“ How to Define and DetermineReference

Intervals in the Clinical Laboratory “

Purpose

The reference interval is the last characteristic to

be studied in the method validation process. It is

generally studied last because the reference

interval itself doesn't enter into the decision on

method acceptability and the study isn't needed

when method performance is unacceptable. If

method performance is acceptable, then it is

important to assess the reference interval(s) to

support the interpretation of patient test results.

Falta de uniformidad en la recolección de datos y en lametodología usada para establecer intervalos de referenciapor laboratorios clinicos y fabricantes.

NCCLS: C28-A2Protocolo básico y uniforme para VR

Los valores de referencia pueden definirse como los valoresde una variable obtenidos de un grupo de individuos (o de unúnico individuo) en un determinado estado de “salud”.

Porqué no se utiliza más el término valores normales?

Esta denominación era equivalente a “valores de referenciaobtenidos de individuos sanos”, pero también podemos obtenervalores de referencia de individuos en estados fisiológicos opatológicos. Para evitar confusiones la Federación Internacional de

Química Clínica (IFCC) recomienda el término Valores deReferencia.

Tipos de valores de referencia (VR)

- VR basados en el sujeto: son valores previos de un individuoobtenidos en un definido estado de salud

- VR basados en la población: son los obtenidos de un grupo deindividuos bien definidos y caracterizados

Health is a relative condition lacking a universal definition. Eachinstitution or investigator may have different criteria for health;these criteria shoul be defined before proceeding.

Good health: history, physical and /or clinical laboratory tests

NCCLS: C28-A2Protocolo básico y uniforme para VR asociados

con un estado de salud bueno

Necesidades y requerimientos :

•Medición de un nuevo analito

•Medición de un analito conocido por unmétodo analítico nuevo o diferente

•Medición del mismo analito por el mismométodo analítico o método comparable parael cual VR de otros laboratorios o defabricantes estan disponibles(TRANSFERENCIA).

REFERENCE INDIVIDUAL

comprise a

REFERENCE POPULATION

from which is selected

REFERENCE SAMPLE GROUP

on which are determined

REFERENCE VALUES

on which is observed

REFERENCE DISTRIBUTION

from which are calculated

REFERENCE LIMITS

that may define

REFERENCE INTERVALS

OBSERVED VALUE

In a person

may be

compared with

Scheme of NCCLS

Protocolo:Establecer una lista de variaciones biológicas e interferentes analíticos segun literatura medica y científica

•Establecer criterios de exclusión y partición y un cuestionario apropiado diseñado para talfin

•Completar el consentimiento del paciente y firmarlo

•Categorizar (sano o no) a los posibles participantes según el cuestionario y/odeterminaciones previas

•Excluir individuos por carecer de “buen estado de salud”

•Decidir el numero de sujetos a incluir en el protocolo acorde con los límites de confidenciadeseados

•Preparar a los pacientes en forma conciente y adecuada

•Recolectar y manejar las muestras acorde a la practica rutinaria del laboratorio

•Determinar los valores bajo condiciones analíticas bien definidas y consistentes con lapractica rutinaria del laboratorio

• Inspeccionar los datos y preparar el histograma para evaluar la distribución de los mismos

•Identificar outliers

•Analizar los valores y determinar los límites y el intervalo de referencia

•Documentar todo lo realizado

Tipos de selección

Selección indirecta: utilizando gráficos y programas matemáticosaplicados a resultados de laboratorio de rutina

Selección directa: los individuos son seleccionados de una poblaciónmadre utilizando criterios de selección (criterios de inclusión yexclusión) y de partición. Nuestra muestra debe ser representativa dela población para la cual queremos establecer VR

a priori a posteriori

Se recomienda la confección de cuestionarios bien diseñados

para la selección de individuos de referencia

A priori Es un metodo que requiere criterios exclusión y de partición muybien definidos antes de seleccionar los individuos (en base aliteratura disponible).Este proceso se utiliza para procedimientos de lab que estan bienestablecidos y para los cuales uno obtiene las fuentes conocidasde variabilidad biologica en la literaturaComo ayuda un cuestionario y una entrevista. El nº de individuosdebe ser estadisticamente valido.

Todo esto es PREVIO a la recoleccion de la muestra

A posteriori

El proceso de exclusión y de partición se da pero en diferente orden yes posterior a la extracción análisis de la muestra.Este proceso es ideal para procedimientos de lab que son nuevos opoco estudiados y poca informacion en la literatura.En este caso el cuestionario debe ser mas completo que el anteriordado que los factores que definen subclases no son conocidos deantemano.

Posibles criterios de exclusión (NCCLS):

•Factores de riesgo: obesidad, hipertensión, fumador, etc.

•Toma de agentes farmacológicamente activos: anticonceptivos orales,

alcohol, tabaco, fármacos de uso prolongado

•Estados fisiológicos específicos: embarazo, lactancia, stress.

•Antecedentes familiares predisponentes

•Proteinuria

•Glucosuria

•Cirugías recientes

•Consumo de drogas de abuso

•Triglicéridos > 195 mg%

Criterios de partición de Valores de Referencia

Los criterios de partición más frecuentes son:

• Sexo• Edad• Raza• Ritmo circadiano• Grupo sanguíneo•Localización geográfica•Momento de la extracción•Posición al momento de la extracción

Es de utilidad el uso de cuestionarios bien confeccionados para fijarcriterios de exclusion y particionamiento.

Es de utilidad el histograma de los datos, por ejemplo observardistribuciones bimodales

Existen varios criterios para realizar la partición

La NCCLS recomienda el criterio aplicado por Harris y Boyd el cual

utiliza el score z

Subject ID Sample ID#

Name: Phone:

Age: Sex: Race:

Height: Weight:

Occupation

Do you consider yourself to be healthy?

Do you exercise regularly? If yes, how often? (hrs per week) And degree of activity (Light or vigorous)

Have you been sick recently?

If yes, when? And what?

Are you taking any prescribed medication? If yes, what?

Do you have high blood pressure?

Do you take vitamin supplements? If yes, what?

Are you exposed to any hazardous chemicals in your job?

Do you use tobacco? If yes, what form? How often?

Do you eat a special diet? If yes, describe

Do you drink alcoholic beverages? If yes, what form? How often?

Recolección y procesamiento de la muestra

Es importante saber cuáles pueden ser las fuentes de variaciónbiológica del analito estudiado. Por ej. el Na+ tiene pocasfuentes de variación, no así las enzimas, proteínas uhormonas. Podemos tener:

- Fuentes de variación controlables: metodológicas (preanalíticas y analíticas)

- Fuentes de variación no controlables: propios de la variabilidadbiológica

Fuentes de variación no controlables: propios de la variabilidadbiológica

Metabólicas

Hemodinámicas

Inducción de enzimas

Daño celular

Fuentes de variación controlables: metodológicas

Pre analítica

• Prepración del paciente: dieta previa, ayuno, abstinencia dedrogas farmacológicas, ritmo circadiano, actividad física,stress.

•Recolección: condiciones ambientales, tiempo, posturacorporal, sitio de recolección, flujo sanguíneo, técnica deextracción

•Manejo de la muestra: transporte, coagulación de la muestra,separación de plasma, conservación

Importancia del procedimiento analítico

En el establecimiento de VR se deben consignar:

-Método de análisis: incluye información sobre reactivos (incluida el

agua), procedimiento, equipamiento, calibradores

- Control de calidad

-Criterios de confiabilidad: inexactitud, imprecisión, limite de

detección, linealidad, interferentes.

Debemos hacer comparables los métodos utilizados para establecer VR

con los que a continuación utilizaremos para la rutina.

Una única muestra es obtenida de un gran número

de sujetos, las determinaciones se efectúan en distintas

Corridas analíticas y distintos días

Valores de Referencia

Analysis of Reference Values

Usualmente el intervalo de referencia es del 95%

Límites: 2.5th and 97.5 th

A veces sólo interesa calcular un límite superior, con lo cual referimos hasta el valor dado por el percentilo 97,5th. No confundir con NDM o “valores críticos”

Para cada uno de los límites se pueden establecer intervalos de confianza

Glucosa

NDM 50 120 200 mg%

IR 70 110

Colesterol 220

Potasio 2,5 4,5 mEq/L

Establecimiento de los límites

Procedimientos paramétricos: se asume que los datos obtenidos, o

alguna transformación matemática de los mismos, adquieren una

distribución gaussiana.

Para el 95% central de los datos x ± 1,96. s (2,5 th y 97,5th)

Para el 90% central de los datos x ± 1,65. s (5,0th y 95,0th)

Procedimientos no paramétricos: no dependen de la distribución de

los datos. Se estiman los límites de referencia a partir de los percentilos

que se calculan de los datos ordenados de menor a mayor (ranqueo). La

NCCLS en el documento C28-A2 del año 2000 recomienda que los

intervalos de referencia sean estimados por métodos no paramétricos

1 7,7

2 7,7

3 7,8

4 7,8

5 7,8

6 7,9

7 7,9

8 7,9

9 7,9

10 811 8

12 8

13 8

14 8,1

15 8,1

16 8,1

17 8,1

18 8,1

19 8,2

20 8,221 8,2

22 8,2

23 8,3

24 8,3

25 8,3

26 8,3

27 8,3

28 8,4

29 8,4

30 8,4

31 8,4

32 8,4

33 8,4

34 8,5

35 8,5

36 8,5

37 8,5

38 8,5

39 8,5

40 8,5

41 8,5

42 8,5

43 8,5

44 8,5

45 8,6

46 8,6

47 8,6

48 8,6

49 8,6

50 8,6

51 8,7

52 8,7

53 8,7

54 8,7

55 8,7

56 8,8

57 8,8

58 8,9

59 8,9

60 8,9

61 8,9

62 8,9

63 9

64 9

65 9

66 9,1

67 9,1

68 9,1

69 9,1

70 9,1

71 9,1

72 9,1

73 9,1

74 9,1

75 9,1

76 9,1

77 9,2

78 9,2

79 9,2

80 9,2

81 9,2

82 9,2

83 9,3

84 9,3

85 9,3

86 9,3

87 9,3

88 9,3

89 9,3

90 9,3

91 9.3

92 9.4

93 9.5

94 9.5

95 9.5

96 9.5

97 9.6

98 9.6

99 9.6

100 9.6

101 9.6

102 9.6

103 9.7

104 9.8

105 9.8

106 9.8

107 9.9

108 9.9

109 9.9

110 10

111 10

112 10.1

113 10.1

114 10.1

115 10.2

116 10.2

117 10.3

118 10.3

119 10.4

120 11.9

Calcio sérico (mg%)

Análisis estadístico de los datos

Siempre se debe realizar un histograma para ver la distribución de los

datos y visualizar la presencia de “outlier”

Histograma

0

5

10

15

20

25

30

7,5 7,9 8,3 8,7 9,1 9,5 9,910,3

10,711,1

y mayo r..

.

Calcio mg%

Frec

uenc

ia

Outliers?

Ejemplo: distribución de frecuencias de valores de calcio sérico

(mg%) de 120 sujetos saludables

Histograma

0

2

4

6

8

10

12

14

Calcio mg%

co

ncen

tració

nm

g%

7,5

8,6

9,8

11,0

12,1

7,5

8,6

9,8

11,0

12,1

Outlier

Es importante graficar los datos en un histograma porque podemos tener

una idea de los valores extremos ya que debemos saber si son probables

en la muestra o pertenecen a otra población. Hay varios test para decidir

si aceptamos o no esos valores, ninguno es contundente.

Criterio de Reed o Dixon

Identificar a un valor extremo como outliers si la diferencia entre

los dos valores más altos (o más bajos) excede 1/3 del rango de

los datos:

Presencia de outliers

Rango = 11,9 – 7,7 = 4,2 4,2 / 3 = 1,4

11,9 – 10,4 = 1,5

El valor 11,9 es un outliers

1,5 > 1,4

la posición del percentilo 2,5th se calcula como:

0,025. (n+1)

para el percentilo 97,5th:

0,975. (n+1)

Cálculo de los percentilos , n= 120

Para el 2,5th 0,025.(n+1) = 0,025.121= 3,025 6, n=240

Para el 97,5th 0,975.(n+1) = 0,975.121= 117,9 235, n=240

El valor que corresponda a la posición 3 y 118 de los datos ordenados

determinarán los límites de referencia (límite inferior y superior

respectivamente):

1 7,7

2 7,7

3 7,8

4 7,8

5 7,8

6 7,9

7 7,9

8 7,9

9 7,9

10 8

11 8

12 8

13 8

14 8,1

15 8,1

16 8,1

17 8,1

18 8,1

19 8,2

20 8,221 8,2

22 8,2

23 8,3

24 8,3

25 8,3

26 8,3

27 8,3

28 8,4

29 8,4

30 8,4

31 8,4

32 8,4

33 8,4

34 8,5

35 8,5

36 8,5

37 8,5

38 8,5

39 8,5

40 8,5

41 8,5

42 8,5

43 8,5

44 8,5

45 8,6

46 8,6

47 8,6

48 8,6

49 8,6

50 8,6

51 8,7

52 8,7

53 8,7

54 8,7

55 8,7

56 8,8

57 8,8

58 8,9

59 8,9

60 8,9

61 8,9

62 8,9

63 9

64 9

65 9

66 9,1

67 9,1

68 9,1

69 9,1

70 9,1

71 9,1

72 9,1

73 9,1

74 9,1

75 9,1

76 9,1

77 9,2

78 9,2

79 9,2

80 9,2

81 9,2

82 9,2

83 9,3

84 9,3

85 9,3

86 9,3

87 9,3

88 9,3

89 9,3

90 9,3

91 9.3

92 9.4

93 9.5

94 9.5

95 9.5

96 9.5

97 9.6

98 9.6

99 9.6

100 9.6

101 9.6

102 9.6

103 9.7

104 9.8

105 9.8

106 9.8

107 9.9

108 9.9

109 9.9

110 10

111 10

112 10.1

113 10.1

114 10.1

115 10.2

116 10.2

117 10.2

118 10.3

119 10.3

120 10.4

7,8 – 10,3 mg%

0

20

40

60

80

100

Nº

de

Ob

se

rva

cio

ne

s

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

POBLACIÓN TOTAL DE VR

0,0

VALORES DE REFERENCIA

LRSLRI 95 %

IC 90 % LRI IC 90 % LRS

120

132

160

188

190

217

247

252

277

308

311

339

367

131

159

187

189

216

246

251

276

307

310

338

366

369

1

1

1

1

2

2

2

3

3

3

4

4

5

7

8

9

10

10

11

12

12

13

14

14

15

15

Nº of sample, n Rank

From To a b

90% Confidence Intervals

ath lowest sample value = lower limit

bth lowest sample value = upper limit

For the 97.5 percentile, substract the values given for a and b from n+1.

1 7,7

2 7,7

3 7,8

4 7,8

5 7,8

6 7,9

7 7,9

8 7,9

9 7,9

10 8

11 8

12 8

13 8

14 8,1

15 8,1

16 8,1

17 8,1

18 8,1

19 8,2

20 8,221 8,2

22 8,2

23 8,3

24 8,3

25 8,3

26 8,3

27 8,3

28 8,4

29 8,4

30 8,4

31 8,4

32 8,4

33 8,4

34 8,5

35 8,5

36 8,5

37 8,5

38 8,5

39 8,5

40 8,5

41 8,5

42 8,5

43 8,5

44 8,5

45 8,6

46 8,6

47 8,6

48 8,6

49 8,6

50 8,6

51 8,7

52 8,7

53 8,7

54 8,7

55 8,7

56 8,8

57 8,8

58 8,9

59 8,9

60 8,9

61 8,9

62 8,9

63 9

64 9

65 9

66 9,1

67 9,1

68 9,1

69 9,1

70 9,1

71 9,1

72 9,1

73 9,1

74 9,1

75 9,1

76 9,1

77 9,2

78 9,2

79 9,2

80 9,2

81 9,2

82 9,2

83 9,3

84 9,3

85 9,3

86 9,3

87 9,3

88 9,3

89 9,3

90 9,3

91 9.3

92 9.4

93 9.5

94 9.5

95 9.5

96 9.5

97 9.6

98 9.6

99 9.6

100 9.6

101 9.6

102 9.6

103 9.7

104 9.8

105 9.8

106 9.8

107 9.9

108 9.9

109 9.9

110 10

111 10

112 10.1

113 10.1

114 10.1

115 10.2

116 10.2

117 10.2

118 10.3

119 10.3

120 10.4

(n=120)

Particionando valores de referencia

• Analizar la posibilidad de particionar siempre y cuando estotenga relevancia desde el punto de vista clinico.

• Para ello 120 muestras en cada subgrupo deberan serobtenidas.

Si ds mayor > 1,5 se debe particionar

ds menor

Otros criterios de partición pueden ser encontrados en:

Clinical Chemistry 48:2; 2002 pág.: 338-352

Clinical Chemistry 32; 1986 pág.: 76 – 79

Clinica Chimica Acta 334; 2003 pág.: 5-23

• Hay situaciones en las que las medias entre los grupos son muy

similares pero la variabilidad en las distribuciones justifica particionar

Z = X1– X2 = Z calculado

(s12 /n1 + s2

2/n2)½

Z = 3.[(n1 + n2)/240]½= Z crítico

Si Z calculado > Z crítico se recomienda particionar

90% Confidence Intervals for Lower and Upper 95% Reference Limits

Analyte Lower reference

limit

Upper

reference

limit

Calcium (mg/dl)

Women (n=120)

Men (n=120)

Combined (n=240)

8,8-9,1

9,1-9,3

8,8-9,1

10,1-10,3

10,3-10,6

10,3-10,6

0

20

40

60

80

100

Nº

de

Ob

se

rva

cio

ne

s

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

POBLACIÓN TOTAL DE VR

0,0

VALORES DE REFERENCIA

LRSLRI 95 % 2,5 %2,5 %

IC 90 % LRI IC 90 % LRS

LRS MaxLRI Max

NCCLS: C28-A2

Necesidad de un programa regional

o nacional para recolección de

muestras de referencia asi como el

establecimiento de bancos de

muestras para estudios de intervalos

de referencia

Reference Interval Transference

Approaches to consider:

Divine judgmentVerification with 20 samplesEstimation with 60 samplesCalculation from comparative method

1. Divine judgment. The acceptability of the transfer may be subjectively assessed on

the basis of consistency between the "demographics and geographics" of the study

population(s) and the demographics of the laboratory's test population(s). The

laboratory simply reviews the information submitted and subjectively verifies that the

reference intervals are applicable to the adopting laboratory's patient population and

test methods. To do this, all the information about the original study should be

requested and made available to the adopting laboratory. This includes the

demographics of the reference sample group, the selection process, pre-analytical

conditions of the study such as subject preparation and specimen collection and

handling techniques, the analytical system used, and the statistical method used to

establish the intervals. Most cases for transference involve adoption of intervals from

another laboratory using the same analytical system or intervals established by the

method manufacturer.

1. US CLIA regulations permit the Medical Director of a laboratory to make this

assessment and judgment.

2. While transference requires only the appropriate signature, the approach depends

on a careful investigation of published recommendations, access to appropriate

information, and significance laboratory and medical experience to assure the

comparability of conditions.

3. Provision of reference intervals for sub-populations, particularly the pediatrics

year-by-year intervals, often requires this approach because of the difficulty in

obtaining sufficient specimens to experimentally establish or verify reference

intervals.

2. Verification with 20 samples. An experimental

validation may be performed by collecting and

analyzing specimens from 20 individuals who

represent the reference sample population. If two or

fewer test results fall outside the claimed or reported

reference limits, the reference interval is considered

verified, as illustrated in the accompanying figure.

This is experimentally simple, requires a minimum of

data, and provides a clear criterion for interpreting the

data and verifying the transference.

It is easiest to select the adult population, adult males,

or adult females as the reference interval to verify,

rather than a smaller sub-population.

3. Estimation with 60 samples. An experimental validation may be

performed by collecting and analyzed specimens from 60 individuals

who represent the reference sample population. The actual reference

interval is estimated and compared to the claimed or reported interval

using a statistical formula comparing the means and standard

deviations of the two populations.

Sometimes finding even 60 reference individuals can be a daunting

task. At the very least, no fewer than 40 individuals should be used to

statistically calculate reference intervals. When fewer than 40

individuals are used, it is best to report the findings in terms of the

minimum and maximum test values observed along with a histogram

showing the distribution of the values.

The statistical comparison of the observed and claimed or reported

intervals is more complicated and therefore less attractive for verifying

a reference interval than the 20-sample approach.

4. Calculation from comparative method. The NCCLS

document also recognizes - but doesn't endorse - another approach

that would adjust or correct the claimed or reported reference

intervals on the basis of the observed methodological bias and the

mathematical relationship demonstrated between the analytical

methods being used (as shown in the accompanying figure). The

regression statistics obtained from a comparison of methods study

could be used to calculate the reference limits (Xlower and Xupper) to

the new method (Ylower = a + bXlower, Yupper = a + bXupper, where a

is the y-intercept and b is the slope of the regression line).

This approach is attractive when the laboratory has performed the

studies necessary to establish its own reference intervals in the

past and then changes to a new analytical method..

Verification by analysis of 20 samples is recommended if there is

any doubt about the reliability of the reference intervals being

transferred from the comparative method.