1Abstract— This paper presents the additive manufacturing process in the manufacture of bioreactor. It was decided to develop an innovative research because the additive manufacturing processes can produce exactly the desired geometry independent of the complexity. In this research was development a cell culture device for the production of biological tissues. The technique chosen was the FDM (Fused Deposition Modeling) due to the capacity to use various polymers. The results meet expectations and the device behaved correctly in the flow simulation.

Keywords— Additive Manufacturing, Bioreactor, Three-

Dimensional Printing, Prototype.

I. INTRODUÇÃO

LESÃO ou perda de tecidos, decorrente de patologias como o câncer ou mesmo como resultado de acidentes,

causam sérios problemas para a saúde do indivíduo envolvido, chegando muitas vezes a afetar a área psicológica do mesmo. Anualmente, cerca de 350 bilhões de dólares são gastos no mundo para a realização de substituição e/ou reposição desses tecidos, porém, as práticas convencionais, como o uso de tecidos biológicos (enxerto autólogo, isoenxerto, aloenxerto ou xenoenxerto) ou materiais sintéticos, oferecem diversos riscos, desde a ocorrência de infecções até mesmo a rejeição ao tecido substituto [1]. Simultaneamente, diversos outros problemas complicam o desenvolvimento de tecnologias voltadas para essa área, como dificuldades e limitações para produção em larga escala (uma produção rápida e principalmente adaptável ás necessidades do paciente), e para preservação do tecido celular a ser implantado [2].

Algumas áreas da ciência têm buscado alternativas no intuito de tornar o processo mais viável. Entre elas, uma que tem apresentado resultados promissores é a área da engenharia de tecidos, cuja linha de pesquisa se baseia na cultura de células apropriadas em um scaffold, submetido a condições que auxiliem no desenvolvimento de uma arquitetura, de funcionalidades e de propriedades mecânicas adequadas para integração e funcionamento in vivo [2].

Os scaffolds utilizados na engenharia de tecido ósseo são estruturas tridimensionais com poros interconectados feitos R. M. G. Santos, Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas (CECS), Universidade Federal do ABC (UFABC), Santo André, SP, Brasil, robson_marino@hotmail.com. L. R. Rodrigues, Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas (CECS), Universidade Federal do ABC (UFABC), Santo André, SP, Brasil, ribeiro.rodrigues@ufabc.edu.br. Corresponding author: Leonardo Ribeiro Rodrigues.

com biomateriais, além do diâmetro dos poros serem controlados. O diâmetro dos poros podem variar entre 100 e 500 µm [3, 4].

O uso dos scaffolds associados às células vem representando uma alternativa as terapias convencionais (utiliza apenas biomateriais ou tecidos biológicos) principalmente por apresentar características que permitem as células se desenvolverem, crescerem e proliferarem. Neste caso os scaffolds são utilizados como suporte, e dependendo da aplicação eles podem ser absorvidos ou não pelo organismo [5]. A. Manufatura de adição (MA)

A integração e a rapidez entre as fases do processo de desenvolvimento de produtos é essencial para tornar mais rápida a transição do conceito do produto para produção efetiva.

O processo de MA utiliza o sistema CAD para a geração do modelo virtual [6] corresponde a um ponto que pode ser extremamente benéfico para o sucesso do desenvolvimento de novos produtos.

A MA pode ser definida como um conjunto de tecnologias baseadas no princípio de sobreposição de camadas de determinado material, com base nas informações matemáticas fornecidas por um modelo matemático gerado no sistema CAD [7].

Essa tecnologia permite a obtenção de peças com um bom nível de qualidade, podendo ser aplicado para a manufatura de pequenos lotes de peças, ou lotes de peças com geometria muito complexa.

A MA também pode ser chamada de prototipagem rápida, esse termo “rápido” é relativo, uma vez que a construção de um protótipo pode consumir de 3 até 72 horas, variando de acordo com a complexidade do objeto. Ainda sim esses processos são mais rápidos que os processos tradicionais (como usinagem), que muitas vezes acaba demandando dias, ou mesmo semanas para a fabricação de um protótipo [8].

Como teste inicial foi utilizada a tecnologia FDM - Fused Deposition Modeling, ou deposição de material fundido para obtenção do protótipo [6].

Nesse processo o modelo é fabricado através da deposição do polímero extrudado sobre uma mesa com movimentação vertical. A cabeça de extrusão se movimenta no plano x-y, e sua carga é aquecida de modo a permitir a sua liberação na forma de filetes em estado semilíquido ou pastoso, e a peça é então construída pelo arranjo paralelo dos filetes, possibilitado pela movimentação da mesma [9].

A

Initial Development of a Device for Cell Culture Obtained through Additive Manufacturing

R. M. G. Santos, L. R. Rodrigues

748 IEEE LATIN AMERICA TRANSACTIONS, VOL. 16, NO. 3, MARCH 2018

B. Biorreatores

Estudos atuais têm apresentado evidências de que estímulos físicos podem afetar a expressão genética de determinadas células, dessa forma acaba por incrementar a capacidade de biofabricação [5].

Para auxiliar no controle das variáveis físicas desse processo de engenharia de tecidos, tem se utilizado os biorreatores.

Biorreatores são usualmente classificados como dispositivos, através dos quais se desenvolvem (de forma controlada e monitorada) processos de fabricação biológicos e/ou bioquímicos, possibilitando a obtenção de ambientes e condições operacionais apropriados (como suprimento de nutrientes e remoção de detritos) [10].

A possibilidade de realizar testes que reproduzam mudanças específicas no meio de cultura, acaba por fornecer um subsídio técnico para a realização de estudos controlados, e consequentemente facilitando a compreensão de determinados efeitos específicos como os: biológicos, químicos, físicos e mecânicos [1].

Os primeiros equipamentos classificados como biorreatores foram criados para utilização em propagação vegetal, permitindo a cultura de células isoladas [11]. Desde então, diversos modelos de biorreatores foram criados, como por exemplo, para processos de fermentação industrial, tratamento de esgoto e processamento de alimentos [10]. Características fundamentais para o desenvolvimento de biorreatores

O projeto do biorreator deve ser o mais simples possível, evitando a presença de falhas de usinagem e/ou montagem, que poderiam originar regiões propícias a servir como criadouros para microrganismos. Essa simplicidade também deve ser demonstrada através da rapidez permitida para a montagem e desmontagem, fazendo com que os scaffolds permaneçam fora da incubadora (normalmente utilizada para o controle dos níveis CO2) o mínimo de tempo possível, reduzindo as chances de falhas no procedimento [12].

Da mesma forma, a disseminação eficiente de uma alta densidade de células no scaffold tem sido associada com a formação de tecidos reforçados em modelos 3D, fazendo com que o desafio de se obter essa distribuição de maneira eficiente e uniforme seja outro ponto fundamental a se considerar no projeto do biorreator [10].

Um último ponto importante a se ponderar diz respeito ao material a ser utilizado na construção do biorreator. Por exemplo, a região que virá a manter contato com o meio de cultura deve ser bioinerte (e não deve permitir, ou pelo menos dificultar a adesão das células), e deverá ser compatível com o uso a uma temperatura de 37º C em atmosfera úmida.

Deve ser um material passível de esterilização (ex.: autoclave, imersão em álcool, entre outros), de modo que o material deva manter suas propriedades iniciais [12]. Esses fatores devem ser considerados, pois devido a sua importância, influenciam diretamente na viabilidade do

projeto. Biorreatores de perfusão (Bp)

Bp geralmente são formados por uma bomba e uma “câmara para alojamento do scaffold”, unidos por uma tubulação. O scaffold é colocado na câmara, e então o fluxo do meio de cultura circula pelo sistema (com o auxílio de uma bomba) mantendo um fluxo constante dos fluidos.

A intenção é que o meio de cultura entre em contato com toda a área superficial do scaffold, facilitando a circulação do meio de cultura também na região interna [12].

Bp são muito utilizados no desenvolvimento de tecidos ósseos. Estudos mostram que essa categoria de dispositivo obteve níveis de marcadores celulares para tecido ósseo maiores do que qualquer outro tipo de tecido, este fato é um indício do seu potencial para diferenciação em células ósseas, além de também estar associado com resultados de aumento na mineralização dos scaffolds. Para que isso ocorra o controle da taxa de vazão no biorreator deve ser precisamente ajustado, e desta forma pretende-se evitar problemas (de adesão, crescimento e proliferação celular) associados com tensões de cisalhamento inadequadas [13]. Parâmetros de uso de Bp para células de tecido ósseo

Verificou-se na literatura um estudo realizado através da utilização de uma amostra de osso trabecular humano descalcificado, no qual células pré-osteoblásticas (MC3T3-E1) foram semeadas com fluxos variáveis, e tiveram os níveis de expressão de mRNA de Runx2, osteocalcina e ALP medidos [12, 14].

De acordo com o estudo citado, o uso de uma taxa de fluxo constante de 1 ml/min. matou a maior parte das células após um período de cultura de 7 dias [12, 14].

A Tabela I apresenta valores bons e ruins encontrados na literatura para o fluxo do meio de cultura em Bp. Os valores que apresentaram bons resultados durante as culturas de tecido ósseo estavam entre 0,1 e 0,4 ml/min., e o fluxo de 1 ml/min. se mostrou ruim, pois as células cultivadas morreram ou o tempo de vida das mesmas foi reduzido [15-17].

TABELA I

VARIAÇÃO DO FLUXO DO MEIO DE CULTURA INDICANDO OS IMPACTOS SOBRE A CULTURA CELULAR.

Valor do Fluxo (ml/min)

Impacto sobre a cultura celular Referência

0,1 Positivo [15, 16] 0,2 Positivo [15] 0,4 Positivo [15] 1 Negativo [12, 14, 17]

Em outro estudo utilizando um biorreator de perfusão

pode-se observar o incremento dos níveis de PGE2 (prostaglandina E2) em comparação a um modelo de cultura celular estático. Nesse estudo foram utilizados scaffolds feitos de fosfato de cálcio [12, 18].

MARINO GARCIA SANTOS AND RIBEIRO RODRIGUES : INITIAL DEVELOPMENT OF A 749

A importância desse trabalho reside no fato de que, com o auxílio de um processo rápido e de baixo custo, e que permita a construção de biorreatores compatíveis com uma variedade de dimensões de scaffolds, será possível reduzir o custo para o tratamento de diversas patologias, reduzindo o impacto das mesmas na qualidade de vida dos pacientes.

Tem como objetivo o desenvolvimento de um protótipo de Bp para tecido ósseo que possa vir a ser adaptado para um sistema de manufatura associado a ambientes hospitalares, através do uso de equipamentos de prototipagem rápida, de modo a permitir uma maior personalização do tratamento de pacientes que perderam tecidos ósseos, aumentando as chances de eficiência do tratamento.

II. MATERIAIS E MÉTODOS

Equipamentos utilizados na fabricação do biorreator Como citado, o objetivo desse trabalho é a criação de um

modelo de biorreator em ambiente virtual 3D, que seja compatível com técnicas de MA, permitindo sua fabricação a partir do uso de impressoras 3D. Dessa forma, os equipamentos previstos para serem utilizados na fabricação do modelo final nessa etapa de planejamento serão: i) Computador, para modelagem do equipamento; ii) Impressora 3D, para construção do protótipo. Utilizou-se para a confecção do protótipo a impressora uPrint SE da marca Stratasys, que utiliza como material de impressão o polímero ABS (Acrilonitrila Butadieno Estireno) que possui boas propriedades para a realização dos primeiros testes geométricos [19]. Softwares utilizados

Para o desenvolvimento desse projeto, diversos softwares

foram utilizados (Quadro I). Para a construção dos textos e de tabelas para apresentação de dados, utilizou-se o Microsoft Office. Para a construção dos desenhos das peças individualmente e para a realização da simulação da montagem, utilizou-se o software SolidWorks.

QUADRO I

LISTA DE SOFTWARES E MÁQUINAS UTILIZADAS. Máquinas, softwares e equipamentos utilizados.

Software

SolidWorks Educational Edition 2012 - 2013

SolidWorks Standard Edition 2013

Microsoft Office Standard 2010

Máquinas e acessórios

Impressora 3D uPrint SE – fabricante Stratasys

Carga de ABS para impressora 3D

Suporte Solúvel SR30

As análises do comportamento do sistema durante a

utilização com o fluído apropriado foram realizadas com o auxílio do software SolidWorks Flow Simulation. Como os

dados de meio de cultura não constavam como padrão para a análise de fluxo (por exemplo: densidade e viscosidade) foram inseridos manualmente para a realização dos testes. Metodologia Utilizada

Decidiu-se focar os esforços no uso da tecnologia de MA. Pode-se citar como vantagem a possibilidade de um design padrão poder ser manipulado e melhorado para atender as necessidades de uso em um hospital, permitindo a realização de mudanças estruturais no mesmo antes de iniciar a impressão, adaptando o projeto do biorreator a necessidade do paciente [20].

O processo de montagem seguiu a técnica DFA – Design for Assembly (projeto pra montagem), e teve uma atenção especial, de modo a garantir não apenas a facilidade para a montagem e desmontagem do produto, mas também sua vedação durante o uso, fundamental para a redução do risco de contaminação do processo.

Para a vedação pretende-se utilizar anéis O-ring feitos de borracha ou anéis de teflon.

Para a escolha do fluxo do meio de cultura utilizado na simulação levou-se em consideração alguns estudos, onde o fluxo de 0,2 ml/min, obteve melhores resultados do que o fluxo de 0,4 ml/min. [21]. Na Tabela II, além do valor do fluxo também estão outros parâmetros importantes utilizados na simulação.

TABELA II PARÂMETROS UTILIZADOS NA SIMULAÇÃO DE FLUXO.

Parâmetros Valores Referências Valor do Fluxo 0,2 ml/min. [15, 21] Densidade 1,004 g/ml [22]

Viscosidade 0,77 cP [22]

Condutividade térmica 0,61 W/m.K [22]

Calor específico 4186,8 J/Kg.K [22]

III. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Com o auxílio do software SolidWorks desenvolveu-se um

protótipo para atender os pontos levantados, sem deixar de lado a compatibilidade com a técnica de MA e a viabilidade celular que será importante nas etapas futuras deste projeto.

O projeto do biorreator é compatível com o equipamento utilizado, e tem um custo de produção de aproximadamente R$6,00 a peça (com base no custo da matéria prima) [19] uma vez que seu peso total será de 29,79g (segundo previsão fornecida pelo SolidWorks), consistindo em um biorreator projetado para a cultura de células em scaffolds individuais, com uma dimensão máxima de 14mm de diâmetro, por 10mm de espessura. O equipamento foi dividido em 3 partes: A) Tampa do biorreator; B) Suporte para o scaffold; e C) Corpo do biorreator.

O Corpo do biorreator (Fig. 1 e Fig. 2c) é o elemento que será responsável pela condução controlada do meio de cultura, além de dar suporte e um posicionamento adequado ao scaffold. Seu orifício central de diâmetro constante tem por

750 IEEE LATIN AMERICA TRANSACTIONS, VOL. 16, NO. 3, MARCH 2018

objetivo permitir que o meio de cultura alcance o suporte com uma pressão relativamente uniforme em toda a área da seção transversal.

Figura 1. Projeção e projeção em corte do corpo do biorreator.

Um conceito que se aplica, não apenas para o corpo, mas

para todos os componentes do biorreator, é a adequação do ambiente de manufatura ao ambiente hospitalar, de forma que o projeto do modelo padrão possa ter algumas dimensões (como o diâmetro do corpo e de seu orifício central) passíveis de mudanças com o objetivo de se adequar aos padrões existentes de mangueiras e tubulações.

O protótipo foi desenvolvido com um diâmetro externo de 30mm, um diâmetro para conexão com tubos (ou mangueiras) de 25,4mm e um diâmetro interno de 18mm. Na região média do eixo foi posicionado o rebaixo que acomodará o suporte para o scaffold.

Na Fig. 2a é apresentada a tampa do sistema que será colocada sobre o suporte montado. A tampa assim como o corpo do biorreator possuem 4 furos que auxiliarão no fechamento do dispositivo. Para o travamento da tampa serão utilizados pinos com fixação por interferência.

Figura 2. Montagem do sistema do biorreator. a) Tampa do sistema. b) Suporte para scaffolds. c) Corpo do biorreator.

O suporte do scaffold (Fig. 2b) tem a função de: i) permitir

o acesso adequado para a manipulação do scaffold; ii) facilitar

a passagem do meio de cultura através da grade vazada; iii) potencializar o crescimento celular.

Os diâmetros dos furos do suporte de scaffold foram pensados apenas para facilitar a passagem do fluxo, sem que o scaffold seja carregado pelo mesmo (possui 1,67mm de diâmetro).

A precisão dimensional da impressora 3D utilizada é de 0,234mm.

Realizou-se a impressão 3D do protótipo em escala real (Fig. 3), e permitiu uma melhor visualização dos conceitos estudados e aplicados, além de uma análise da eficiência do processo de fabricação e do mecanismo de montagem.

Observou-se alguns pontos que podem ajudar na melhoria do projeto, principalmente para adaptá-lo á tolerância fornecida por outras impressoras que futuramente serão testadas.

Uma vantagem da prototipagem rápida diz respeito a adaptabilidade do processo. Para realizar uma determinada alteração em um produto prototipado necessita apenas alterar o desenho que alimenta a impressora (respeitando-se fatores limitantes de qualquer ordem).

Com relação ao protótipo (Fig. 3a, Fig. 3b e Fig. 3c) pode-se dizer que, com exceção dos furos para conexão da tubulação para passagem do meio (Ø18mm), as outras áreas onde ocorrerá montagem de componentes precisam estar com um encaixe que confira vedação ao sistema, evitando vazamentos.

Figura 3. Peças do biorreator impressas. a) Tampa. b) Suporte para Scaffold. c) Corpo do Biorreator.

Decidiu-se que a tolerância seria pensada considerando-se um ajuste com folga, onde a dimensão mínima do furo é sempre maior, ou em casos extremos, igual a dimensão máxima do eixo [23]. Com base nos valores usualmente utilizados para ajustes [24].

As variáveis utilizadas para a simulação no SolidWorks Flow Simulation foram extraídas da Tabela II, e os resultados estão nas Fig.4 e Fig.5.

A simulação teve como objetivo apresentar o comportamento do sistema durante a passagem do meio de cultura, e segundo dados da literatura (Tabela II) o fluxo de 0,2 ml/min. tem um impacto positivo na cultura celular,

cà

bà

aà

a

c

b

MARINO GARCIA SANTOS AND RIBEIRO RODRIGUES : INITIAL DEVELOPMENT OF A 751

favorecendo a proliferação das mesmas. O sentido do fluxo adotado na simulação é indicado na Fig.4.

Figura 4. Projeção do biorreator com a representação do fluxo do meio de cultura.

Com a simulação do fluxo do meio de cultura que passa no

interior do biorreator montado (Fig.5) foi possível observar que o meio de cultura tem o fluxo reduzido ao passar através do suporte para scaffolds, isso ocorre por causa dos orifícios presente na superfície. A porosidade cria uma barreira obrigando o meio de cultura passar apenas por entre os furos do suporte e desta forma controlando o fluxo.

Figura 5. Vistas ortogonais (planta, elevação e lateral) do biorreator com representação do fluxo do meio de cultura.

A Fig.4 e a Fig.5 representam o comportamento do fluido dentro do sistema montado, onde se pode observar um comportamento uniforme dos pontos azuis que representam o meio de cultura.

Não houve indícios de problemas na simulação e nem na montagem dos componentes do dispositivo manufaturado.

A Fig.6 representa de forma simplificada o sistema montado no qual o biorreator poderá ser inserido em trabalhos futuros. A incubadora fornece o controle da temperatura e de alguns elementos gasosos, como CO2. A bomba gera um fluxo constante do meio de cultura que flui de forma controlada pelo sistema.

A intenção é que o meio de cultura passe através do

scaffold e deposite células e nutrientes em sua superfície porosa, além de manter o sistema em movimento.

Utiliza-se dois reservatórios de meio de cultura para reduzir o tempo de troca do mesmo [20].

Figura6.Representaçãosimplificadadosistemamontado.Figuraadaptada[20]

IV CONCLUSÃO

Com êxito foi desenvolvido um dispositivo para cultura

celular utilizando a técnica de manufatura por adição. O sistema de montagem foi eficiente e as peças foram

produzidas conforme o projeto. A simulação do fluxo foi verificada através das imagens

coletadas (Fig. 4 e Fig.5) e constatou-se que o fluido passa com mais facilidade na região central do dispositivo conforme era previsto na teoria da mecânica dos fluidos que indica uma maior velocidade no centro do fluxo.

Através da análise do fluxo podemos supor que a melhor região para posicionar o scaffold seria no centro do “suporte para scaffolds”. Podemos concluir que na região central ocorrerá a maior deposição e proliferação de células, além de maior liberação de nutrientes, fato que ajudará na aceleração da produção do tecido biológico.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Universidade Federal do ABC por fornecer uma estrutura adequada para a realização dos estudos.

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1º2º

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Biorreator

Incubadora

Ambiente

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Robson Marino Garcia Santos, possui graduação em Engenharia de Gestão pela Universidade Federal do ABC (2016). Atualmente é Técnico de Laboratório - Área Mecânica da Universidade Federal do ABC. Tem experiência na área de Engenharia Mecânica, com ênfase em Processos de

Fabricação.

Leonardo Ribeiro Rodrigues, possui técnico em mecatrônica pela Escola Técnica Estadual Lauro Gomes (2001), graduação em Tecnologia Mecânica pela Faculdade de Tecnologia de São Paulo (2004), mestrado em Engenharia Mecânica pela Universidade Estadual de Campinas (2008) e doutorado em Engenharia

Mecânica pela Universidade Estadual de Campinas (2012). Realizou o doutorado sanduíche no Instituto Nacional de Engenharia Biomédica - Faculdade de Engenharia do Porto Portugal (2010). Participou do Programa Nacional de Pós Doutorado da CAPES (PNPD/CAPES) na Universidade Federal do ABC (2014). Atualmente é Professor Adjunto A na Universidade Federal do ABC e integrante do INCT-Biofabris. Atua principalmente nos seguintes temas: biocerâmicas, nanotecnologia, nanociência, engenharia tecidual, rotofiação de polímeros e compósitos.

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