lateral inhibition
TRANSCRIPT
-
8/10/2019 lateral inhibition
1/5
P r o c N a t i .
A c a d .
S c i . USA
V o l . 9 1 ,
p p . 1 0 1 3 9 - 1 0 1 4 3 , O c t o b e r 1 9 9 4
D e v e l o p m e n t a l
B i o l o g y
L a t e r a l
i n h i b i t i o n m e d i a t e d b y t h e
D r o s o p h i l a
n e u r o g e n i c g e n e
D e l t a i s e n h a n c e d
b y p r o n e u r a l p r o t e i n s
MARIANNE
K U N I S C H * ,
MARC
H A E N L I N t , AND J o s e A . C A M P O S O R T E G A * t
* I n s t i t u t
f f r E n t w i c k l u n g s b i o l o g i e , U n i v e r s i t i t
z u
K d l n , 5 0 9 2 3 C o l o g n e ,
G e r m a n y ; a n d t L a b o r a t o i r e d e
G 6 n 6 t i q u e M o l 6 c u l a i r e
d e s E u c a r y o t e s ,
C e n t r e
N a t i o n a l
d e
l a
R e c h e r c h e
S c i e n t i f i q u e ,
F a c u l t d
d e
M 6 d e c i n e , F - 6 7 0 8 5
S t r a s b o u r g
C e de x , F r a nc e
C o m m u n i c a t e d
b y
P e t e r
S t a r l i n g e r ,
J u l y 5 ,
1 9 9 4
( r e c e i v e d f o r
r e v i e w
May 1 1 ,
1 9 9 4 )
ABSTRACT C e l l s i n t h e
n e u r o e c t o d e r m
o f
D r o s o p h i l a
b e c o m e
e i t h e r
n e u r a l
o r e pi d e rm a l
p r o g e n i t o r s . A c r i t i c a l
t h r e s h o l d
c o n c e n t r a t i o n
o f
p r o n e u r a l
g e n e
p r o d u c t s i n a g i v e n
c e l l c a u s e s i t t o
d e v e l o p
a s
a
n e u r o b l a s t .
T h e
p r o t e i n s e n c o d e d
b y
t h e
g e n e s D e l t a
( D )
a n d N o t c h
( N )
a c t
a s
t h e s o u r c e
a n d t h e
r e c e p t o r ,
r e s p e c t i v e l y ,
o f
i n h i b i t o r y s i g n a l s
s e n t
b y
t h e n e u r o -
b l a s t t o
n e i g h b o r i n g
c e l l s
t h a t
p r e v e n t
t h e s e c e l l s f r o m a l s o
a d o p t i n g
t h e n e u r a l
f a t e .
We s h o w h e r e
t h a t
p r o n e u r a l g e n e
p r o d u c t s
a c t i v a t e t r a n s c r i p t i o n
o f D e l t a i n t h e n e u r o e c t o d e r m
b y b i n d i n g
t o
s p e c i f i c
s i t e s i n i t s
p r o m o t e r .
T h i s
t
p t i o n a l
a c t i v a t i o n e n h a n c e s
l a t e r a l
i n h i b i t i o n
a n d
t h u s
h e l p s
e n s u r e
t h a t
c e l l s
i n
t h e
v i c i n i t y
o f p r o s p e c t i v e
n e u r o b l a s t s
w i l l
t h e m -
s e l v e s
b e c o m e e p i d e r m o b l a s t s .
C l u s t e r s
o f
i n i t i a l l y e q u i v a l e n t
c e l l s
i n t h e n e u r o e c t o d e r m o f
D r o s o p h i l a
h a v e t o d e c i d e
b e t w e e n
d e v e l o p i n g
a s
n e u r a l
o r
e p i d e r m a l p r o g e n i t o r s 1 ,
2 ) .
T h e
f a t e o f
a n y g i v e n
n e u r o e c -
t o d e r m a l c e l l
t o b e c o m e
e i t h e r
n e u r o b l a s t
o r
e p i d e r m o b l a s t
i s
d e t e r m i n e d b y
c e l l u l a r i n t e r a c t i o n s
t h a t
i n v o l v e
a
r e g u l a t o r y
n e t w o r k c o n t a i n i n g p r o d u c t s
o f
t h e
s o - c a l l e d
p r o n e u r a l
a n d
n e u r o g e n i c g e n e s . T h e p r o n e u r a l g e n e s p r o m o t e
n e u r a l
d e -
v e l o p m e n t ,
a n d
t h e n e u r o g e n i c
g e n e s
m e d i a t e
s i g n a l s
b e -
t w e e n
a d j a c e n t
c e l l s
3 ,
4 ) .
T h e
p r o t e i n s
e n c o d e d
b y
N o t c h
( N )
a n d
D e l t a
D O ) ,
t w o
o f
t h e n e u r o g e n i c
g e n e s ,
i n t e r a c t
d i r e c t l y a t t h e
m e m b r a n e s
o f
c o n t i g u o u s
c e l l s
( 5 - 7 ) , p a s s i n g
a
s i g n a l
f r o m
t h e n e u r o b l a s t
t o t h e
n e i g h b o r i n g
c e l l s t h a t
i n h i b i t s
n e u r a l
d e v e l o p m e n t
( 8 - 1 1 ) .
D e l t a
p r o t e i n
i s
a s s u m e d
t o b e
t h e
s o u r c e
( 1 2 ,
1 3 )
a n d N o t c h
p r o t e i n
i s a s s u m e d
t o
b e
t h e
r e c e p t o r ( 1 3 - 1 6 )
o f
t h i s n e u r a l
i n h i b i t o r y
s i g n a l .
T h e
r e l a t i v e
s i g n a l s t r e n g t h
i s
t h o u g h t
t o d e t e r m i n e
w h e t h e r ,
i n a
g i v e n c e l l , p r o d u c t s o f
t h e
p r o n e u r a l
g e n e s - f o r e x a m p l e ,
t h o s e o f
t h e a c h a e t e - s c u t e
g e n e
c o m p l e x ( A S C )
o r o f
t h e
E n h a n c e r
o f
s p l i t
g e n e c o m p l e x
[ E ( S P L ) - C ] - f u n c t i o n a l l y
p r e d o m i n a t e .
P r e d o m i n a n c e o f ASC o r
E ( S P L ) - C
p r o d u c t s ,
a l l
m e m b e r s
o f t h e b a s i c
h e l i x - l o o p - h e l i x
f a m i l y
o f
t r a n s c r i p -
t i o n a l
r e g u l a t o r s
( 1 7 - 2 1 ) ,
c a u s e s
e n t r y
i n t o
t h e
n e u r a l o r
e p i d e r m a l p a t h w a y
o f
d e v e l o p m e n t , r e s p e c t i v e l y 3 ) .
We s h o w h e r e
t h a t t h e b a s i c
h e l i x - l o o p - h e l i x p r o t e i n s
e n c o d e d
b y
t h e
ASC
g e n e s
a c t i v a t e
t r a n s c r i p t i o n
o f D e l t a
w i t h i n
t h e
n e u r o e c t o d e r m b y
b i n d i n g
t o
s p e c i f i c
p r o m o t e r
s i t e s .
A c t i v a t i o n
o f
D l
e n h a n c e s
t h e n e u r a l
i n h i b i t o r y ,
e p i -
d e r m a l i z i n g
s i g n a l
s e n t
b y
t h e
n e u r o b l a s t ,
a s s h o w n
b y
m i n i g e n e s c a r r y i n g p r o m o t e r f r a g m e n t s .
M u t a t i o n o f t h e s e
b i n d i n g
s i t e s r e d u c e s
t h e a m o u n t o f
D e l t a
t r a n s c r i p t s
i n
n e u r o e c t o d e r m a l c e l l s
a n d ,
a s
a
c o n s e q u e n c e ,
d e c r e a s e s
t h e
e f f i c a c y
o f t h e
e p i d e r m a l i z i n g s i g n a l
s e n t
b y
t h e n e u r o -
b l a s t ,
t h u s
a l l o w i n g
d i f f e r e n t i a t i o n o f e x c e s s n e u r o b l a s t s .
MATERIALS AN D METHODS
S t r a i n s a n d P r e p a r a t i o n
o f
E m b r y o s .
F o r
e x p e r i m e n t s
w i t h
m i n i g e n e s ,
t h e
a m o r p h i c
m u t a t i o n D I F I O
( 2 2 , 2 3 )
w a s
u s e d .
P e r m a n e n t s t r a i n s
w e r e
e s t a b l i s h e d
w i t h X -
o r
s e c o n d -
c h r o m o s o m a l i n s e r t i o n s
o f t h e
m i n i g e n e s ,
e i t h e r i n h o m o z y -
g o s i t y
o r
b a l a n c e d , t o g e t h e r
w i t h m a r k e r 4 3 9 , D I F J O / T M 3 ,
B d s
l a c Z .
T h e
m a r k e r
4 3 9
i s
a P - l a c Z e l e m e n t
i n s e r t e d i n
r e g i o n 6 4 A
d r i v e n b y a n e u r a l e n h a n c e r a c t i n g
i n
a l l
n e u r o -
b l a s t s
a n d
s e n s o r y - o r g a n
m o t h e r
c e l l s
( 2 2 , 2 4 ) .
T h i s
i n s e r t i o n
w a s r e c o m b i n e d i n t o a c h r o m o s o m e
c a r r y i n g
D I F J O
a n d
b a l a n c e d
w i t h
T M 3 , B d s
l a c Z ,
w h i c h
c a r r i e s
a n o t h e r P - l a c Z
e l e m e n t
c o u p l e d
t o
t h e
5 '
r e g i o n
o f
t h e
t w i s t g e n e e x p r e s s e d
a t
t h e b l a s t o d e r m
s t a g e a n d t h e r e a f t e r
( 2 5 ) . D I F J O
h o m o z y -
g o t e s c a n t h u s
b e
u n e q u i v o c a l l y d i s t i n g u i s h e d
f r o m h e t e r o -
z y g o u s
o r
T M 3 , B d s
l a c Z
h o m o z y g o u s
s i b l i n g s a t e a r l y
e m b r y o g e n i c
s t a g e s .
N e u r a l
p r o g e n i t o r s
w e r e
v i s u a l i z e d
w i t h
a n a n t i b o d y a g a i n s t ( - g a l a c t o s i d a s e , u s i n g a s e c o n d a r y
a n t i -
b o d y c o u p l e d
t o a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ; t h e
e m b r y o s w e r e a l s o
s t a i n e d
w i t h
a n
a n t i - i n v e c t e d a n t i b o d y
( s e c o n d a r y
a n t i -
b o d y
c o u p l e d
t o
h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e , b r o w n r e a c t i o n
p r o d u c t , r e f .
2 2 ) t o l a b e l
t h e
m e t a m e r i c
b o u n d a r i e s .
E m b r y o s
w e r e d i s s e c t e d a n d m o u n t e d
f l a t t o
s h o w t h e
g e r m b a n d
i n
i t s
e n t i r e
e x t e n t .
W h o l e - m o u n t i n s i t u
h y b r i d i z a t i o n
w a s d o n e o n
t r a n s g e n i c
e m b r y o s c a r r y i n g
t h e c o n s t r u c t D i E ) ( 4 . 3 ) - I a c Z
( 2 4 )
a n d
v a r i a n t s
o f
i t ,
w i t h a 3 - k b E c o R I
d i g o x i g e n i n - l a b e l e d
f r a g m e n t
o f
p W - A T G - l a c Z
a s
p r o b e ( 2 6 ) . C u t i c l e
p r e p a r a -
t i o n s
w e r e
m a d e a c c o r d i n g t o c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s .
C o n s t r u c t i o n o f
P l a s m i d s
f o r
D N A - B i n d i n g
A s s a y s .
F o r
c o n s t r u c t i o n
o f
e x p r e s s i o n
v e c t o r s , t h e c o d i n g r e g i o n
o f
a c h a e t e ( a c ) ,
b e g i n n i n g
a t
p o s i t i o n
+ 2 4
u p s t r e a m
o f
t h e
t r a n s l a t i o n
s t a r t
s i t e ,
w a s
a m p l i f i e d
b y
P C R ,
u s i n g
t h e
f o l -
l o w i n g
p r i m e r s :
s e n s e ,
5 -AATCATGGATCCAGTTT-
TCAACGACGACGAGGAGTCA-3 ; a n t i s e n s e ,
5 ' - C G G T -
CAGGATCCCAGGTCGTCCTGCCAGAGTGATAT-
A T A - 3 ' . T h e
a m p l i f i e d p r o d u c t
w a s
c l o n e d
i n t o t h e BamHI
s i t e o f
t h e
p E T 3 a
e x p r e s s i o n
v e c t o r
( 2 7 ) .
l e t h a l o f s c u t e
e x p r e s s i o n
p l a s m i d s
w e r e
g e n e r a t e d
f r o m
a f u l l - l e n g t h
cDNA, p r o v i d e d b y
J .
M o d o l e l l ( C B M ,
M a d r i d ) ,
b y c l o n i n g
a
P v u
I I
s i t e
( + 4 4 ) - E c o R V
f r a g m e n t
i n t o
t h e f i l l e d - i n BamHI
s i t e o f t h e
p E T 3 c e x p r e s s i o n
v e c t o r . T h e c o n s t r u c t
f o r
e x p r e s s i o n
o f
d a u g h t e r l e s s p r o t e i n
w a s
p r o v i d e d b y
H a r a l d
V a s s i n
( C o l u m b u s ,
O h i o ) .
D N A - B i n d i n g
A s s a y s .
P r o t e i n e x p r e s s i o n
a n d
p u r i f i c a t i o n
w a s
e s s e n t i a l l y
a s
d e s c r i b e d
i n r e f . 2 8 . F o r D N A - b i n d i n g
s t u d i e s ,
d o u b l e - s t r a n d e d
o l i g o n u c l e o t i d e s
( T a b l e
1 )
a n d
a p -
p r o p r i a t e
r e s t r i c t i o n
f r a g m e n t s
( s e e
F i g .
1 ,
f r a g m e n t
I :
E c o R l - E c o R V ,
2 9 8
b p ;
f r a g m e n t
I I :
E c o R V - B g l
I I ,
3 0 2
b p ;
f r a g m e n t
I I I :
B g l I l - H i n d I I I ,
3 1 0
b p )
w e r e
l a b e l e d a t b o t h
e n d s
b y f i l l i n g - i n
w i t h K l e n o w
f r a g m e n t
i n t h e
p r e s e n c e
o f
[ a - 3 2 P ] d A T P .
L a b e l i n g , b i n d i n g
r e a c t i o n s ,
a n d
f o o t p r i n t e x -
p e r i m e n t s
w e r e
d o n e a s
d e s c r i b e d
( 2 8 ) .
I n V i t r o M u t a g e n e s i s .
F o r i n v i t r o
m u t a g e n e s i s ,
t h e f o l l o w -
i n g
D l
g e n o m i c
f r a g m e n t s
w e r e c l o n e d
i n
B l u e s c r i p t K S ( + )
( s e e
F i g . 1 ) :
i )
E c o R I - H i n d I I I
f r a g m e n t ,
i i )
E c o R V - P s t
I
f r a g m e n t , i i i )
P s t
I - X b a I
f r a g m e n t ,
i v )
X b a
I - X b a
I .
M u t a t i o n s
w e r e
i n t r o d u c e d
i n t o t h e
g e n o m i c f r a g m e n t s b y
A b b r e v i a t i o n s :
A S C ,
a c h a e t e - s c u t e
gene c o m p l e x ;
E ( S P L ) - C ,
E n -
h a n c e r
o f
s p l i t
gene
c o m p l e x ;
mgXX, m i n i g e n e
XX
t T o whom
r e p r i n t r e q u e s t s
s h o u l d b e a d d r e s s e d .
1 0 1 3 9
T h e
p u b l i c a t i o n
c o s t s o f t h i s
a r t i c l e
w e r e
d e f r a y e d
i n
p a r t
b y
p a g e
c h a r g e
p a y m e n t .
T h i s a r t i c l e
m u s t
t h e r e f o r e b e
h e r e b y
m a r k e d
a d v e r t i s e m e n t
i n
a c c o r d a n c e
w i t h 1 8
U . S . C .
1 7 3 4
s o l e l y
t o
i n d i c a t e t h i s
f a c t .
-
8/10/2019 lateral inhibition
2/5
1 0 1 4 0 D e v e l o p m e n t a l
B i o l o g y : K u n i s c h e t a l .
T a b l e 1 .
B i n d i n g o f p r o n e u r a l p r o t e i n s t o s p e c i f i c
s i t e s i n
D 1
p r o m o t e r
B i n d i n g
s i t e s
O l i g o n u c l e o t i d e ( g e n o m i c ) s e q u e n c e d a / d a a c / a c l s c / I s c
d a / l ' s c
d a / a c
I *
CTGCATCTAACAA CGGCAAAGGA
MediumM
I I *
ATTAACTAGCCAGCTGTTGTTGTTGTG
S t r o n g
- -
+ + + +
I I I *
GATTGGAAAGCAGCTGTTTTCGAGCT
S t r o n g Weak Weak
+ +
+
+
+
+
I V t
T TC GA CA CA TC CAC AT GT AC T GAT GA GAG TCT G M e d i u m
- -
+
+
V t
CTGTGGGAAGCG
M A A M I T T C G T C C T T C G
M e d i u m
-
-
+ +
V i t t
GTTCTTGTTACATTTGATCTAATATGG
S t r o n g
- -
- -
V I I t
GTTACATTTGCAITCTTGTGGGAAAA
S t r o n g
- -
+
+
V i i i t
T C C C G G A C C G C A & C f M C C T T G C A A A A
S t r o n g
- -
-
+
I X
AACCGGTTTACAGGTGCTAACTTGGC
ND ND ND
+
+
+ +
+ +
X
TATTGCCATTACAGTITGACATCTTT
N D ND ND ( + )
( + )
X I
ATGTGGCGTGTGCACGTGTAGCTTGCAA
ND ND
ND
+ + + +
X i i i I ATTGCAAAACCATGThCGACAAGTA
ND ND ND +
+
S t r o n g , m e d i u m ,
a n d
w e a k
r e f e r s
t o
d e g r e e
o f
p r o t e c t i o n
i n D N a s e I
a s s a y s . - ,
No
p r o t e c t i o n .
1 s c ,
l e t h a l o f
s c u t e I 1 ) s c ) . T h e E - b o x e s a r e
u n d e r l i n e d .
I n m o s t c a s e s , 1 o r 2
n t
f l a n k i n g
t h e
E - b o x e s w e r e
a l s o
p r o t e c t e d .
F o r
s i t e
I V ,
1 8 c o n s e c u t i v e n t
( u n d e r l i n e d a n d
i n
b o l d f a c e
t y p e )
w e r e
p r o t e c t e d .
N u m b e r o f
p l u s e s i n d i c a t e s
r e l a t i v e b i n d i n g
a f f i n i t y ; + , v e r y
l o w
a f f i n i t y ; - ,
n o
b i n d i n g ; ND,
n o t d e t e r m i n e d .
A l l
o l i g o n u c l e o t i d e s
w e r e
s y n t h e s i z e d
i n
a
C y c l o n
P l u s
( M i l l i p o r e )
D N A
s y n t h e s i z e r .
* F r a g m e n t I ,
E c o R I - E c o R V .
t F r a g m e n t
I I ,
E c o R V - B g l
I I .
l B e c a u s e b o x e s V I a n d
V I I
a r e
v e r y
n e a r e a c h
o t h e r , o l i g o n u c l e o t i d e
V I w a s
d e l i b e r a t e l y c h a n g e d
t o
m u t a t e E - b o x
V I I .
E - b o x V I w a s
n o t
m u t a t e d
i n
o l i g o n u c l e o t i d e
V I I
b e c a u s e n o
b i n d i n g
o f h e t e r o d i m e r s
t o E - b o x
V I
w a s f o u n d .
u s i n g
t h e o l i g o n u c l e o t i d e - d i r e c t e d
i n v i t r o
m u t a g e n e s i s
s y s -
t e m ,
v e r s i o n
2
( A m e r s h a m
B u c h l e r )
a n d
t h e
f o l l o w i n g
o l i g o -
n u c l e o t i d e s
w i t h
m u t a t e d s e n s e - s t r a n d
s e q u e n c e s ( b o l d f a c e
a n d
u n d e r l i n e d ) . i )
TGGCAAAGGATTAACTAGC-
GAAIMTTGTTGTTGTGCGAAATCC
( b o x
I I ) ;
i i )
TACACGAAAAGATTGGAAAIATACTTTTTCGAGC-
TCCCTGGGAA ( b o x I I I ) ;
i i i )
AGGACACATCCACATG-
TACATCATTATAGAGTCTGTGGGAAGCGCAC ( b o x
I V ) ;
( i v ) GC C GA C A GC C A A C C GGT T T A GA T A T C -
CTAACTTGGCTTTAAAAGTCGG
( b o x I X ) ; ( v )
TTGTT-
TAAATATTGCCATTAGAIATCGACATCTTTATAGT-
GAATT
( b o x
X ) ; v i )
GCAACAAAAAATGTGGCGTGTA-
GATATCTAGCTTGCAACAACGAC
( b o x X I ) .
T h e
m u t a t e d
f r a g m e n t s
w e r e
u s e d
f o r
f o o t p r i n t
a n a l y s i s ,
a s
w e l l
a s t o
r e p l a c e
t h e
c o r r e s p o n d i n g
f r a g m e n t s
i n
t h e
D l - l a c Z
p r o m o t e r
c o n s t r u c t
D E E I ( 4 . 3 ) - l a c Z
( 2 4 )
a n d
f o r
g e r m - l i n e
t r a n s f o r m a t i o n ,
a s
d e s c r i b e d
( 2 4 ) .
T h e
r e c i p i e n t
s t r a i n
f o r
g e r m - l i n e
t r a n s f o r m a t i o n
w a s
1 1 1 8
M i n i g e n e s .
T h e
m i n i g e n e s
u s e d
w e r e
m i n i g e n e
3 9
( m g 3 9 )
a n d t w o m ut a t e d v a r i a n t s o f
i t , m g 2 4 ,
w h i c h h a s t w o m u t a n t
b o x e s
I I I
a n d
I V ) ,
a n d
m g 4 8 ,
w h i c h h a s s i x m u t a t e d b o x e s
I I ,
I I I , I V , I X ,
X ,
a n d
X I ) . m g 3 9
( d e s c r i b e d
i n
r e f .
2 4 )
c o n s i s t s o f
i )
a
9 . 2 - k b
E c o P J - X b a
I
f r a g m e n t ( f r o m
- 9 . 2
k b
t o - 3 6 9
b p )
o f
t h e
5 '
g e n o m i c DNA,
i i )
a
f u l l - l e n g t h
cD N A
c l o n e ,
a n d
i i i )
t h e
g e n o m i c
t r a i l e r ,
c l o n e d
i n
v e c t o r PW5N
( a
m o d i f i c a t i o n
o f
t h e
C a S p e r
v e c t o r
w i t h
t h e
p o l y l i n k e r
o f
P W 8 ,
f r o m
E c o R I
t o
P s t
I ) .
T h e
c D NA c l o n e w a s
a f u s i o n
b e t w e e n
a
B g l
I I
f r a g m e n t
f r o m
c l o n e
c G 6 . 1
( f r o m
+ 2 3 4
t o
+
1 6 6 1 )
a n d a
B g l
I I - S p e
I
f r a g m e n t
f r o m c l o n e c 3 . 2
( 2 3 ) .
T h e
g e n o m i c
3 '
r e g i o n
u s e d w a s
a
1 . 6 - k b
S p e
I
f r a g m e n t
f u s e d
t o
t h e
S p e
I
s i t e
( + 4 9 4 7
b p )
o f
t h e
cDNA.
0 . 5
k b
E
R V
BG
I
m
IVvvi-
vm
V I I
H
BG
l
RESULTS
ASC R e g u l a t e s
D l
T r a n s c r i p t i o n . U s i n g
D l
p r o m o t e r - l a c Z
r e p o r t e r f u s i o n s , we p r e v i o u s l y
s h o w e d t h a t
a g e n o m i c
f i a g m e n t
c o n t a i n i n g
4 . 3
k b
o f
s e q u e n c e
i m m e d i a t e l y u p -
s t r e a m o f t h e
t r a n s c r i p t i o n
s t a r t
s i t e ,
t h e
u n t r a n s l a t e d l e a d e r ,
t h e f i r s t
e x o n ,
a n d t h e
f i r s t i n t r o n ( r e f e r r e d t o
a s
t h e
4 . 3 - k b
p r o m o t e r f r a g m e n t ,
F i g .
1 )
g e n e r a t e s
a
s t r i k i n g r e g u l a r n e u -
r o e c t o d e r m a l e x p r e s s i o n p a t t e r n c o n s i s t i n g o f t w o c l u s t e r s
o f
c e l l s
p e r h e m i s e g m e n t r e f . 2 4 ; F i g . 2 A ) .
T h e p a t t e r n , w h i c h
i s v i s i b l e i m m e d i a t e l y p r e c e d i n g s e g r e g a t i o n o f t h e S 1 n e u -
r o b l a s t s 2 , 3 ) ,
i s
s t r i k i n g
f o r
t w o r e a s o n s :
i )
i t
i s
n o t
d i s t i n g u i s h a b l e
i n
t h e d i s t r i b u t i o n o f
e n d o g e n o u s
D e l t a R N A
a n d
i i )
i t
i s r e m i n i s c e n t o f
t h e
t r a n s c r i p t i o n
p a t t e r n
o f t h e
ASC g e n e s
a t t h i s
s t a g e .
I n d e e d , t h e n e u r o e c t o d e r m a l c l u s -
t e r s
a r e n o t
f o u n d
i n
e m b r y o s h o m o z y g o u s
f o r
D f t l ) s c ' 9 ,
w h i c h
l a c k
t h r e e
o f
t h e
f o u r
ASC
g e n e s - n a m e l y ,
a c h a e t e ,
s c u t e ,
a n d
l e t h a l
o f s c u t e .
E a c h
o n e
o f
t h e s e
g e n e s c o n t r o l s
e x p r e s s i o n o f
D l - l a c Z
i n a
p a r t i c u l a r
d o m a i n o f t h e
c l u s t e r s ,
a s s h o w n
b y s t u d y i n g
t h e
p r o m o t e r - l a c Z
f r a g m e n t
i n t h e
b a c k g r o u n d
o f
d e l e t i o n s
a f f e c t i n g
i n d i v i d u a l
g e n e s .
I n
a d d i -
t i o n , t h e
t r a n s c r i p t i o n p a t t e r n
o f t h e
e n d o g e n o u s g e n e ,
w h i c h
i s
n o r m a l l y
e x p r e s s e d
i n a l l
c e l l s o f
t h e
n e u r o e c t o d e r m , i s
a l s o
c h a n g e d
i n m u t a n t s
l a c k i n g
A S C ,
e x h i b i t i n g c o n s p i c u o u s
g a p s
t h a t
c o r r e l a t e
w i t h
t h e
p o s i t i o n
o f t h e c l u s t e r s o f
D e l t a - l a c Z R N A
( 2 4 ) .
A l l
t h e s e d a t a
t h u s s u g g e s t
t h a t t h e
p r o t e i n s
e n c o d e d
b y
a c h a e t e ,
s c u t e ,
a n d l e t h a l
o f s c u t e
g e n e s
a r e
d i r e c t l y
o r
i n d i r e c t l y
r e s p o n s i b l e
f o r
a c t i v a t i o n o f t r a n -
s c r i p t i o n
o f
D l
i n t h e n e u r o e c t o d e r m a l
c e l l
c l u s t e r s .
P r o n e u r a l P r o t e i n s
B i n d
t o S p e c i f i c S i t e s
i n
t h e
D l
P r o m o t e r .
T o
s u b s t a n t i a t e f u r t h e r t h e
r e l a t i o n s h i p s
b e t w e e n p r o n e u r a l
g e n e s
a n d
D l ,
we
u s e d
b a c t e r i a l l y
e x p r e s s e d
a c h a e t e ,
l e t h a l
p
-
I-
~ A
X
+ 1
BG
roI
I X
X
ATG
X I
X I I
F I G .
1 . P o s i t i o n s o f
b i n d i n g
s i t e s f o r
p r o n e u r a l p r o t e i n s ( i n d i c a t e d b y
Roman
n u m e r a l s )
o n
t h e 4 . 3 - k b
p r o m o t e r f r a g m e n t . E , E c o R I ; R V ,
E c o R V ; B G , B g l I I ;
H ,
H i n d I I I ;
P ,
P s t I ; X ,
X b a I . S t a r t s i t e a n d d i r e c t i o n o f D e l t a
t r a n s c r i p t i o n
a r e
i n d i c a t e d
b y
t h e b e n t a r r o w .
P r o c .
N a t l .
Acad
S c i .
USA
9 1
( 1 9 9 4 )
-
8/10/2019 lateral inhibition
3/5
P r o c .
N a t l . A c a d .
S c i .
USA
9 1
( 1 9 9 4 )
1 0 1 4 1
B c
E
F i G .
2 .
I n
s i t u
h y b r i d i z a t i o n s w i t h
d i g o x i g e n i n - l a b e l e d
l a c Z
p r o b e s on t r a n s g e n i c s t a g e - 8 e m b r y o s . ( A )
E m b r y o
c a r r i e s
t h e
D l E 2 ( - 4 . 3 )
c o n s t r u c t
( 2 4 ) ,
w h i c h
c o n s i s t s
o f
t h e
D 1
w i l d - t y p e
4 . 3 - k b
promoter
f i a g m e n t
a n d l a c Z
r e p o r t e r
gene. N o t i c e t h e
n e u r o e c t o -
d e r m a l
c l u s t e r s o f
e x p r e s s i o n
( a r r o w h e a d s ) .
I n
B-F
t h e e m b r y o
c a r r i e s
t h e
same t r a n s g e n e
w i t h d i f f e r e n t b o x e s m u t a t e d . ( B )
E m b r y o
c a r r i e s c o n s t r u c t M 2 , w i t h a m u t a t e d
I V
b ox . ( C)
Embryo c a r r i e s
c o n s t r u c t
M l
w i t h b o x I I I m u t a t e d . ( D )
Embryo c a r r i e s c o n s t r u c t MS
w i t h
m u t a t e d b o x e s
I X ,
X , a n d XI. ( E )
Embryo c a r r i e s
c o n s t r u c t M 3
w i t h
b o x e s
I l l
a n d
IV m u t a t e d .
( F ) C o n s t r u c t M6
c a r r i e d
m u t a t i o n s
i n b o x e s I I , I I I , I V , I X ,
X , a n d X I .
E m b r y o s
c a r r y i n g c o n s t r u c t
M 4 ,
w i t h b o x e s II , I I I , a n d IV m u t a t e d
( d a t a
n o t
s h o w n ) , e x h i b i t
t h e
same
e x p r e s s i o n
as
t h o s e s h o w n i n E a n d
F .
( A n t e r i o r
i s
a t
t o p i n
a l l
p h o t o g r a p h s ; X 1 2 5 . )
o f s c u t e ,
a n d
d a u g h t e r l e s s
p r o t e i n s
f o r
e l e c t r o p h o r e t i c
mo-
b i l i t y s h i f t a n d
DNase
I
p r o t e c t i o n assays.
d a u g h t e r l e s s gene
( d a )
i s
u b i q u i t o u s l y
e x p r e s s e d a n d e n c o d e s a b a s i c
h e l i x -
l o o p - h e l i x p r o t e i n
( 2 9 ,
3 0 )
c a p a b l e o f f o r m i n g
h e t e r o d i m e r s
w i t h p r o t ei n s
e n c o d e d
b y
A S C
t h a t
b i n d
t o
DNA w i t h h i g h
a f f i n i t y ( 3 1 ) .
We
f i n d h i g h - a f f i n i t y
b i n d i n g o f
d a u g h t e r l e s s /
l e t h a l
o f s c u t e
a n d
d a u g h t e r l e s s / a c h a e t e
h e t e r o d i m e r s , as
w e l l
as
l o w - a f f i n i t y
b i n d i n g o f t h e
c o r r e s p o n d i n g h o -
m o d i m e r s , t o
a
number
o f
E - b o x e s
(CANNTG) a n d o t h e r
s i t e s
w i t h i n t h e
4 . 3 - k b
promoter
f r a g m e n t
( F i g .
1 , T a b l e
1 ) .
The h i g h e s t b i n d i n g
a f f i n i t y
f o r b o t h
h e t e r o d i m e r s
was f o u n d
a t s i t e s I I I a n d I X ; s i t e s
I I
a n d X I
s h o w s l i g h t l y
l o w e r
a f f i n i t i e s ,
a n d a l l t h e
r e m a i n i n g
s i t e s s h o w
m u c h
l o w e r
a f f i n i t i e s .
One b i n d i n g
s i t e ( I V )
c o n s i s t e d o f 1 8 n t
(CACAT-
G T A C C T G C T T A T G ) t h a t were
p r o t e c t e d i n DNase I
assays,
i n c l u d i n g
one
c o n v e n t i o n a l
a n d two
m o d i f i e d E - b o x e s ; a l l t h e
o t h e r
b i n d i n g s i t e s
d e t e c t e d
were
c o n v e n t i o n a l
E - b o x e s ,
a l t h o u g h
1 or 2 n t f l a n k i n g
most E - b o x e s
were a l s o
p r o t e c t e d
i n DNase I
p r o t e c t i o n
a ss a y s .
P r o n e u r a l
P r o t e i n s
A c t i v a t e D l
T r a n s c r i p t i o n .
O l i g o n u c l e -
o t i d e - d i r e c t e d
m u t a g e n e s i s
w a s
u s e d
t o
m o d i f y
b i n d i n g s i t e s
I I ,
I I I ,
I V ,
I X ,
X ,
a n d X I
i n
t h e D l
4 . 3 - k b
p r o m o t e r
f r a g m e n t .
S i x c o n s t r u c t s
w i t h d i f f e r e n t
m u t a t e d b o x e s
( c o n s t r u c t
Ml
w i t h b o x I I I
m u t a t e d ; c o n s t r u c t M 2 w i t h a m u t a t e d b o x
I V ;
c o n s t r u c t M 3 w i t h
b o x e s I I I
a n d
I V m u t a t e d ;
c o n s t r u c t M 4
w i t h
b o x e s
I I ,
I I I , a n d I V
m u t a t e d ;
c o n s t r u c t MS
w i t h
m u t a t e d b o x e s
I X ,
X , a n d
X I ; a n d
c o n s t r u c t M 6
w i t h
m u t a t i o n s i n b o x e s I I ,
I I I , I V ,
I X , X ,
a n d
X I ;
F i g s . 1 a n d
2 )
w e r e
m a d e .
F o o t p r i n t i n g
a n a l y s i s
u s i n g
m i x t u r e s
o f
d a u g h -
t e r l e s s ,
l e t h a l o f
s c u t e a n d / o r
a c h a e t e
p r o t e i n s g a v e n e g a t i v e
r e s u l t s
f o r b i n d i n g
t o
t h e
f r a g m e n t
c a r r y i n g t h e
m u t a t e d s i t e s
I I , I I I ,
a n d
I V . B e c a u s e a f t e r
m u t a g e n e s i s s i t e s
I X ,
X , a n d X I
h a v e t h e
s a m e s e q u e n c e a s m u t a t e d
s i t e I I , we
a s s u m e
t h a t
b i n d i n g o f
p r o n e u r a l p r o t e i n s t o
t h e s e s i t e s i s a l s o a b o l i s h e d .
I t i s
w o r t h
m e n t i o n i n g t h a t m u t a t i o n
o f s i t e I V (CACATG-
TACCTGCTTATG) t o
CACATGTACATCATTAAT a b o l -
i s h e d
i t s
b i n d i n g a b i l i t i e s , a l t h o u g h
t h e r e s u l t i n g s e q u e n c e s t i l l
i n c l u d e d
a c o n v e n t i o n a l (CACATG)
E - b o x ,
i n d i c a t i n g t h a t
t h i s E - b o x
i s
n o t s u f f i c i e n t
f o r
DNA b i n d i n g .
T o t e s t
w h e t h e r b i n d i n g
o f
ASC
a n d
d a u g h t e r l e s s
p r o t e i n s i s
r e s p o n s i b l e f o r
g e n e r a t i o n o f
t h e
n e u r o e c t o d e r m a l c l u s t e r s
o f
D e l t a - a c Z
t r a n s c r i p t s , t h e
s i x m u t a t e d 4 . 3 - k b
p r o m o t e r
f a g -
m e n t s w e r e c l o n e d
i n f r o n t o f
t h e l a c Z r e p o r t e r
g e n e
a n d
u s e d
f o r
g e r m - l i n e t r a n s f o r m a t i o n .
T o
m a k e
s u r e
t h a t
a l l
e m b r y o s
c a n i e d
t h e m u t a t e d
t r a n s g e n e ,
o n l y
h o m o z y g o u s o r
h e m i z y -
g o u s
v i a b l e i n s e r t i o n s o f
e a c h c o n s t r u c t
w e r e
s t u d i e d ;
b e t w e e n
t w o
a n d s i x
i n d e p e n d e n t i n s e r t i o n s ,
d e p e n d i n g o n
t h e
c o n s t r u c t ,
w e r e u s e d .
S t a i n i n g
c o n d i t i o n s w e r e t h e
s a m e i n
a l l c a s e s . T h e
p a t t e r n
o f
D e l t a - l a c Z t r a n s c r i p t i o n w a s
a l t e r e d i n
e m b r y o s
c a r r y i n g a n y
o f t h e
m u t a t e d 4 . 3 - k b
p r o m o t e r - l a c Z
faents
( F i g . 2 ) ,
i n
t h a t
t h e
a m o u n t o f R N A
d e t e c t e d
b y
i n s i t u
h y b r i d i z a t i o n
u s i n g a
d i g o i g e n i n - l a b e l e d
l a c Z
p r o b e
w a s
r e -
d u c e d
i n a l l
c a s e s .
M u t a g e n e s i s
o f b o x
m
p r o d u c e s f a r
l e s s
d e t e c t a b l e
D e l t a - l a c Z R N A t h a n
d o e s a l t e r a t i o n o f
s i t e
I V
( F i g .
2
B a n d
C ) ,
i n
a g r e e m e n t w i t h
t h e
h i g h e r
b i n d i n g a f f i n i t y
o f
b o x
m. M u t a t i o n
o f b o x e s
I l l
a n d
I V
t o g e t h e r
l e a d s
t o
v i r t u a l l y
c o m p l e t e
l o s s
o f t r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v i t y
o f t h e D e l t a I a c Z
c o n s t r u c t s
w i t h i n t h e
n e u r o e c t o d e r m ( F i g . 2
D - F ) . T h e
p r e s e n t
m a t e r i a l
d i d n o t
a l l o w
u s
t o
c o n c l u d e
w h e t h e r
m u t a t i o n o f
p a r t i c u l a r
b i n d i n g
s i t e s
r e d u c e s D e l t a - l a c Z
t r a n s c r i p t s
i n
d e -
f i n e d r e g i o n s
o f t h e
n e u r o e c t o d e r m .
E p i d e r m a l - D i f f e r e n t i a t i n g A c t i v i t y D e p e n d s o n
T r a n s c r i p -
t i o n a l
A c t i v a t i o n b y
P r o n e u r a l
P r o t e i n s . A
m i n i g e n e c o n t a i n -
i n g
t h e e n t i r e
w i l d - t y p e
c o d i n g
r e g i o n
o f D l d r i v e n
b y
a
- 9 . 2 - k b
f r a g m e n t
o f
w i l d - t y p e
5
g e n o m i c
D N A
( m g 3 9 ;
r e f .
2 4 )
c a n a l m o s t
c o m p l e t e l y
r e s t o r e D l
f u n c t i o n
d u r i n g e a r l y
n e u r o g e n e s i s
a n d , c o n s e q u e n t l y ,
r e s c u e s
t h e
n e u r o g e n i c p h e -
n o t y p e
o f
e m b r y o s h o m o z y g o u s
f o r
t h e
a m o r p h i c
m u t a t i o n
D I F l O ( r e f s .
2 2 - 2 4 ; s e e
F i g s . 3
a n d 4 ) .
A c c o r d i n g l y ,
we u s e d
v a r i a n t s
o f
t h i s m i n i g e n e t o t e s t
t h e
f u n c t i o n
o f
t h e
m u t a t e d
p r o m o t e r
f r a g m e n t s . P o s i t i o n a l e f f e c t s
w e r e c o n t r o l l e d
b y
s t u d y i n g t h r e e
t o f o u r
i n d e p e n d e n t i n s e r t i o n s o f e a c h m i n i -
g e n e .
T h e a b i l i t y o f
m g 3 9
t o r e s c u e
t h e
n e u r o g e n i c
p h e n o t y p e
o f
t h e l o s s - o f - f u n c t i o n
o f
D l w a s
c o n s i d e r a b l y
r e d u c e d
b y
m u t a t i o n o f
b i n d i n g
s i t e s
f o r
b a s i c
h e l i x - l o o p - h e l i x
p r o n e u r a l
p r o t e i n s .
T r a n s g e n i c D I F l O
e m b r y o s
c a r r y i n g
e i t h e r
m g 2 4 ,
w h i c h
c o r r e s p o n d s t o m g 3 9 w i t h t w o
m u t a n t
s i t e s
I I I
a n d
I V ) , o r
m g 4 8 ,
w h i c h h a s s i x m u t a t e d s i t e s
I I ,
I I I ,
I V , I X ,
X ,
a n d X I )
i n t h e
s a m e
f r a g m e n t ,
e x h i b i t e d a
s t r o n g l y
n e u r a l i z e d
n e u r o e c t o d e r m ,
w h i c h a t t a i n e d a n i n t e r m e d i a t e
p h e n o t y p i c
d e g r e e
( F i g s .
3
D
a n d E a n d
4
G
a n d
H ) .
DISCUSSION
T h e p r o t e i n s e n c o d e d
b y t h e
g r o u p
o f
p r o n e u r a l
g e n e s ,
t o
w h i c h
ASC
b e l o n g s ,
a r e k n o w n
t o
r e n d e r
n e u r o e c t o d e r m a l
c e l l s
c o m p e t e n t
f o r
a n e u r a l f a t e
3 ,
4 ) .
O u r d a t a
s h o w
t h a t
p r o t e i n s
e n c o d e d
b y
ASC g e n e s a n d d a
a l s o d i r e c t l y a c t i v a t e
D e l t a
t r a n s c r i p t i o n b y
b i n d i n g t o
s p e c i f i c
s i t e s i n
t h e D l
D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y :
K u n i s c h
e t
a l .
-
8/10/2019 lateral inhibition
4/5
1 0 1 4 2
D e v e l o p m e n t a l
B i o l o g y :
K u n i s c h
e t a l .
F I G .
3 .
C u t i c l e p r e p a r a t i o n s .
( A )
W i l d
t y p e .
( B )
H o m o z y g o u s
D l F X 1 O
e m b r y o ;
t h e
c u t i c l e o f t h i s
e m b r y o
i s
r e d u c e d t o a s m a l l
d o r s a l
p a t c h .
( C ) H o m o z y g o u s
D l F X 1 o
e m b r y o t r a n s g e n i c
f o r
m g 3 9 2 4 ) .
T h e m u t a n t
p h e n o t y p e
h a s
b e e n
c o n s i d e r a b l y a t t e n u a t e d ;
t h e
e m b r y o
s h o w s
o n l y
s l i g h t
h e a d d e f e c t s .
( D
a n d
E ) H o m o z y g o u s
D l F x 1 O
e m b r y o s
c a r r y i n g
m g 2 4
a n d
m g 4 8 , c o r r e s p o n d i n g
t o
m g 3 9
b u t
w i t h s i t e s
I I I
a n d
I V ,
a n d
s i t e s
I I ,
I I I , I V , I X ,
X ,
a n d
X I ,
r e s p e c t i v e l y ,
m u t a t e d . T h e
r e s c u i n g
a b i l i t i e s o f t h e
m u t a n t
m i n i g e n e s
a r e
c o n s i d e r a b l y
r e d u c e d :
o n l y
d o r s a l
e p i d e r m i s
d e v e l o p s .
( x 1 2 5 . )
p r o m o t e r .
T h e c l u s t e r s o f D e lt a - la c Z
R N A - c o n t a i n i n g
n e u -
e n d o g e n o u s g e n e
was
s t r o n g l y
m o d i f i e d i n
s u c h
m u t a n t
r o e c t o d e r m a l
c e l l s
e x p r e s s e d
b y
t h e
4 . 3 - k b
p r o m o t e r
f r a g -
e m b r y o s
2 4 ) .
We
s h o w
h e r e
t h a t
g e n e r a t i o n
o f
t h e
n e u r o -
m e n t h a d b e e n
r e p o r t e d
a b s e n t
i n
e m b r y o s l a c k i n g
a l l
ASC e c t o d e r m a l
t r a n s c r i p t i o n p a t t e r n d e p e n d s
on
b i n d i n g
o f
p r o -
g e n e s
a n d
s t r o n g l y
m o d i f i e d
i n
t h o s e
l a c k i n g
i n d i v i d u a l
AS C
n e u r a l
p r o t e i n s
t o
s p e c i f i c p r o m o t e r
s i t e s ,
a s t h i s
p a t t e r n
i s
g e n e s ;
a l s o t h e n e u r o e c t o d e r m a l
t r a n s c r i p t i o n
p a t t e r n
o f
t h e
a f f e c t e d
u p o n
m u t a t i o n
o f
t h e s e s i t e s .
M u t a t i o n
o f a
s i n g l e
F I G . 4 . F l a t
p r e p a r a t i o n s
o f t h e
e m b r y o n i c
g e r m
b a n d
f r o m
w i l d - t y p e
( A )
i s
s t a g e
9 ;
B
i s
s t a g e
1 0 ) ,
D I F l O
X
i
o m o z y g o t e s ( C
i s
s t a g e
9 ;
D i s
s t a g e
^t
^1 1 ) ,
D i F l O
h o m o z y g o t e s c a r r y i n g
m g 3 9
( E
i s l a t e
s t a g e
9 ;
F
i s
s t a g e
1 0 ) ,
a n d
D I F I O
h o m o z y g o t e s c a r r y i n g
^
m g 2 4
( G
i s l a t e
s t a g e
9 ;
H i s
s t a g e
1 1 ) .
N e u r o b l a s t s
( a r r o w h e a d s
i n
A )
a n d
s e n s o r y - o r g a n
m o t h e r c e l l s
( a r r o w -
h e a d
i n
B )
w e r e
v i s u a l i z e d
w i t h
a n
a n t i b o d y a g a i n s t
3 - g a l a c t o s i d a s e
a n d
a
s e c o n d a r y a n t i b o d y c o u p l e d
t o
a l -
k a l i n e
p h o s p h a t a s e
( v i o l e t r e a c t i o n
*
_t
K
; p r o d u c t ) ;
( - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y
i n
*
~a-
h e s e c e l l s
w a s
d r i v e n
b y
a
n e u r a l
e n h a n c e r .
A l l
e m b r y o s
w e r e a l s o
s t a i n e d
w i t h
s e c o n d a r y a n t i b o d y
c o u -
p l e d
t o
h o r s e r a d i s h
p e r o x i d a s e ,
b r o w n r e a c t i o n
p r o d u c t 2 2 ) .
T h e
t ;x.
i snumber
o f
n e u r o b l a s t s i n c r e a s e s b e -
t w e e n
s t a g e s
9 a n d
1 1
i n
t h e w i l d
t y p e
f f i r
A
t
,
t
_ 1 A-B ,
n d
t h e
n e u r a l i z a t i o n o f
t h e
r
1 ; t ; t
e u r o e c t o d e r m
a n d
p r o n e u r a l
c l u s -
t e r s
t h a t
g i v e
r i s e t o s e n s o r y
o r g a n s
( a r r o w h e a d
i n
D )
f o l l o w s
a s i m i l a r
c o u r s e
i n
t h e m u t a n t s ( C - D ) . T h e
wt
}>i
L }
wgw
t ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ m u t a n t
p h e n o t y p e
i s
c o n s i d e r a b l y
w e a k e n e d
b y
a
c o p y
o f
m g 3 9 .
T h e
ipatternof
e u r o b l a s t s i n
E r e s e m b l e s
t h a t
o f w i l d
t y p e
( A
a n d
B ) .
H o w e v e r ,
; z K a g e s A
_ 7 >s _
m o r e
n e u r o b l a s t s t h a n n o r m a l a r e d e -
Z I
> * 3 2 2 _
j l 4 * , A
,
t e c t e d i n o l d e r m u t a n t
e m b r y o s
F ) ,
w h i c h
ma y
a c c o u n t
f o r t h e
s l i g h t
c u -
ticul re f e c t s . I n i t i a l s t a g e s o f n eu -
r o g e n e s i s
a r e
e s s e n t i a l l y
n o r m a l i n
D I F l O h o m o z y g o t e s
t h a t
c a r r y
m g 2 4 ,
c o r r e s p o n d i n g
t o
m g 3 9
b u t w i t h b o x e s
I I I
a n d I V
m u t a t e d
( G ) . H o w e v e r ,
D e l t a
a c t i v i t y
s u p p l i e d b y
m g 2 4
i s
i n s u f f i c i e n t
a t l a t e r
s t a g e s ,
a n d
t h e
f i n a l
n e u r a l i z a t i o n s e e n
i n
t h e s e em-
b r y o s
i s
c o n s i d e r a b l e
( H ) . ( A n t e r i o r i s
7
G
av
E
a t
t o p
i n
a l l
p h o t o g r a p h s ; x 1 2 5 . )
P r o c .
N a t l .
Acad
S c i . USA
9 1
( 1 9 9 4 )
-
8/10/2019 lateral inhibition
5/5
P r o c .
N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 ( 1 9 9 4 )
1 0 1 4 3
h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g s i t e , s u c h
a s s i t e I I I ,
l e a d s
t o s t r o n g
r e d u c t i o n
o f
t h e
D e l t a - l a c Z
t r a n s c r i p t s
i n
t h e n e u r o e c t o d e r -
m a l c e l l c l u s t e r s ; m u t a t i o n
o f s i t e
I I I
a l o n g
w i t h m u t a t i o n
o f
t h e l o w - a f f i n i t y s i t e I V a b o l i s h e s
t r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v i t y o f
t h e D e l t a - l a c Z c o n s t r u c t i n t h e n e u r o e c t o d e r m . F u r t h e r -
m o r e ,
o u r r e s u l t s s h o w t h a t t h e i n f l u e n c e t o w a r d a n
e p i d e r -
m a l f a t e o f
t h e
D e l t a p r o t e i n
o n n e i g h b o r i n g
c e l l s d e p e n d s
o n
a c t i v a t i o n
o f
D e l t a
t r a n s c r i p t i o n m e d i a t e d
b y b i n d i n g
o f
t h e
p r o n e u r a l p r o t e i n s :
m g 3 9
l o s e s i t s
a b i l i t y t o r e s c u e
t h e
n e u r o g e n i c
p h e n o t y p e
o f
D l F - h o m o z y g o u s
e m b r y o s
a f t e r
m ut a t i o n o f
t w o o r m o r e o f t h e
b i n d i n g
s i t e s f o r p r o n e u r a l
p r o t e i n s .
T h e s e
f i n d i n g s t h u s s u g g e s t
t h e
f o l l o w i n g m e c h a n i s m f o r
s e g r e g a t i o n
o f
t h e n e u r o b l a s t f r o m
a n i n i t i a l l y
e q u i v a l e n t
g r o u p
o f c e l l s .
I t i s
a s s u m e d t h a t n e u r o b l a s t s , l i k e s e n s o r y -
o r g a n
m o t h e r c e l l s
( 3 2 , 3 3 ) ,
a r e s i n g l e d o u t f r o m p r o n e u r a l
c l u s t e r s b e c a u s e
t h e y
e x p r e s s p r o n e u r a l p r o t e i n s
a t
l e v e l s
e x c e e d i n g
a c r i t i c a l t h r e s h o l d . N o t e t h a t p r o n e u r a l
g e n e
p r o d u c t s a c t i v a t e t r a n s c r i p t i o n o f
t h e i r own
g e n e s
( 3 4 , 3 5 ) .
A c t i v a t i o n
o f
D e l t a
t r a n s c r i p t i o n
b y
p r o n e u r a l
p r o t e i n s
e n -
h a n c e s
t h e
a b i l i t y o f t h e
p r o s p e c t i v e
n e u r o b l a s t
t o s e n d a n
i n h i b i t o r y
s i g n a l t o
n e i g h b o r i n g
c e l l s . W i t h i n
a n
a r r a y
o f
m u t u a l l y i n t e r a c t i n g
c e l l s ,
f l u c t u a t i o n s i n p r o n e u r a l p r o t e i n s
c o u l d
i n c r e a s e
i n h i b i t o r y
s t r e n g t h
b y o n e
o f t h e
c e l l s ,
t h u s
l o w e r i n g
t h e p r o b a b i l i t y
t h a t
a n y s u r r o u n d i n g
c e l l s
a d o p t
t h e
n e u r a l f a t e . T h i s d i f f e r e n t i a t i o n ,
i n
t u r n , r e d u c e s t h e i r
e f f i -
c a c y
a s s o u r c e s
o f
l a t e r a l
i n h i b i t i o n
a n d
e v e n t u a l l y
l e a d s t o
a
r e i n f o r c e m e n t
o f
t h e n e u r a l - f a t e
d e c i s i o n o f t h e
n e u r o b l a s t .
We a r e
g r a t e f u l
t o
N i p a m
P a t e l a n d
C o r e y
G o o d m a n f o r
t h e
s e c o n d a r y a n t i b o d y
c o u p l e d
t o
h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ,
B e a t e
H o s s
f o r
e x p e r t
t e c h n i c a l
a s s i s t a n c e ,
a n d
o u r
c o l l e a g u e s
i n
C o l o g n e
f o r
d i s c u s s i o n s .
T h i s w o r k w a s
s u p p o r t e d b y
t h e
D e u t s c h e
F o r s c h u n g s -
g e m e i n s c h a f t ( S F B 2 4 3 )
a n d t h e
F o n d s
d e r
C h e m i s c h e n
I n d u s t r i e .
M . K .
w a s
a
f e l l o w
o f
B o e h r i n g e r I n g e l h e i m
F o n d s .
1 .
H a r t e n s t e i n ,
V .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
( 1 9 8 4 )
R o u x ' s
A r c h .
D e v . B i o l .
1 9 3 ,
3 0 8 - 3 2 5 .
2 . T e c h n a u , G .
M .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
( 1 9 8 5 )
R o u x ' s
A r c h .
D e v .
B i o l .
1 9 4 ,
1 9 6 - 2 1 2 .
3 .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
( 1 9 9 3 )
i n
T h e
D e v e l o p m e n t
o f
D r o s o p h -
i l a ,
e d s . B a t e ,
C .
M.
M a r t i n e z - A r i a s ,
A .
( C o l d S p r i n g
H a r b o r
L a b .
P r e s s ,
P l a i n v i e w , N Y ) , p p .
1 0 9 1 - 1 1 2 9 .
4 .
G h y s e n , A . ,
D a m b l y - C h a u d i t r e ,
C . ,
J a n ,
L .
Y .
J a n ,
Y .
N .
( 1 9 9 3 )
G e n e s D e v . 7 ,
7 2 3 - 7 3 3 .
5 .
B r a n d ,
M .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
( 1 9 9 0 )
R o u x ' s A r c h . D e v .
B i o l .
1 9 8 ,
2 7 5 - 2 8 5 .
6 .
F e h o n ,
R .
G . ,
K o o h , P . J . , R e b a y ,
I . ,
R e g a n ,
C .
L . ,
X u ,
T . ,
M u s k a v i t c h ,
M .
A .
T .
A r t a v a n i s - T s a k o n a s , S . ( 1 9 9 0 )
C e l l
6 2 ,
5 2 3 - 5 3 3 .
7 . L i e b e r , T . ,
A l c a m o ,
E . ,
H a s s e l ,
B . ,
K r a n e , J . F . , C a m p o s -
O r t e g a ,
J .
A .
Y o u n g ,
M . W. ( 1 9 9 2 )
N e u r o n
9 ,
8 4 7 - 8 5 9 .
8 . T a g h e r t , P .
H . ,
D o e , C .
Q .
G o o d m a n ,
C . S .
( 1 9 8 4 )
N a t u r e
( L o n d o n )
3 0 7 ,
1 6 3 - 1 6 5 .
9 . D o e , C . Q .
G o o d m a n , C . S . ( 1 9 8 5 )
D e v .
B i o l .
1 1 1 ,
2 0 6 - 2 1 9 .
1 0 .
T e c h n a u ,
G .
M .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
( 1 9 8 6 )
R o u x ' s
A r c h .
D e v .
B i o l . 1 9 5 , 4 4 5 - 4 5 4 .
1 1 . S t u t t e m , I .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
( 1 9 9 1 ) D e v e l o p m e n t ( C a m -
b r i d g e ,
U . K . ) S u p p l . 2 ,
3 9 - 4 6 .
1 2 .
T e c h n a u ,
G . M .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
( 1 9 8 7 )
P r o c .
N a t l .
A c a d . S c i . USA 8 4 , 4 5 0 0 - 4 5 0 4 .
1 3 .
H e i t z l e r ,
P .
S i m p s o n ,
P .
( 1 9 9 1 ) C e l l 6 4 ,
1 0 8 3 - 1 0 9 2 .
1 4 . H e i t z l e r , P . S i m p s o n , P . ( 1 9 9 3 ) D e v e l o p m e n t ( C a m b r i d g e ,
U . K . )
1 1 7 ,
1 1 1 3 - 1 1 2 3 .
1 5 .
L i e b e r ,
T . , K i d d , A l c a m o ,
S .
E . ,
C o r b i n ,
V .
Y o u n g ,
M .
W.
( 1 9 9 3 )
G e n e s
D e v . 7 , 1 9 4 9 - 1 9 6 5 .
1 6 .
S t r u h l , G . , F i t z g e r a l d ,
K .
G r e e n w a l d , I .
( 1 9 9 3 ) C e l l
7 4 ,
3 3 1 - 3 4 5 .
1 7 .
V i l l a r e s ,
R .
C a b r e r a ,
C .
V .
( 1 9 8 7 ) C e l l 5 0 , 4 1 5 - 4 2 4 .
1 8 . A l o n s o ,
M . C .
C a b r e r a , C .
V .
( 1 9 8 8 )
E M BO
J .
7 ,
2 5 8 5 - 2 5 9 1 .
1 9 .
K l i m b t ,
C . ,
K n u s t , E . ,
T i e t z e ,
K .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
( 1 9 8 9 ) E M B O
J . 8 , 2 0 3 - 2 1 0 .
2 0 .
D e l i d a k i s ,
C .
A r t a v a n i s - T s a k o n a s ,
S .
( 1 9 9 2 )
P r o c . N a t l .
A c a d . S c i .
USA 8 9 ,
8 7 3 1 - 8 7 3 5 .
2 1 . K n u s t , E . , S c h r o n s ,
H . , G r a w e ,
F .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
( 1 9 9 2 )
G e n e t i c s
1 3 2 ,
5 0 5 - 5 1 8 .
2 2 .
C a m p o s - O r t e g a ,
J .
A .
H a e n l i n ,
M .
( 1 9 9 2 )
R o u x ' s
A r c h . D e v .
B i o l . 2 0 1 ,
1 - 1 1 .
2 3 . H a e n l i n , M . ,
K r a m a t s c h e k ,
B .
C a m p o s - O r t e g a , J .
A . ( 1 9 9 0 )
D e v e l o p m e n t ( C a m b r i d g e ,
U . K . ) 1 1 0 ,
9 0 5 - 9 1 4 .
2 4 .
H a e n l i n , M . ,
K u n i s c h ,
M . , K r a m a t s c h e k ,
B .
C a m p o s - O r -
t e g a , J .
A .
( 1 9 9 4 )
M e c h . D e v . 4 7 , 9 9 - 1 1 0 .
2 5 .
T h i s s e , C . ,
P e r r i n - S c h m i t t ,
F . , S t o e t z e l , C . T h i s s e ,
B .
( 1 9 9 1 )
C e l l
6 5 ,
1 1 9 1 1 2 0 1
2 6 .
T a u t z ,
D .
P f e i f l e ,
C .
( 1 9 8 9 )
C h r o m o s o m a 9 8 , 8 1 - 8 5 .
2 7 .
S t u d i e r ,
F .
W.
M o f f a r t ,
A .
( 1 9 8 6 )
J .
M o l . B i o l .
1 8 9 , 1 1 3 - 1 3 0 .
2 8 .
O e l l e r s ,
N . ,
D e h i o ,
M .
K n u s t ,
E .
( 1 9 9 4 )
M o l . G e n . G e n e t .
2 4 4 , 4 6 5 - 4 7 3 .
2 9 .
C a u d y ,
M . , V a e s s i n ,
H . ,
B r a n d ,
M . ,
T u m a , R . , J a n , L .
Y .
J a n ,
Y .
N .
( 1 9 8 8 )
C e l l 5 5 ,
1 0 6 1 - 1 0 6 7 .
3 0 .
C r o n m i l l e r ,
C . ,
S c h e d l ,
P .
C l i n e ,
T .
W.
( 1 9 8 9 ) G e n e s
D e v .
2 ,
1 6 6 6 1 6 7 6
3 1 .
M u r r e ,
C . ,
S c h o n l e b e r
M c C a w ,
P . ,
V a e s s i n ,
H . ,
C a u d y ,
M . ,
J a n ,
L .
Y . ,
J a n ,
Y .
N . , C a b r e r a , C . V . , B u s k i n , J .
N . ,
H a u s c h k a ,
S .
D . , L a s s a r ,
A .
B . , W e i n t r a u b ,
H .
B a l t i m o r e ,
D .
( 1 9 8 9 )
C e l l 5 8 ,
5 3 7 - 5 4 4 .
3 2 .
C u b a s , P . ,
d e
C e l i s ,
J . - F . ,
C a m p u z a n o ,
S .
M o d o l e l l ,
J .
( 1 9 9 1 )
G e n e s
D e v .
5 ,
9 9 6 - 1 0 0 8 .
3 3 .
S k e a t h , J .
B .
C a r r o l l ,
S .
B .
( 1 9 9 1 ) G e n e s D e v . 5 ,
9 8 4 - 9 9 5 .
3 4 . v a n
D o r e n ,
M . , P o w e l l ,
P .
A . ,
P a s t e r n a k ,
D . ,
S i n g s o n ,
A .
P o s a k o n y ,
J .
W.
( 1 9 9 2 )
G e n e s
D e v .
6 ,
2 5 9 2 - 2 6 0 5 .
3 5 .
M a r t f n e z ,
C . M o d o l e l l , J . ( 1 9 9 2 ) S c i e n c e
2 5 1 ,
1 4 8 5 - 1 4 8 7 .
D e v e l o p m e n t a l
B i o l o g y :
K u n i s c h e t a l .