fases alternativas al c18 y sus aplicaciones - agilent · • cuando se trabaja cerca del pka de un...

Fases alternativas al

C18 y sus aplicaciones

Julián de la Mata

Especialista de Columnas

26-27 Septiembre 2012

Agenda

Fases alternativas al C18 y sus aplicaciones

Zorbax CN, Stable Bond Aq, Bonus RP

Polaris Amide y Ether

Zorbax Fenil y Pursuit Difenil y PFP

Columnas HILIC

WIN 2010 organization

Agilent Restricted

July 7th to 9th , 2010

Confidentiality Label

September 27, 2012 3

C18 es la fase reversa ligada más popular porque...

Las columnas C18 proporcionan buena retencion y resolución

con muchas muestras diferentes

Las columnas C18 tiene una larga duración en muchas fases

móviles diferentes (pH 2-8 o e incluso pH 2-9 y hasta 11.5)

Las columnas C18 son muy flexibles para el desarrollo de

métodos y la optimización, debido a su amplio rango de

condiciones de uso.

Hay una gran variedad de C18’s para optimizar la selectividad y

resolución con diferentes tipos de muestras– i.e. diferentes tipos

de ligado C18 (monomerico vs. polimerico, monofuncional vs.

trifuncional, diferente densidad de ligado, diferentes reactivos de

ligado etc.) y diferentes desactivaciones ( endcapping).



Química de la fase reversa ligada en HPLC

- 95% de la gente usa HPLC de fase reversa

La mayoría de las fases C18 son monocapa ligada y desactivadas

endcapping ligado Superficie de

silanoles

libre, 50% sin

desactivar

Endcapping

group

Superficie de

silanoles libres antes

del ligado



Ligado Monomérico vs. Polimérico

Ligado monomerico

Ligado típico Zorbax

•Eclipse Plus

•Eclipse XDB

•StableBond

•Bonus-RP

•Agilent HC(2)/TC(2)

Ligado Polimérico

Eclipse PAH

Silano Trifuncional

Altamente reproducible

¿Porqué necesitamos alternativas al C18?

min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

10

20

min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

10

20

min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

10

20

Fenol

Metilparaben Etilparaben

N,N-Dietil-m-

toluamida

Propilparaben Butilparaben

Tolueno

Heptilparaben

Eclipse Plus C18

Eclipse Plus

PhenylHexyl

Bonus RP

Flujo: 0.5ml/min; Gradiente::25 a 80%ACN en 3min, a 4min 90%ACN,a 4.5min 25%ACN, por 6min25%ACN

Tiempo de análisis: 6min; Vol inyección.: 3µl con needle wash (Agua/Methanol=50/50)por 6 s; T: 30°C (storage/run)

DAD: 254nm bw 10, ref. 360/100nm, 4nm slit, peak width 0.01min

Impacto en el desarrollo de métodos:Resolución—Efecto

de la Selectividad, Eficiencia, y Retención

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Reso

luti

on

Increase N

Increase Alpha

Increase k'

Lo que más influye en la Resolución es la Selectividad

• Cambio Fase Estacionaria

• Cambio Fase Móvil

• Temperatura

• Los Platos es lo más fácil de aumentar

Rs = N½/4 (-1)/ k’/(k’+1)

Plates: 5000 10000 15000 20000 25000

Alpha: 1.10 1.35 1.60 1.85 2.1

k’: 2.0 4.5 7.0 9.5 12.0

Parámetros Típicos Desarrollo Métodos

Lo que más influye en la Resolución es la Selectividad

¿Qué clases de Fármacos son críticos? Ácidos, bases, moleculas polares y compuestos aromáticos/conjugados,

4-Acetamidofenol

pKa 9.71

C l

N +

C l -

Clormequat

Adenosintrifosfato (ATP)

Acido acetilsalicílico

pKa = 3.5

cis-Permetrina

http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Adenosintriphosphat_protoniert.svg&filetimestamp=20080419200523

Influencia del valor de pH en diferentes clases

de sustancias

apolar polar ionizable

Naftaleno Alcohol Bencílico Acido Benzoico

Acenafteno Nitrobenceno Benzanilida

pH 3

pH 7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Time (min) Time (min) Time (min)

Efecto del pH en la Forma de Pico

a o cerca del pKa de la Muestra

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Time (min) Time (min)

Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN

Flujo: 1.0 mL/min. Temperatura: RT

pH 4.4

Cerca

del pka

pH 3.0

Al menos una

unidad de pH

alejada del pka

Ibuprofeno

pKa = 4.4

CH3CHCOOH

CH2CH(CH3)2

• Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y

esto debe evitarse.

Tf = 3.9 Tf = 1.8

Fases ZORBAX CN y StableBond Aq,

ZORBAX Bonus RP, Polaris Amide y Polaris Ether

para compuestos polares

O

CH3

O

CH3

StableBond CN

Eclipse XDB CN

O

Aq StableBond Aq

(Bonus RP y Polaris tambien para bases fuertes)

Separación de Acidos/Bases. Fases Stablebond

Columna: 4.6 x 75 mm, 3.5 m Fase Móvil : 80% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 : 20% MeOH Flujo : 1.0 mL/min Temperatura: 35°C Detección: UV 254 nm

StableBond

SB-C18

Time (min)

0 5 10

1 3

2

StableBond

SB-Phenyl

1

3

StableBond

SB-C8

Time (min)

0 5 10 15

1

2, 3

Time (min)

0 5 10 15 20

Time (min)

0 5 10

2

3

1

2

StableBond

SB-CN

Muestra: 1. Barbital 2. Sulfametoxazol 3. Cafeina

Selectividad óptima para separaciones ultrarrápidas

min

RRHT SB-Phenyl: Selectividad más rápida!

Columna: RRHT 4.6 x 50mm, 1.8um Fase Movil: Acetonitrilo (40%):Tampon 60% pH=2.4 25mM NaH2PO4

Flujo: 1.85 mL/min Detección: DAD, 254 nm LC: Agilent 1200 RR LC Vol inyección: 1 uL

Orden de elución: Picos 3,4 & 5

Muestras:

1. Tolmetina

2. Naproxeno

3. Diflusinal

4. Ibuprofeno

5. Diclofenaco

para SB-Phenyl

SB-Phenyl 1.8um

SB-C8 1.8um

SB-C18 1.8um

SB-CN 1.8um

0 1 2 3 4 5

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Optima!

Doble de tiempo

Tailing

Interacciones secundarias

Co-Elución

ZORBAX: Bonus RP

1

1

1

1

1

1

PG R

PG R

PG R

Rango de pH: 2 - 9

Límite de temperatura: 60ºC Tamaños de Partícuila: 1.8, 3.5, 5, 7 3m

•Gel de sílice ultra pura Zorbax RxSil

•Silanos monofuncionales

•Grupo amida polar embebido

•Cadenas laterales voluminosas para

estabilidad a bajo pH

•Triple desactivación para estabilidad

a pH medio y buenas formas de pico

Ventajas:

Analisis de compuestos altamente

polares en condiciones 100% acuosas.

Selectividad ortogonal

Columnas:4.6 x 150 mm, Fase Móvil: 25 mM Citrato

Sódico, pH 6/ MeOH, 75/25, Flujo: 1 mL / min.,

Detección: 254 nm

Volumen de inyección: 3 µLMuestra: Cefalosporinas

(1 Cefalexin, , 2 Cefaclor, 3 Cefuroxim, 4 Cefoxitin)

Columnas: 4.6 x 150 mm, Fase Móvil: MeOH:0.1% TFA

(70:30) Flujo: 1 mL/min., Temperatura: RT, Inj.: 2 µL,

Detección: 254 nm, Muestra: Triazinas (1. Prometrina 2.

Tebuthion, 3. Atrazina, 4. Propazina, 5. Diuron, 6.

Propanill, 7. Dacthal

Selectividad Ortogonal de la Bonus RP

mAu

0

40

80

120 DAD1 A, Sig=254,16 Ref=450,80 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ063.D)

min2 4 6 8

mAu

0

40

80

120 DAD1 A, Sig=254,16 Ref=450,80 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ062.D)

0

1

2

3

4

2

3

1

4

Bonus-RP

Alkyl-C8

mAU

0

400

800 DAD1 B, Sig=254,16 Ref=360,60 (F:\2\DATA\TRIAZINE\AZINE046.D)

min0 2 4 6 8

mAU

0

400

800 DAD1 B, Sig=254,16 Ref=360,60 (F:\2\DATA\TRIAZINE\AZINE047.D)

Bonus-RP

Alkyl-C8

1

2 3 4

7

5 6

Cefalosporinas Pesticidas

1

2

3 5

4

7 6

La mejor resolución con Poroshell 120 Bonus-RP –

Compuestos básicos- β-Bloqueantes

2

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

-100

0

100

200

300

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

-100

0

100

200

300

1

1

2

3

3 4

4

5

5 6 7

6 7

Poroshell 120 EC-C18

Poroshell 120 SB-C18

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

-100

0

100

200

300 2

1 3 4 5

7 6

Poroshell 120 Phenyl Hexyl

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

-100

0

100

200

300

2

1 3 4

5 7

6 Poroshell 120 Bonus RP

10 mM pH 3.8 NH4HCO2, Metanol; 90 % B a 30 % B durante 12 min, 0.35 ml/min, todas las columnas 2.1 x 100 mm

1. Atenolol, 2. Pindolol, 3. Naldolol, 4. Metoprolol, 5. Acebutolol, 6. Propranolol, 7. Alprenolol

.

Polaris Amide y Polaris Ether

Las fases Polaris C18/C8-A y Ether

deslocalizan la densidad de electrones, lo

que minimiza las interacciones

secundarias con los silanoles libres

residuales

Optimización de la simetría de pico

Tamaños de partícula: 5 und 33m

Las Fases Polaris optimizan la forma de pico y la

retención

Polaris C18 Ether 30 X 2.0

Polaris C18A 50 X 2.0

Pursuit C18 50 X 2.0

Optimización de la forma de pico

Mejora la retención

Polaris C18 Ether 30 X 2.0

Polaris C18A 50 X 2.0

Pursuit C18 50 X 2.0

ZORBAX Bonus RP

Polaris Amide y Ether

• Fases alquílicas con amida

polar embebida e intensa

desactivación (endcapping)

=>Para el análisis de

compuestos polares

=> Para trabajar con fases 100%

acuosas

Para rango de pH medio

StableBond-Aq

• Fase Reversa Polar con cadenas laterales voluminosas

=> Para el análisis de compuestos polares

=> Para trabajar con fases 100% acuosas

Para rango de pH bajo y alta temperatura

Desarrollo de métodos con fases polares de

diferente selectividad

Columna: 4.6*150 mm (5µm)

Fase Móvil: 99% 20 mM NaHPO4, pH2, 1% ACN

Muestra: Ácidos orgánicos

1. Acido láctico

2. Ácido acético

3. Ácido Cítrico

4. Fumárico

5. Ácido succínico

Columna: 4.6 x 150, 5 um

Fase Móvil: (25 mM Kphos , pH7.2)/(MeOH: ACN,

50:50), 45:55

Muestra:Supresores del apetito. Aminas

1. Fentermina pKa10.1

2. Fenfluramina pKa 9.1

StableBond-Aq

Desarrollo de métodos con fases polares de

diferente selectividad

Bonus RP

Separación de Uracilo y Urea via HILIC con

ZORBAX RxSIL

HPLC System: HP1090

Columna:ZORBAX Rx-SIL, 4.6 x 150 mm

Part. No.: 883975-901

Fase Móvil: isocrático - 90/10

ACN: K2HPO4, 20 mM pH 7.2

Detección: UV 210 nm

Flujo: 1 mL/ min.

Temperatura: RT

min1 2 3 4 5

mAu

0

20

40

60

80

100

120

140

160

DAD1 A, Sig=210,16 Ref=450,80 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ112.D)

0

ZORBAX Rx-SIL

1

2

1. Uracilo

2. Urea

Precaución: Las columnas Rx-SIL se envían en disolvente de fase normal (hexano). Deben acondicionarse

previamente para trabajar en HILIC. El procedimiento de lavado está disponible

HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography

Tipos de compuestos:

Moléculas altamente polares que no se retienen en fase reversa

Fases estacionarias:

Silica gel Rx Sil, Amino, Diol, Cyano y las especiales (zwitterionicas)

Fase móvil:

>50-60 Acetonitrilo mezclado con fase acuosa/polar , ácido fórmico, formiato, acetato (no tampón fosfato)

Gradiente:

100% ACN a 50%ACN

El agua es el disolvente más fuerte

Detección:

UV y MS-ESI

El alto contenido orgánico ofrece una buena sensibilidad en MS



Analitos típicos en HILIC

1. Amino acidos (cuando solo unos pocos

son de interés)

2. Bases nucleicas (purinas y pirimidinas,

uracilo, adenina, guanina, timina,

cistosina)

3. Nucleosidos (Adenosina, citosina.)

4. Alcaloides

5. Carbohidratos

6. Acrilamida

Melamina

Citosina

Amfetamina

CH 2 CHCH 3

NH 3 +

24

Mecanismos de interacción HILIC en columnas

basadas en sílica

O O O O

H2O H2O

H2O H2O H2O

H2O

H2O H2O

- - - -

H2O

3

CH 2 CHCH 3

NH +

ACN

ACN ACN

ACN ACN

ACN ACN

ACN ACN ACN

3

CH 2 CHCH 3

NH +

1. Partición con la capa de agua adsorbida a la sílice

2. Intercambio iónico con los silanoles

1.

2.

Silica

Elución de los componentes de una muestra

Alcanos

Olefinas

Aromaticos

Etéres

Esteres, Aldehidos,

cetonas

Alcoholes, Aminas

Amidas

Ácidos carboxílicos

NP

RP

Se

cu

en

cia

de

Elu

ció

n

< k’-Valor

No polar

polar

HILIC

Secu

en

cia

de E

lució

n

< k’-Valor

polar

Alcoholes, Aminas

Amidas

Ácidos carboxílicos

< k’-Valor

Condiciones RP

ZORBAX Eclipse XDB C18,

2.1*150 mm

100ppb

5%ACN – 90%ACN en 10 min

Ranitidina

m/z 315 - 176

Condiciones HILIC

ZORBAX Eclipse

RxSil,

2.1*150 mm

100ppb

95%ACN – 50%ACN

en 10 min Ranitidina

m/z 315 - 176

Paroxetina

m/z 330 - 192 Paroxetina

m/z 330 - 192

Separación HILIC de

productos

farmacéuticos básicos

en suero mediante

ZORBAX RxSil

Nota de aplicación 5989-3761EN

Ventajas con HILIC

Buena retención de compuestos altamente polares que no se

conseguiría en el modo de RP.

Selectividad diferente a la LC RP y NP. Selectividad ortogonal. Orden

de elución inversa a RP

• Pueden usarse flujos más altos y/o columnas más largas debido a la baja

viscosidad de las fases con alto contenido en organico: mayor eficiencia

Mejor sensibilidad en en LC/MS

• Un alto contenido en orgánico lleva a una mejor s/n en ESI-MS

La preparación de la muestra es más fácil gracias a la alta

concentración de fase orgánica

• SPE, o extracción líquido/líquido que dejan las muestras en un alto

contenido orgánico.

• Desolvatación y spray más eficaz en electrospray MS

• Puede facilitar la solubilidad de la muestra

Consideraciones a tener en cuenta en HILIC

El gel de silice necesita una equilibración más lenta

• Una equilibración intensa es esencial para la obtención de resultados reproducibles

• Es aconsejable el uso de formiato / acetato + sal (amonio, etc) para aumentar la fuerza iónica, y obtener un mejor control de la forma de pico y de las interacciones.

• A menudo se logran mejores resultados en modo isocrático.

• Gradientes restringidos de 100%-50% de ACN

Las separaciones son muy sensibles al pH, éste debe ajustarse con mucha precisión.

• El pH elegido debe permitir la máxima interacción con la gel de slice

• Picos dobles (peak splitting)

• Causa: los mecanismos de par iónico se ajustan a través de la fuerza iónica por la concentración de la sal o tampón

Separación de analitos del ―Grupo 4‖ de la EPA

1694: HILIC con ZORBAX HILIC Plus en aguas

residuales Ap.Note 5989-3761EN

Condiciones HILIC

ZORBAX Eclipse HILIC Plus,

2.1*150 mm, 3.5 um

100ppb

98%ACN – 70%ACN in 12 min

Temperatura: 25C

Flujo:0.25 ml/min

Pos ESI Ionisierung

Sensibilidad: por debajo de

ppb (0.1 ppb)

Poroshell 120 HILIC -análisis de Catecolaminas

min 1 2 3 4 5

mAU

0

50

100

150

200

250

0.2

22

0.6

71

1.2

65

1.8

85

2.1

61

3.0

72

A: 90 (Tampón100 mM pH 3) 10 MeCN

B: 90 MeCN 10 (Tampón100 mM pH 3)

% A % B

Inicial 0 100

5 Min 7.5 92.5

6 min 0 100

12 min 0 100

0. 55 mL/min

Poroshell 120 HILIC 2.1x 100mm

1. Dopamina, 2. Epinefrina, 3. Norepinefrina

3

1

2

• Las Catecolaminas pueden ser

dificiles de separar por fase reversa

• Este cromatograma muestra un

rápido análisis de 3 catecolaminas

con la columna Poroshell 120 HILIC

Group/Presentation Title

Agilent Restricted

Month ##, 200X

Tipo de fase

Fenil ligada

Desacti

vada

Tipo de

Silica Columna Agilent Qué las diferencia?

Dimetil

Fenilhexil Si B Eclipse Plus Phenyl-

Hexyl

El grupo hexilo más

voluminoso añade

hidrofobicidad a la fase.

Dimetil Feniletil

Si B Eclipse XDB-Phenyl Primera Fenil Silica Tipo B

Diisopropil

Feniletil No B SB-Phenyl

La no desactivación

aumenta las interacciónes

hidrofílicas y con los

silanoles

Dimetil Feniletil

Si A ZORBAX Phenyl

Fenil original

Silica tipo A con diferente

selectividad

Diphenyl

Si B Pursuit Diphenyl Única con funcionalidad

Difenilo

Fases ZORBAX Fenil y Pursuit DiPhenyl.

Un amplio rango de selectividades alternativas.

Pursuit Diphenyl- Selectividad Unica

WIN 2010 organization

Agilent Restricted

July 7th to 9th , 2010

Par Crítico

Antifungicos en Pursuit XRs DP y C18

Columnas: Mencionadas en los cromatogramas

Dimensiones: 150 x 4.6 mm, 5m

Fase movil : A: H2O + 0.1% HCOOH, B: CH3CN +

0.1% HCOOH

A:B - 80:20

Flujo: 1.0 ml/min

Temperatura: Ambiente

Detección: 254 nm

Muestra: 1. 4-Acido Aminobenzoico

2. Acido Sorbico

3. Acido benzoico

4. Acido salicílico

Ácido Benzoico Ácido Sorbico

Pursuit PFP (Pentaflurofenil): Analitos polares,

Nucleotidos y Nucleosidos

Buena alternativa a C18 para compuestos polares en fases 100% acuosas o con

alto contenido acuoso, como compuesos aromáticos y nitroaromáticos y sistemas

conjugados (esteroides),isomeros posicionales y compuestos halogenados

Selectividad basada en interacciones p-p, transferencia de cargas, dipolos,

enlaces de hidrógeno e interacciones electrostáticas.

Compatible con fase reversa, fase normal e HILIC. A bajo contenido de organico

la retencion se basa en fuertes interacciones dipolo-dipolo, y a alto contenido de

orgánico en interacciones hidrofóbicas y p-p

DISCOVERY TOUR

26-27 Septiembre 2012

Formulas moleculares de hormonas esteroideas

Pequeños sistemas conjugados

Esteroides – Fase Fenilo y ACN

El ACN facilita la separación según la hidrofobicidad

Esteroides – Fase Fenilo y MeOH

El MeOH facilita la separación según la aromaticidad/electrones pi

App. Note 5989-9130EN

Formulas moleculares de hormonas esteroideas

: Estrógenos Sistemas aromáticos altamente conjugados

Estrógenos: Diferencias de selectividad ZORBAX Eclipse

Plus C18/FenilHexil

Condicions Isocráticas:

Fase Móvil : 60% MeOH/40% Agua, Flujo: 1ml/min, Vol. inyección: 3ul, Temperatura: 25C, Detección: 220nm

App. Note 5989-9130EN

Alrededor de un 30% más de eficiencia

La mejor resolución con Poroshell 120 Phenyl-Hexyl

– Para compuestos esteroideos

0 2 4 6 8 10 12

0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

100

150

0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

100

150

0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

100

150

mAU

0

50

100

150




Poroshell 120 Bonus RP

Separación de 8 Esteroides : 40 -80 % MeOH/14 min, 0.4 ml/min 25 C 2.1 x 100 mm , 0.1 % acido fórmico tanto en agua como en MeOH

1.Hydrocortisone, 2.b-Estradiol, 3. Andostadiene 3,17 dione, 4. Testosterone, 5.

Ethyestradione, 6. Estrone, 7. Norethindone acetate, 8. Progesterone

1 3

2,5 6

4 7 8

1

3

2,5,6

4 7 8

1

1

3,2

3

7,8

7 8

4

2 5 6

6,4

5

Structures of Azo Dyes

Aniline o-toluidine Methoxyanaline Benzidine

ChloroanilineDimethylbenzidine Napthalamine

Dichlorbenzidine

3,3′-Dimethoxybenzidine

Estructuras de los colorantes azoicos

R-N=N-R‘ Compuestos azo

HN=NH Diazeno

N=N Grupo Azo

Condiciones:

Fase Móvil A:10mM Acetato amónico, B: MeOH, Gradiente: 25%B->90%B en 9 min, Flujo: 1ml/min, Vol. Inyección: 2ul,

Temperatura: 25C, Detección: 220nm

Colorantes Azo y sus productos de degradación

en diferentes fases Zorbax Fenil.

Separación de derivados de la degradación de

colorantes Azo -N=N-

15 to 100 % MeOH over 10 min @ 0.4 ml/min, Solvent A is 10 mM Ammonium Acetate pH 4.8

min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

100

200

300

400

DAD1 A, Sig=260,80 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY30000002.D)

min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

100

200

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min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

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min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

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Poroshell 120 Bonus RP

9 picos

Different Bonded Phases – Different Selectivity

NSAIDS

Mobile Phase 40 % ACN 60 % 25 mM Sodium Phosphate Buffer pH= 2.4 Flow Rate= 1.5 ml/min 4.6 x 50mm UV

210 nm 2µl Elution order for Eclipse Plus Phenyl Hexyl: (1) Piroxicam, (2) Sulindac,(3) Tolmetin, (4) Naproxen,

(5) Ibuprofen, (6) Diclofenac, (7) Celebrex (equal portions of approximately 1 mg/ml solutions

Eclipse Plus Phenyl-Hexyl

Eclipse Plus C8

Eclipse Plus C18

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0

50

100

150

200

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200

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1 2

3

4

56

7

3

4

56

7

1,2

3

4

56

7

1,2

α2,1=1.11

α6,5=1.24

α2,1= 1

α5,6=1.11

Rs5,6=2.26

α2,1= 1

α5,6=1.08

Rs5,6=1.84

Eclipse Plus – Selectividad en función del grupo

funcional fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE)

RRHT Eclipse Plus Phenyl - Hexyl

4.6 x 50 mm, 1.8um

4.6 x 100 mm, 3.5um

4.6 x 150 mm, 5um

Fase Móvil 40 % ACN 60 % 25 mM Na Tampon Fosfato pH= 2.4 Flujo= 1.5 ml/min Detección: UV 210 nm 2

Muestra: (1) Piroxicam , (2) Sulindac,(3) Tolmetin, (4) Naproxen, (5) Ibuprofen, (6) Diclofenac, (7) Celebrex 1 mg/ml)

2 µ l inj

4 µ l inj

6 µ l inj

min 2.5 5 7.5

10 12.5 15 17.5 20

mAU

0

50

100

150

200

min 2.5 5 7.5 10 12.5 15

17.5 20

mAU

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100

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min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

mAU

0

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100

150

200

Eclipse Plus Phenylhexyl – La selectividad es

independiente del tamaño de partícula fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE)



Columnas Agilent ZORBAX y especiales de HPLC Columnas para Pequeñas Moléculas

Fase Reversa • Poroshell 120 EC-C18, EC-C8

• Eclipse Plus C18, C8, Phenyl-Hexyl, Poroshell Phenyl-Hexyl

• Eclipse XDB-C18, C8, Phenyl, CN, Poroshell EC-CN

• StableBond-C18, C8, Phenyl, C3, CN and SB-AQ, Poroshell 120 SB-C18 , SB-C8 y SB-Aq

• Bonus-RP, Polaris C18-A , C18-eter. C8-A y C8-eter, Poroshell 120 Bonus-RP

• Extend-C18

• Pursuit XRs Diphenyl y PFP

• Rx-C18, Rx-C8

• Traditional/Original ZORBAX – ODS (C18), C8, Phenyl, CN, TMS

Fase Normal • Rx-Sil

• Original ZORBAX – CN, NH2, Sil, Eclipse XDB-CN

HILIC

• ZORBAX HILIC Plus

• Poroshell 120 HILIC

Columnas para BioMoleculas –

Proteinas y Peptidos

Fase Reversa

• 300StableBond

• 300Extend-C18

Intercambio iónico – Bio SCX Series II – para

aplicaciones de proteómica 2D y Bio-IEX

Poroshell (Fase Reversa)

• 300SB-C18, C8, C3, 300Extend-C18

Exclusión Molecular

• GF-250 and GF-450

• Bio-SEC

Bio Monoliths

• Protein A

• Ion-Exchange (DEAE, QA, SCX)

Columnas Poliméricas

• Hi-Plex poliméricas para Carbohidratos y acidos

organicos

• PLRP-S y PL-IEX y PLGel para GPC

¿Entonces, que fase ligada debo

elegir?* C18 ofrece la mayor retención, quizás demasida para algunas

muestras y a veces muy poca para otras.

C8 retiene menos que C18, pero con similar selectividad en la

mayoría de los casos

Fenil significantemente menos retentiva para compuestos no

polares, pero retiene bien compuestos polares, por lo que

reduce los tiempos de análisis para las mezclas polar/no polar

CN la menos retentiva, cambios en selectividad, buena para

reducir tiempos de analisis para compuestos que eluyen muy

tarde y evita las separaciones en gradientes.

HILIC ofrece buena retención de compuestos muy polares con fases

móviles de alto contenido de orgánico

* Mas del 20% de Organico

¿Entonces, que fase ligada debo

elegir?* Fases Móviles al t ament e

Acuosas*

C18 raramente ofrece ventajas en la retención, y la selectividad

puede no ser óptima y con poca retención

C8 a menudo proporciona un poco más de retención que C18

con una selectividad similar

Fenil más retentivo con cambios de selectividad

C3 similar a Fenil en retención pero muestra cambios en selectividad

comparada con C18, C8 y Fenil

CN la menos retentiva, grandes cambios en selectividad,

buena resolución.

Bonus RP, las mejores columnas en cuanto a retención y selectividad para

SB-Aq, fases 100% acousas

Polaris,PFP

* Por debajo del 20% de Orgánico

Nuestra recomendación es usar

Poroshell 120, disponible en

9/27/2012

Agilent Confidential 48

EC-C18

EC-C8

SB-C18

SB-C8

EC-CN

Fenil-Hexil

Bonus RP

SB-Aq

HILIC

1.7um

0.5um

0.5um

Y las precolumnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC

Nuestra recomendación es usar

Poroshell 120, disponible en

9/27/2012

Agilent Confidential 49

EC-C18

EC-C8

SB-C18

SB-C8

EC-CN

Fenil-Hexil

Bonus RP

SB-Aq

HILIC

1.7um

0.5um

0.5um

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5990-5951EN

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fases alternativas al c18 y sus aplicaciones - agilent · • cuando se trabaja cerca del pka de un...

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