunrôledirectdanslaréponseimmunitaireadaptative
parlalibérationdirectedemoléculesagissantsurlapopulationdelymphocytesainsiquepar
un rôle de cellule présentatrice d’antigènes au sein de lamoelle osseuse. En effet, après
injectiondevirusmodifiéAnkara, il aétémontréquedesneutrophilesont la capacitéde
migreràpartirdusitecutanéd’injectionverslamoelleosseuseoùilsinteragissentavecdes
cellulesmyéloïdesrésidentes.Cerôleestdeplusrenforcéeparlalocalisationdeneutrophiles
auseindesnœudslymphatiques8.
1.2.3 ApoptoseetsurviedesPNNlorsd’infection
Dansdesconditionsnormales,laduréedeviedesgranulocytescirculantestcourte,entre24
et48heures,cequifaitquelepoolsanguinestrenouveléentièrementenmoyenne2foispar
jourchezl’homme.L’apoptosedesneutrophiles lesrendinsensiblesauxstimuliextérieurs,
avecpourconséquence,l’expressiondesignaux«eat-me»àl’originedelareconnaissance
decescellulesparlesmacrophagescirculantsetleuréliminationdanslarate,lamoelle,ainsi
queparlescellulesdeKüppferdanslefoie.Cependantlorsd’inflammationetdemigration
transendothélialedesneutrophilesauseindestissus,ilestessentielqueceux-cirestentactifs
jusqu’à l’éliminationdesagentspathogènes.Cen’estqu’aprèscetteétapeque lescellules
immunitairespeuventsubir l’apoptose, lanécroseoubien laNETose(libérationdesNETs).
L’apoptoseneutrophiliquejoueunrôlemajeurdansleprocessusderégulationetdefinde
l’inflammationgrâceàlacapacitédecescellulesdeséquestrerdescytokinesinflammatoires
enplusdedevenirprogressivementinsensiblesauxstimuliavecarrêtdelaproductionetde
lalibérationdemoléculespro-inflammatoires.L’activitédesmacrophagesphagocytairesest
également influencée avec une polarisation vers le phénotype M2 dont la principale
caractéristiqueestdepromouvoir larésolutiondesprocessus inflammatoires.Cesderniers
libèrent des cytokines telles que l’IL-10 et le TGF-b, qui interviennent également dans le
processusderéparationdestissuslésés.
Lorsd’unretarddansledéclenchementded’apoptosedescellulesinflammatoires,oud’un
défautdephagocytosedesmacrophages,lesneutrophilespeuventpersisterauseindumilieu
34
inflammatoire et être à l’origine d’une réponse exacerbée avec production prolongée de
cytokinespro-inflammatoiresetàtermeuneatteintedestissusdel’hôte.
Lalutteefficacecontrelesagentspathogènesrésultedoncd’unéquilibreentreuneapoptose
tropprécocepouvantconduireàundéfautd’immunitédel’hôteàl’origined’uneinfection
chroniqueetsévèrepour l’organisme,ouà l’inverse,d’uneapoptosetroptardivequipeut
êtredirectementnuisiblepour l’organisme.C’est lecasdansdesmaladieshumainestelles
que le syndrome de détresse respiratoire aigüe, l’arthrite rhumatoïde, le sepsis parmi
d’autres.
On retrouve cettemêmeanalogie de l’équilibre au niveau cellulaire. Il existe un équilibre
constant entre les signaux apoptiques et les signaux de survie des neutrophiles. Lors de
l’absencedesignauxextérieurs,lesneutrophilessubissentuneapoptosediteconstitutive,par
défaut.Cependant,danslamajoritédescas,cescellulesreçoiventunensembledesignaux
antagonistesquilesmaintientvivantsetactifs34.
OnretrouveparmilessignauxdesurvieleGM-CSF,leleucotrièneB4,leC5a,laprotéineC-
Réactivedelaphaseaigüe, leLPSbactérienainsiquel’ADNbactérien.Cesontdessignaux
agissantsurdifférentescascadesdephosphorylationàl’originedelasurviedesPNN.
On retrouve également les b2 intégrines dans la régulation du temps de survie des
neutrophilesenplusdu rôle fondamentald’adhésionetdemigrationbienétabli,qui sont
essentielspourl’immunitédel’hôte.OnretrouvelamoléculeMac-1appartenantàlafamille
desb2-intégrinesavecunrôledans la liaisonaufibrinogène, lescomplexes immuns,et les
plaquettes.Ils’agit,aumêmetitrequeCD11c/CD18,derécepteursspécifiquesaupartiesC3ib
ducomplémentcapablesderégulerlaphagocytosedesbactériesopsoniséestoutenétant
capables de reconnaitre directement des fragments de ces agents pathogènes. Différents
ligandsdurécepteurMac-1aurontdeseffetssurlasurviedesneutrophiles.
35
Tableau2:LigandsdeMac-1etleurseffetssurl'apoptosedesneutrophiles(d'aprèsKebiretFilep34).
Ligand Action Rôlesurl’apoptose
ICAM-1 AdhésionetmigrationPNN Supprimeapoptose
Fibrinogène Précurseurdefibrine,initie
coagulation
Supprimeapoptose
Plasminogène Précurseurdeplasmine,
initiefibrinolyse
Supprimeapoptose
Angiostatine Inhibeangiogenèse
Pasd’effet
MPO Lysebactérienne,stimule
expressionMac-1et
libérationMPO
Supprimeapoptose
Héparine
Immobile
Soluble
Soluble,BPM
Anticoagulant
Int.adhésiondesleucocytes
Inhibeliaisonfibrinogène
Provoqueapoptose
Inconnu
Pasd’effet
Bactérieopsonisée Phagocytosedesbactéries Provoqueapoptose
1.2.4 Propriétésanti-tumorales
Desexpérienceschezl’animalontpermisd’étudierleprofildeneutrophilesetleurinfluence
sur lemilieu favorisant d’apparition d’une tumeur. En effet, des études indiquent que la
présencedeneutrophilesengrandequantitésigneraitunmoinsbonpronosticavecunprofil
pro-tumorigène. Il est également admis l’existencedeneutrophilesdont leprofil est anti-
tumorigène.
Eneffet,denombreusestumeurslibèrentdesmoléculesquivontattirerlesneutrophilesdans
lemilieutumoral,tellesqueCXCL6,CXCL8etCCL3.Unefoissurplace,cesneutrophilesdit
36
associés aux tumeurs (TAN, Tumor Associated Neutrophils) seront activés à leur contact,
augmentant ainsi le signal de recrutement. Les neutrophiles activés produisent alors des
moléculesquivontfaciliter ledéveloppementtumoraldontlesmetalloprotéasesMMP8et
MMP9, ainsi que des molécules stimulant l’angiogenèse telles que VEGF. De plus, en
désorganisant la lame basale de la matrice extracellulaire, les neutrophiles favorisent le
passagedescellulestumoralesdanslacirculationsanguineetainsil’apparitiondemétastases.
Les TAN vont également avoir un effet immunosuppresseur sur les cellules T CD8+ qui
possèdentuneactioncytolytiquesurlescellulestumorales.
Parailleurs, lesTANpeuventégalementexerceruneactionanti-tumorale localementdans
certainscancers.EneffetlaproductionlocaledeROSpermetuneactionlytiquedirectesur
lescellulestumorales,tandisquelalibérationd’unligandFASinduiraitl’apoptosedecellules
tumorales.Deplus,lalibérationdecytokinespro-inflammatoiresengendreunestimulation
decellulesTCD8+anti-tumorales.Enfin,plusieurstechniquesthérapeutiquessebasentsurla
production d’anticorps reconnaissant les cellules tumorales, afin de stimuler l’activité
phagocytairedesneutrophilespourlescellulestumorales.
Ainsi,parrapprochementaveccequiadéjàétédécritpourlesmacrophages,certainsauteurs
tendentàdifférenciercesdeuxprofilsdeTANsenN1pourlescellulesàprofilanti-tumoralet
N2pourcellesfavorisantledéveloppementtumoral7.
1.3 Spécificitésrelativesàl’espècebovine
Laproductiondesneutrophilesdansl’espècebovineestsemblableàcelledécriteauparavant
pourl’homme,avecuneduréemoyennede6jours.Cependant,danscetteespèce,ilssont
retenusunjoursupplémentairedanslamoelleavantderejoindrelacirculationsanguine.Ceci
estvalablemêmelorsd’inflammationaigüeetcomparativement,laréservedeneutrophiles
danslamoelleosseuseestinférieureàcellesdesautresespèces.Celaexpliqueenpartiela
raison pour laquelle une neutropénie est souvent observée lors des phases précoces de
l’inflammationàréponsegranulopoïétique35.Ceciestparlasuitecompenséparlastimulation
delagranulopoïèseetledécalageàgauchedelacourbed’Arneth,quitraduitlaproduction
de jeunes neutrophiles. D’autre part les bovins possèdent un troisième type de granules
37
neutrophiliques,plusamplesque lesgranulesprimaireset secondaires.Ce typeoccupe la
moitié du cytoplasme des neutrophiles de cette espèce. Des études cytochimiques et
immunocytochimiques ont permis de montrer l’absence de lysozyme à l’intérieur des
neutrophilesbovinsalorsqu’ils’agitd’unemoléculetrèsprésentedansd’autresespèces35.
L’absence de neutrophilie au cours des 3 à 5 premiers jours d’une inflammation rend la
distinctionentreuneinflammationchroniqueetuneréponserécente,difficileensebasant
surleseulleucogramme.Ainsi,est-ilplusaiséderechercheruneproductionenexcèsd’une
protéinedephaseaiguëcommelefibrinogèneoul’haptoglobine,afindedistinguerlesdeux
situations.Lorsd’inflammationaigüemarquée,onobserveuneneutrophiliemodéréesuiteà
lastimulationdelagranulopoïèse.Cependant,lorsd’inflammationchronique,onobserveune
concentrationnormaleoubienunelégèreneutropénielorsqu’ilyaunefortemobilisationde
neutrophiles.
Plusieurscausespeuventêtreàl’origined’uneneutrophilieavecenpremierlieulesinfections
d’originesbactériennes,viralesetfongiques.Cetteaugmentationestégalementobservéelors
d’affectionsdigestivescommeundéplacementdelacaillette,unprocessusnéoplasique,une
anémieimmuno-médiée,unetoxicose,unsyndromededétresserespiratoireaigüedueàune
hypersensibilitéainsiquesuiteàl’administrationdesomatotropine.
1.3.1 Lesmédiateursdel’inflammationchezl’espècebovineAinsiquedansd’autresespèces,lesneutrophilessontattiréspardeschimioattractantslibérés
lors d’une infection, parmi lesquels on retrouve essentiellement des chimiokines comme
CXCL8,lesleucotriènesLTB4etlesPAFs.CXCL8etLTB4sontnonseulementresponsablesde
l’attractiondesneutrophiles,maisaussidel’amplificationdelaréponseinflammatoirevuque
cesdernierssonteux-mêmescapablesd’ensynthétiseraprèsactivation.CXCL8anotamment
étéétudiéavecprécision,cequiapermisdedéterminerqu’ils’agitd’unemoléculelargement
expriméeparlesneutrophilesainsiquepardesmacrophagesdanslestissusenflammés.In
vitrolesneutrophilesactivésvontlibérercettemoléculeaprèsavoirsubiladiapédèseetle
chimiotactisme.CXCL8estdonclibéréepardesneutrophilespermettantuneamplification
de la réponse inflammatoire et également l’activation de la réponse oxydative des
neutrophiles36,37.
Les PAF sont des molécules dérivées de phospholipides produites par différents types
38
cellulaires. Elles sont capables d’attirer les polynucléaires neutrophiles et de les activer,
provoquantlalibérationdeROSainsiqueladégranulation.Cesontégalementdesmolécules
capables d’agir sur les neutrophiles qui peuvent eux même en libérer dans les tissus,
provoquantainsiuneamplificationdelaréponseinitiale38,39.
C5a est un des fragments du complément rapidement libéré lors d’inflammation. Il agit
égalementsur lesneutrophilesbovinsviaunrécepteurmembranaire(C5R)à l’origined’un
influx de calcium stimulant le chimiotactisme de ces cellules ainsi que leur activité
phagocytaireetlesdéfensesoxydatives,enplusderetarderl’apoptose.Aterme,cettevoie
designalisationpermetenpluslasynthèseetlalibérationdeCXCL8parlesneutrophiles.C5a
provoqueégalementl’apparitiondeCD14àlamembranedesneutrophiles.Ils’agitd’undes
corécepteur de TLR4, qui est stocké dans des vésicules intracellulaires40. Des études ont
également montré que la cytokine TNF-a possède une action similaire avec la capacité
d’activerlesneutrophilesetpromouvoirlaphagocytoseetl’explosionrespiratoire41.
Comme pour d’autres espèces, les neutrophiles bovins peuvent également détecter
directementlesagentspathogènesenreconnaissantdesfractionstrèsconservéessurleurs
membranes. Lors d’exposition à un agent pathogène, les neutrophiles expriment des
cytokinespro-inflammatoirestellesIL-1,TNF-α,etCXCL8,parmid’autres.Lareconnaissance
desMAMPSparlesPRRestmoinsbienconnuechezl’espècebovinequechezl’hommeoula
souriscommenousl’avonsdécritauparavant.AinsiConejerosetal42ontpudémontrerque4
PAMPsétudiésontproduitunchangementdelatailleetdelaformedesneutrophilesenplus
destimuler lespropriétésdephagocytose.Malgréuneréponsedifférentielleselon lesLPS
rencontrés, l’expressionensurfacedeTLR2etdeTLR4aétédémontréeparcytométriede
fluxainsiquel’augmentationdel’expressiondeTLR4membranaireaprèscetteexposition,qui
provoquelalibérationdeCXCL8danslemilieu43.IlexisteégalementdesPRRcytoplasmiques
NOD 1 et NOD 2 (Nucleotide bindingOligomerizing Domain) capables de reconnaitre des
composésbactériensetd’activerlatranscriptiondufacteurNF-kB(chezl’hommeseulNOD2
est présent). Il s’agit d’une voie importante chez les bovins, conduisant à lamigration et
probablementaurôleprotecteurdesneutrophiles.Cependantilnes’agitpasdel’uniquevoie
d’activationdeNF-kB43,44.
Delamêmefaçonquecelledécriteauparavant,lerôledesmoléculesd’adhésionlorsdela
réponse inflammatoireest reconnue,avecnotammentuneexpressionaugmentéedesb2-
39
intégrines sur les endothelia 45. Le syndrome de déficience d’adhésion leucocytaire a par
ailleursétélargementétudiédanscetteespèceoùàunemutationsurlegènecodantpourCD
18 a été identifiée. Elle causait undéfaut d’extravasationdes neutrophiles dans les tissus
infectés.Lesanimauxatteintsétaientsujetsàdesneutropéniespersistantesetdesinfections
récurrentesquientrainaientgénéralementlamortprécoce(avantl’âgedesixmois)dessujets
atteints46.
1.3.2 LesmécanismesdedéfensepermisparlesneutrophileschezlesbovinsOnretrouvechezlesbovinstroistypesdegranulescontenantdesmoléculesimpliquéesdans
lesdéfensesanti-bactériennes.Lesgranulestertiairessontlesplustardifsdansleurapparition
et sont les plus nombreux dans cette espèce 47. On retrouve également des vésicules
contenantdesprotéinesmembranairesainsiquelaphosphatasealcaline.Larépartitiondans
différents organites permet également la séparation de composés capables de s’activer
réciproquement et permettant une réponse contrôlée fidèle aux signaux reçus. Ainsi les
protéases sont généralement les derniers composés libérés lors de l’activation des
neutrophiles,laissantsupposerqu’ils’agitd’uneréponsededernièreligne,étantdonnéson
potentielnocifenverslestissusdel’hôte.Encomparaisonaveclesneutrophileshumains,on
trouvechezlesbovinsuneactivitéantimicrobienneaccrueavecdesquantitésplusmarquées
delactoferrine,deprotéineB12,dephosphatasesalcalinesetacides,ainsiquedeglutathion
peroxydaseetoxydase.Encontrepartie, lesneutrophilespossèdentmoinsdelysozyme,de
MPO,decatalasedeβ-gluconidaseetdeβ-galactosidase48.
Parmi les peptides antimicrobiens étudiés chez les bovins, il faut noter la présence de
cathélicidines de plusieurs formes (différemment de ce qui est vu chez l’homme) dont la
productionpeutêtrelargementamplifiéelorsd’inflammation.Cesontdesmoléculesstockées
sousformedepro-enzymesdanslesgranuleslargesetactivéesparl’élastasecontenuedans
les granules azurophiles.On retrouve également la présenced’uneuniquedéfensineb et
l’absence de défensine a. Ces molécules possèdent un spectre antibactérien ainsi
qu’antifongiques49,50.
EnplusilexistedesPGRPs(PeptidoglycanRecognitionProteins)quisontégalementprésentes
chezlesbovinsetquisontcapablesdereconnaitredesséquencesconservéeschezdifférentes
bactéries,enexerçantuneactivitéantibactérienneetantifongique51.
40
Defaçonanalogueàcequiaétédécritchezl’hommeetlasouris,laprésencedeNETsasuscité
de nombreuses études dans les derniers quinze ans, et dans l’espèce bovine, le même
mécanismeaétédécrit52,53.
Demanière semblableà cequi est connuchez l’homme, lesneutrophilesbovinsexercent
égalementuneactivitédecontrôledelaréponseinflammatoire,enplusdeleurrôlecentral
dans l’élimination des agents pathogènes. Ces capacités aussi bien pro- qu’anti-
inflammatoiresnesontpastrèsbienélucidéeschezlesbovins.Lesneutrophilessontcapables
d’attirer d’autres cellules inflammatoires en libérant des PAF et du LTB4. La libération de
glycoprotéineacidea1endiminuantlaproductiondeROSetenstimulantlaproductionde
CXCL 8, est également modulateur de la réponse neutrophilique54,55. Les neutrophiles
exercentdeplusuneactivitésurlesautrescellulesimmunitairesdontlesmacrophagesetles
monocytes.Cesdernierssontstimuléslorsdeladégranulationdesneutrophilesbovinsavec
la production de CD31 et CD11a par lesmonocytes.De plus, des expériences in vitro ont
montréquelesmonocytesdeviennentdesmacrophagesavecunprofilM2etunelibération
accrued’IL-10etd’IL-12,etuneplusgrandecapacitédephagocytoseetdeproductiondeROS
auboutde4joursd’incubationenprésencedesproduitsdedégranulationdesneutrophiles56.
Par ailleurs, il semblerait que les neutrophiles sont capables d’intégrer des protéines
membranairesdecellulesmortes,quiconserventleurspropriétésfonctionnelles.Ceciaurait
une influencedirecte sur l’immunité adaptative car lesneutrophiles joueraientun rôlede
cellulesprésentatricesd’antigènes57.
Commedansl’espècehumaine,lesneutrophilesconstituentunpooldecelluleshautement
différenciéesdontletempsdesurvieestcourt.Cependantils’avèrequelorsd’inflammation,
cescellulessontcapablesdesurvivrepluslongtempsdanslestissusenflammés.Cecipermet
uneaugmentationdeleurpotentielantibactérienmaisproduitégalementdesaltérationsdes
tissusdel’hôte.Onobservechezlesbovinsunretarddel’apoptosedesneutrophiles,ainsi
qu’un délai de la phagocytose par les macrophages ; ceci peut avoir des conséquences
importantesquiserontdétailléesplusloin.
41
1.4 Lesmarqueursdel’inflammationchezlesbovinsParmi les différents paramètres hématologiques, le leucogramme est le moyen le plus
appropriépourévalueruneinflammationcomptetenudel’influencedelalignéeblanchelors
d’inflammation. Il permet d’obtenir le nombre de leucocytes totaux, de neutrophiles
segmentésetnonsegmentés,deséosinophiles,desbasophiles(quisonttrèspeunombreux
dansl’espècebovine),desmonocytes,etdeslymphocytes.
Lateneurend'hémoglobineestvariablementaffectéelorsd'inflammation.Lorsd'affection
chronique,uneanémiehypochromemacrocytairepeutêtreobservée.Cependant,enraison
de sa faible sensibilité et de sa faible spécificité, ce paramètre n'est pas utilisé comme
marqueurdel'inflammationchezlesbovins.Ilestaujourd‘huidifficiled’établirdessensibilités
etdesspécificitéspourladétectiond’unprocessusinflammatoirepourunparamètredonné.
Lesétudespermettentcependantdetracerdesgrandeslignesavecdesvaleursseuilschezun
animalsain.
42
1.4.1 Leucogramme
Valeurs usuelles
Onpeutretrouverlesvaleursusuellesdelaformulesanguinedesbovinsdansletableau.
Tableau3:Numérationetformulesanguinechezlebovinadulte58
Variations physiologiques
Ilestimportantdenoterquecesvaleurssontvalableschezl’adulte,alorsquechezlenouveau-
né et le jeune, on observe une variation au cours des premières semaines de vie. A la
naissance, le rapport Neutrophiles : Lymphocytes (N:L) est supérieur à 2:1 voire 3:1 ; il
43
La numération et la formule leucocytaire permettent donc souvent de s’orienter vers un type de maladie en fonction de la quantité et de la répartition des différents leucocytes. Les résultats devront être examinés en parallèle de ceux de la numération érythrocytaire et thrombocytaire, explicités dans les parties précédentes, et rappelés ici. L’ensemble de ces paramètres constitue la numération formule sanguine (tableau 2). Tab 2: Numération formule sanguine normale du bovin adulte.
Numération formule sanguine Formule érythrocytaire
Paramètres Valeurs normales Moyenne
Numération érythrocytaire (x 106 /mm3) 5 - 10 7
Taux d'hémoglobine (g /100
ml) 8 - 15 11
Hématocrite (%) 24 - 46 35 VGM (µm3) 40 - 60 52 TGMH (pg) 11 - 17 14 CCMH (%) 30 - 36 32,7
Numération réticulocytaire 0 0 Diamètre érythrocytaire (µm) 4 - 8 5,8
Formule leucocytaire
Paramètres normaux (nombre/mm3) Ecarts normaux Moyenne
Pourcentage de la population
leucocytaire (%)
Pourcentage moyen
Numération leucocytaire 4000 - 12000 8000 Neutrophiles non segmentés 0 - 120 20 0 - 2 0,5
Neutrophiles segmentés 600 - 4000 2000 15 -45 28 Eosinophiles 0 - 2400 700 0 - 20 9 Basophiles 0 - 200 50 0 - 2 0,5 Monocytes 25 - 840 400 2 - 7 4
Lymphocytes 2500 - 7500 4500 45 - 75 58 Autres
Numération Thrombocytaire 100000 - 800000 500000
C. Les groupes sanguins des bovins et leurs conséquences pratiques
1. Les différents groupes sanguins des bovins
Comme dans les autres espèces de mammifères, les groupes sanguins des bovins sont déterminés par des antigènes portés sur la membrane des hématies. Ces antigènes sont soit de nature glucidique portés par des glycoprotéines ou des glycolipides, soit de nature protéique. Ils sont codés par différents gènes, et variables selon les individus d’une même espèce.
On distingue 11 systèmes de groupes sanguins chez les bovins, représentés par des lettres (A,B,C,F,J,L,M,S,Z,R’,T’) (tableau 3). Ces systèmes sont pour certains codés par un seul gène (un seul locus bi allélique), mais certains sont codés par une combinaison de gènes situés à des loci contigus, et représentent ainsi de véritables systèmes génétiques très polymorphes. Par exemple, jusqu’à 800 combinaisons sont possibles pour le système B [4, 5, 29].
43
s'inverseprogressivementdurantlespremièressemainesdevie,enraisondeladiminution
desneutrophilescirculantsetdel'augmentationsimultanéedunombredelymphocytes.
Uneautrevariationcourammentrencontréeestcelled’unleucogrammeditdestress,comme
conséquencedel’augmentationdelaconcentrationdecortisoletd’adrénaline.Onobserve
uneaugmentationdunombredeneutrophilesetdelymphocytes,quiengénéralnedépasse
pas le double des valeurs usuelles sous l’action de l’adrénaline. Dans le cas d’une
hypercortisolémie,lesvariationssontplusmarquées.Cependantlaneutrophilieobservée,qui
peutdurerjusqu’à72heures,n’estpasaccompagnéed’unedéviationàgauchedelacourbe
d’Arneth,comptetenudel’absencedelibérationdecellulesimmaturesdepuislamoelle.A
cause de la séquestration concomitante des lymphocytes dans les tissus lymphoïdes, on
observeégalementuneaugmentationdurapportN:L.Ceciestobservénotammentlorsde
situationsdestress,d’excitationouaprèsl’exercicephysique.Fréquemmentnotéaumoment
duvêlage,laneutrophilieestsuivied’unediminutionrapidedunombredeneutrophilesdans
les48h,avantderevenirauxvaleursdebaseauboutde4à6jours.Onl’observeégalement
danslecasd’atteintesavecdesréactionsinflammatoireslégères(déplacementdelacaillette,
hypocalcémiepuerpérale,dystociesimple…)59,60.
Onretrouvebienentendudesvariationssemblableslorsdemisesbassanscomplicationsou
bienlorsd’injectiondecorticostéroïdes.
Variations lors d’états inflammatoires Commedécritauparavant,comptetenudelaparticularitédelafaibleréservedeneutrophiles,
on observe chez les bovins une neutropénie accompagnée d’une lymphopénie lors des
premièresheuresdelaréactioninflammatoire.Laséquestrationdesneutrophilesauseindu
site inflammatoire génère cependant desmessagers hormonaux à l’origine d’abord d’une
libérationdupoolderéservesousl’actiondeNRF(NeutrophilReleasingFactor),puisd’une
néo-granulopoïèse libérant des neutrophiles immatures sous l’action de G-CSF. Ainsi un
décalageàgauchedelacourbed’Arnethestgénéralementobservé24à48heuresaprèsla
neutropénieprimaire.
44
Figure7Dynamiquedelaréponseleucocytaireauxinfectionsbactérienneschezlesbovins
35,60
Lesvariationsdeproportionsentre lesdifférents typescellulairespermettentd’orienter le
diagnosticenfonctiondelarépartitionobservée.Sions’intéresseplusparticulièrementaux
neutrophiles,ladiminutiondunombredces–derniersestprésentedanslespremièresheures
de l’inflammation mais également lors de septicémie et d’endotoxémie d’origine gastro-
intestinale.Lorsdescertainesinfectionsviralesetdecanceraffectantlamoelleproductrice
(possiblement accompagnés d’une anémie aplasique), une diminution du nombre de
neutrophilescirculantsestégalementpossible.
Al’inverse,laneutrophilieestprésentelorsd’inflammationsuppuréeetelleestengénéral
plutôtdebonpronosticindiquantl’activationdelaréponseimmunitaire.Ilconvientdenoter
aumêmemomentlaprésencedemonocytescirculants,normalemententrèsfaiblequantité
(entre25et840/mm3),dontlenombrepeutêtreaugmentélorsd’uneinfectionchronique,
oubiendiminuésdefaçontransitoireenréponseàunstresscorticoïde.
Laprésencedeneutrophiles non-segmentés circulants donc immatures enparallèled’une
neutropénie,estlesigned’uneinflammationsévèreleplussouventd’originebactérienne.La
régénérationdupooldeneutrophilescirculantsparlamoelleestinsuffisanteetpermetde
89
Figure 9 : dynamique de la réponse leucocytaire aux infections bactériennes aiguës chez les bovins, d'après [221].
Figure 10 : cinétique de variation précoce des différentes populations leucocytaires saguines lors d'inoculation intrammaire expérimentale d'endotoxine d'E.coli, d'après [127].
STOCK DE NEUTROPHILES IMMATURES ET ADULTES DE LA MOELLE OSSEUSE
(envoie dans le sang un nombre limité de cellules après un délai de quelques heures)
LEUCOCYTES CIRCULANTS
Valeurs moyennes normales 8.000 mm3
Neutrophiles 2.200
Eosinophiles 700
Lymphocytes 4.600
Autres 500
Diapédèse massive au sein du foyer inflammatoire
Désintégration dans la circulation générale
(20 à 50%)
6 à 24 h
Leucopénie
± 2.000
24 h
leucopénie avec
glissement à gauche
3 à 4 jours
leucocytose avec
neutrophilie
Temps en heure
Neu
trop
hile
s sa
ngui
ns
(x10
3 / µl
) N
eutr
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ar ra
ppor
t à h
0 (N
)
Neutrophiles segmentés Neutrophiles non segmentés (B)
Lignées prolifératives (P) Neutrophiles segmentés (M) Pool de réserve (R)
45
répondreauxbesoinsdelaréponseimmunitaire.
1.4.2 LesprotéinesdelaphaseaigüeLadéfinitiondonnéepar laSociétéFrançaisedeBiologieCliniquepour lesprotéinesde la
phase aigüe (PPA) est la suivante : ce sont des protéines plasmatiques dont le taux de
production hépatique est supérieur au taux du catabolisme, au cours de la réaction
inflammatoire,quellequesoitlacausedecettedernière».Enfonctiondel’augmentationou
de la diminution de leur production pendant cette réaction, on parle respectivement de
protéinespositivesounégatives.Différentesétudesontpermisd’isolerchezlesbovinsdes
glycoprotéineshydrosolublesrépondantàcescritères:l’haptoglobine,laSAAetl’alpha1-AGP
plasmatiques.DesvaleursseuilsontétéétabliesdontcellesproposéesparEckersalletal61:
- Haptoglobine(HP):50mg/L
- SérumAmyloïdeA(SAA):9,6mg/L
- a1-glycoprotéine(AGP):0,5mg/L
On peut donc affirmer que lors de différentes affections à l’origine d’un processus
inflammatoire, une augmentation de ces paramètres au-dessus du seuil établi est observée.
Cependant pour chaque paramètre, spécificité et sensibilité varient ce qui peut en partie être
expliqué par leur nature, leurs fonctions et leur métabolisme. La Protéine C-Réactive n’est pas
considérée comme une protéine de l’inflammation aigüe chez les ruminants.
L’Haptoglobine (Hp) L’haptoglobineestunemoléculecomposéededeuxchaînespolypeptidiquesreliéesparun
pontdisulfure.L’haptoglobinealacapacitédefixerl’hémoglobinelibreainsiquesesdérivés
provenantdelalysedesglobulesrougesparapoptoseoulorsd’hémolyse.Lecomplexeformé
(Hb-Hp) est par la suitemétabolisé par lesmacrophages ou dans le foie. Cettemolécule
possèdeégalementdespropriétésanti-oxydantesindirectesparinhibitiondelaproduction
deradicauxlibrespouvantendommagerlestissusendogènes.Elleparticiperaitégalementà
l’angiogenèse, jouant ainsi un rôle direct dans la cicatrisation. Chez les bovins, sa
concentrationaugmented’unfacteurx100lorsdeprocessusinflammatoire,cequienfaitune
des protéinesmajeures de l’inflammation dans cette espèce. Chez des animaux sains, les
concentrationsenhaptoglobinesonttrèsbassesvoirenulles(<0,2mg/mL)alorsquedansdes
46
conditions morbides, notamment lors d’infections bactériennes avec un processus
inflammatoire aigu (métrite, abcès hépatique, …), les concentrations augmentent très
fortement;lamêmeobservationaétéfaitedanslesconditionsd’inflammationprovoquée
expérimentalement62,63.
Plusieurstechniquesdedosagedel’haptoglobineontétédéveloppées,dontdesméthodes
rapides et peu onéreuses pouvant être utilisées en pratique médicale 64. Cependant des
interférences sont possibles notamment lors d’hémolyse marquée avec la formation de
complexesHp-Hb en grande quantité qui vont subir lemétabolisme hépatique à l’origine
d’une concentration circulante plus faible alors qu’un processus inflammatoire évolue en
parallèleprovoquantlahaussedesaconcentration.
Les variations de la concentration de l’haptoglobine semblent très spécifiques (valeur de
spécificité supérieure à 85%et de sensibilité comprise entre (60 et 90%). La haussede la
concentrationestlerésultatdelaproductiond’IL-6etdeTNF-a60,65.
SAA Le terme de Serum Amyloïde A (SAA) regroupe un ensemble d’apolipoprotéines dont la
structureestconservéeauseindedifférentesespècesetdefaiblepoidsmoléculaire.Elleest
liéeauxHDL(HighDensityLipoprotein)defaçonphysiologiqueetsaproductionhépatiqueest
largementamplifiéeparlescytokinesinflammatoires(TNF-a,IL-6,IL-1)lorsd’inflammation.
Saconcentrationpeutsubirunehaussede100à1000foisdansdebrefsdélais66.
Lerôledecesmoléculesn’estpasentièrementélucidémaisilsembleraitqu’elleparticipeàla
régulation du métabolisme des HDL et du cholestérol. Elle jouerait de plus un rôle
chimiotactiquepourlescellulesdel’inflammationenfacilitantl’adhérencedecescellules.
Son dosage se fait principalement par ELISA indirect chez les bovins 60. Lors de processus
inflammatoires,ils’agitdelamoléculeaveclasensibilitélaplusélevée,entre80et100%et
dontlaspécificitévarieentre80et90%.Cecipeutêtredûaufaitquelaseuleinfluencedel’IL-
6suffiraitàaugmenterlesconcentrationsdeSAA65,avecparfoisdesanimauxprésentantune
élévationdutauxdeSAAalorsqueceuxdel’haptoglobinerestentinchangés.Lesvaleurssont
élevéesmêmelorsd’inflammationmodéréeainsiquelorsdestressetautresphénomènes
non inflammatoires. Pour ces raisons, il est donc important de corréler les variations
observéesaveccellesdel’haptoglobineetlecontexteclinique.
47
a1- AGP L’a1-AGPestuneglycoprotéineconstituéed’unechainepolypeptidiquedontlacomposition
enacideaminésestconnuepourl’espècebovine.Safonctionestencoremaldéterminée;elle
joueunrôledansl’hémostaseetlarestaurationdestissusconjonctifsensedéposantsurla
surface des fibres élastiques néoformées, les protégeant ainsi des conditions lytiques du
milieuinflammatoire.Sonrôleprécisn’estpasentièrementcomprismaisellestimuleraitla
croissance des fibroblastes avec également une forte action immuno-modulatrice et anti-
inflammatoire.Cerôleestdémontréinvitro.
Deskitsdedosagepar immunodiffusionradialesontdisponiblesdans lemarché.Lepicde
concentration semble se produire tardivement lors de processus inflammatoire avec des
valeurspeumodifiéesendébutd’inflammation,cequiexpliquedesvaleursdesensibilitétrès
variablesenfonctiondesétudes.
1.4.3 Myélopéroxydase
Structure et localisation Lamyéloperoxydase (MPO) est une enzyme hémique présente en concentrations élevées
danslesgranulesprimairesdesneutrophiles,représentant5%delamasseprotéiquedela
cellule. Chez l’homme, la MPO est présente également mais dans des quantités bien
moindres,dansdespopulationsdemacrophagesrésidentstelleslescellulesdeKüppferdans
lefoieouencorelamicroglie.
C’estuneenzymequiagitensynergieaveclesautresenzymesdel’explosionrespiratoire,la
NADPH-oxydase, et la NOsynthase. Cette action conjointe permet d’éliminer les
microorganismesphagocytés qui sont résistants aux enzymesprotéolytiques. Il existe une
grandesimilitudeducomportementenzymatiquedelaMPOdanslesdifférentesespècesoù
elleaété identifiée,malgréune séquenced’acidesaminésqui varie. Lesdonnées lesplus
maîtriséesconcernentlesenzymeshumainesetéquines.
Lamyéloperoxydaseappartientà la familledesperoxydasesdesmammifères,présenteen
grande quantité dans les granules primaires des neutrophiles, et dans les monocytes en
quantité plus faible. Elle est indétectable avant les dernières étapes de maturation des
macrophages. La synthèse de MPO a lieu dans la moelle osseuse au sein des cellules
48
myéloïdes.LorsdelasynthèsedeMPOhumaine,unpassagedansleréticulumendoplasmique
de la séquence immature permet une N-glycosylation de celle-ci et incorpore le groupe
prosthétiquehémiqueàFe3+donnantnaissanceàlaproMPOde90kDadepoidsmoléculaire.
L’enzymematureestobtenuesuiteaupassagedansuncompartimentpré-granulaire.L’hème
est liéparsonatomeFe(III)àdeuxhistidinesde laprotéine, l’unepar liaisoncovalenteet
l’autreparunponthydrogène.Parailleursl’hèmeprésentetroisliaisonscovalentesavecla
protéine. La protéine étant glycosylée, son poids varie entre 120 et 150 kDa, avec un pic
d’absorptioncaractéristiqueà430nmà causede sa structurehémique. Suiteàdifférents
signaux(liaisondeTLR,GM-CSF,TNF-a…),laMPOpeutêtrelibéréepardégranulationoubien
parapoptoseounécrosecellulaire67,68.
Figure8:StructuredunoyauhémiquedelaMPOhumaine
69
Rôle biologique LaMPOestuneenzymeclédanslerôlededéfensedesneutrophilesdansl’immunité.La
MPOpossèdeuneactivitéperoxydaseetdechlorationlibérantdel’acidehypochloreuxHOCl
ou bien des acides hypo-halogénés à partir d’ions bromure ou iodure. Son activité de
chlorationcréedesagents intermédiaireshautementréactifsconduisantà la formationde
dérivéschlorés.Différemmentdesautresperoxydases,laMPOesttrèsréactivesoussaforme
naturelleMPO–FE(III)donnantunintermédiairelui-mêmehautementréactifCdIdecourte
duréedeviequiréagitavecCl-afindedonnerl’ionhypochloreuxetrestituerlaMPO-Fe(III).
49
• Activitédechloration
MPO-Fe(III)+H2O2<--->CdI+H2O��
CdI+Cl-+H+--->MPO-Fe(III)+HOCl�
CdIpeutparailleursréagiravecunsubstratréducteurDHpourformerCdIIpossédantune
structurehémiqueàFe(IV)etunproduitoxydéradicalaireprovenantdeDH.Enréagissant
avecunnouveauréducteur,CdIIrestituelaMPO-Fe(III)enformantundeuxièmeproduit
oxydéradicalaire.Lesproduitsoxydésradicalairespeuventdiffuseretconduireàla
formationdeproduitsactifsdelipoperoxydationàpartirdedifférentsréducteurstelsque
lesnitrites(NO2-),l'ascorbate,l'urate,lescatécholamines,lesœstrogènes,lasérotonineet
latyrosine.
• Activitéperoxydase
MPO-Fe(III)+H2O2--->CdI+H2O��
CdI+DH--->CdII+D•+H+��
CdII+DH--->MPO-Fe(III)+D•+H+�
DesconcentrationsmaximalesenH202etenCl-sontnécessairesafind’optimiserlaproduction
d’ionhypochloreuxetainsiéviterlaformationdeCdII(etd’ionsuperoxyde)àpartirdeCdIqui
réagitavecH202ainsiquelaformationdeCdIparréactiondelaMPOavecHOCl.
Deplus,laMPOpeutréagiravecdesréducteurs(dontO2-°)afindeformerCdIIIinactif.Cette
réactionrestetoutefoisréversibleetpeutseproduireendébutdephagocytoselorsquelepH
àl‘intérieurduphagosomeestalcalinoubienneutre,favorisantainsil’actiondelaNADPH-
oxydase avec une MPO quiescente. Lorsque le pH se rapproche du pH optimal de
fonctionnement de la MPO, c’est-à-dire pH=5,5, CdIII libère à nouveau de la MPO-Fe(II)
naturelle.
• FormationduCdIII
MPO-Fe(III)+substratréd.--->MPO-Fe(II)(CdIII)+substratoxydé
MPO-Fe(II)+O2--->MPO-Fe(II)-O2�
Toutefois,uneinactivationirréversibledelaMP–Fe(III)parHOClestpossible,cequilaisse
supposerunmécanismed’autorégulation.
50
Ainsi pH, productiondeO2-°avec formationdeH202, concentrationdeCl- dans le plasma,
concentrationsenréducteursetenmonoxyded’azotevontbalancerdefaçoncomplexeles
différentesréactionsdelaMPOauseinduphagosome.
Lamyéloperoxydasevadoncpermettredeformerdifférentesespècesoxydantes.Commecité
précédemment,l’acidehypochloreuxestleprincipalproduitdel’enzyme,ilagitcommeun
puissantbactéricideàl’intérieurduphagosomedanslequelilestformé,etvapermettrede
nombreuses réactions dans le milieu extracellulaire. La MPO sera ainsi responsable
directementdelaproductiondenombreusesmoléculesoxydantesparticipantàladéfensede
l’hôte. Il est intéressant de noter que ce sont ces espèces qui seront responsables de la
chimioluminescenceobservéelorsdelastimulationdesneutrophilesinvitro.
Figure9:ProduitsformésparactionoxydantedeHOCletréactionsd'HOClavecd'autresespècesactivéesdel'oxygèneetde
l'azote.67
L’activité principale de laMPOdécrite pour l’enzymehumaine est principalement un rôle
antimicrobien au sein des phago-lysosomes des neutrophiles. Les granules spécifiques
51
contenant la NADPH-oxydase sont les premiers à fusionner et à relarguer leur contenu
enzymatique.Lecontenudesgranulesazurophiles (dont laMPO)estdéverséaprès fusion
membranaire dans un deuxième temps, formant alors de nouvelles espèces activées.
L’activité de laMPO s’intensifie avec l’acidification dumilieu. LaMPO agit sur une large
gammedemicroorganismesparoxydationdedifférentsproduitsetdifférentsmécanismes.
La fixationsurdesstructurespolysaccharidiquesde lamembranebactériennepermetà la
MPOuneattaqueextracellulairedemicroorganismescommelesparasitesetleschampignons
trop volumineux pour être phagocytés, et qui sont souvent résistants aux enzymes
protéasiquesethydrolytiques.Enoxydantdifférentesstructuresenzymatiques,laMPOpeut
induirerapidementlamortcellulaire.
MalgréuneforteconcentrationdelaMPOaucontactdirectdesagentsinfectieuxauseindu
compartimentintracellulairequ’estlephagolysosome,unepetitequantitédel’enzymepeut
êtredéverséedanslemilieuextracellulaire,notammentlorsd’inflammationsévère.Eneffet
lorsquelesneutrophilesprocèdentàunedégranulationexacerbéeoulorsqu’ilsdeviennent
apoptotiques, une action toxique locale est prévisible. Malgré une inhibition des effets
délétèresdelaMPOparl’albumine,lacéruloplasmineouleslipoprotéinesdefaibledensité
quisontplussensiblesauxeffetsoxydantsdelaMPO,deslésionsdestissusendogènessont
fréquentes.Deplusils’agitd’uneinhibitionquiestréversible.LaMPOestcytotoxiquepour
leshématiesainsiquepourlescellulesendothélialeset lesfibroblastes;cesdeuxderniers
pouvantl’internaliserlorsdeladégranulationdesneutrophiles.ParailleurslaMPOpossède
lacapacitéd’oxyderlesneutrophilesdel’hôtemême.
LaMPOpeutégalementagirdirectementouindirectementdanslatransductiondessignaux
de l’inflammation en interférant dans la cascade des protéines kinases et au travers du
médiateurNF-kB.Ellepeutavoiruneffetbénéfiqueounéfasteselonl'endroitetlemoment
oùseproduitlaréactioninflammatoire.
Libérée au sein du site inflammatoire, la MPO est à l’origine de la formation d’espèces
oxydantesdiffusiblesquivontavoiruneactivitésurlesvoisinesalentour.EnsynergieavecCl-
et H202, la MPO perturbe les fonctions de prolifération, de production d’anticorps et de
cytolysedeslymphocytesT,BetNK(NaturalKiller)enfonctiondunombredeneutrophileset
dupotentielantioxydantdel’environnement.Parinteractionavecdesmacrophages,laMPO
peutégalementinduirelaproductiondecytokinespro-inflammatoirestellesqueTNF-aetIL-
52
1. Ces cellules ont également un potentiel oxydant accru vis-à-vis desmicroorganismes à
capsulespolysaccharidiquesrésistantesauxprotéases.
Parailleurs,laMPOpeutégalementavoiruneffetlimitantsurlaréactioninflammatoireen
diminuant le potentiel de phagocytose des neutrophiles par oxydation des récepteurs
membranaires.
Desdérégulationsdel’activitéoxydantedelaMPOsontliéesàdifférentesmaladiestellesque
lamaladied’Alzheimeroul’athérosclérosechezl’homme70.Desmutationsgénétiquesdans
l’espècehumainesontconnuescommeétantà l’originededéficitsenMPOsanstoutefois
provoquer des signes cliniques, car in vitro les neutrophiles présentent une explosion
respiratoireetuneactivitéphagocytaireaccrues.Cesaltérationsconduisentàunesensibilité
accrueauxinfectionsfongiques.
Onpeutdoncémettrel’hypothèsequelaquantificationdeMPOpermettraitd’estimer
l’intensitédurecrutementetdel’activationdesneutrophilesetdoncindirectement
l’importanceduprocessusinflammatoiredansletissuoùilapparaît.
Techniques de mesure et lien avec la quantité de neutrophiles
Plusieurstechniquespourquantifierlerecrutementetl’activationdesneutrophilesontété
décrites permettant de mesurer la concentration de MPO chez l’homme ou le cheval.
Cependant laconcentrationenzymatiquen’estpasproportionnelleà l’activité,car ilexiste
plusieurs inhibiteurs endogènes de son activité. Il serait donc plus intéressant de pouvoir
exprimerl’activitéafind’estimerlasévéritédelaréactioninflammatoire.Cependantiln’ya
pasdeconsensussurlaméthodelaplusfiablecomptetenudesdifférentssubstratsutilisés
(Tétraméthylbenzidine (TMB),dianisidine,guaiacol)quine sontpas spécifiquesde laMPO
maisdetouteactivitéperoxydasique.Ilestimportantdenoterquel’hémoglobineainsiquela
myoglobine possèdent une activité peroxydasique, ce qui peut directement influencer les
mesures71.L’activitéperoxydasiquedelaproductiondeH202etparchimioluminescence72.
D’aprèsPullietal.73différentestechniquessontutiliséesafindemesurersoitlaprésencede
MPOousonactivité souventdans l’objectifdequantifier laprésencedeneutrophiles. Les
sondes majoritairement utilisées pour mettre en évidence la présence de MPO sont la
53
dianisidine,leTMBsuividel’AdénosineDiphosphatehydrogénase(ADPH)etlataurine.Ace
jour,aucuneétudecomparantlesdifférentestechniquesentreelles.
Afindes’affranchirdesinterférencesavecd’autresmoléculesàactivitéperoxydasique,Pulli
etsonéquipeontproposéuneméthodededosageavecdesanticorpsanti-MPOquid’après
leursrésultats,estfidèleetreproductible,ainsiqued’unebonnesensibilité;elleestcapable
dedétecterlaproductiondeMPOàpartirde500neutrophiles.Parallèlement,lafixationde
la MPO par des anticorps augmenterait la spécificité des dosages. La corrélation entre
l’activitédelaMPOdanslescompartimentsintracellulairesetlaquantitédeneutrophilesa
étémontré.
54
2 Analysesystématiquedesmoléculesspécifiquesdesneutrophiles
2.1 Introduction
L’identificationetlaquantificationdescellulesinflammatoiresdanslesangpériphériqueainsi
quedans les tissussontétudiéesdepuisplusieurscentainesd’annéeset sontcorréléesau
conceptmêmede lathéoriecellulaire.L’analyseminutieusedecesprélèvementsapermis
toutd’abordd’identifierdifférentesfamillesainsiquedespatternsdeprésenceconsidérés
physiologiqueschezdespatientssains.Ledéveloppementdelacytologiecliniqueainsique
de l’hématologie cliniqueapermisdedétecterdevariationsanormalesdans les contenus
cellulairesetleurrépartition.Ceciaaboutiàunemeilleurecompréhensionmédicalesurles
processusphysiopathologiquesd’infiltrationcellulaire, leurévolutionaucoursdutempset
leursréponsesàdestraitements.
Historiquementdifférentestechniquesontserviàidentifieretàclasserlestypescellulaires,
que ce soit sur la basede leurs propriétés physico-chimiques, immunologiquesouencore
fonctionnelles.Deuxtraitscaractérisentlesgranulocytesneutrophiliques:leurcourtedurée
devie,avecunemoyennede5joursàpartirdumomentoùilsquittentlamoelle,ainsique
leurfaiblecapacitédesynthèseprotéiqueunefoisarrivésàmaturation.Depuislamaîtrisede
lafabricationd’anticorpsdirigéscontredesépitopesprécis,l’immunomarquageaétéutilisé
dans l’identificationdesneutrophilespour lesdistinguerdesautres leucocytes.Différentes
méthodes de séparation et d’identification des neutrophiles ont permis d’étudier leurs
caractéristiquesetleurparticipation,ainsiquelacinétiquederecrutement,lorsdelaréponse
inflammatoire.Traditionnellement,leprotocoledeséparationdesneutrophilesreposesurla
techniquedesédimentationafindelesisolerdurestedescellulescirculantesdanslesang.La
technique décrite par Ferrang et Thong repose sur une différenciation en couche des
différentstypescellulairesprésentsdanslesang,sicettetechniqueestutilepourpurifierles
cellulesàpartirdusang,elleestd’uneutilitémoindredanslaquantificationdesneutrophiles
présentsdanslesautrestissus.
55
2.2 MatérieletméthodesNousavonsprocédéàuneanalysesystématiquedespublicationsportantsurledifférentes
méthodespubliéesd’analysedesneutrophilesprésentsdanslestissus,endehorsdel’analyse
histologique.
Labasededonnéesestreprésentéeparlalittératureaccessibleenlignenotammentsurdes
sitesspécialiséstelPubmed,ScienceDirectetGoogleSchoolar.Lesarticlesrecenséssontdes
articles en langue anglaise publiés dans des revues spécialisées. Afin de concentrer nos
recherchessur les techniques lesplusrécentes,nousavonssélectionné lesarticlespubliés
entre 1990 et 2018. Les termes utilisés pour la sélection des articles ont été :neutrophil
quantification, polynuclear neutrophil biomarker, inflammation quantification, determining
neutrophilsintissue,neutrophilsELISAquantification,cytometryquantification.
Lesarticlesrépondantàcescritèresderechercheontététriésdansunpremiertempsàpartir
de la lecture du résumé afin de s’assurer qu’il s’agissait bien de descriptions techniques
portantsur lesneutrophileshumains,murinsoubovins,etqu’ils traitaientdirectementou
indirectement des méthodes de quantification des granulocytes neutrophiliques dans les
tissus au sens large, aussi bien les fluides biologiques (dans lesquels les cellules sont en
suspension)que les tissusorganisés, que lesneutrophilesont infiltré.Au final, les articles
remplissant ces critères ont été étudiés afin d’extraire les informations relatives aux
techniques d’identification des neutrophiles. Toutes les références supplémentaires
identifiéesaucoursde la lecturedesarticlesprécédemment sélectionnésontété incluses
dansl’étudeetanalyséesdefaçonanalogueàcequenousavonsprécédemmentdécrit,afin
derecueillirdesarticlesquiauraientéchappéàlarechercheavecdesmotsclés.
Parfois différents articles ont été retenus pour une même approche technique car les
méthodes étaient sensiblement différentes. Ce choix permettait généralement d’apporter
uneprécisionoudesinformationssupplémentairessurlatechniqueenquestion.
56
2.3 RésultatsNospremièresrecherchesaveclesmoyensdécritsnousontfaitaccéderàplusde600articles
parmi lesquelsnous avons toutd’abord sélectionné ceuxqui s’intéressaient à l’infiltration
neutrophilique spécifiquement dans l’inflammation. Beaucoup d’articles de recherche
cliniques’intéressentàlanétoseetàlamanièredelaquantifier,maisnousavonsexclusces
articlescarlatechniquenepermetpasdequantifierlescellules,etilsnerépondaientdonc
pasauxobjectifsdenotreétude.
Initialement,44articlesontétéséparéspourlecturedont28ontétéretenusetcomparés.
Les articles analysant des techniques décrites antérieurement et parfois adaptées afin de
prouverlacorrélationdemaladiesspécifiquesdanscertainsorganeschezl’homme,ontété
supprimés de notre étude. De même, toute étude de la réponse inflammatoire qui ne
s’intéressaitpasauxaspectscellulairesetlaréponseauxstimuliinflammatoiresaétéécartée.
Deplus, lesétudescorroborantdes résultatsdéjà rapportésparunautrearticleavecune
méthode identique n’ont pas été retenus à la faveur des études originales. En effet nous
n’avonspaslafinalitédedéterminerprécisémentlesvoiesmoléculairesdel’inflammationdes
organeslorsd’affectionsspécifiques;cependantlorsquetoutmarqueuroriginalaétéproposé
dansdetellesétudes,quenousavonsjugéexploitabledansladétectiondesneutrophiles,la
méthodeaétéanalyséeetinclusedansnotreétude.Aufinal,28articlesontétéretenuset
analysés.
2.3.1 Méthodesdécritespourlesespècesmurineethumaine:Chez les espèces étudiées, différents milieux ont servi de support à la recherche des
neutrophiles.Ainsienfonctiondumilieubiologique,lesméthodesvarient.Eneffetlorsque
lesneutrophilessontlibresdansunmilieuliquide,commelesang,lesexsudatsinflammatoires
ou bien le liquide articulaire qui peuvent être le site d’une infiltration neutrophilique, ou
encoredansdestissusorganisésinfiltrés.
Ainsidanslepremiercas,lescellulessontaisémentaccessibles.Parlareconnaissanced’un
marqueurdesurfacedescellulesilestpossibledelesidentifieretlesdénombrer.Ilsuffitpour
celadegénérerunligandspécifiqued’untelmarqueur,postérieurementdistinguable.
57
Cependant lors de l’analyse de tissus organisés et solides, il n’est pas possible d’aller
directementaucontactdescellulesinfiltréesauseind’uncompact.Pourcelailconvientde
défaire la structureorganisée.Encassant les tramesextracellulairesqui relient lescellules
entreellesainsiquelesliaisonsintercellulaires,ilyaatteintedesmembranescellulairesqui
sontalorsplusdifficilementanalysables.Cecirenddoncnécessaireuneméthodededétection
qui puisse relier les concentrations d’un biomarqueur contenu uniquement dans les
neutrophilesaunombredeneutrophilesprésents.Ainsil’analysed’uncomposantmoléculaire
d’unbroyatdetissupermettraituneanalyse indirectede lacompositioncellulaireetde la
proportiondeneutrophiles.
Automatisation avec coloration Giemsa
Le dénombrement microscopique se fait à l’aide des différences morphologiques qui
distinguentlesneutrophilesdesautrestypesdeleucocytes.Cecomptagesefaitàpartirdes
frottis de sang périphérique suite à une coloration. Le traitement est particulièrement
chronophage, dépendant de celui qui l’exécute, et dès est susceptible d’erreur non
négligeable. De plus, les différentes techniques de coloration et la variation du temps
d’expositionpourchaquetypedecolorationcauseunevariabilitémarquéedel’intensitéde
couleur de chaque compartiment subcellulaire et la possibilité de confusion entre types
cellulaires.C’estpourquoidesméthodesdedéterminationautomatiséesavecdesprotocoles
biendéfinissontrecherchées,telestlecasdesrecherchesdeAhmghalanetal(2009)74afin
de mesurer automatiquement les différents types cellulaires sur un frottis à l’aide d’un
algorithme.Enanalysantaumicroscopeélectroniquereliéàunecaméradigitale,deslames
ayantsubiunecolorationauGiemsa,ilsparviennentàdétecterlesnoyauxplurilobésdepar
leur coloration de plus forte intensité et de les séparer des autres lymphocytes par leur
proximité inférieure au diamètre d’un leucocyte. Ils parviennent ainsi à quantifier les
neutrophilesobservéssurlesfrottissanguinsavecuneprécisionrapportéede96%.
Les protéines membranaires de surface
Pourl’identificationdesneutrophilesselondifférentesméthodes,ilconvientdeconnaîtredes
protéinesmembranaires spécifiques des cellules neutrophiles, et ce afin de produire des
anticorpscapablesdelesreconnaitre.
58
Parmilestechniquesdequantification,l’immunohistooucyto-chimietellequelacytométrie
defluxsontutilisées.
Lacytométriedefluxmesurelafluorescenceetladiffusiondelalumièreàtraversdescellulesensuspension.Cetteméthodepermetd’analyserlespropriétésdescellulesenlesexposantàun faisceau laser après séparation dans un liquide de gaine. Des capteurs permettentd’analyser lespropriétésde la lumièrediffractéeetcelleémisepar lescellulesafind’enendéduire les propriétés physiques (taille et complexité cellulaire interne). De plus, lareconnaissance à l’aide d’anticorps spécifiques de protéinesmembranaires, couplés à desmarqueurs fluorescents, permet de discerner différentes populations de cellules. Ainsi,plusieursétudesontdécritladéterminationdesprotéinesspécifiquesdesneutrophiles75.
Figure10:Schémad'uncytomètredeflux75
DNA Content AnalysisThe measurement of cellular DNA content by flow cytom-etry uses fluorescent dyes, such as propidium iodide, thatintercalate into the DNA helical structure. The fluorescentsignal is directly proportional to the amount of DNA in thenucleus and can identify gross gains or losses in DNA.Abnormal DNA content, also known as “DNA contentaneuploidy”, can be determined in a tumor cell population.DNA aneuploidy generally is associated with malignancy;however, certain benign conditions may appear aneuploid(7–12). DNA aneuploidy correlates with a worse prognosisin many types of cancer but is associated with improved
survival in rhabdomyosarcoma, neuroblastoma, multiplemyeloma, and childhood acute lymphoblastic leukemia(ALL)1 (11, 13–16). In multiple myeloma, ALL, and myelo-dysplastic syndromes, hypodiploid tumors cells portend apoor prognosis. In contrast, hyperdiploid cells in ALL havea better prognosis (11, 13). For many hematologic malignan-cies, there are conflicting reports regarding the independentprognostic value of DNA content analysis. Although con-
1 Nonstandard abbreviations: ALL, acute lymphoblastic leukemia; PNH,paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; and RBC, red blood cell.
Table 1. Common clinical uses of flow cytometry.Field Clinical application Common characteristic measured
Immunology Histocompatibility cross-matching IgG, IgMTransplantation rejection CD3, circulating OKT3HLA-B27 detection HLA-B27Immunodeficiency studies CD4, CD8
Oncology DNA content and S phase of tumors DNAMeasurement of proliferation markers Ki-67, PCNAa
Hematology Leukemia and lymphoma phenotyping Leukocyte surface antigensIdentification of prognostically important subgroups TdT, MPO
Hematopoietic progenitor cell enumeration CD34Diagnosis of systemic mastocytosis CD25, CD69Reticulocyte enumeration RNAAutoimmune and alloimmune disorders
Anti-platelet antibodies IgG, IgMAnti-neutrophil antibodies IgGImmune complexes Complement, IgG
Feto-maternal hemorrhage quantification Hemoglobin F, rhesus DBlood banking Immunohematology Erythrocyte surface antigens
Assessment of leukocyte contamination of blood products Forward and side scatter, leukocytesurface antigens
Genetic disorders PNH CD55, CD59Leukocyte adhesion deficiency CD11/CD18 complex
a PCNA, proliferating cell nuclear antigen; TdT, terminal deoxynucleotidyltransferase; MPO, myeloperoxidase.
Fig. 1. Schematic of a flow cytometer.A single cell suspension is hydrodynamically focused withsheath fluid to intersect an argon-ion laser. Signals arecollected by a forward angle light scatter detector, a side-scatter detector (1), and multiple fluorescence emissiondetectors (2–4). The signals are amplified and converted todigital form for analysis and display on a computer screen.
1222 Brown and Wittwer: Flow Cytometry
59
Fungetal(2011)76ontpubliéunrécapitulatifdesantigènesconnusenfonctionpourl’
homme.
Tableau4:RécapitulatifdesAntigènesNeutrophiliqueshumainsetleurscaractéristiquesd'aprèsFungetal.(2011)76
Desmarqueursde la lignéemyéloïdeont étéproposéspar Lagasse et al. (1996)77 afin de
séparerneutrophilesetmonocytesdesautrestypesleucocytaires.Enutilisantdeuxanticorps
Gr-1etMac-1quireconnaissentdesépitopesmembranaires,spécifiquesdesneutrophileset
des monocytes, respectivement, la cytométrie de flux permet de distinguer les deux
populationsdont lesneutrophiles,etainside lesquantifieravecunmarquage fluorescent
préalable.Ceciaétéfaitdansdestissusmurinsnotammentlesang,lesponctionsdemoelle
osseuseetdesfractionsderatebroyée;cetteidentificationaétéconfirméeenmicroscopie
électronique. Cette étude a notamment permis de relever que l’expression de Gr-1
augmentaitàlasurfacedesneutrophilesaucoursdeleurmaturation,dansunpremiertemps
danslamoelleosseuseetensuitedanslacirculationsanguineetdanslarate.
[35]. In the German population, the HNA-3a antigen fre-quency is 97%, with gene frequencies of 0Æ792 and 0Æ207for HNA-3a and HNA-3b, respectively [35]. Antibodies toHNA-3a are implicated in immune neutropenia [36,37], butin the last two decades have gained notoriety for theirinvolvement in severe and often fatal TRALI events [38–41]. These antibodies are predominantly leucoagglutinat-ing, causing bulky cellular aggregates in vitro by bindingto neutrophils via their F(ab) ends [34]. This may echo theirin vivo behaviour and explain their association with themost severe TRALI reactions. Consequently, these antibod-ies are best detected using the granulocyte agglutinationtest (GAT) [42].
HNA-4a is located on the aM subunit (CD11b) of theC3bi receptor (CD11b ⁄CD18) and is expressed on granulo-cytes, monocytes and natural killer cells (Table 1) [43,44].HNA-5a is located on the aL (CD11a) subunits of the LFA-1complex, expressed on all leukocytes [44,45]. Antibodies toboth HNA-4a and HNA-5a were originally identified in serarespectively from a multiparous blood donor [43] and amulti-transfused male patient [45] indicating that the anti-gens are immunogenic. However, the clinical relevance ofantibodies to these antigens is still unclear in spite of thefunctional importance of their carrier glycoproteins. HNA-4a and HNA-5a antibodies have not yet been implicated intransfusion reactions, although ANN cases have been asso-ciated with each antigen [46,47].
InvestigationThe most widely used, accredited approach for detectingneutrophil-reactive antibodies is the combined use of thegranulocyte immunofluorescence test (GIFT) and GAT. Both
of these techniques have recently been described in detail[48]. In the GIFT, antibodies binding to neutrophils arelabelled with a conjugated anti-human globulin which canthen be visualized either by fluorescence microscopy ormore usually, using flow cytometry [3,49]. GAT reactionsrely upon a very different principle, because they dependon the ability of IgG antibody to sensitize and stimulateneutrophils, which results in migration to and agglutina-tion of adjacent neutrophils [50]. Thus, viable and func-tional neutrophils are critical to successful GAT results.Results from the International Granulocyte ImmunobiologyWorkshop have repeatedly demonstrated that the GAT isvital for the effective detection of antibodies to HNA-3a[42].
The fact that neutrophils live only for 6–8 h and arefragile, make it essential that fresh blood is used for neutro-phil isolation. The principle of neutrophil isolation is thatunwanted cell types are physically separated and removed,leaving behind a purified, functional pool of neutrophils[3,51,52]. In our laboratory, we centrifuge EDTA or citratedwhole blood (1000 g for 10 min) and remove platelet-richplasma. Dextran (5% solution) is mixed with the remainingleucocyte-rich mixture and this is incubated at 37!C for30 min at an angle to promote rapid red cell sedimentation.The leucocyte-rich plasma is then transferred into a freshconical tube, and underlayed with 1Æ077 and 1Æ114 densitygradient solutions. After centrifugation at 1600g for15 min, remaining red cells sediment at the bottom of thetube, granulocytes are retained at the lower gradient inter-face and mononuclear cells are retained at the top gradientinterface. Harvested granulocytes are washed with bufferprior to their use in the GIFT, GAT or monoclonal antibodyimmobilization of granulocyte antigen (MAIGA).
Table 1 HNA systems and their characteristics
Ag System HNA-1 (15-25) HNA-2 (26-33) HNA-3 (34-42) HNA-4 (43,44,46) HNA-5 (44,45,47)
Ag HNA-1a HNA-1b HNA-1c HNA-2a HNA-3a HNA-3b HNA-4a HNA-5a
Old nomenclature NA1 NA2 SH NB1 5b MART OND
Gylcoprotein(Cluster)
FccRIIIb (CD16b) gp 50-64 (CD177) CTL-2 (undefined) aM (CD11b) aL (CD11a)
Anchor ⁄ link glycosyl-phosphatidylinositollink (GPI)
GPI transmembrane transmembrane transmembrane
Expression Neutrophils Neutrophils(monocytes ofpregnant women)
Neutrophils, granulocytes,monocytes, lymphocytes,platelets, kidney, placentaltissue, spleen, lymph nodetissue, endothelial cells
Granulocytes,monocytes,T-lymphocytes
Granulocytes,monocytes,lymphocytes
Neutrophil antigen and antibody investigations 383
" 2011 The Author(s).ISBT Science Series " 2011 International Society of Blood Transfusion, ISBT Science Series (2011) 6, 381–386
60
Lacytométriedefluxestdevenueuneméthodeubiquiste,performanteetrapidedemesure
de la concentration des neutrophiles dans le sang. La maîtrise de différents marqueurs
membranairesapermisaussidedifférencierlesneutrophilesparmilesleucocytesainsique
desuivreleurdifférenciationaucoursdeleurdéveloppement.
Lesneutrophilesmurinspossèdentdegrandesquantitésdeprotéinesmembranairesde la
familledeLy6B,Ly6CetLy6G,commerapportéparP.Y.Leeetal(2013)78.Ils’agitdeprotéines
dontlerôlen’estpasencoreentièrementcomprismaisdontonestimequ’ellesparticipentà
lamigration. Ly6Bestplusparticulièrementexprimée sur les cellules au seinde lamoelle
osseuse et sur les neutrophiles circulants, mais également à la surface des monocytes
immatures.Ils’agitdoncd’unmarqueurutiledesneutrophilesencombinaisonavecF4/80;
CCR2,etCD11b,pourdifférencierlesneutrophilesdesmonocytes.
Ly6C est également présente sur les neutrophilesmais aussi sur différentes cellules de la
lignéeblanche;elleestprincipalementutiliséecommemarqueurdesmonocytes.Roseetal
(2014)ontproposéd’utiliser lemarquageavecLY6Get LY6Cpour identifierde façonplus
fiablelesneutrophiles79.
Ly6G ayant été démontrée comme une protéine exclusivement présente chez les
neutrophiles, elle a étéutiliséepar J.Daley et al. (2008) 80 pour enlever la productionde
neutrophileschezdessouris,confirmantainsilaspécificitévis-à-visdesneutrophiles.
Laquantificationdel’évolutiondel’expressiondeCD11baétéétudiéelorsdel’activationdes
neutrophiles et desmonocytes pendant l’inflammation. Il est difficile de séparer les deux
typescellulairesuniquementsurlabasedel’expressiondeCD11b;enoutre,sonexpression
nepermetpasdequantifieraveccertitudelaquantitédeneutrophilesactivés.AinsiNicholson
et al (2007) ont utilisé la cytométrie de flux pour analyser les neutrophiles dans le sang
périphérique afin de mesurer l’évolution de l’expression de CD11b lors d’activation par
chimiokineschezdespatientssainsetdepatientsatteintsdemaladiepulmonaireobstructive
chronique81.CD11betCD18sontdesmoléculesb2intégrines,quiparticipentàl’adhésion
auxprotéinesdesurfacedel’endothéliumvis-à-visdesquellesdesanticorpsspécifiquessont
disponibles.Demême, l’expressionde la L-sélectine (CD62L)à la surfacedesneutrophiles
permetdemesurerl’activationdesneutrophilesdefaçonindirectemaiségalementlacapacité
d’adhésionauxcellulesendothéliales,commemontréparMarshalletal(1997)82.
61
CependantBatemanetal(1993)ontdécritqueleniveaudebased’expressiondeCD11bet
CD18 ne permettait pas de définir avec précision l’activation des neutrophiles lors de
stimulationinflammatoirechezdesindividusmalades83.
Chezl’homme,plusieursanticorpsdirigéscontreCD35,CD16,CD64,etCD87,ontétéproposé
en association pour étudier la maturation des neutrophiles, en comparant la présence
séquentielle de ces molécules au cours du développement neutrophilique et permettant
mêmed’identifierdesanomaliesdelamaturationdesneutrophiles.Ilconvientdenoterque
lors de cette étude les auteurs se sont intéressés à la corrélation entre l’expression des
marqueursencytométriedefluxetledénombrementmanuelsurlameeffectuéenparallèle
pardesobservateurs.Ilsontdécritdescorrélationsstatistiquesentrelaproportiondesjeunes
neutrophiles«bandcells»avecl’expressiondesmarqueursdeCD16etCD35.Ladifférence
estplusgrandeencequiconcerne lesneutrophilessegmentés,mais ilyaégalementune
différencemarquéeentrelesdifférentsobservateurs84.
Les molécules intracellulaires Desmoléculesprésentesdanslesgranulesdesneutrophilesontétédoséesdansleplasma
afin d’établir si leurs concentrations étaient corrélées avec le nombre de neutrophiles
circulants. Lors de la dégranulation des neutrophiles, des contenus intracellulaires sont
déversés dans le milieu extérieur. Compte tenu du faible potentiel de synthèse des
neutrophiles,ilestpossibledelesdosersoitenstimulantlescellulesàladégranulation,soit
endéstructurantleurmembranecellulaire.
Sorensenetal(1997)85ontdéveloppéuntestELISAafindedoserlahCAP-18,unecathélicidine
présente dans les granules spécifiques des neutrophiles humains. Ils ont montré une
corrélationpositiveentre laquantitédeneutrophiles circulantset laquantitédehCAP-18
plasmatique,malgrélaprésenced’unequantitébasaledecetteprotéinedansleplasma,qui
estd’origineinconnuemaistrèsvraisemblablementd’originenonneutrophiliqueetmyéloïde.
Desétudesprécédentesavaientdéjàpermisdemontrerunerelationentrel’élastase
circulanteetlaquantitédeneutrophilesdansdesinfiltratscutanés.AinsiLammersetal
(1986)ontreliélaquantitéd’élastaselibéréeaunombredeneutrophilesinfiltrésdansdes
extraitsdepeaud’humainparimmunofluorescence86.
62
L’étudedelaquantitédelipocaline2associéeàlagélatinaseneutrophiliqueaégalementété
proposéecommeprotéineaigüedel’inflammation,carelleestsécrétéeparlesneutrophiles
humains.Laquantitésériqueaugmenteenfonctiondel’étatd’activationdesneutrophiles.Il
s’agitdoncd’unemoléculeintéressantedanslesétudesconcernantl’inflammationrénaleet
articulairechezl’homme.EllepeutêtredoséegrâceàuntestELISA87.
Deslipocalinesassociéesàlagélatinaseneutrophilique(NGAL),quisontdescollagénasesde
type IV libéréespar lesneutrophileshumains,ontétéétudiées chezdes sujets sains.Une
étudequantitativedelacollagénaseprésentedanslesgranulesazurophiliquesaétéréalisée
etuntestELISAaétéproposéparKjeldsenetal(1996)88.Lesauteursontconcluàl’absence
decorrélationentre lenombredeneutrophileset le tauxdegélatinasemesuréedansdes
échantillonsdesangchezlessujetssains.Cependant,unecorrélationétaitprésentechezdes
patientsatteintsde lymphomenon-Hodgkinien.Lagélatinaseserait liéedefaçonfidèleau
nombredeneutrophilescirculants,sansinterférencedel’activitémyéloïde88,89.
Parmi lesmoléculescandidatesprésentesdans lesvésiculesdesneutrophileson trouve la
myélopéroxydase,quiestégalementexpriméeparleséosinophilesalorsqu’elleestabsente
dans lesmacrophages.Brownetal (2001)90avaitmontrépar immunohistochimie,que les
cellulesdeKupferainsiquelesmacrophagesrésidentsdanslefoieexprimaientégalementla
MPO. Cependant, des études plus récentes ont investigué cette possibilité à l’aide de
différentestechniquescommel’immunohistochimie,leWesternBlotetlaRT-PCRdansdes
échantillonsdefoiemurinssainsouavecdeslésionsinduitesparunesurchargealcoolique,
ainsiquedansdeséchantillonsdefoieléséshumainsavecdeslésions.Lesauteursn’ontpas
conclusuruneoriginestrictementhépatiquedelaMPO91.
Dansdesessaisutilisantdesmodèlesanimaux, laMPOestunmarqueurdel’inflammation
trèssensibleetprécocecarilestprésent24heuresavantquelenombredeneutrophilessoit
augmentéetqu’ilspuissentêtredétectésenhistologie92.Onretrouvedanslalittératuretrois
techniquesdedosagedel’activitéperoxydasiquedontlaspécificitéetlasensibilitéontété
rapportées:
- La chimioluminescence dépendante du luminol à pH acide, spécifique de la
myéloperoxydase (MPO) des neutrophiles et dont l’activité a été corrélée à la
quantitédeneutrophilesdansdestumeurs93
- L’activité péroxydasique révélée avec de l’Adénosine Diphosphate Hydrogène
(ADPH)l’ADPH
63
- L’activitédechlorinationavecdel’acide2-[6-(4ʹ-hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-
on-9-yl]benzoïque(HPF)etdel’acide2-[6-(4ʹ-amino)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-
yl]benzoique(APF),) dont le différentiel de signal représenterait spécifiquement
l’activitédelaMPO94
L’équipedePullietal(2013)73ontpubliéunconséquenttravailsurlamyélopéroxydaseetla
déterminationd’unetechniquespécifiqueetstandardiséedemesuredesonactivitéausein
destissusetliquidesbiologiques.Lorsdel’analysedesméthodesprécédemmentcitéesilsont
concluàlaprésenced’uneinterférenceavecd’autresprotéineslorsdelamesuredel’activité
delaMPO.EnutilisantdesanticorpsmonoclonauxspécifiquesdelaMPO,ilsontdémontréla
spécificitéetlarépétabilitédesmesuresdel’activépéroxydasiquedansdeséchantillonsde
différentstissusmurinsbroyés.Ilsontainsipuétablirunerelationfidèleetrobusteentrela
quantitédeMPOetl’infiltrationneutrophiliquedestissus.
Une équipe canadienne a étudié une méthode semi-quantitative par immuno-
chromatographie(lateralflowtest)dedéterminationdel’activitéperoxydasiquedelaMPOà
partir de prélèvement d’expectoration chez des patients humains. Ils en concluent une
corrélationentrel’activitédelaMPOetlaquantitédeneutrophilesdanslesprélèvements,
dénombrésparuncomptagedanslesconditionsclassiques95.
RujuanDAietal (2017)ontutilisédes techniquesdeRT-PCR(RealTimePolyméraseChain
ReactionouPCRquantitative)pourquantifierl’expressiondel’élastaseneutrophiliqueetde
lamyéloperoxydasecirculantelorsl’administrationd’œstrogènechezlasouris.Ilsontconclu
à l’augmentation de ces molécules parallèlement à l’augmentation des neutrophiles
quantifiésparcytométriedefluxautraversdesmarqueursGr-1etCD11b.Ilsn’ontcependant
pas proposé de corrélation entre les deux facteurs 96.Uneméthode a été décrite afin de
mesurer les neutrophiles de façon quantitative sur des échantillons de prélèvements
nasopharyngés humains congelés en utilisant la RT-q sur les gènes codant CD16, CD18 et
CD26L, desmolécules considérées comme spécifiques des neutrophiles. Ils concluent que
cetteméthodepourraitêtreétendueàd’autresprélèvementsquelesexpectorationsnaso-
pharyngées97.
64
2.3.2 Chezlesbovins
Différentes études ont été menées chez les bovins afin de dénombrer les neutrophiles
présentsdanslelaitnotamment,lorsd’augmentationdelaconcentrationcellulairesignantla
présence d’une mammite. Différentes techniques ont été décrites afin de quantifier les
populationsdecellulesprésentesdanslelait.
Desméthodesdecytologie enmicroscopieoptiquepermettent l’identificationdirectedes
cellulesprésentesetleurclassificationsurlabasedescaractéristiquesmorphologiques98.
Demultiples techniquesde cytométriede fluxontétédécritesdans lebutdedéterminer
précisément les quantités de cellules dans des échantillons de lait. Lemarquage avec de
l’ioduredepropidiumetl’analyseparcytométrieenfluxestpossiblepourdétecterdesétats
inflammatoires avec des concentrations cellulaires basses, lors de mammites99.
L’augmentationdelaconcentrationdecellulesdanscecasprécisétantprincipalementdueà
unrecrutementdeneutrophiles.
Desanticorpsspécifiquesdesneutrophilesbovinsprésentsdanslelaitontétédéveloppéset
ontpermisl’essordetechniquesindirectesdedétectiondecescellulesdanslelaitavecdes
test ELISA notamment. Ainsi, à l’aide d’anticorps polyclonaux murins, la densité optique
mesuréeàl’aided’untestELISApermettaitunemesurefiableetbiencorréléeauxrésultats
ducomptagecellulairedansleséchantillonsdelait.Lasensibilitéétaitdel’ordrede95%etla
spécificité d’environ 97%. La fiabilité du test permettrait notamment la détection
systématiquedel’affluxneutrophiliquepourdesconcentrationsinférieursà100000cellules
parmillilitre100quiestconsidéréecommeleseuilau-dessusduquellaglandemammaireest
considéréecommeenflamméeàlasuited’uneinfection.
Par la suite, une technique reliant un marquage spécifique des neutrophiles à l’aide
d’anticorpspolyclonauxmarquésavecdel’isothiocyanatedefluorescéine(possédantunpic
d’excitationà470nm,fluorescenceverte)coupléàunmarquagedel’ADNavecdel’iodurede
propidium(excitationà530nm, fluorescence rouge),etuneanalyseenmicroscopieaété
proposée.Ainsi lorsde l’analysemicroscopique, ladétectiondesneutrophiless’estavérée
spécifiqueetsensible,avecunmarquagevertsurlesmembranesentourantunefluorescence
rouge. Cette technique est utile et fiable notamment lors de forte augmentation de la
65
cellularité du lait puisque les neutrophiles représentent dans ce cas, plus de 80% de la
populationdesleucocytesrecrutés101.
Coorayetal(1994)ontmontréunecorrélationentrelaconcentrationdeMPOdanslelaitet
laconcentrationcellulaire.DesanticorpsmurinsmonoclonauxspécifiquesdelaMPObovine
ontétéproduitsetutilisésafindemesurerlaMPOdansleséchantillonsdelaitavecuntest
ELISA.Parailleurs,l’absenced’interférencedesautresprotéinesdulaitoudel’inflammation
elle-mêmeaétédémontrée,ainsiquel’absencederéactioncroiséeavecla lactoferrine, la
lactoperoxydase,l’albuminesérique,lesproduitsdedégradationdeslymphocytesainsique
lesprotéinesdulaitnormal102.
Zerbe et al (2002) se sont intéressé aux écoulements utérins de vaches atteintes
d’endométrite causée par Escherichia coli ou Trueperella pyogenes et la population de
neutrophiles présentes. Malgré l’absence de quantification, ils ont montré un phénotype
altéréetuneproductionderéactifsoxygénésréduiteparlesneutrophilesprésentsdansles
sécrétions prélevées, rendant certaines techniques de détection inappropriées dans ce
cadre103.
66
2.4 DiscussionetpossiblesapplicationsIlexistedemultiplestechniquesdequantificationdesneutrophiles,ducomptagedirectàdes
méthodes de détection indirectes. Le comptage direct se base essentiellement sur des
lecturesde frottis sanguins,ouétalement sur lamedeprélèvements liquides.Ce sontdes
techniqueshistoriquesmaisquidemandentdutempsdanslapréparationetnesontpaslibres
d’erreurs.Eneffetenfonctiondutechnicienquisechargedelapréparationetdelalecture,
desvariationsnonseulementde l’intensitéde lacolorationainsiquedu recensementdes
types cellulaires sont fréquentes. De plus ces lectures sont largement dépendantes de
l’équipementdelaboratoiredisponible.
D’autrestechniquesdequantificationdespolynucléairesneutrophilesconnuesetmaitrisées
sontpossiblesàl’aided’équipementscouteux,dehautetechnicitéetdontlestempsd’analyse
ne sont pas négligeables. La détention et l’utilisation de ces équipements demande une
expertiseetuncertaindébitafind’optimiserleurutilisation.Lacytométriedefluxestdeplus
enplusrépandueetreprésenteaujourd’huiunedestechnologieslespluspuissantesutilisées
enroutineenhématologieetenimmunologie.Enmoinsde60ans,lesappareilsdemesure
sont passées d’un traitement de quatre couleurs de fluorescence à plus de 10 couleurs
mesuréesactuellement.Afind’identifierlesneutrophilescirculantsdanslesangpériphérique,
deux paramètres physiques analysés par réfraction de la lumière émise sont cependant
suffisants.Progressivement l’ajoutdemarqueurs fluorescentsdont le signalpeutêtre lua
permis d’affiner les techniques ainsi que d’identifier de nouveaux types cellulaires. Ces
marqueurs fluorescents sont conjugués à des anticorps spécifiques des types cellulaires à
déterminer104.Ainsil’étudedesmarqueursdesneutrophilesreprésenteunepartsignificative
destravauxutilisantlacytométriedeflux.
Il convient de relever que la grande diversité des études représente une difficulté dans
l’identificationd’unmarqueuruniverselquisurpasseraittouslesautres.Eneffetenfonction
de l’espèce cible, de la nature de l’échantillon biologique plusieurs techniques ont été
décrites.AinsiRoseetal(2014)79affirmentqu’unmarquagedirigécontreLy6C/Ly6Gpermet
une détection plus spécifique des neutrophiles spléniques par rapport à l’utilisation des
anticorps anti-Gr1. Cependant lemarquage le plus communémentutilisé cible la protéine
CD11b.Cependant,l’expressiondecesmarqueursquidiffèrentenfonctiondel’activitédes
67
neutrophilesetdontl’interactionpeutmêmeinduiredeschangementsdel’expression.On
retrouve cette même problématique lors de l’analyse des contenus des granules des
neutrophiles,oùdesdifférencespeuventapparaîtredifférenceparmilesneutrophilesciblés.
ParailleursCD11bestégalementprésentàlasurfacedeséosinophilesetdoitêtreconsidéré
avec précaution chez des individus avec une éosinophilie82. Ainsi, par accumulation des
données,desvariationsexistentauseinmêmede lapopulationdeneutrophilessanspour
autantenconnaîtrelacause,commelepassagepardifférentesétapesdematuration.Alors
que les neutrophiles sont considérés comme des cellules à faible pouvoir d’expression
protéique, ces différences sont difficiles à expliquer sauf à conclure à des différences
d’expressionmembranaireenfonctiondecertainsétats.AinsiChristofferssonetPhillipson
(2018)105ontrécemmentrecensélessous-typesrépertoriés:
Tableau5:Caractéristiquesetfonctionsdessous-typesdeneutrophiles(d'aprèsChristoffersonetPhillison105
)
On voit donc que non seulement la cytométrie de flux reste une technique couteuse et
requérantunecertainetechnicité,maislesprogrèstechniquesetdesconnaissancessurcette
populationcellulaireconduisentàs’interrogersurlapertinencedeteloutelmarqueurpour
l’identification de ces cellules et les différences au sein de la population ciblée. Est-ce
Table 1 The features and functions of neutrophil subtypes
Neutrophil subtype Defining features Function Model system Reference
N1 (antitumor) Hypersegmented nuclei, highTNFα, ICAM-1, FAS
Cytotoxic (through ROS) Mouse, subcutaneous andorthotopic tumors
Fridlender et al. 2009
N2 (protumor) Circular nuclei, high arginase,CCL2, CCL5
T cell inactivation, angiogenic factors, matrixdegradation
N1 (pro-inflammatory) Ly6G+, CD206− Promotes adverse ventricle wall remodeling Mouse, myocardial infarction Ma et al. 2016N2 (anti-inflammatory) Ly6G+, CD206+ Attenuates adverse ventricle wall remodeling
SiglecFhi (protumor) SiglecFhi, Cancer promotion; myeloid cell recruitment,angiogenesis, T cell suppression
Mouse, KP lung tumor,Human, non-small cell lung
cancer patients
Engblom et al. 2017
Pro-tumorigenic VEGF, MMP-9, CXCR4,IFNγ-responsive
Proangiogenic, matrix degradation Mouse, subcutaneous tumorsand metastases, Matrigel assay
Jablonska et al. 2010
Pro-angiogenic CD49d, CXCR4, VEGFR1, MMP-9 Accumulate at hypoxic sites and stimulateangiogenesis
Mouse, transplanted hypoxic tissue,hindlimb ischemia, recruitmentmodels
Christoffersson et al.2012,
Massena et al. 2015
Reverse-migrated Activated morphology Can re-mount responses to microbes and injuries Zebrafish wounding and infection Ellett et al. 2015
PMN-N BNormal^ neutrophils, round nuclei,CD49d−, CD11b−, TLR-2,-4,-9
No effect on macrophages Mouse, MRSA infection Tsuda et al. 2004
PMN-I Multilobular nuclei, CD49d+, CD11b−,IL-12, CCL3, TLR-2,-4,-5,-8
Activates M1 macrophages
PMN-II Ring-shaped nuclei, CD49d−, CD11b+,IL-10, CCL2, TLR-2,-4,-7,-9
Activates M2 macrophages
IL-17A-producingneutrophils
RORγt, IL-17 Clear infections Human blood, cystic fibrosis –pseudomonas aeruginosa-infected,mouse, fungal infection
Taylor et al. 2014,2016,
High density neutrophils Hypersegmented nuclei Anti-tumor Mouse, tumor models,Human cancer
Sagiv et al. 2015Low density neutrophils Banded/ring-shaped to hypersegmented
nucleiTumor-permissive
CD62Lbright/CD16bright Multilobular nuclei, Human; LPS administration tovolunteers
Pillay et al. 2010, 2012CD62Ldim/CD16bright Hypersegmented nuclei, CD11chi,
CD11bhi, CD54hiROS release to control T cell proliferation
CD62Lbright/CD16dim Banded nuclei, CD11clo, CD11blo,CD54lo
CellTissueRes
(2018)371:415–423419
68
raisonnabledeciblertoutelapopulationavecununiquemarqueurmembranaireouserait-ce
plusprécisde l’analyser au caspar casen fonctionde laquestionposéeoud’utiliserune
combinaisondemarqueurs?
Une autre approche très étudiée consiste à relier l’activité de laMPO contenue dans les
granulesdesneutrophilesàlaquantitédecellulesneutrophiliques.Uneétudemajeureaété
conduiteparPullietal(201373),montrantunerelativementbonnecorrélationaveclaquantité
deneutrophilesdansdifférentstissusavecunprotocolestandardisédontlesrésultatssont
répétables.Enquantifiantl’activitédelaMPOàpartirdebroyatstissulairesàl’aided’untest
ELISA,Pullietsonéquipeontpuquantifierlesneutrophilesinfiltrésdefaçonindirecte.Cetest
est à la fois simple et robuste, une fois les anticorps anti-MPO correctement identifiés et
l’ELISAmisaupoint. Les champsd’applicationpotentiels sontnombreux.Compte tenude
l’absenced’étudesavecuneméthodeaussidétailléepourlaquantificationdesneutrophiles
par ELISA, son développement pour une future enmédecine vétérinaire incluant l’espèce
bovine,estenvisageabledanslesuividecertainesaffectionstrèsrépandues.
Lediagnosticdenombreusesaffectionspourraitbénéficierdecetapporttechnique.Eneffet,
les infections de la sphère respiratoire, mammaire et génitale sont particulièrement
fréquenteschezlesbovins.Lesneutrophilesontunrôleparticulierdanslesinfectionscomme
lespneumoniesoulesmammitesd’originebactérienne.Mêmes’ilsparticipentàl’élimination
des infections, lesneutrophilesproduisent aussi desdommages tissulaires à la suitede la
libération de leur contenu intracellulaire, qui est un facteur important des atteintes des
parenchymes.Desétudesontmontréque larégulationdunombreetde ladiapédèsedes
neutrophiles permettait d’atténuer les signes cliniques des animaux atteints 106. Plusieurs
étudessesontintéressésàlacinétiquedel’infiltrationdesneutrophilessuiteàdesépisodes
destressouchezdesanimauxsoumisàdes infectionsviralestels leBVDou l’herpèsvirus
Bovinde type1107.Alorsque lepremier induituneneutropénie favorableàdes infections
pulmonaires d’origine bactérienne, le second induit une infiltration leucocytaire dont des
neutrophiles activés délétères au tissu pulmonaire. Comme relaté dans des études en
médecinehumaine,ilexisteunecorrélationentrel’activitédelaMPOdessécrétionsnasales
et la présence de neutrophiles95. Il faut cependant déterminer des seuils d’interprétation
69
permettantl’interprétationdesrésultatsdecesmesures.Ladéterminationdeseuilschezdes
veauxatteintspermettraituncriblagerapidedesanimauxatteints,permettantdumêmecoup
untraitementprécoce.
Parailleursenélevagelaitier,lesmammitesetendométritessonttrèsfréquentespendantle
peripartum.
Lasélectiongénétiquedesanimauxainsiquelesavancéesdanslanutritionetdanslagestion
del’élevageontpermisuneaugmentationdelaproductionlaitièreparanimal.Cependant,
parallèlementàcettehausseuneprédispositionauxmaladiesmétaboliquesetinfectieuses
estobservée.Ellesontlacaused’importantespertespourl’industrielaitière.Lapériodede
sensibilitémaximale s’étendde la3emesemaineprécédant laparturition jusqu’à la3eme
semainepost-partum,désignéepériodede transitionpendant laquelle les vaches laitières
hauteproductricessubissentdenombreuxchangements:qu’ilssoienthormonauxàlasuite
delaparturitionetledébutdelalactation,métaboliquesavecleschangementsnutritionnels
etl’exportationfortedegrandesquantitésd’énergieetdeprotéines,enplusdel’évolution
concurrente demaladies infectieuses. Ces changements sont fortement liés entre eux et
évoluentconcomitamment.Environ75%despathologiesrencontréeschezlavachelaitière
s’expriment pendant cette période de transition.Différentes études se sont penchées sur
l’activité des neutrophiles pendant cette étape de transition, et malgré les différentes
méthodesutiliséesdesrésultatscontradictoiresontétéobtenus.Ilenressortnéanmoinsque
l’activitépro-inflammatoiredesneutrophilesestaugmentée.108McDougallatal(2017)109ont
démontréquechezdesvachessainesuneneutrophiliepassagèrerelativeàlahaussedela
cortisolémiedueàlamisebasetuneréductiondescapacitédediapédèseétaientprésentes
enperipartum.Ladiminutiondunombredeneutrophilescirculantspeutêtreimputableàune
migrationdesneutrophilessuiteaudéveloppementd’infectionsauseindestissusutérinou
mammaire.
Lesendométritessontdéfiniescommeuneinflammationendométrialeprésenteau-delàde
21joursaprèslaparturitionenl’absencedesignescliniquessystémiques.Histologiquement,
on retrouve une interruption de la continuité de l’épithélium et la présence de cellules
inflammatoiresavecpourl’essentieldesneutrophiles.Lediagnosticcytologiquereposesur
l’identificationd’uneaugmentationdelaproportiondesneutrophilesdansleséchantillonsà
70
lasuiteduprélèvementutérinparcytobrosseousurdesprélèvementsdefaiblequantitéde
lavage utérin. Ces tests de référence sont capables de diagnostiquer des endométrites
cliniques et subcliniques sur la base du pourcentage de neutrophiles dénombrés. Un
pourcentage supérieur à 5% de neutrophiles serait le signe d’une inflammation et d’une
endométritepossiblementsubclinique.Cesendométritesnesontpastoujoursdétectéeset
sont la cause de nombreux échecs de reproduction, synonymes d’importantes pertes
économiquesdanslesélevagesbovins110.
Par ailleurs les mammites figurent parmi les causesmajeures de pertes économiques en
élevage laitier. Ces pertes sont la conséquence du retrait du lait dont la concentration
cellulaireest tropélevéeet lecoûtdestraitementsréaliséspourenrayer les infections.La
techniquediagnostiquedesmammites lapluscommunereposesur ledénombrementdes
cellulessomatiquedans le lait,quisontessentiellementdesneutrophilespourdesvaleurs
augmentéeslorsd’infection111.
Ainsi, pour les trois affectionsmajeuresde l’élevagebovin, il existeune augmentationdu
nombre de neutrophiles localement recrutés. La détection précoce de ces signes
inflammatoiresestessentiellepourlapriseenchargelamiseenœuvredutraitement,etainsi
minimiserlespertesdeproduction.Pourcela,ilconvientd’utiliserdesmoyensdiagnostiques
fiables,rapidesetpeuonéreux.Touttestdiagnostiqueapplicableauplusprèsdel’animalest
essentiel, notamment en médecine vétérinaire. Tout retard de diagnostic réduit
significativementlaprobabilitédeguérison.
Un biomarqueur est une caractéristiquemesurable et évaluée comme un indicateur d’un
processus normal, pathologique ou d’une réponse pharmacologique d’un essai
thérapeutique.Unbiomarqueurinformatifdoitréuniruncertainnombredequalités,comme
laspécificité, lasensibilité, lecaractèrerépétable.Enoutre,pourquecebiomarqueursoit
utilisableenroutineildoitêtrefacileàmettreenœuvreetpeuonéreux.
ilexistedoncunepossibilitédedévelopperuntestnoninvasifdedétectiondesneutrophiles
de façon indirecte, comme l’indique l’étude de Pulli, au travers de lamesure de l’activité
enzymatiquedelaMPO.Ilestpossiblequ’untestbasésurdesanticorpsmonoclonauxcontre
laMPObovine soitutilisabledans les trois situationsdécrites. Les anticorpsmonoclonaux
peuventaisémentêtreproduitsparlestechniquesusuelles,pargéniegénétiqueoupardes
71
protocoles conventionnels par immunisation de la souris Dans les expériences de Pulli, le
contenuintracellulaireestextraitafind’isolerlamyélopéroxydasecontenuedanslesgranules
neutrophiliquesàl’aided’acétone.Danschaquecas,desétudesontmontréquelamesurede
l’activitédelaMPOestpotentiellementexploitable.Eneffet,ledéveloppementdecetypede
testadéjàétéenvisagéafindedétecterlaprésenced’unemammitechezlavachelaitière;il
conviendrait d’établir le lien avec la concentration neutrophilique et le diagnostic de
mammitessubcliniques102.Demême,enmédecinehumaine,l’analysedel’activitédelaMPO
dans les sécrétions nasales est utilisée en tant quemarqueur de l’inflammationdes voies
respiratoires lors de bronchites chroniques (et dans le suivi des traitements de ces
affections)95. Il serait intéressant d’examiner des situations propres aux bovins. Pour cela,
outre le développement de tests performants, à la condition que les réactifs nécessaires
soient disponibles, il sera ensuite nécessaire d’établir la relation entre la quantité de
neutrophilesetl’activitépéroxydasique,afindefixerdesseuilsd’interprétation.Ilconviendra
égalementdedéterminer les concentrations idéalesdemesureafind’établir un intervalle
dans lequel on observe une relation linéaire entre l’activité MPO et la concentration
neutrophilique.
72
3 Conclusion
L’objectifdenotretravailétaitd’analyserlesdonnéespubliéesdisponiblesafindecomparer
les dernières techniques de mesure des neutrophiles et d’identifier une technique
performante, rapide, peu couteuse, et moins dépendante de ressources techniques
spécialisés, et éventuellement transposable à la pratique quotidienne des vétérinaires
praticiensenélevagebovin. L’utilisationd’unbiomarqueurdirectdesneutrophiles semble
l’approchelaplusadaptée.
Denombreusesétudesontanalysél’activitédelaMPOcontenuedanslesneutrophilesafin
de déterminer leur nombre de façon indirecte lors d’inflammation neutrophilique. les
techniquesontévoluéetdesprotocolessensiblesetrépétablesontétéproposés.Graceàune
testELISAilestpossiblederelierl’activitéperoxydasiqueàl’infiltrationneutrophilique,même
lorsquecelui-ciestenfaiblequantité.
Il seraitdonc intéressantdemettreenœuvredesexpériencesafind’étendre leprotocole
proposéàlamesuredel’activitédelaMPObovinedanslebutdeproposeruntestdiagnostic
précoce et non invasif utilisable pour trois maladies caractérisées par une infiltration
neutrophiliquedestissus.
73
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{FormattingCitation}
80
DUPONTChristophe
TITRE:Lesgranulocytesneutrophiles:morphologie,fonctionsetméthodesdequantificationdansl’espèce
bovine.
Résumé:
Lesneutrophilessontlesplusgrandseffecteursdel’immunitéinnée.Ilsillustrentlapremièrelignededéfensecontrelesinfectionsbactériennes,viralesoufongiques.Laréponseinflammatoiremédiéeparlesneutrophilesestcomplexeetsedérouleenplusieursétapes.Lamyélopéroxydase(MPO)estuneprotéinehémiqueprésenteuniquementdanslesneutrophiles,notammentchezlesbovins.Parmilesdifférentesméthodesdequantificationdesneutrophilesanalysésuneméthodeproposéerécemmentamènedesopportunitésdedéveloppementd’untestrapidedequantificationdesneutrophilesautraversd’undosagedel’activitédelaMPOdansdestissusgrâceàunmarquageparELISA.Chezlesbovinsunbiomarqueurseraitutiledanstroispathologiesspécifiquesrencontréesenélevagebovinetàfortimpactéconomique.Eneffetledéveloppementd’untestrapidedel’inflammationrespiratoire,mammaireainsiqu’utérineseraitlargementbénéfiqueàlapratiquevétérinairerurale. Motsclés:neutrophiles,inflammation,myélopéroxydase,ELISA,bovin,quantificationAbstract:
Neutrophilsarethemaineffectorsofinnateimmunity.Theyillustratethefirstlineofdefenseagainstinfectionofbacteria,virusesorfungi.Theinflammatoryresponsemediatedbyneutrophilsiscomplexandhappensinseveralsteps.Themyeloperoxidaseisahemeproteinfoundonlyinneutrophils,includedinthebovinespecie.Amongdifferentquantificationmethodsofneutrophilsintissuesanewmethodhasbeenproposed.ItisanopportunityofdevelopmentofaquicktestforneutrophilsquantificationbasedonMPOactivityintissuesampleswithanELISAtest.Incowsanusefulbiomarkerofrespiratory,mammaloruterinediseasecouldbehelpfulconsideringtheeconomicimpactforfarmersofthosediseases.Suchtestcouldbeveryadvantageousinveterinarianpractice.
Keywords:neutrophils,inflammation,myeloperoxidase,ELISA,bovine,quantification