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INFORME FINAL. DE SERVICIO SOCIAL

NOMBRE:

MATRICULA:

LICENCIATURA:

TRIMESTRE

HORAS / SEMANA:

TITULO:

NOMBRE DEL

ASESOR:

Ramirez Herndndez Norberta Araceli.

83322570

Bioloaia Exberirnental. CBS.IztapalaDa.

92- P.

25.Durante 6 meses.

Induccibn a j lna fases anormalegen

cultivo Celular p e ~ gxDosici6n a polvos

inoa8nicos.

8161. FranciscQ Jesús Arenas Huertero.

Invest¡- Asociado A LUGAR DONDE SE DESARROLLO: InstitutQ Nacional dB

Canceroloafa, Divisi6q m lnvestlaaci6n Bgsica. Avenida San Fernando# 2 2 ,TlalDanL!!!l&XicoD.F.CP.14000.=,5734662.

FECHA DE INICIO: S DE NOVIEMBRE D E 1991

FECHA DE TERMINACION: 5 DE MAYO DE 1992.

CLAVE:

FIRMA ALUMNO.

N. A ndndet 8161. Francisco J. Arenas H.

1

INDUCCION DE ANAFASES ANORMALES EN CULTIVO

CELULAR POR EXPOSICION A POLVOS INORGANICOS.

INTRODUCCION.

Existen diferentes tipos de asbesto 1; todos pueden provocar fibrosis

pulmonar, pero no son igualmente fibrogenicos. La crocidolita 2 por ejemplo

puede ser m& fibrogenica y generadora de mesoteliomas pleurales en

humanos que el crisbtilo. Sin embargo, el cris6tilo es el que produce mayor

citotoxicidad, ademhs de ser el mhs ampliamente usado en el mundo 2. La

incidencia de sus efectos se debe a que son silicatos minerales hidratados

que se encuentran en la naturalezal.

Como podemos observar el asbesto cris6tilo (AC), tiene la capacidad

de inducir daAo a diferentes níveles, por lo tanto representa un agente de

estudio debido a sus efectos citotbxicos y carcin6genicos conocidos,

adem& de ser ampliamente usado en nuestro medios4

Los estudios experimentales en animales han mostrado que el AC y

la crocidolita inducen mesotelioma de pleura en ratas, despues de la

inyeccibn intrapleural y carcinoma broncogbnico despues de ser

inhaladosl6. En celulas en metafase se ha logrado observar aberraciones

cromosómicas, como gaps cromatídicos, rupturas, intercambio de

cromAtidas, anillos cromosómicos y pulverizaciones parciales y totales 7s8e9.

Los efectos genotbxicos tambien se han observado como anormalidades en

anafase en cultivos de celulas de hamster Sirio (SHE), expuestas al

asbesto crocidolita. Del total de anafases analizadas el 18% fueron

anormaleslo a una dosis de l p g / c m 2 . Este tipo de asbesto induce

aneuploidía provocando pbrdildas o ganancias de algún cromosoma. De

hecho, en estos cultivos las c6lulas al fagocitar la

acumula en la regi6n perinucleiar. Cuando las c6lulas

2 crocidolita, 6sta se

entran en mitosis la

presencia de las fibras interfieren en la segregaci6n de los cromosomas.

Así, se han reportado anormalidades en anafase como: puentes anafhsicos,

cromosomas en ’retraso” durante la migraci6n y cromosomas ‘pegajosos”.

El fierro carbonilo (FC) es un polvo inorgánico inerte. Esta propiedad

ha sido descrita por Osornio y co1ab4J1J2J3. De sus estudios se Sabe que

representa un control negativo en modelos de exposici6n , tanto in vitm

como in vivu. Sin embargo, en el presente trabajo se evaluar6 por primera

vez su genotoxicidad.

OBJETIVO:

El objetivo del presente proyecto fue evaluar la capacidad del AC

para inducir anormalidades en anafase en cultivo celular. Estos efectos

fueron comparados con los inducidos por el polvo inerte FC. Se utilizaron

como parámetros las siguientes anormalidades:

A) Puentes anafásicos (láminas 2A y 4A).

B) Anafases multipolares (Ihminas 28 y 48).

C) Cromosomas “retrazados” dllrante la migraci6n (lámina 3).

3

MATERIAL Y METODOS.

1. PREPARACION DE LAS DOSIS DE POLVOS INORGANICOS.

En el proyecto se emplearon dos polvos: el AC que se us6 como

control positivo debido a sus efoctos citot6xicos y carcin6genos conocidos 1,

adembs de valorar ahora su capacidad de inducir anafases anormales; y el

FC que correspondi6 al control negativo debido a sus propiedades

inertes13.

Del asbesto cris6tilo se obtuvieron partículas respirables de acuerdo a

Brodyl4. Se prepar6 una suspensi6n al 1% en agua destilada. Se sonic6

por 45 min y se concentraron las fibras de gran tamaAo centrifugando a

2000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se colect6 para ser filtrado al

vacío en membranas de nucleopore de 0.45 pm. Se retiraron las partículas

de asbesto en fresco, para resuspenderlas en etanol al 95 YO y se dej6

evaporar en un horno a 60° C. De esta manera quedaron concentradas las

partículas menores de 10 pm,. El hierro carbonilo present6 un diAmetro

promedio 0.4-3.0 pm, siendo su forma esfbricall.

En la literatura se ha descrito que en el intervalo de 10 a 100 p g se

han observado anormalidades en metafase15 debido a asbestos. Así en el

presente estudio se emplearon las siguientes dosis : O, 10, 20, 40 y 80

pg/ml. Para llegar a la dosis deseada se pesaron 10 mg de ambos polvos,

se esterilizaron en autoclave a 15 lbs por 15 minutos y al final se

resuspendieron en medio de cultivo RPMI-1640 (GIBCO). Antes de cada

experimento se sonicaron durante 10 min. A partir de esta suspensibn se

realizaron las diluciones necesarias para lograr las dosis finales.

4

11. CULTIVO CELULAR.

Se us6 la línea celular BALBCBT3 para este proyecto. Se utilizaron

densidades celulares descritas por Hesterberg y Barrett lo (8 O00 c6lulas).

Sin embargo, al final de las exposiciones las c6lulas BALBCBT3 resultaron

fuertemente dafiadas, y el material obtenido no permiti6 llegar a evaluar

100 figuras en divisi6n. Así este tipo celular resulta ser altamente sensible al

daAo por polvos. Por lo anterior, los cultivos se realizaron de la siguiente

manera. Se sembraron 100,000 c6lulas en 2 ml de medio RPMI-1640

(GIBCO) suplementado con penicilina (31 pg/ml, SIGMA), estreptomicina

(50 pg/ml, SIGMA), fungizona (25 pg/ml, SIGMA), gentamicina (80 pg/ml,

SHERAMEX) y 10% de suero ,fetal bovino (SFB, SIGMA). Los cultivos se

realizaron en un portaobjetos ¡integrado a cajas de cultivo ("Slide Flask",

NUNC). Las celulas se incubaron a 37 o C durante 24 horas. AI termino de

&te tiempo se agregaron las dosis de AC y FC (O, 5, 10, 20, 40, 80 pg/ml )

durante 12 horas de exposicibnl. Tanto para el control como para el AC y el

FC se realizaron tres series de 'cultivos, para cada dosis de polvo.

111. TINCION CELULAR :

Las dlulas fueron lavadas una vez con 2 ml de PBS. Posteriormente

se fijaron con metanol-ac6tico 3:l conteniendo 4 mM de MgCI, y 1.5 mM de

CaCI,. La fijaci6n se hizo con tres lavados más de 15 minutos cada uno. Se

dejaron secar a temperatura ambiente por 12 horas. Posteriormente se

incubaron en Bcido percl6rico al 5% a temperatura ambiente. Los

portaobjetos fueron lavados con agua destilada y se dejaron secar a

temperatura ambiente. Por últirno las c6lulas se tefiieron con safranina-O al

5%, en &ido ac6tico al 10 % durante 10-15 minutos. Despues se lavaron

5

con agua destilada y se dejaron secar al aire. Se cuantificaron 100 figuras

de divisibn, incluyendo metafases y anafases con ayuda de un microscopio

de campo claro. Las anafases se evaluaron ademhs para la presencia de

alteraciones.

IV. ANALIStS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS.

Se realiz6 la prueba de Chi-cuadrada16 para evaluar las diferencias

entre el control sin polvos y la!s diferentes dosis de Bstos. Las diferencias

fueron estadísticamente significativas cuando el valor de p fue menor a

0.05.

6

RESULTADOS.

En la figura 1 se ilustra el porcentaje de metafases, anafases totales y

anafases anormales de las celdas BALBC/3T3 expuestas a polvos

inorganicos (AC y FC), para cada una de las dosis incluyendo al control. En

los cultivos expuestos a AC se puede notar que el porcentaje de metafases

se mantiene sin variaci6n desde 5 hasta 40 pg/ml, y solamente con un

aumento a 80 pg/ml. A esta dosis fue estadísticamente significativa la

variaci6n con respecto al control. El porcentaje de anafases disminuye

conforme las dosis de AC aumenta. Las variaciones fueron

estadísticamente significativasl para todas las dosis. Por otro lado el

porcentaje de anafases anormales aument6 desde 5 hasta 40 pg/ml, y en

este intervalo las variaciones fueron tambih estadísticamente significativas.

En los cultivos expuestos a FC es notable que tanto las metafases como las

anafases se mantuvieron constiantes y aunque para las anafases anormales

no existió una clara tendencia, ninguna variación en los indices resultó

estadísticamente significativa en cada dosis.

En el cuadro 1 se ilustran los tipos de anafases anormales como

puentes anafhsicos, anafases multipolares y cromosomas en retraso,

inducidos por polvos inogánicos (AC y FC) en las c6lulas BALBC/3T3

expuestas. En los cultivos expuestos a AC, predominaron los puentes

anafásicos (lamina 2A) y en la dosis de 40 pg/ml el número inducido fue

estadísticamente significativo con respecto al control. La frecuencia de este

efecto fue de 3 veces m& que el inducido por el FC. Las anafases

multipolares (lámina 26) fueron producidas en igual número en ambos

polvos; pero las inducidas por el AC desde 5 hasta 40 pg/ml fueron

7

estadísticamente significativas , Para el FC ninguna de las anormalidades

inducidas fueron estadisiticamente significativas.

En el cuadro 2 se ilustran los efectos en cromosomas y en

citoesqueleto de las cblulas BHLBCI3T3, expuestas a polvos inorgiinicos

(AC y FC). En los cultivos expuestos a AC predominb el efecto directo en

cromosomas reconocido como cromosomas dichtricos. Hay que recordar

que este tipo de dano se observa como puentes anafhsicos. Se observaron

diferencias estadísticamente significativa a 40 pg/ml con respecto al control.

El efecto indirecto en citoesqueleto se observa por perturbaci6n del huso

mit6tico; como por ejemplo anafases multipolares (Ihmina 2) y cromosomas

en retraso (Ihmina 3). S610 a 5 y 20 pg/ml de AC, estas anormalidades

fueron estadísticamente signi,ficativas con respecto al control. No se

observaron diferencias en todos los cultivos expuestos a FC.

BALBC/3T3 EXPUESTbrS A ASBESTO CRISOTILO

' O 0 1 A J

10 7 * * -....+..I.

....................

METAFASES

ANAFASES ANAF ANORM

1- I I I +

CONTROL 5.0 10.0 20.0 40.0 80.0

DOSIS POLVO ( CI g/ml)

BALBC/3T3 EXPUESTAS A FIERRO CARBONILO

S"- "". * """ """" .f """" 3 """ "3

METAFASES

ANAFASES ANAF ANORM

""_ + .". ....................

...... ...... ....... "".."-f ..... f.... *..

1 *.

1 . 1 *a\..

I 1 ' CONTROL 5.0 10.0 20.0 40.0 80.0

DOSIS POLVO ( p g/ml)

FIGURA 1. lndice de metafases, anafases totales y anafases anormales de cblulas BALBC/3T3 expuestas a polvos inorgdnicos. (* Diferencias estadisticamente significativas con respecto al control).

CUADRO 1. Tipos de anafases anormales de c4lulas BALBC/3T3 expuestas a polvos inorgdnicos.

DOSIS

PQlml

Asbesto crlsdtilo CONTROL

5. O 10.0

20.0 40.0 80.0

TOTALES

Fierro carbonilo CONTROL

5.0 10.0

20.0

40. O 80.0

TOTALES

PUENTES ANAFASES CROMOSOMAS

ANAFASICOS MULTIPOLARES EN RETRASO

1.6 f 0.5 1.6 f 0.5 3.0 f 1.0 2.3 f 1.1 4.3 f 2.0" 0.7 f 0.5

13.5 2 5.6

1.3 f 1.5

0.6 f 0.5 1.0 f 0.0 1.1 f 1.1

0.6 f 0.5 0.0 f 0.0

4.6 2 3.6

0.3 f 0.5 1.3 f 0.5" 1.0 f 0.0"

1.6 f 1.5" 1 .o f 0.0' 0.7 f 0.5

5.9 f 3.0

0.6 f 0.5

1.0 f 1.0

1.0 f 1.0

1.3 f 1.1

1.0 f 1.0

1.0 f 1.0 5.9 f 5.6

0.3 f 0.5

0.3 f 0.4 0.0 f 0.0

0.6 f 1.1

0.3 f 0.5 1.4 f 0.1

2.9 f 2.6

0.3 f 0.5 0.0 f 0.0 0.0 f 0.0 0.3 f 0.5

0.3 f 0.5 0.0 f: 0.0

0.9 f 1.5

TOTALES

2.2 2 1.5 3.2 2 1.4 4.0 f 1.0 4.5 f 3.7 5.6 f 2.5 2.8 2 1.1

22.6 f 11.2

2.2 2 2.5 1.6 f 1.5 2.0 2 1.0 2.7 f 2.7

1.9 2 2.0 1.0 f 1.0

11.4 f 10.7

*. Diferencias estadísticamente significativas con respecto al contrd, p< 0.05.

CUADRO 2. Efectos en cromosomas y en el ciioesqueleto de c&ulas

BA LBC/BT3, expuestas a polvos Inorgdnicos.

DOSIS CROMOSOMAS PERTURBACION DEL

W m l DICENTRICOS HUSO MITOTIC0 TOTALES

Asbesto cris6tilo

CONTROL 1.6f 0.5

5.0 1.6 f 0.5

10.0 3.0 f 1.0

20.0 2.3 f 1.1

40.0 4.3 f 2.0*

80.0 0.3 f 0.5

TOTALES 13.1 f 5.6

Fierro carbonilo

CONTROL 1.3 f 1.5

5. O 0.6 f 0.5

10.0 1.0 f 0.0

20.0 1.1 f 1.1

40.0 0.6 f 0.5

80.0 0.0 k 0.0

TOTALES 4.6 2 3.6

0.6 f 1.0 2.2 f 1.5

1.6 f 0.9* 3.2 f 1.4

1.0 f 0.0 4.0 f 1.0

2.3 f 2.6* 4.6 f 3.7

1.3 f 0.5 5.6 2 2.5

0.9 f 0.6 1.2 f 1.1

7.7 f 5.6 20.8 f 11.2

0.9 f 1.0 2.2 f 2.5

1.0 f 1.0 1.6 f 1.5

1.0 f 1.0 2.0 f 1.0

1.6 f 1.6 2.7 f 2.7

1.3 f 1.5 1.9 f 2.0

1.0 k 1.0 1.0 f 1.0

6.8 f 7.1 11.4 f 10.7

O. Diferencias estadísticamente significativas con respecto al control, pe 0.05

A

B

LAMINA 1. CBlulas BALBC13T3. A y B. Anafases normales. Tincidn con Safranina 0.5%. A. 3740.6 X. B. 3937.5 X.

A

B

LAMINA 2. C6lulas BALBC/3T3 expuestas a 40 pg de asbesto cris6tilo. A. Puente anafasico (flecha). 3937.5 X. B. Anafases multipolares. 61. 2953.1 X. 82. Anafase multipolar con puente (flecha) y cromosoma en retraso (flecha). 3150 X. B3. Anafase con 4 polos. 31 50 X. Todas tinci6n con safranina 0.5%.

A

B

LAMINA 3. Cdlulas BALBC/STS expuestas a 40 pg de asbesto cris6tilo. A. Anafase con I cromosoma en retraso (flecha). 3150 X . B. Anafase con 2 cromosomas en retraso (flecha). 3150 X. T o d a s tínci6n con safranina 0.5%.

A

B

LAMINA 4. Ct5lulas BALBC/3T3 expuestas a 20 pg de

fierro carbonilo. A. Puente anaf6sico (flecha). 3150 X. B. Anafase multipolar. 3150 X. Todas tinci6n con safranina 0.5%.

8

DISCUSION.

Los resultados indican que el AC es caphz de inducir anafases

anormales, con un índice mkimo del 5.6% a 40 pg/ml. Tradicionalmente, el

anhlisis de daAo genetic0 se ha realizado en cromosomas en metafase,

comprobhndose sus efectos; sin embargo, en esta t6cnica se detiene la

dinarnica de divisi6n celular y ademhs, se manipula el material genetic0 a lo

largo del proceso. La t6cnica utilizada en el presente estudio no interviene

en la dinarnica de divisi6n, el analisis del daAo es directo (in situ ) y no

requiere aplicar drogas como la colchicina o colcemida. Por 6stas razones

pueden existir variaciones al aplicar una u otra t6cnica al valorar el

potencial genotbxico de algún polvo. Si bien es cierto que se ha

comprobado el efecto genot6xico en anafases por asbesto, este fue

evaluando la crocidolita5 (es el asbesto menos usado en nuestro país).

Ahora, los resultados del presente estudio comprueban el hecho anterior

pero en este caso debido a AC.

De los parámetros evaluados, el índice de metafases se mantuvo sin

variaci6n desde 5 hasta 40 pg/nil y solamente con un aumento de &te a 80

pg/ml. Este evento se puede explicar debido a que disminuye el porcentaje

de anafases a 80 pg.

Pero para comprender mejor los efectos citotóxicos y genotóxicos del

asbesto, es necesario conocer los diferentes métodos que nos permitan la

evaluación, como se mencion6 anteriormente. Uno de ellos es el análisis de

los cromosomas en metafase, que permite solamente evaluar el efecto

directo en cromosomas; como aberraciones num6ricas y estructurales 15.

Otro es el caso de la metodo~logía utilizada en este estudio; donde las

9

cblulas se dejan progresar haista el final del ciclo mit6tic0, permitiendo

observar dos efectos de interacci6n de las fibras de asbesto con las c6lulas.

El efecto directo nos revela que efectivamente el AC induce daAos y que en

este caso se observan como puentes anafhsicos. Estos cromosomas son el

producto del daAo cromos6mico directo. El efecto indirecto de daAo

genetic0 nos revela que las fibras de AC daAan directamente al

citoesqueleto; generando así anafases multipolares y cromosomas en

"retraso". Este hecho tiene importancia ya que posiblemente el M$+ que

contienen las fibras de AC pueda estar afectando la calidad de la tubulina

en los microtúbulos y en conlsecuencia, a los cromosomas durante la

división celular15 Sin embargo, el mecanismo puede mediarse tambih

extracelularmente durante la interacci6n fibra-membrana y proteínas de

unión a elementos del citesqueleto 17. En todos estos eventos la tubulina

resulta dañada por la fibra, aunque estructuralmente se deberá verificar

este hecho.

Este metodo revela que las fibras de asbesto inducen directa y/o

indirectamente anormalidades en anafases, lo cual nos permite apoyar el

siguiente postulado: que la interacción física de las fibras de asbesto con

los cromosomas y/o proteínas del huso mitótico, provocan la segregaci6n

anormal durante la mitosis generando aneuploidía para posteriormente

desencadenar el fen6meno de transformacibn neoplásica5

10

CONCLUSIONES.

De los resultados obtenidos se puede decir que el AC es genot6xic0,

ya que es c a p k de inducir anafases anormales. Se comprob6 que el AC es

cap& de inducir danos directcs (mayor número de puentes anafhsicos) a

40 pg/ml e indirectos (perturbaciones del citoesqueleto), a 20 pg/ml.

Tambih se comprob6 el efecto genot6xico inerte del FC.

SUGERENCIAS

Se sugiere el estudio biol6gico del asbesto a nivel de tubulina

durante el cultivo celular, ya que la tubulina es la proteína estructural del

huso mitbtico y, en estas fibras es donde reside la dinhmica de segregación

cromosómica durante la mitosis.

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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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