In the name of

God

Summer School

Influenza Unit,Pasteur Institute of Iran

summer 2011

SDS-PAGE Western Blotting

Summer School

کاربردها SDS-PAGEو

پروتئین • خلوص میزان بررسیپروتئین • مولکولی وزن تعیین•) بالتینگ ) وسترن پروتئین شناساییسولفیدی • دی باندهای حضور وتایید شناساییپروتئین • کمی مقدار تخمینپروتئینها • ای ترجمه از پس تغییرات تعیینغیره ......• و

Summer School

SDS-PAGESodium Dodecyl Sulphate _

Polyacryl Amide Gel Electrophoresis

Summer School

ElectrophoresisElectro + Phoresis

( باردار مولکولهای در پروتئینها(حرکتجداسازی به منجر که الکتریکی میدان

گردد می آنهاSummer School

الکتروفورز فرآیند بر موثر عوامل

مولکولها • فیزیکوشیمیایی خصوصیاتمولکولها • اطراف محیط شرایطالکتریکی • میدان های مولفه

Summer School

مولکولها فیزیکوشیمیایی خصوصیات

شکل •اندازه•بارالکتریکی•

Summer School

مولکول اطراف محیط شرایط

•) ( غلظت و نوع الکتروفورز محیط بستریاو) • بافری ،ظرفیت یونی قدرت ، نوع (pHبافر

محیط • حرارت درجه

Summer School

الکتروفورز بسترهای

اندود) • کاغذ،ورقه جامدسیلیکاژل، به شده

) وسلولز آلومینا• ( آکریل پلی جامد نیمه

) آگارز و آمیدمایع•

Summer School

PAGEPolyacryl Amid Gel Electerophoresis

Summer School

برای آمید آکریل بسترپلی چراشود؟ می استفاده پروتئینها

Summer School

آمید آکریل پلی ویژگیهای

دماها، • در شیمیایی نظر یونی pHاز وقدرتهای هااست پایدار مختلف

است • غیرفعال و بار بدون ترکیبیاست • شفافدارد • را منافذ از وسیعی دامنه ایجاد قابلیتهستند • خالص بسیار آن مونومرهای• ... غیره و

Summer School

پلی در دخیل اجزا و آمید آکریل پلی ژل ترکیبمریزاسیون

Summer School

آکریل پلی ژل پلیمریزاسیون واکنشآمید

شیمیایی • پلیمریزاسیون- آمونیوم) (TEMEDپرسولفات

پلیمریزاسیون •فوتوشیمیایی

- (TEMEDریبوفالوین)

پلیمریزاسیون بر موثر عوامل

•) کننده ) شروع آمونیوم پرسولفات•TEMED) کاتالیزور)•) مهارکننده ) هوا اکسیژن(ºC30-20دما )•

زمان ) • بهترین (20-60زمان دقیقه

آکریل پلی ژل فیزیکی خصوصیاتآمید

منافذ • اندازهاالستیسیتی•ژل • چگالیمکانیکی • قوام

ژل دهنده تشکیل جز دو غلظت از متاثر اینهااست آمید آکریل بیس و آمید آکریل یعنی

Optimal Resolution Range

Acrylamide Percentage Separating Resolution 15.0% Gel 15- 45 Kd 12.5% Gel 15- 60Kd 10.0% Gel 18- 75Kd 7.5% Gel 30-120Kd 5.0% Gel 60-212Kd

Summer School

) تانک) و نمونه ژلها، بافرها

نوع •یونی • قدرتزیاد - جریان برقراری در نمونه یونهای نقش تا باشد کم

باشدتوان - افزایش بافر یونی غلظت بردن باال

گرما و الکتریکی• ( تغییر برابر در مقاومت بافری (pHظرفیت•pH (می پروتئین در تغییراتی باعث نباشد مناسب اگر

) است مهم الکتروفورز در که گردد

Summer School

ژل در بافری سیستمهای

پیوسته•و یونی است pHترکیب ثابت ژل سراسر و ها قسمت تمام بافردر

•) قسمتی) چند ناپیوستهو یونی سراسر pHترکیب و ها قسمت تمام ژل بافردر( Stacking &Resolving) است یکدیگرمتفاوت با

Summer School

Stacking & Separating Gels

SDS-protein

Glycin

Cl

Stacking gel height =2 well height

Summer School

: ناپیوسته سیستم مزیت

و • نیست نمونه حجم از متاثر الکتروفورز کاراییروش این با رقیق های نمونه از باالیی حجم

باشند می تفکیک قابلکننده • متراکم یا باال ژل در حرکت طی در پروتئینها

(Stacking) صورت نازکی به های سپس الیه و آمده درجداکننده یا پایین ژل ( Separating =Resolving)در

شوند می تفکیک خود اجزای به

Summer School

نمونه (sample buffer)بافر

Sample buffer component

• SDS )Sodium Dodecyl Sulfate( detergent

– solubilizes and denatures proteins

– negative charge to proteins

• 2-ME reduce disulphid bounds

• Glycerol

• Bromophenol Blue

• Tris bufferSummer School

تانک بافر

چیست؟ تانک بافر در گالیسین نقش

SDS-PAGE

Summer School

SDS

Summer School

SDSجایگاه

بافرها • ترکیب در( Separatingو Stackingبافرژلها)-(Sample bufferبافرنمونه)-بافرتانک-

Summer School

پروتئین SDSاثر ساختار بر

Levels of Protein Organization

• Primary structure = linear chain of amino acids

• • Secondary structure = domains of repeating structures, such as β-pleated

• sheets and α-helices

• • Tertiary structure = 3-dimensional shape of a folded polypeptide, maintained by disulfide bonds, electrostatic interactions, hydrophobic effects

• • Quaternary structure = several polypeptide chains associated together to form a functional protein

Summer School

SDS-PAGEانواع

-Denature SDS-PAGE-Non Denature SDS-PAGE

Summer School

ویروس همآگلوتینین واحدهای زیردی پیوندهای ومکان آنفلوآنزا

آن ساختار در سولفیدی

کار ایمنی

آمید • آکریل بیس و آمید آکریل•TEMED•2-ME•SDSو ...•

Summer School

MSDS

Material Safety Data Sheet

Summer School

Biosafety ofAcrylamide & Acrylamide-Bis

Summer School

71.1: وزن مولكوليcH2=cHcoNH2 فرمول شيميايي :

جامد كريستالي وضعيت ظاهري:سفيد و بي بو

Summer School

گير ،سمي کننده آتش محيط وآلودهزيست

است • نوروتوكسين شدت به ماده اينمي • جذب سرعت به تنفس و پوست راه از

است. ممكن و دارد سوء اثر باروری بر شود . شود جنين در ناهنجاريهايي بروز سبب

است • سرطانزااز • عبارتند آميد آكريل با مسموميت عاليم

ضعف، شدن، سوزن سوزن گيجي، و منگي. ولرز تكلم اختالل رفتن، راه در تعادل عدم

Summer School

ایمنی اقدامات : اس�تفاده از عين�ك ب�ا حف�اظ كن�اري تم7اس ب7ا چش7م•

ال�زامي ا�س�ت. اين� م�اده در� ص�ورت تم�اس ب�ا �چش�م �مي تو�اند باعث �سوز�ش چشم� و ورم� ملتحمه شود.

� چش�م را ب�ه م�دت • � ب�از ك�رده و س�ريعا پل�ك چش�م را ك�امالص�ورت �مش�اهده 15 د�ر ده�ي�د. شستش�و �آب �ب�ا دقيق�ه

پزش�ك �مراجع�ه ب�ه داده �و اد�ام�ه را شس�تش�و ع�و�ارض نمائيد.

�اظتي تم77اس ب77ا پوس77ت•��تكش حف��تفاده از دس�: اس. ب�ه�تر اس�ت از دو �جفت دس�تكش من�اس�ب ال�ز�امي ا�س�ت

� وارد �ا�س�تفاده �ش�و�د. اي�ن م�اد�ه از� طر�ي�ق ز�خم �ب�از س�ري�عا�پو�س�ته �پو�س�ته ب�اعث م�اده �ا�ين ب�ا ب�دن مي ش�ود�.تم�اس

شدن پوست مي شوددر ص�ورت تم�اس محل�ول ي�ا پ�ودر آكري�ل آمي�د ب�ا پوس�ت، •

� دقيق�ه 15مح�ل� تم�اس� را �ب�ا آب ف�راوان �و ص�ابون ب�ه م�دت �و مس ئ�ول ايمني را �در جريا�ن قرا�ر ده�يد �.ش�ستش�و داده

Summer School

اقدامات ایمنی در موارد زیر

: در ص�ورتكه ف�رد حجم زي�ادي بلعي7دن-خوردن•�ا�ز� م�اده را� ب�لعي�ده �باش�د ف�رد �را �وادا�ر ب�ه� اس�تف�راغ كن�ي�د �اين �ك�ا�ر� ب�ا ق�ر�ار د�ادن� ان�گش�ت ي�ا قاش�ق �د�ر �پزش�ك �� ب�ه پش�ت� زب�ان� ا�مك�ان� پ�ذي�ر �اس�ت.� ف�ور�امرا�جع�ه �كني�د.� ت�ذ�كر ب�ه� ف�رد�ي� ك�ه هوش�يار ن�يس�ت

هرگز از راه خوراكي چيزي ندهيد.: از طري�ق استنش�اق بس�يار س�مي اس�ت. تنفس •

�ر تنف�س ��د. اگ��ل كني��ازه م�نتق��وا�ي ت��ه ه��ر�د را� ب�فقطع شده� بو�د به� وي �تنفس مصنوعي �بدهيد

نگهداری و ذخیره سازی

در محيطي با تهويه مناسب و خنك نگهداري •شود.

در صورت بروز حريق از كپسول هاي پودر •خشك شيميايي ؛ دي اكسيد كربن يا آب جهت

استفاده نماييداطفاء حريق

Summer School

اثرات زيست محيطي و رفع آلودگي�ت •��ط زيس��ان و محي��راي آبزي��اده ب�اين م

آنها بسيار خطرناك است. در حيوان�ات ب�اعث ايج�اد توم�ور در ري�ه؛•

مي شود .و ... آدرنال ،غده تيروئيد

Summer School

دفع پسماندهاي آكريل آميد:•اد زائ�د آكري�ل آمي�د ش�امل ژل و حول�ه كاغ�ذي آل�وده باي�د در ي�ك م�و

ك�يسه ز�يپ دار قرار� داده شود �و براي� سوزا�ندن ارسال �گردد.رفع آلودگي سطوح :•

: آل�ودگي را ب�ا م�واد خن�ثي آل�ودگی در ص7ورت كم ب7ودن حجم- م�ث�ل خ�اك�؛ش�ن�؛� ما�س�ه� و �ي�ا �ه�ر �م�ا�د�ه ج�اذ�بي �ك�ه ب�ا �آن �واكنش نم�ي ده�د جم�ع آوري� ن�ما�يي�د) �از خ�اك �ار�ه اس�ت�فاده �نكني�د�(. س�پ�س مح�ل

�% و� ب�ع�د �ب�ا م�حل�و�ل س�ديم 1/6آ�ل�ود�ه �را �ب�ا م�ح�ل�ول �س�دي�م پ�ر �س�ولفا�ت�دقيق�ه ب�ا� حجم زي�اد %30� پوش�ا�ن�ده �و بع�د �از �1/6ب�ت�ا بي س�ولفات

آب شستشو دهيد.آل7ودگیدر ص7ورت زي7اد ب7ودن حجم- : اف�راد را ب�ا زدن عالمت

.��نش�ت م�اده� ش�يميايي ازخط�ر ب�ر ر�وي �درب آزمايش�گاه مط�ل�ع كني�د � آ�زمايش�گاه ج�لوگ�یر�ی کنی�د ؛ تهو�ي�ه مناس�ب را رو�ش�ن نم�و�ده و ف�ور�ا

�نم�ودن �آب م�ي تو�اني�د غ�لظت� بخ�ارات آن را �ر�ا �ت�رك �كني�د�. ب�ا� اس�پريدر هوا كم كنيد.

Summer School

• � براي محل�ول س�ازي و ت�وزين پ�ودر آكري�ل آمي�د باي�د حتم�ااز �هود شيم�يايي�، دستكش و �ماسك استف�اده �کنید.

در ص�ورت ريختن ژل، م�يز ك�ار را ب�ا حول�ه كاغ�ذي، كاغ�ذ •خشك كن يا اليه جذب كننده ديگر بپوشانيد.

سيس�تم • ج�انبي ل�وازم س�اير و ه�ا شيش�ه ه�ا، گيره � بشوييد. الكتروفورز را بعد از استفاده كامال

ژل اس�تفاده ش�ده و اض�افي را بع�د از بس�تن كام�ل، ب�ا •ا�س�تفا�ده از دس�تكش� در كيس�ه ا�ي جداگان�ه ق�رارداده و � بس�ته ش�ده �د�ور بريزي�د)آكري�ل آمي�د بص�ور�ت ژل �ك�امال

اثر سمي كمتري دارد.(به�تر اس�ت بج�اي پ�ودر آكري�ل آمي�د، محل�ول ه�اي آم�اده •

خريداري و مصرف شود. Summer School

اين م�اده ب�اعث آس�يب ب�ه چش�م، پوس�ت و سيس�تم گوارش�ي •

و ب�ه سي�س�تم� عص�بي� مرك�ز�ي ميگ�رد�د. هم�چ�نین مي �توان�د

محي�طي آس�يب رس�اند�ه و �در ص�ورت تم�اس� ط�والن�ي م�دت

ب�ا �تجم�ع �در �ا�رگ�ا�ن �ه�اي م�ختل�ف ب�د�ن س�الم�ت� ف�ر�د ر�ا� ب�ه� خط�ر

.اندازد

اقدامات ایمنی

در تم�اس ب�ا چش�م وپوس�ت و تنفس مانن�د آكري�ل آمي�د رفت�ار مي ك�نيم •مح�ل آل�ودگي را ب�ا آب و دس�تمال تم�يز ك�رده و آن را در س�طل زبال�ه •

م�خص�و�ص بر�ي�زي�د.� در �ص�ورت� ري�ختن �مق�ادير ز�ي�اد �از �اين محل�ول ب�ه آن �آن� آ�ب نريزي�د و� ب�راي� تم�ي�ز �ك�رد�ن� مح�ل �ا�ز م�س�ئول �دس�ت� ن�زد�ه� و روي

.�ايمني� كمك �بگيريددر مواق�ع اس�تفاده از دس�تكش و ماس�ك و لب�اس مخص�وص اس�تفاده •

.شود

شخصي • :محافظت

به�تر اس�ت ك�اربر در موق�ع اس�تفاده در ات�اقي ب�ا تهوي�ه مناس�ب ك�ه در آن ذ�رات� معل�ق پ�راكن�ده �از� اين م�ا�ده� ب�ه ا�س�تان�ه خط�ر� ن�مي رس�ند ك�ار

كند در اين ات�اق مي بايس�تي وس�ايل ايم�ني ب�راي شستش�و چش�م و ب�دن

وجود داشته باشد

Summer School

نگهداري بیس آکریل آمید

اين م�اده مي بايس�تي در محي�ط ب�ا تهوي�ه خ�وب

درج�ه س�انتی گ�راد نگه�داري 25و دم�ای زي�ر

شود

 

TEMED

Summer School

TEMED

Tetramethylethylenediamineنام شيميايي:

آميني شديدمشخصات ظاهري: محلول شفاف ، بي رنگ با بوي

- در حالت مايع و بخار به شدت آتش گيراست.

- در صورت تنفس يا بلعيدن سوزاننده است.

در مدت طوالني نوعي تاري ديد ایجاد می کند.TEMED- تماس با مقادير كم

بوده است به سرعت به فضاي آزاد TEMED اگر فردي كه در معرض بخار

منتقل شود اين تاثير موقتي خواهد بود.

Summer School

SDS-PAGEاجرای

Summer School

الکتروفورز عملی اجرای مراحلSDS-PAGE

آماده سازی ژل•آماده سازی نمونه•سوارکردن ژل •نمونه گذاری•راندن نمونه در ژل•تثبیت و رنگ آمیزی نمونه ها•نگهداری ژل• تحلیل نتایج•

Summer School

ژل سازی آماده

Summer School

قالب سازی آماده

Summer School

(resolving) اول ژل ریختن

Summer School

دوم ژل (Stacking)ریختن

Summer School

(Comb) شانه قراردادن

Summer School

تانک در ژل قالب قراردادن

Summer School

گذاری نمونه و نمونه سازی آماده

Summer School

Summer School

SDS-Protein

Glycine < SDS-Protein < Cl

Electrophoretic Migration of Glycine, SDS-Protein and chloride in electrical field

Summer School

How does an SDS-PAGE gel work?

• Negatively charged proteins move to positive electrode

• Smaller proteins move faster

• Proteins separate by size

Summer School

آمیزی رنگ

Summer School

SDS-PAGE آمیزی رنگ انواع

پذیر • برگشتایمیدازول با آمیزی رنگ

ناپذیر • برگشت - Coomassie staining - Silver staining

ژل نگهداری

Summer School

نتایج آنالیز

Summer School

Dot & Western-Blotting

Summer School

Western-Blotting

اساس: • که است ایمونوشیمیایی تکنیک تعریفباشد می بادی وآنتی ژن آنتی واکنش آن

کاربرد:•تحقیقات-تشخیص-

Summer School

Blotting

) ( پلی ژل از پروتئینها مولکولها انتقالغشا به آمید آکریل

Summer School

Kind of Blotting

• Kind of Molecule- Western Blotting(protein)- Eastern Blotting(lipid)- Southern Blotting(DNA)- Northern Blotting(RNA)

Summer School

غشا به مولکول انتقال راههای

مستقیم••) ژل ) از مستقیم غیر

غشا به ژل از مولکولها انتقال راههای

برق • جریان از استفاده ( Electro Blotting)با

از • استفاده برق بدون Non Electro)جریانBlotting )

انتشار-موئینگی - خاصیتخال - کمک (Vacum)با

Summer School

برق جریان با انتقال روشهایتانک • در (Wet/Tank transfer)انتقال

بافر حاوی

خشک انتقال• (Semidry transfer)نیمه

Summer School

تانک در (Wet/Tank transfer)انتقالبافر حاوی

Semidry transformationانتقال نیمه خشک

Summer School

الکترود دو بین ژل و غشا گرفتن قرار ترتیبWestern-Blotting

W. Blotting Procedure

Summer School

Western-Blottingمراحل

الکتروفورز از استفاده با پروتئینها مخلوط از پروتئین SDS-PAGEتفکیک

غشا روی بر پروتئین (Transferring)انتقال غشا کردن (Blocking)مسدود

) غشا ) در پروتئینها اختصاصی تشخیص منظور به لیگاند بادی آنتی با نمودن مجاور

Blotآشکارسازی

Summer School

Summer School

تفکیک پروتئین از مخلوط پروتئینها با استفاده از SDS-PAGEالکتروفورز

غشا به پروتئین انتقال

Summer School

(Membrane)غشا

Summer School

غشا (membrane)انواعنیتروسلولز-سلولز - اتیل آمینو اتیل دیسلولز - متیل کربوکسی-PVDF) فلوراید) دی وینیلیدن پلی-DBM) متیل) اکسی آزوبنزل دی-DPT) تیواتر) فنیل آزو دینایلون--Summer School

غشا انتخاب بر موثر عوامل

بالتینگ • هدفقیمت•

Summer School

سلولز نیترو ویژگیهای

منافذ • میکرومتر 0/45تا 0/05اندازهپروتئین • به اتصال باالی ظرفیتقیمت • ارزان

انتقال (Transfer Buffer)بافر

Summer School

انتقال بافر موثربرانتخاب عوامل

)برای گلیکوپروتئینها از بافر بورات سدیم نوع پروتئین •استفاده می شود(

نوع غشا•نوع الکتروفورز• CAPSمانند تعیین توالی پروتئین که از بافر هدف بالتینگ)•

(استفاده می گردد

Summer School

غشا به انتقال تایید راههای

یا ) • سلولز نیترو غشا آمیزی ( PVDFرنگ- - ( بلک آمیدو اس، پانسو مانند پذیر درصد(0/01برگشت- ( آمیدوبلک آبی، کووماسی ناپذیر (0/5برگشت اسیدی درصد

تجاری • خاص پروتئینی مارکرهای از استفاده

Summer School

غشا به انتقال از بعد مراحل سایر

Summer School

Membrane Blocking(Quenching)

Blocker must be inert protein(BSA, hemoglobin, Skim milk,Gelatin,…)

Summer School

تشخیص اختصاصی پروتئینها در غشا با استفاده ازلیگاندها

مستقیم • تشخیصغیرمستقیم • تشخیص

) ثانویه ) لیگاند به متصل ها رادیواکتیو،فلورسانس،آنزیم مواد از استفاده با

: لیگاندها انواعمی ) - قرار استفاده مورد پژوهشی یا تشخیصی اهداف با که بادیها آنتی

گیرند(لکتینها-و ...-

Summer School

) بالتینگ) وسترن ایمونوبالتینگ

Summer School

Blot Detection & Evaluation

Summer School

Thanks