introducción a la lipidómica, preparación de muestras y ......spener, f. y col. (2003) eur. j....

Introducción a la Lipidómica,

preparación de muestras y

análisis cuantitativo de lípidos

Óscar Pastor, PhD.

Servicio de Bioquímica Clínica

Unidad de Cuantificación Molecular

Hospital Universitario Ramón y Cajal-IRYCIS

[email protected]

2

“Lipids are fatty acids and their derivatives, and

substances related biosynthetically or functionally

to these compounds”

“Hydrophobic or amphipathic small molecules that

may originate entirely or in part by carbanion-based

condensations of thioesters (fatty acids, polyketides,

etc.) and/or by carbocation-based condensations of

isoprene units (prenols, sterols, etc.)”

“Group of naturally occurring compounds, which have

in common a ready solubility in such organic solvents

as hydrocarbons, chloroform, benzene, ethers and

alcohols”

…si no es aminoácido, no es proteína, no es

carbohidrato, no es ácido nucleico….es un lípido.

¿Qué es la lipidómica?

TLC HPLC

Nivel de grupo o clase

“Estudio de los lípidos en el organismo…”

3

Grupo o clase de lípido

Conjunto de moléculas de lípido que comparten

estructura y propiedades químicas similares

Esteroles Triglicéridos

Fosfatidilcolina

(PAF)

Ceras

Funciones muy distintas 4

¿Cuál es el objetivo de la lipidómica?

“Caracterización a nivel mólecular de los lípidos

en un sistema biológico, así como su función y

estudiar su relación con la expresión de las

enzimas y proteínas implicadas en su

metabolismo y su regulación génica”

Caracterizar CUANTIFICAR

En lípidos la información relevante es sobre

todo cuantitativa

5

Spener, F. y col. (2003) Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105: 481-482.

tég

no

logía

permanentes

Continuos (min)

Espectrometría de

masas

Técnicas de

secuenciación

6

7

Triglicérido (TG) clase

especie TG (52:4)

ácido_graso TG (16:0_18:1_18:3)

posición TG (16:0/18:1/18:3)

molécula TG (16:0/18:1ω-9/18:3 ω-3)

Reto analítico: caracterizar y cuantificar

¿Cúal es el reto de la lipidómica?

- 3 cadenas alifáticas C-6 a C-32

- Hasta 6 dobles enlaces

- cis / trans

37 cadenas distintas en humanos

Triglicéridos

9139;)!1(!

)!1(3,37,

CR

mn

nmCR nm

8

2

90 especies distintas !!!

TG (52:1)

9

6500 Fosfolípidos distintos !!!

General

st ructure of

sphingolipids

Building blocks of sphingolipids

26000 Esfingolípidos distintos !!!

www.lipidmaps.org

12

LIPIDOMICS !!!

¿Cómo se realiza un estudio de lipidómica?

Cl3CH/MeOH (2:1) Folch. J.1957 JBC

Calibrator

CL

FC

Calibrator

CL

CL

FC

FC

Figure 1. Separation of a mixed lipid standard. Each lipid in the mix was present at a

concentration of 50 mg/dL. CE, cholesteryl ester; TG, triglyceride; FC, free cholestrol; FFA,

free fatty acids; ISTD, bathyl alcohol internal standard; MG, monoglycerides; PE,

phatidylethanolamine; PG, phosphatidylglicerol; CL, cardiolipin; PI, phosphatidylinositol; PS,

phosphatidylserine; PC, phosphatidylcholine; SPM, sphyngomyelin.

isooctano isopropanol cloroformo

polaridad

IPA/hexano (2:3)

MTBE

Importante la adición de

estándares internos para controlar

la recuperación de nuestra clase Chamorro L. Pastor O y cols. Clin Chim Acta. 2013 14

Estándares

de clase

Es imprescindible optimizar las condiciones de extracción para nuestra clase

15

Métodos de fraccionamiento en clases

R-NH2

Cl3CH/IPA Et2O MeOH

CE, TAG FFA PL

16

TLC (cromatografía de capa fina)

17

HPLC-ELSD

Chamorro L. Pastor O y cols. Clin Chim Acta. 2013 18

Espectrometría de masas (nivel especies-moléculas)

•Medida de la masa molecular / nº de cargas (m/z)

•Intensidad ~ concentración de la sustancia

19

Esquema de un analizador de masa

M M+1

M+2

M+3

I total = I n 1+ 0.0109n+0.01092 n(n-1)

2+...

æ

èç

ö

ø÷

Concn =I total (n)

I total (istd)

æ

èçç

ö

ø÷÷Concistd

Cuantificación directa basada en espectros de masa

I total (n)

I total (s)

Conctotal (n)

Concistd

21

Serna J, Pastor O y cols. Chem Phys Lipids 2015.

Estrategia de cuantificación directa (“shotgun”)

23

421 candidatos

125 candidatos

746.6 ± 0.5 Da

746.6 ± 0.05 Da

PC-O-34:1

746.5695

PC 33:1

746.6058

PE 36:1

746.5622

PS-O-34:2

746.5330

746.6 m/z

24

En una muestra compleja la masa es insuficiente para identificar un lípido

Rmin=M/Δm=746.5695/0.0365 =20454

Rmin=M/Δm=746.5695/0.0005 =1493139 !!!!

Analizador MS/MS

Phosphatydilcholine (PC 18:0/20:4))

O

O

H O

R 1 O O P

- O

O

O

R 2

H e a d g r o u p

g l y c e r o l p h o s p h o d i e s t e r

Choline: -CH2-CH2-N(CH3)+ Mr=104.17080

R1: -CH2-(CH2)n-CH3 n=16 Mr=256.2475, Stearic

R2: -CH2-(CH2)n-CH3 n=20 (4 double bonds), Mr=304.47, AA

Analizador MS/MS

[M+H]+

810.6007

O

O

HO

R1 O OP

-O

O

O

R2

Headgroup

glycerol phosphodiester

O

O

HO

R1 O OP

-O

O

O

R2

Headgroup


184.150662

m/z

184.1

256.2 304.4

(Daughter)

Identificar una molécula

(Parent)

[M-H]+

810.6007 PC(38:4)

O

O

HO

R1 O OP

-O

O

O

R2

Headgroup


O

O

HO

R1 O OP

-O

O

O

R2

Headgroup


184.150662

m/z

806.60 PC(38:6) 786.6PC(36:4)

782.6 PC(36:2)

760.61 PC(34:1)

762.61 PC(34:0)

Detectar moléculas con un fragmento similar

Summary of the phospholipid class-specific scan modes available in positive and negative ion ESI-MS.

B. Brügger et al. PNAS 1997;94:2339-2344 ©1997 by National Academy of Sciences

Precursor

+184

Análisis PC especies por infusión directa (“shotgun”)

ESI+

La infusión directa no elimina el

problema de la supresión iónica.

Especies muy ionizables como PC

impiden la ionización de las menos

abundantes.

A lipid

extract of a

biological

sample

Negative-

ion mode Anionic lipid

molecular

species

Addition

of LiOH

A mildly

basic lipid

extract

Weak anionic

lipid molecular

species

Charge neutral

but polar lipid

molecular

species

Mass spectra of a

cellular lipidome

Intrasource separation

of cellular lipid classes

Han X. Mass Spectrom Rev. 2012 Jan-Feb;31(1):134-78.

• Posibilidad de infundir el extracto y realizar

multiples excaneados.

• Evitamos la cromatografía.

• Es preciso optimizar las condiciones para cada

clase.

• Problema con especies poco ionizables o poco

abundantes.

• Necesidad de un equipo específico para

realizar la infusión directa.

Inconvenientes

Ventajas

LC-MS/MS

LC

34

tiempo 35

LPC

PC, PE , SM, Cer, DG

TG, CE

Retention Time (seconds)

36

Extracted ion traces

tiempo

EITs

37

EIT (200-410 segundos)

38

Extracted ion chromatograms

tiempo

EICs

39

EICs (400-950 uma)

Area de pico ≈ Conc. molécula 40

• Menos problemas de supresión iónica. Mayor

sensibilidad.

• Identificación de más especies. Separación de

isóbaros.

• Cromatografía. Reproducibilidad de picos.

• Necesidad de instrumentos con tiempos de

escaneado rápidos.

• Procesamiento de señales más complejo.

Inconvenientes

Ventajas

Bioinformático al rescate!!!

42

Una muestra muchas opciones

43

Look! I can smell

ingredients !!!

Oh! You can smell

ingredients. So what?

44

45

No dirijidas: “Untargeted”

morralla

46

Dirigídas: “Targeted”

47

NO dirigida

Infusion-MS

LC-MS/MS

GC-MS

MALDI-MS

TLC / HPTLC

HPLC-ELSD/RAD

Decisiones a tomar en un estudio lipidómico

dirigida

Biomarcadores

Mecanismos

¿Problema? ¿Estrategia? ¿Métodos?

D a y s p o s t-im m u n iz a tio n

Cli

nic

al

Sc

ore

s

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9

0

1

2

3

4 E A E

E A E -E lla g ic

*

*

* *

Cu

mu

lati

ve

Sc

ore

s

E A E E A E -E l la g ic

0

5

1 0

1 5

2 0

**

Da

y o

f o

ns

et

E AE E AE -E lla g ic

0

5

1 0

1 5

**

A B

C

Efecto ácido elagico en un modelo de EAE

Efectos no asociados con

un descenso de

marcadores de estrés

oxidativo

51

dirigida LC-MS/MS Mecanismo


HexCer

Cer

Sulf

LacCer

SM

Efecto ácido elagico en un modelo de EAE

β-actin

MBP

Peak Remission

EAE EAE-Ellagic EAE EAE-Ellagic

Control

Ellagic

Ellagic acid protects from myelin-associated

sphingolipid loss in experimental autoimmune

encephalomyelitis

MB

P/

-ac

tin

ra

tio

0

2

4

6

8

E lla g ic

C o n tro l P e a k R e m is s io n

E A E

*

**

+

+

Acute Remission

c

c

c d

B C



encephalomyelitis



encephalomyelitis

*

*

Cells were cultured in medium with 10% LPDS for 2 h, and then incubated for 4 h with urolithin A (50 μM) or urolithin B (50 μM), in the

presence of 2 µCi/mL of BSA-complexed 3H-palmitate. Control cells were exposed to BSA-complexed 3H-palmitate. Incorporation of 3H-

palmitate into ceramide was monitored by HPLC coupled to a radioflow detector. Radioactivity traces were integrated and corrected for cell

protein and expressed in relative area units. Results are mean ± SEM from three independent experiments. Statistical comparisons shown

are control versus urolithin A or urolithin B (* P < 0.05).

Effect of ellagic acid on ceramide synthesis in rat glia C6 cells.

¿Problema?

La determinación clásica de FA omega-3

es difícil de realizar en la práctica clínica.

¿Puede la lipidómica simplificar su

realización?

57

Monitorización del consumo de omega-3 en nutrición humana

58

NO dirigida LC-MS/MS Biomarcadores


Monitorización del consumo de omega-3 en nutrición humana

MALDI-MS

DHA Placebo

57

57

Figure 1

!22

PLACEBO

basal 6 mo. 12 mo.

DHA Supplemented

basal 6 mo. 12 mo.

z-s

co

re

LC-MS/MS 192 especies analizadas

62

Supplemental Figure 4. Fast PC and LPC lipidomics using MALDI-TOF/MS. Representative

mass spectrum of a plasma sample. Plasma (10 µL) was mixed with 90 µL of acetonitrile (ACN),

containing internal standards, and centrifuged. 10 µL of the upper phase were mixed with 90 µL of

isopropanol/ACN (60/40). The solution was blended 1:1 (v/v) with matrix, 9-aminoacridine

solution (10 mg/mL in IPA/ACN, 60/40). The matrix-sample mixture was finally spotted (0.65 µL)

on a MALDI 384 well plate, and mass spectra acquired on a Bruker Autoflex III MALDI-TOF

spectrometer. PC (phosphatidylcholine) and LPC (lysophosphatidycholine) species were detected as

[M+H]+ adducts.

5

m/z

496.5

834.7

63

Figure 4

!25

r=0.7602

y=0.36383 + 0.58191x

r=0.3674

y=0.41872 + 0.36851x

P=0.007P=0.012

A)

B)

GC-MS 100 muestras 2 semanas

MALDI-MS 100 muestras en 1 día

64

Biochim Biophys Acta. 2016 Sep;1861(9 Pt A):1142-1150. PMID: 27355565

65


A B

C D

Fig 5


introducción a la lipidómica, preparación de muestras y ......spener, f. y col. (2003) eur. j....

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