Introducción a la Lipidómica,
preparación de muestras y
análisis cuantitativo de lípidos
Óscar Pastor, PhD.
Servicio de Bioquímica Clínica
Unidad de Cuantificación Molecular
Hospital Universitario Ramón y Cajal-IRYCIS
2
“Lipids are fatty acids and their derivatives, and
substances related biosynthetically or functionally
to these compounds”
“Hydrophobic or amphipathic small molecules that
may originate entirely or in part by carbanion-based
condensations of thioesters (fatty acids, polyketides,
etc.) and/or by carbocation-based condensations of
isoprene units (prenols, sterols, etc.)”
“Group of naturally occurring compounds, which have
in common a ready solubility in such organic solvents
as hydrocarbons, chloroform, benzene, ethers and
alcohols”
…si no es aminoácido, no es proteína, no es
carbohidrato, no es ácido nucleico….es un lípido.
¿Qué es la lipidómica?
TLC HPLC
Nivel de grupo o clase
“Estudio de los lípidos en el organismo…”
3
Grupo o clase de lípido
Conjunto de moléculas de lípido que comparten
estructura y propiedades químicas similares
Esteroles Triglicéridos
Fosfatidilcolina
(PAF)
Ceras
Funciones muy distintas 4
¿Cuál es el objetivo de la lipidómica?
“Caracterización a nivel mólecular de los lípidos
en un sistema biológico, así como su función y
estudiar su relación con la expresión de las
enzimas y proteínas implicadas en su
metabolismo y su regulación génica”
Caracterizar CUANTIFICAR
En lípidos la información relevante es sobre
todo cuantitativa
5
Spener, F. y col. (2003) Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105: 481-482.
tég
no
logía
permanentes
Continuos (min)
Espectrometría de
masas
Técnicas de
secuenciación
6
7
Triglicérido (TG) clase
especie TG (52:4)
ácido_graso TG (16:0_18:1_18:3)
posición TG (16:0/18:1/18:3)
molécula TG (16:0/18:1ω-9/18:3 ω-3)
Reto analítico: caracterizar y cuantificar
¿Cúal es el reto de la lipidómica?
- 3 cadenas alifáticas C-6 a C-32
- Hasta 6 dobles enlaces
- cis / trans
37 cadenas distintas en humanos
Triglicéridos
9139;)!1(!
)!1(3,37,
CR
mn
nmCR nm
8
2
90 especies distintas !!!
TG (52:1)
9
6500 Fosfolípidos distintos !!!
General
st ructure of
sphingolipids
Building blocks of sphingolipids
26000 Esfingolípidos distintos !!!
www.lipidmaps.org
12
LIPIDOMICS !!!
¿Cómo se realiza un estudio de lipidómica?
Cl3CH/MeOH (2:1) Folch. J.1957 JBC
Calibrator
CL
FC
Calibrator
CL
CL
FC
FC
Figure 1. Separation of a mixed lipid standard. Each lipid in the mix was present at a
concentration of 50 mg/dL. CE, cholesteryl ester; TG, triglyceride; FC, free cholestrol; FFA,
free fatty acids; ISTD, bathyl alcohol internal standard; MG, monoglycerides; PE,
phatidylethanolamine; PG, phosphatidylglicerol; CL, cardiolipin; PI, phosphatidylinositol; PS,
phosphatidylserine; PC, phosphatidylcholine; SPM, sphyngomyelin.
isooctano isopropanol cloroformo
polaridad
IPA/hexano (2:3)
MTBE
Importante la adición de
estándares internos para controlar
la recuperación de nuestra clase Chamorro L. Pastor O y cols. Clin Chim Acta. 2013 14
Estándares
de clase
Es imprescindible optimizar las condiciones de extracción para nuestra clase
15
Métodos de fraccionamiento en clases
R-NH2
Cl3CH/IPA Et2O MeOH
CE, TAG FFA PL
16
TLC (cromatografía de capa fina)
17
HPLC-ELSD
Chamorro L. Pastor O y cols. Clin Chim Acta. 2013 18
Espectrometría de masas (nivel especies-moléculas)
•Medida de la masa molecular / nº de cargas (m/z)
•Intensidad ~ concentración de la sustancia
19
Esquema de un analizador de masa
M M+1
M+2
M+3
I total = I n 1+ 0.0109n+0.01092 n(n-1)
2+...
æ
èç
ö
ø÷
Concn =I total (n)
I total (istd)
æ
èçç
ö
ø÷÷Concistd
Cuantificación directa basada en espectros de masa
I total (n)
I total (s)
Conctotal (n)
Concistd
21
Serna J, Pastor O y cols. Chem Phys Lipids 2015.
Estrategia de cuantificación directa (“shotgun”)
23
421 candidatos
125 candidatos
746.6 ± 0.5 Da
746.6 ± 0.05 Da
PC-O-34:1
746.5695
PC 33:1
746.6058
PE 36:1
746.5622
PS-O-34:2
746.5330
746.6 m/z
24
En una muestra compleja la masa es insuficiente para identificar un lípido
Rmin=M/Δm=746.5695/0.0365 =20454
Rmin=M/Δm=746.5695/0.0005 =1493139 !!!!
Analizador MS/MS
Phosphatydilcholine (PC 18:0/20:4))
O
O
H O
R 1 O O P
- O
O
O
R 2
H e a d g r o u p
g l y c e r o l p h o s p h o d i e s t e r
Choline: -CH2-CH2-N(CH3)+ Mr=104.17080
R1: -CH2-(CH2)n-CH3 n=16 Mr=256.2475, Stearic
R2: -CH2-(CH2)n-CH3 n=20 (4 double bonds), Mr=304.47, AA
Analizador MS/MS
[M+H]+
810.6007
O
O
HO
R1 O OP
-O
O
O
R2
Headgroup
glycerol phosphodiester
O
O
HO
R1 O OP
-O
O
O
R2
Headgroup
glycerol phosphodiester
184.150662
m/z
184.1
256.2 304.4
(Daughter)
Identificar una molécula
(Parent)
[M-H]+
810.6007 PC(38:4)
O
O
HO
R1 O OP
-O
O
O
R2
Headgroup
glycerol phosphodiester
O
O
HO
R1 O OP
-O
O
O
R2
Headgroup
glycerol phosphodiester
184.150662
m/z
806.60 PC(38:6) 786.6PC(36:4)
782.6 PC(36:2)
760.61 PC(34:1)
762.61 PC(34:0)
Detectar moléculas con un fragmento similar
Summary of the phospholipid class-specific scan modes available in positive and negative ion ESI-MS.
B. Brügger et al. PNAS 1997;94:2339-2344 ©1997 by National Academy of Sciences
Precursor
+184
Análisis PC especies por infusión directa (“shotgun”)
ESI+
La infusión directa no elimina el
problema de la supresión iónica.
Especies muy ionizables como PC
impiden la ionización de las menos
abundantes.
A lipid
extract of a
biological
sample
Negative-
ion mode Anionic lipid
molecular
species
Addition
of LiOH
A mildly
basic lipid
extract
Weak anionic
lipid molecular
species
Charge neutral
but polar lipid
molecular
species
Mass spectra of a
cellular lipidome
Intrasource separation
of cellular lipid classes
Han X. Mass Spectrom Rev. 2012 Jan-Feb;31(1):134-78.
• Posibilidad de infundir el extracto y realizar
multiples excaneados.
• Evitamos la cromatografía.
• Es preciso optimizar las condiciones para cada
clase.
• Problema con especies poco ionizables o poco
abundantes.
• Necesidad de un equipo específico para
realizar la infusión directa.
Inconvenientes
Ventajas
LC-MS/MS
LC
34
tiempo 35
LPC
PC, PE , SM, Cer, DG
TG, CE
Retention Time (seconds)
36
Extracted ion traces
tiempo
EITs
37
EIT (200-410 segundos)
38
Extracted ion chromatograms
tiempo
EICs
39
EICs (400-950 uma)
Area de pico ≈ Conc. molécula 40
• Menos problemas de supresión iónica. Mayor
sensibilidad.
• Identificación de más especies. Separación de
isóbaros.
• Cromatografía. Reproducibilidad de picos.
• Necesidad de instrumentos con tiempos de
escaneado rápidos.
• Procesamiento de señales más complejo.
Inconvenientes
Ventajas
Bioinformático al rescate!!!
42
Una muestra muchas opciones
43
Look! I can smell
ingredients !!!
Oh! You can smell
ingredients. So what?
44
45
No dirijidas: “Untargeted”
morralla
46
Dirigídas: “Targeted”
47
NO dirigida
Infusion-MS
LC-MS/MS
GC-MS
MALDI-MS
TLC / HPTLC
HPLC-ELSD/RAD
Decisiones a tomar en un estudio lipidómico
dirigida
Biomarcadores
Mecanismos
¿Problema? ¿Estrategia? ¿Métodos?
48
D a y s p o s t-im m u n iz a tio n
Cli
nic
al
Sc
ore
s
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9
0
1
2
3
4 E A E
E A E -E lla g ic
*
*
* *
Cu
mu
lati
ve
Sc
ore
s
E A E E A E -E l la g ic
0
5
1 0
1 5
2 0
**
Da
y o
f o
ns
et
E AE E AE -E lla g ic
0
5
1 0
1 5
**
A B
C
Efecto ácido elagico en un modelo de EAE
Efectos no asociados con
un descenso de
marcadores de estrés
oxidativo
50
51
dirigida LC-MS/MS Mecanismo
¿Problema? ¿Estrategia? ¿Métodos?
HexCer
Cer
Sulf
LacCer
SM
Efecto ácido elagico en un modelo de EAE
β-actin
MBP
Peak Remission
EAE EAE-Ellagic EAE EAE-Ellagic
Control
Ellagic
Ellagic acid protects from myelin-associated
sphingolipid loss in experimental autoimmune
encephalomyelitis
MB
P/
-ac
tin
ra
tio
0
2
4
6
8
E lla g ic
C o n tro l P e a k R e m is s io n
E A E
*
**
+
+
Acute Remission
c
c
c d
B C
Ellagic acid protects from myelin-associated
sphingolipid loss in experimental autoimmune
encephalomyelitis
Ellagic acid protects from myelin-associated
sphingolipid loss in experimental autoimmune
encephalomyelitis
*
*
Cells were cultured in medium with 10% LPDS for 2 h, and then incubated for 4 h with urolithin A (50 μM) or urolithin B (50 μM), in the
presence of 2 µCi/mL of BSA-complexed 3H-palmitate. Control cells were exposed to BSA-complexed 3H-palmitate. Incorporation of 3H-
palmitate into ceramide was monitored by HPLC coupled to a radioflow detector. Radioactivity traces were integrated and corrected for cell
protein and expressed in relative area units. Results are mean ± SEM from three independent experiments. Statistical comparisons shown
are control versus urolithin A or urolithin B (* P < 0.05).
Effect of ellagic acid on ceramide synthesis in rat glia C6 cells.
¿Problema?
La determinación clásica de FA omega-3
es difícil de realizar en la práctica clínica.
¿Puede la lipidómica simplificar su
realización?
57
Monitorización del consumo de omega-3 en nutrición humana
58
NO dirigida LC-MS/MS Biomarcadores
¿Problema? ¿Estrategia? ¿Métodos?
Monitorización del consumo de omega-3 en nutrición humana
MALDI-MS
DHA Placebo
57
57
Figure 1
!22
PLACEBO
basal 6 mo. 12 mo.
DHA Supplemented
basal 6 mo. 12 mo.
z-s
co
re
LC-MS/MS 192 especies analizadas
60
61
62
Supplemental Figure 4. Fast PC and LPC lipidomics using MALDI-TOF/MS. Representative
mass spectrum of a plasma sample. Plasma (10 µL) was mixed with 90 µL of acetonitrile (ACN),
containing internal standards, and centrifuged. 10 µL of the upper phase were mixed with 90 µL of
isopropanol/ACN (60/40). The solution was blended 1:1 (v/v) with matrix, 9-aminoacridine
solution (10 mg/mL in IPA/ACN, 60/40). The matrix-sample mixture was finally spotted (0.65 µL)
on a MALDI 384 well plate, and mass spectra acquired on a Bruker Autoflex III MALDI-TOF
spectrometer. PC (phosphatidylcholine) and LPC (lysophosphatidycholine) species were detected as
[M+H]+ adducts.
5
m/z
496.5
834.7
63
Figure 4
!25
r=0.7602
y=0.36383 + 0.58191x
r=0.3674
y=0.41872 + 0.36851x
P=0.007P=0.012
A)
B)
GC-MS 100 muestras 2 semanas
MALDI-MS 100 muestras en 1 día
64
Biochim Biophys Acta. 2016 Sep;1861(9 Pt A):1142-1150. PMID: 27355565
65
Biochim Biophys Acta. 2016 Sep;1861(9 Pt A):1142-1150. PMID: 27355565
A B
C D
Fig 5
Biochim Biophys Acta. 2016 Sep;1861(9 Pt A):1142-1150. PMID: 27355565