In vivo Anti-Chagas Vinylthio-,Vinylsulfinil-, and Vinylsulfonilbenzofuroxan derivatives

Porcal W, Hernández P, Boiani M, Aguirre G, Boiani L, Chidichimo A, et al.

J. Med Chem. 2007

INTRODUCCIÓN

“La enfermedad de Chagas, también conocida como tripanosomiasis americana, es causada por el parásito Trypanosoma cruzi. La forma más común de contraer la infección es a través del contacto con las heces de un insecto triatominio (conocido con los nombres de chinche besucona, benchuca, vinchuca, chipo o barbeiro), el cual se alimenta de la sangre de seres humanos y animales”. (1)

En América existen cerca de 20 millones de personas infectadas y 200 millones se encuentran en riesgo. Este parásito eucariota comparte muchas de las características con el ser humano (hospedero), lo cual dificulta el desarrollo de fármacos selectivos y con pocos efectos secundarios.

Los fármacos que se utilizan con más frecuencia para tratar esta enfermedad son dos heterociclos nitroaromáticos: el Nifurtimox y el Benznidazol. Éstos “suprimen la parasitemia y pueden curar la fase aguda del Mal de Chagas en 60-80% de los casos”; sin embargo no son muy útiles en la fase crónica de este mal. (2)

El mecanismo de acción del Nifurtimox es a través de la reducción del grupo nitro a un radical nitroanión, el cual reacciona con el Oxígeno produciendo superóxido y otras especies reactivas del oxígeno. El mecanismo de acción del Benznidazol, también es a través de la reducción del grupo nitro y el intermediario que se forma reacciona covalente con biomoléculas ART ocasionando peroxidación de lípidos, daño al ADN y a las membranas celulares.

Estos fármacos le generan estrés oxidativo al parásito, sin embargo, en el ser humano también producen efectos adversos como anorexia, vómito, polineuropatía periférica, dermopatía alérgica, entre otros.

El Ketoconazol y la Terbinafina son otros fármacos que se han utilizado como tratamiento de la enfermedad de Chagas. Estos medicamentos antifúngicos inhiben la biosíntesis del esterol que compone la membrana.

A pesar de que la secuenciación del genoma de este parásito fue completado recientemente, no se han descubierto nuevos fármacos para tratar el Mal de Chagas. Por lo tanto, el objetivo de este estudio consistió en descubrir un nuevo fármaco antichagásico que fuera más selectivo y menos tóxico usando un N- óxido como grupo biorreductivo.

DIANAS

Entre las principales dianas se encuentra la Proteasa Cruzaín, la cual es una enzima presente en el parásito y cumple con las funciones de nutrición. Además, se cree que puede estar involucrada en la penetración del tripomastigoto a las células del hospedero y a su vez participa en la diferenciación del parásito durante su ciclo de vida.

Otra enzima importante del T. cruzi es la Tripanotión Reductasa. Ésta es NADPH dependiente y cumple la misma función que posee la Glutatión reductasa en los seres humanos, es decir, se encarga de reducir el Glutatión Oxidado a Glutatión Reducido. Por lo tanto, esta enzima constituye un mecanismo de defensa del parásito contra el estrés oxidativo. La Tripanotión Reductasa también se encarga de regenerar el Tripanotión oxidado a Tripanotión reducido.

Además, se busca la capacidad del fármaco de Interaccionar con Tioles como el Glutatión. Esto debido a que el GSH al igual que la espermidina son precursores directos del tripanotión, que es un tiol que “reemplaza muchas de las funciones del glutatión en el parásito” y por ende también es un mecanismo de defensa del T. cruzi frente al estrés oxidativo. (2)

METODOLOGÍA

Los nuevos agentes anti T. cruzi se desarrollaron tomando como precursores los derivados antichagásicos conocidos (1-7). Los compuestos diseñados incorporaban en su estructura los dos farmacóforos conocidos de los precursores: el benzofuroxano y el viniltio-, vinilsulfinil- o vinilsulfonil.

A los derivados se les examinó de forma in vitro su actividad antiproliferativa contra tres diferentes cepas de T.cruzi: Tulahuen 2, CL Brener y Y (resistente a Nifurtimox y Benznidazol). La citotoxicidad inespecífica de estos derivados fue evaluada in vitro contra macrófagos humanos. Se le realizaron a los mejores derivados estudios bioquímicos para determinar el mecanismo de acción. También se analizaron los efectos en la respiración celular, en la inhibición de dos sitios activos esenciales en las enzimas CP y TR, además de la reacción química con GSH.

RESULTADOS

Se utilizaron dos vías diferentes para obtener derivados con dos farmacóforos: Por medio de condensación/oxidación se generaron derivados feniltio, fenilsulfinil y fenilsulfonivinil y realizando sustitución/eliminación se obtuvo el derivado vinilsulfonimetil.

Todas las estructuras propuestas fueron establecidas por NMR, IR y MS. La pureza fue establecida por TLC y microanálisis.

Los derivados benzofuroxanos existen como una mezcla de tautómeros a temperatura ambiente. Los benzo sustituyentes pueden ocupar la posición 5- o 6- y la proporción de ambos tautómeros en el equilibrio depende de las características electronegativas de los sustituyentes.

Actividad Antitripanosomátida In Vitro

Se ha descrito la existencia de la forma intracelular de T.cruzi en su estado epimastigoto como un estadío intracelular obligado en los mamíferos. Por lo tanto los compuestos fueron estudiados in vitro sobre la forma epimastigoto del parásito.

Se evaluó la habilidad de los derivados para inhibir el crecimiento de la forma epimastigoto de diferentes cepas de T.cruzi (Tulahuen 2, CL Brener y Y), se realizó a 25 µM y la IC50 fue determinada por el más activo de los componentes. Los parásitos crecieron en presencia del componente por 5 días y el porcentaje de inhibición fue determinado contra el control (no se le agregó droga al medio). Los benzofuroxanos no polares; 13-18 y 23 mostraron la mejor actividad sobre las tres cepas, en especial el derivado 16, ya que requirieron menos dosis para inhibir el crecimiento del 50% de los epimastigotos. La menor actividad la presentó el derivado 22, el cual es el más polar.

Citotoxicidad inespecífica

La citotoxicidad se evaluó in vitro utilizando macrófagos humanos (TPH-1) como modelo celular y se midió el IC50 de los macrófagos. Se usaron concentraciones de 25-1000 µM. En el estudio el Ktz y la Tbf fueron incluidos como referencias. Los Z-estereoisomeros, 2, 16 y 18 fueron más tóxicos que los análogos E contra los macrófagos humanos, quizás como consecuencia de la mejor solubilidad en el medio biológico. El derivado 17 fenilsulfonilvinil mostró la mejor selectividad, siendo pobremente tóxico contra los macrófagos a concentraciones que eran 250, 50 y 80 veces su concentració inhibitoria media sobre los epimastigotos.

Evaluación Anti- T. cruzi. In Vivo

Los mejores agentes anti T. cruzi que se obtuvieron in vitro contra la cepa Tulahuen 2 (componentes 13-18 como mezcla equimolar de isómeros geométricos, 13:14 (1:1), 15:16 (1:1) y 17:18(1:1)), fueron evaluadas in vivo en un modelo murino con enfermedad aguda de Chagas. En este estudio preliminar, ratones hembra Swiss fueron inoculadas intraperitonealmente con 2000 tripomastigotos. El tratamiento comenzó 5 días post-infección VO de 60 mg/kg/día de cada componente durante 30 días. Se incluyó un grupo control. El nivel de la parasitemia se determinó semanalmente, la mortalidad fue observada diariamente y las pruebas serológicas fueron realizadas de 60 a 90 días post infección. Ninguno de los animales tratados con benzofuroxanos murió durante el tratamiento, en el grupo control la supervivencia fue de 75%

Las tres mezclas de componentes fueron capaces de disminuir el tripomastigote en el día de mayor parasitemia, día 26 post- infección. Para los animales tratados con benzofuroxanos, la completa y permanente supresión de la parasitemia fue observada para el día 41. La mezcla 17:18 fue la que mostró mayor actividad in vitro seguida por la 15:16 y por último la 13:14.

No se observaron señales de toxicidad durante el tratamiento de los animales con mezclas equimolares 13:14, 15,16 o 17:18. Todos los animales sobrevivieron hasta el final del estudio de la parasitemia. Ninguno de los animales tratados con benzofuroxanos o Bnz usados como control en los estudios de anticuerpos mostraron serología negativa anti T. cruzi. Sin embargo mezclas equimolares de sulfóxidos, 15:16 y sulfonas, 17:18 disminuyeron los niveles de anticuerpos entre los días 60 y 90, mostrando mayor rendimiento que Bnz en este ensayo.

MECANISMOS DE ACCIÓN ESTUDIADOS

Respiración Celular: Los compuestos estudiados no tienen efecto sobre la respiración del parásito, es decir, no producen inhibición o incremento en el consumo de Oxígeno del T cruzi.

Inhibición de la Proteasa Cruzaín: Se estudiaron los compuestos 13, 15, 16, 17 y 18 para determinar si éstos eran inhibidores de esta proteasa y se compararon con los compuestos antichagásicos de partida 1, 2, 5 (E64) y una mezcla equimolar de 1:2. Las concentraciones de estos compuestos utilizadas para el estudio variaron entre 10-100µM y se midió el porcentaje de inhibición de esta enzima.

Como se puede observaren la siguiente figura, sólo los precursores 1 y 2 o su mezcla equimolar inhiben cerca del 50 % a la proteasa cruzaín a concentraciones que van entre los 50 y100 µM. Ninguno de los otros derivados estudiados son buenos inhibidores de la enzima, por lo que se podría decir que los Benzofuroxanos estudiados no inhiben esta proteasa o lo hacen en forma muy débil.

El compuesto precursor 3 es un inhibidor irreversible de la Cruzaín y como puede apreciarse en la siguiente tabla, este derivado interacciona con 5 residuos de aminoácidos en el sitio de unión de la enzima; mientras que los derivados 17 y 18 sólo interaccionan con dos residuos de aminoácidos. La interacción con estos 5 residuos de aminoácidos es esencial para que ocurra la inhibición de esta proteasa, razón por la cual los compuestos estudiados no son inhibidores de la Cruzaín.

Inhibición de la Tripanotión Reductasa: Se estudiaron los compuestos 15, 16, 17 y 18 para determinar si éstos eran inhibidores de la enzima. Para realizar este ensayo se utilizaron 100µM de cada compuesto, NADPH, Tripanotión reductasa y Tripanotión disulfuro (en su forma oxidada).

Si la enzima es inhibida, la Tripanotión reductasa no puede reducir el Tripanotión en su forma oxidada a la forma reducida. Sin embargo, durante el ensayo se observó un cambio de coloración de amarillo a café claro lo cual indica la presencia de Tripanotión reducido el cual reaccionó con los compuestos estudiados. Ningún compuesto inactivó esta enzima enmás de un 15%, razón por la cual estos derivados no son considerados como inhibidores de la Tripanotión Reductasa.

Capacidad de interaccionar con Tioles (Glutatión): Se estudiaron los compuestos 2,14, 16 y 18 para determinar si éstos eran inhibidores de la enzima. Se eligieron los isómeros Z debido a que estos eran más activos en comparación con los isómeros E y a la vez porque eran más solubles en el medio de ensayo.

Los derivados vinilsulfonil 16 y 18 fueron los que reaccionaron más rápido (después de 2 min de incubación) con el GSH, en especial el primero. El compuesto 14 reaccionó más lentamente y el derivado 2 no reaccionó aún después de 48 horas de incubación.

Se consideró como diana de estos compuestos vinilsulfonil y vinilsulfinil la reactividad con el Glutatión.

En el parásito, el Glutatión cumple dos funciones muy importantes, la primera es que actúa como mecanismo de defensa frente al estrés oxidativo y la segunda es que es un precursor del Tripanotión el cual reemplaza muchas de las funciones que cumple el glutatión.

La Triparedoxina Peroxidasa es otra enzima que posee el T. cruzi, cuya su función también es proteger al parásito del estrés oxidativo. Esta enzima toma los electrones donados por la Triparedoxina y reduce el péroxido de hidrógeno y otros hidroperóxidos. El Tripanotión en su forma reducida (TSH) es el que se encarga de regenerar la Triparedoxina (Tpx) (3), es decir, sin el Tripanotión ni el Glutatión los mecanismos de defensa que posee el parásito contra el estrés oxidativo están muy reducidos.

A pesar de que el parásito tiene la enzima Tripanotión Reductasa, que reduce tanto el Tripanotión oxidado (TSSG) y el Glutatión oxidado a sus formas reducidas, ésta no es muy eficiente en reducir el Glutatión y como ya se mencionó anteriormente sin Glutatión no hay síntesis de Tripanotión.

Estos compuestos vinilsulfonil y vinilsulfinil estudiados se cree que reaccionan con el GSH en un proceso redox y actúan como depletores de los niveles de glutatión.

En el T. cruzi los niveles de GSH son mucho menores que los de los mamíferos, por lo que la depleción de los niveles de Glutatión es más peligroso en el parásito. Además, se ha observado que en mamíferos la síntesis de Glutatión puede ser inhibida hasta un 80-90% sin evidencia de toxicidad y asimismo este efecto también puede ser contrarrestado por la enzima Glutatión Reductasa, la cual a diferencia de la Tripanotión Reductasa, funciona eficientemente y puede mantener los niveles de GSH.

CONCLUSIONES

Los nuevos derivados benzofuroxano tienen actividad in vitro contra diferentes cepas de T.cruzi El compuesto con el sustituyente Fenilsulfonilvinil es el más selectivo.

Los derivados estudiados no poseen citotoxicidad contra macrófagos humanos.

Los derivados Vinilsulfinil y vinilsulfonil son entidades depletoras de tioles.

Los compuestos estudiados no inhiben la CP ni la TR.

Los derivados viniltio, vinilsulfinil y vinilsulfonil después de 30 días de tratamiento disminuyen la parasitemia en animales con infección aguda T2, sin provocar signos de toxicidad.

Estos derivados disminuyen los niveles de anticuerpos contra la cepa T2 después de 60-90 días de tratamiento.

Se desarrolló una nueva familia de agentes antiparasitarios que exhiben una actividad in vivo promisoria, sin embargo se deben realizar estudios preclínicos. (dosis, toxicidad).

BIBLIOGRAFÍA

(1) http://www.cdc.gov/chagas/sp/

(2) Goodman & Gilman. Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica. 11ª ed. México DF: Mc Graw Hill; 2006.

(3) Porcal W, Hernández P, Boiani M, Aguirre G, Boiani L, Chidichimo A, et al. Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi TryparedoxinPeroxidases Catalytically Detoxify Peroxynitrite via Oxidation of Fast Reacting Thiols. JBC 2004; 279 (33): 34175–34182.