Les cellules souches mésenchymateusesLes cellules souches mésenchymateuses

du tissu adipeux humain : du tissu adipeux humain :

Etude de leur potentiel myogéniqueEtude de leur potentiel myogénique

Ari Massoudi

UMR 6543 CNRS« Stem cells and differentiation »

Centre de BiochimieUniversité de Nice-Sophia Antipolis

Faculte des Sciences

Renouvellement tissulaire

- Tissus à renouvellement rapide

Renouvellement de l’épidermeRenouvellement de l’épithélium intestinalRenouvellement des cellules du sang….

Dégénérescence

- Traumatique (brulure, blessure…)

- Pathologique (Alzheimer, défaut génétique, cirrhose…)

Des cellules non-spécialisées assurentle maintien de l’homéostasie tissulaire :

« cellules souches et progéniteurs »

Un homme adulte ≈ 10 trillions (10.1018 ) de cellules spécialisées

• 20- 40 millions de cellules disparaissent / seconde !

Totipotentes

stade 8 blastomères (3 jours)

Nouveau-né

œuffécondé(jour 1)

embryon pré-implantatoire

Pluripotentes

cellules souches embryonnaires (ES)

(≈400 types cellulaires)

trophoblasteBouton embryonnaire

(ICM)

cellules souches germinales

embryonnaires (EG)

Pluripotentes

Embryon/Fœtus

cellules foetales

Multipotentes

Cellules souches du cordon ombilical

Cellules souches adultes• NSC• MSC• SC

• ESC• SPG …

Multipotentes,Oligopotentes,

Unipotentes

1. Totipotentes => organisme entier

2. Pluripotentes => l’ensemble des types cellulaires

3. Multi / oligopotentes => capacités plus restreintes

4. Unipotentes => un seul type cellulaire

cellules souches/progéniteurs

(Adulte ≈ 400 types cellulaires)

progéniteur

précurseur

cellule différenciée

cellule souche

Hiérarchie ontogénique

Potentiel régénératif

Les cellules souches sont des cellules « rares »Fréquence : 1 / 500 à 108

Identitétissulaire

« Définition minimum mais insuffisante » :

« Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité »

de se transformer en au moins un type cellulaire

Cellule souche

Cellule souche

« Définition minimum mais insuffisante » :

« Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire

Traits importants s’ajoutant à la définition minimum :

• Auto-renouvellement :

maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires

• Multipotence :

la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire

• Clonogénicité :

les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule

progéniteur

précurseur

cellule différenciée

cellule souche

Auto-renouvellement

Maintien du pool de cellules souches au fil des générations

Cellule souche

« Définition minimum mais insuffisante » :

« Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire

Traits importants s’ajoutant à la définition minimum :

• Auto-renouvellement :

maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires

• Multipotence :

la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire

• Clonogénicité :

les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule

progéniteur

précurseur

cellule différenciée

cellule souche

Mulipotence

La potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire

Multipotence par plasticité

progéniteurs unipotents

cellule souche

indéterminée

Programme type cellulaire A

Programme type cellulaire B

Plasticité : capacité d’acquérir de novo différents « programmes » de différenciations

Le programme peut se matérialiser par l’expression de facteurs de transcription qui

entrainent l’expression de gènes spécifiques d’un type cellulaire

Multipotence par trans-différenciation

Song et al. Faseb J. 2004de la Fuente et al. Exp Cell Res. 2004Real et al. Dev Biol. 2006

Multipotence par fusion

Ying et al. Nature. 2002Terada et al. Nature. 2002Spees et al. PNAS. 2003Garbade et al. EJCS. 2005 Ishikawa et al.FASEB J.2006

Cellule souche

« Définition minimum mais insuffisante » :

« Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire

Traits importants s’ajoutant à la définition minimum :

• Auto-renouvellement :

maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires

• Multipotence :

la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire

• Clonogénicité :

les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule

Cellules souches mésenchymateuses (MSC)

Définition de l’ International Society for Cellular Therapy (ISCT) :

Toute population cellulaire obtenue à partir d’un tissu/organe ayant in vitro les

caractéristiques minimums suivantes :

• Adhérence au plastique (par opposition aux cellules hématopoïétiques)

• Multipotence mésenchymateuse Adipo-Ostéo-Chondrocytaire

• Combinatoire d’expression des marqueurs de surface :

CD45, CD34, CD19, CD14, CD11b, HLA-II… Négatives

CD105, CD90, CD73… Positives

• Clonogénicité

culture in vitroexpansion

cellules adhérentes

adipocytes

cellules stroma-vasculaire

Tissu adipeux humainnouveaux-nés ou enfants

human Multipotent Adipose-Derived Stem cells(hMADS cells)

Culturesecondaire

Zaragosi et al. Stem Cells. 2006

Rodriguez et al. J Exp Med. 2005

• Auto-renouvellement

• Activité télomérase

• Caryotype normal

• Non-tumorigénique in vivo - souris nude -

• Multipotence

cellules hMADS => propriétés fondamentales de cellules souches :

Multipotence

mésenchymateuse des cellules hMADS

cellules hMADS

adipocytes

ostéocytes

chondrocytes

induction adipogénique

induction osteogénique

induction chrodrogénique

cellules hMADS = MSC du tissu adipeux

• CD34 négative• adhérence au plastique

Multipotence mésenchymateusepar « plasticité »

ALPOstéonectine OstéocalcineOstéopontine

ColI1…

CBFA-1

Osterix

SMADs

VD3R

FosB

Adipocytes

CD36GAPDH

LPLaFABPLeptine

AdiponectineAdipsine

…

Pref-1

C/EBP

C/EBP

PPAR

PPAR

C/EBP

Induction adipogénique Induction ostéogénique

progéniteur

précurseur

Ostéocytes

Alizarin redORO

hMADS cells

Contribution myogénique cellules hMADS in vivo

cellules hMADS

injectionintra-musculaire

Résultats antérieurs du laboratoire :

Protéine dystrophine humaine

Noyaux hMADS / myofibre

Rodriguez et al. J Exp Med. 2005.

plusieurs mois après

souris mdx

Souris mdx = modèle de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD)Mutation ponctuelle dans le gène dystrophine => nécrose musculaire

Myogenèse

La myogenèse est sous le contrôle de facteurs de transcription « clés » :Myogenic Regulatory Factors (MRF) : Pax7, MyoD, myf-5, myogénine, MRF4

nls-LacZcellules hMADS

myoblastes lignée C2C12 souris+

noyau humain-gal +

myotube hybride homme - souris

Résultats similaires obtenus avec :

• Myoblastes primaires souris wt ou mdx

• Myoblastes humains de patients sains

• Myoblastes humains de patient DMD

Contribution myogénique cellules hMADS in vitro

Expression de messagers musculaires humainsen co-culture hMADS / C2C12

D 0

D 1

D 2

D 4

hMADS cells / C2C12 co-cultures

h = human specific primers

m = mouse specific primers

h sarcospan

h dystrophin

h muscle creatine kinase

h enolase 3

h desmin

h actin

m hprt

muscle markers

hum

an m

uscl

e ce

llsm

ouse

C2C

12

RT-PCR

noyaux hMADS

sarcoglycane humain

( confocal analysis )

Expression de la protéine -sarcoglycaneen co-culture hMADS / C2C12

sarcoglycane humain

Myotubes issus de myoblastesde patient DMD

Co-culture celllules hMADS / myoblastes DMD

dystrophine

Expression de la dystrophine en co-culture

Myotubes hybrides hMADS/DMD expriment la dystrophine

3) Par quel mécanisme les cellules hMADS contribuent-elles à la myogenèse ?

1) Contribution des cellules hMADS

à la formation de myotubes hybrides

2) Expression de gènes musculaires

codés par le génome hMADS dans les myotubes hybrides

in vitro

Hypothèse :

Les cellules hMADS possèdent

une « plasticité myogénique » intrinsèque ?

Stratégie :

« Allumer » le programme myogénique

en testant différentes conditions inductives

connues pour promouvoir la myogenèse

Mecanisme de la contribution myogénique ?

• 46 conditions de culture testées en présence ou en l’absence de sérum• milieux conditionnés provenant de myoblastes

• membrane natives provenant de myoblastes• différents type de matrice extracellulaire

Aucune des conditions testées n’a permit d’induire un programme myogénique

Conditions de culture testées pour promouvoir la myogenèse des cellules hMADS

Hypothèse : Seuls les myoblastes induisent le programme myogénique

dans les cellules hMADS ?

Stratégie :

Evaluer l’expression des MRF par les cellules hMADS en co-cultures

Pax7 ? MyoD ?

Myogenin ?

cellules hMADS

Myoblastes

Induction« complexe »

« myo »-hMADS

Mecanisme de la contribution myogénique ?

Pax7 + MyoD +

Myogenin +

myoblastes Myogenin +

Expression de la myogénine en co-culture GFP-hMADS / myoblastes C2C12

GFP-hMADS cells Myogenin -

Aucun MRF exprimé par les cellules hMADS en co-culture

Expression des MRF en co-culture

GFP-hMADS cells : Pax7-Myoblasts : Pax7+

GFP-hMADS cells : MyoD- Myoblasts : MyoD+

Résultats similaires :

co-cultures

hMADS/ myoblastes humains

Expression de la myogenin en co-culture

GFP

noyau hMADS

Hoescht

smooth

noyau souris

merge myoG

hum myogenin

hum actin

mouse hprt

co-culturehMADS/C2C12

myotubes

RT-PCR

hu

man

mu

scle

cel

lsm

ou

se C

2C12

Noyaux issus des cellules hMADS dans les myotubes hybridescontiennent la myogénine codée par le génome de souris

noyau hMADS

noyau souris

Mécanisme de la contribution myogénique ?

cellules hMADS

Myoblastes

induction« complexe »

« myo-like »-hMADS

Engagement « partiel »indépendante des MRF ?

Hypothèse :

Pax7 -

MyoD -

Myogenin -

Desmine +Nestine +

Desmine ?Nestine ?

myoblastes myotubes (j4)

myoblastes humains

GFP-hMADS

+myoblastes

C2C12souris

Nestine « humaine »

différenciation

Expression de Nestine humaine

En co-cultures, seuls les myotubes hybrides expriment la Nestine humaine

Co-culture

Expression de Nestine humaine

*

*

*

*

Co-culture cellules hMADS / myoblastes C2C12 souris

Myotube hybride

Myotubes humain

Conclusion

2nd hypothèseEngagement partiel

1st hypothèsePlasticité myogénique

Expression gènes musculaires :

sarcoglycane +dystrophine +

nestine +sarcospane +

desmin +enolase3 +

muscle creatine kinase +

myocytes

cellules hMADS

Fusion cellulaire

myotube MRFs( myogenin, herculin, MEFs )Conversion myogénique des cellules hMADS

Modèle :Conversion

myogénique post-fusion

Perspectives

Expression gènes musculaires :

sarcoglycan +dystrophin +

nestin +sarcospan +

desmin +enolase3 +

muscle creatin kinase +

Myogenin-expressing myoblasts

hMADS cells

cellular fusion

myotube MRFs( myogenin, herculin, MEFs )

Rôle des MRFsdans la

reprogrammation

Facteurs impliquésdans la fusionhétérologue

reprogrammationapproche globale

This work has been supported byAssociation Française contre les Myopathies