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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
Tesis
“IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS DEL DENGUE EN PACIENTES
FEBRILES QUE HABITAN EN EL ESTADO DE COLIMA”
Para obtener el grado de
MAESTRA EN CIENCIAS MÉDICAS
PRESENTA:
Q.F.B. RUTH RENDÓN RAMÍREZ
ASESORES:
DRA. ELENA MARGARITA CASTRO RODRÍGUEZ
DR. FRANCISCO ESPINOZA GÓMEZ
COLIMA, COL; JUNIO DEL 2006.
ESTA INVESTIGACIÓN FUE DESARROLLADA CON:
� Financiamiento CONACyT 34543. � Financiamiento del Fidecomiso Dr. Ramón Álvarez Buylla de Aldana
de la Universidad de Colima 374/05. � Financiamiento CONACYT 186719, del Fidecomiso Institucional
para el fomento de la tecnología y el fomento, desarrollo y consolidación de científicos y tecnólogos.
ESTA INVESTIGACIÓN FUE PRESENTADA EN:
� El IV Congreso Nacional de Virológica en la sesión de Carteles con el titulo: “Dengue virus en pacientes febriles sin cuadro de infección aparente”.
� En las CVIII Jornadas Nacionales de Ciencias Farmacéuticas y IV jornadas estudiantiles de Fármacobiología con el título de: “Identificación de los Serotipos el virus del dengue en el Estado de Colima”.
Se envió el manuscrito: “Dengue virus detection in serum simples from febrile patients”, a la revista Emerging Infectious Diseases donde se encuentra en revisión.
I.- RESUMEN
El Estado de Colima está reportada como una zona endémica para dengue y los casos
reportados anualmente se basan en casos sintomáticos con cuadro clínico claro, sugestivos de
dengue.
En el Estado de Colima hay un porcentaje considerable de pacientes febriles sin
cuadro clínico sugestivo de dengue o atípico, a los cuales no se les descarta infección por
dengue. Además desde el año 1997 no existe un estudio que describa que serotipos están
circulando actualmente.
El presente estudio es un estudio descriptivo transversal, con muestreo por
conveniencia, donde se captaron pacientes febriles (igual o mayor 38.5 ºC), que acudían a los
centros de atención médica del Estado de Colima en el periodo de julio/2004 a
septiembre/2005. A estos pacientes se les solicitó su participación con carta de consentimiento
informado. Se tomó una muestra sanguínea de la cual se obtuvo el suero. En el que se
determinó la presencia del virus del dengue (búsqueda de cada uno de los 4 serotipos), por la
Técnica de Retrotrascripción y Reacción en Cadena de la Polimerasa. De las 215 muestras
procesadas, resultaron 28 positivas para dengue (2 para DEN1 y 26 para DEN3). Como
controles positivos se utilizaron muestras de RNA para cada serotipos de dengue
proporcionados por el Dr. Farfán Ale de la Universidad Autónoma de Yucatán.
Los resultados muestran que en el Estado de Colima la incidencia de dengue en
pacientes febriles fue de 13.02 % en un periodo de 15 meses y que actualmente se encuentran
circulando al menos 2 serotipos (DEN1 y DEN3).
i
II.- ABSTRACT
Colima State was reported as endemic zone for dengue virus infection and the cases of
dengue infection reported every year were only those referred with dengue symptoms as is
classified for the Worth Health Organization (WHO).
In Colima State there are a considerable numbers of febrile patients without dengue
symptoms or with symptoms atypical, and all those cases are not supported with a lab test.
Also since 1997 there are not a descriptive study of the dengue serotypes circulating in
Colima.
The present study is transversal descriptive. Sample were captured for convenience, we
included febrile patients (equal or more than 38.5 º C) admitted at emergency department of
several hospitals of Colima State in the period of july/2004 to Septembre/2005. Informed
consent was obtained for blood sample. Serum specimens were analyzed for dengue virus
presence (DEN1, DEN2 DEN3 and DEN4), with Reverse Transcription - Polymerase Chain
Reaction assay (RT-PCR); we analyzed 215 samples, 28 were positive for dengue virus: 26
(92.85 %) for DEN3 and 2 (7.1%) for DEN1. Positive controls were donated for Dr. Farfán
Ale from Autonomous University of Yucatán.
The results of the present study indicated that the incidence of dengue infections in
febrile patients at Colima State is 13.02 % in 15 months and there are at least two setotypes of
dengue virus (DEN1 and DEN3) in this State.
ii
III.- AGRADECIMIENTOS
Al equipo de trabajo de campo conformado por José María Maya, Arturo Aguillón Zamora+, Beatriz Orozco Calleja y Lourdes Juárez Romero.
A mis compañeros de laboratorio de regulación génica por su ayuda y compañía;
haciendo ameno el trabajo de laboratorio.
Al todo el personal (familiares, amigos y conocidos) que de alguna manera colaboró en la captura de las muestras por mencionar algunos de ellos: Q.F.B. Irma P. Gutiérrez Hernández, Alejandro González, Q.F.B. Aarón González Torres, Q.F.B Víctor Suárez Bravo, Q.F.B. Adriana Mariscal Luna, Lic. Enf. Isela Herrera Barbosa, M.P.S.S Yureli Téllez, M.P.S.S Dianilla Portillo Lozano, Q.F.B. Rocío, Q.F.B Carlos Curiel, Q.F.B Esther, Q.F.B. Mara, a las laboratoristas: Dorian, Beatriz, Sandra Anguiano y a la Trabajadora Social, Claudia Preciado.
A los integrantes del Subcomité de Investigación de Salud en el IMSS: Dra. Alicia Martínez Contreras, Dr. Benjamín Trujillo Hernández, Dra. Rebeca Millán Guerrero, M.C. Carlos Enrique Tene Pérez y al Lic. Enf. Oscar López Ramírez por sus correcciones y su apoyo.
Al Dr. Gabriel Ceja Espíritu, Dr. Sergio Barreto Torres, Q.F.B. Maria Dolores Chávez Sánchez, Dr. Cesar Ramírez Hernández, Dr. Carlos Hernández Dávila, Dr. Pedro Hernández, Dr. Jesús Francisco Calvillo Vázquez, Dr. Ruelas y a la Dra. Judith Hernández García, por su desinteresada colaboración.
A la Dra. Elena Castro Rodríguez por toda su paciencia, enseñanzas y su invaluable
ayuda. Al Dr. Francisco Espinoza Gómez y Dr. Oscar Newton Sánchez por su apreciable
apoyo en el desarrollo de este trabajo y en el temple de mi carácter. Al Dr. Ernesto Reynoso Zúñiga y a la M.C. Celina Gutiérrez por su apoyo, consejos y
desinteresada colaboración en el desarrollo de esta investigación. Al Dr. José Arturo Farfán Ale investigador de la Universidad Autónoma de Yucatán
que donó los controles positivos para cada serotipo del virus del dengue. Al Dr. Clemente Vázquez Jiménez por sus correcciones y su tiempo. A toda la población del Estado de Colima y muy especialmente a la gente de Cofradía de Juárez y Tecomán que me facilitaron el trabajo en campo. Al Fidecomiso Dr. Ramón Álvarez Buylla de Aldana y CONACYT por su apoyo económico, ya que sin este, esta investigación no hubiese sido posible.
iii
IV.- DEDICATORIAS
A Dios que le debo todo lo que tengo y soy.
A mis padres, Orfanel Rendón y Eloisa Ramírez, y a mis hermanos, Mely, Orfa, Orbe y Migue, que son mi inspiración.
A mis familiares y amigos que siempre me apoyan en cada una de mis locuras.
A todos, muchas gracias.
iv
V.- ÍNDICE
Contenido Página I.- RESUMEN..……………………………………….……………………………………..i II.- ABSTRACT ……..……..……………....…………………………………….…….…..ii III.- AGRADECIMIENTOS.……………………………………………………….……….iii IV.- DEDICATORIA..…………………..…………………………………………..….......iv V.- ÍNDICE……………….………….……………………………………………..……....v VI.- MARCO TEÓRICO
6.1 Definición del problema ...............…………..……………..………....…...........1 6.2 Antecedentes……………………..………………………..………..........….........2
6.2.1 Enfermedad .…………………………………….…………...................4 5.2.1.1 Dengue Clásico (trancazo o quebrantahuesos)....……............................5 5.2.1.2 Dengue hemorrágico (DH) y Síndrome de Choque por dengue (ShCD)…..5
6.2.2 Hospedero.......………………………………….………….....………...8 6.2.3 Vector……….………………………..…………..……….....…... ….....9 6.2.4 Virus….……………………………..……………..........………..…....12 6.2.5 Diagnóstico diferencial…………………...……………………….…..15 6.2.6 Diagnóstico de laboratorio……………...…………………………..…16
5.2.6.1 Pruebas serológicas…………...…....………………………..17 6.2.7 Tratamiento……………………………...…………………………....19
6.3 Justificación…………………………………………...………………………....21 6.4 Objetivo general……………………………………...………………………......22 6.5 Objetivos específicos………………………………...………………………......22
v
VII.- MATERIAL Y MÉTODOS
7.1 Diagrama de flujo de la metodología………....………….…………….………...23 7.2 Universo de Trabajo……………………………………………………….……..24
7.3 Diseño del estudio………………………………………………………….…….24 7.4 Obtención de datos……………………....………………………………….……24
7.5 Definición de las variables…………………………………………………….…25 7.6 Análisis estadísticos de datos……………………………………………….……26 7.7 Metodología...............…………………………………………………...……….27 7.8 Aspectos éticos………………………………………………………..………….32 VIII.- RESULTADOS.………… ............................................................................................33 IX.- DISCUSIÓN….………….….......................................................................................37 X- CONCLUSIONES…………………………………..………………………….……….44 XI.- PERSPECTIVAS……………………………………..……………………….………...45 XII.- BIBLIOGRAFÍA…………………………………..……………………….…......…...46 XIII.- ANEXOS
13.1 Carta de consentimiento informado……………………………………..…..….50 13.2 Colección de la muestra para el diagnóstico del virus del dengue..……………51
13.3 Formato de recolección de datos del procesamiento de muestras..….................52
vi
1
VI.- MARCO TEÓRICO
6.1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Actualmente, las epidemias por dengue son uno de los problemas de salud pública más
relevantes en la mayor parte de las comunidades urbanas de los países tropicales1,2.
Actualmente, dos y medio billones de personas en el mundo que habitan dichas áreas están en
riesgo de contraer la enfermedad.3
Los virus del dengue han sido agrupados en cuatro serotipos: DEN1, DEN2, DEN3 y
DEN4. 4,5 Los cuatro serotipos son capaces de producir infección asintomática, enfermedad
febril y cuadros severos (dengue hemorrágico y síndrome de choque por dengue), que pueden
conducir hasta la muerte.
Las encuestas seroepidemiológicas en México indican que varios millones de personas
han sido infectadas por uno o más de los serotipos desde 1978. En México el Estado de
Colima ocupa el segundo lugar de casos de dengue hemorrágico desde 1984 al 2002. 6
El Estado de Colima, es una zona permanentemente infestada por Aedes aegypti (vector
del dengue), con brotes epidémicos de dengue clásico y hemorrágico desde 1997 al 2002. 1 La
incidencia anual reportada en el estado se basa en la población que presenta cuadros febriles
con cuadro clínico claro sugestivo de dengue a los cuales se les corrobora enfermedad por
dengue con la búsqueda de anticuerpos (IgM) por la técnica de ELISA.
Está reportado que un porcentaje considerable de infección por dengue presenta cuadros
atípicos, fácilmente confundibles con otras virosis (hepatitis, rubéola, enterovirosis, etc.) o
con infecciones bacterianas (leptospirosis, tifoidea, etc.)7,8 En Colima hay un porcentaje
considerable de pacientes febriles que no presenta un cuadro clínico que claramente sugiera
infección por dengue a estos pacientes no se les descarta la presencia de enfermedad por virus
del dengue.
Por lo que en este estudio nos enfocaremos a tratar de responder las siguientes preguntas:
¿Qué porcentaje de la población con cuadro febril agudo con o sin sintomatología
sugestiva de dengue presenta virus de dengue circulante en suero? y ¿A que serotipo del
virus del dengue pertenecen las muestras positivas?
2
6.2 ANTECEDENTES
La Organización Panamericana de la Salud (OPS) ha considerado al dengue como el
mayor problema de salud pública de América luego del Síndrome de Inmunoindeficiencia
adquirida (SIDA), encontrándose dos tercios de la población mundial en zonas propicias para
el desarrollo de enfermedad por dengue. Es posible que cada año 80,000.000 personas
contraigan la enfermedad.
El dengue es una enfermedad de carácter agudo febril, con frecuencia epidémico. Es la
infección humana más prevalente de las causadas por un virus de la familia Flaviviridae,
siendo propia de regiones subtropicales y tropicales donde es trasmitida por mosquitos del
género Aedes.
Existen cuatro serotipos del virus (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4), que producen
anticuerpos contra antígenos específicos, la inmunidad cruzada no es permanente, pudiéndose
constatar infecciones por varios serotipos simultáneamente. 9
Durante más de una década, DEN1, DEN2 y DEN4 han circulado ampliamente en el
Continente Americano, pero desde 1994 se detectó la presencia de DEN3 en Centroamérica.10
En nuestro país, los cuatro serotipos han sido identificados en algún momento y en la
actualidad el serotipo predominante es DEN2 (ver Tabla I). Debido a las facilidades que
existen hoy en día para viajar, así como el movimiento migratorio alrededor del mundo, la
distribución geográfica de este virus se ve modificada continuamente. 6
Tabla I. Porcentaje de Serotipos de Dengue en México desde 1995-2002
SEROTIPOS 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002
DEN1 16.7 27 6.5 5 3 0.7 - 0.7
DEN2 38.6 2 1.6 2 13.4 55.2 75 65.6
DEN3 8.8 60 88.3 93 81.7 44.1 25 33.7
DEN4 35.9 11 3.6 - 1.9 - - -
Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica (InDRE) 6.
En México como en otras partes del mundo, la presencia del dengue está condicionada
a la existencia del vector, quien habita en áreas bien determinadas (ver fig 1). Los estados de
la República Mexicana que tienen menor riesgo a tener dengue son: Baja California,
Chihuahua, Durango, Zacatecas, Aguascalientes, Guanajuato, Querétaro, Tlaxcala y el Distrito
Federal (D.F). 6
3
Figura 1. Distribución de Aedes aegypti y áreas de transmisión de Dengue, 2002. Se muestra como el patrón de distribución del mosquito vector y la presencia de la transmisión de dengue están ligadas. OMS (Organización Mundial de la Salud)6
Los estados con mayor riesgo para la enfermedad son: Sonora, Nuevo León,
Tamaulipas, Sinaloa, Veracruz, Nayarit, Jalisco, Colima, Michoacán, Guerrero,
Oaxaca, Chiapas, Tabasco, Campeche, Yucatán y Quintana Roo. Esto se ve reflejado
en la figura 2 donde se muestran los casos de dengue hemorrágico en los estados mas
afectados de 1984 al 2002. 6
Figura 2. Distribución Nacional de los Casos de DH de 1984 al 2002. El territorio nacional se muestra divido en zonas con base al número de casos de dengue ocurridos en el periodo. En las zonas rojas se señalan los estados que presentan mayor número de casos de dengue hemorrágico (DH), entre las cuales se encuentra Colima. Al mismo tiempo se visualiza, que la mayor parte de la extensión territorial nacional, presenta casos de dengue hemorrágico. Remarcando así que la enfermedad del dengue en nuestro país es un problema de salud pública. OMS
6.
4
6.2.1 ENFERMEDAD
El dengue es una enfermedad que se manifiesta de manera e intensidad variable en
relación con los factores del huésped y determinadas características de la cepa viral. 11
Los cuadros clínicos que se presentan por los 4 serotipos del virus pueden ser
idénticos; pero la inmunidad desarrollada por cada serotipo no es protectora entre ellos; es
decir la infección por uno de ellos producirá anticuerpos específicos para el serotipo que la
originó. 9
El diagnóstico del dengue, se realiza con la integración de las características clínicas de
la enfermedad y el estudio serológico para confirmar la presencia de anticuerpos y la
identificación del serotipo del virus del Dengue. El 40 % de infecciones por dengue son
asintomáticas o presentan un cuadro clínico atípico de dengue. 6 En zonas endémicas, la
presencia de fiebre aguda sin origen claramente identificable sugiere fuertemente viremia por
dengue. Esto es lo que algunos autores denominan “alerta de fiebre”. 1
La enfermedad sintomática puede presentarse (ver figura 3) en forma leve como
dengue clásico, en forma más severa como dengue hemorrágico o en su presentación más
grave, síndrome de choque por dengue. 6
Infección viral por dengue Asintomática Sintomática
Fiebre Síndrome de Fiebre Indiferenciada fiebre por dengue hemorrágica (Síndrome viral)
Sin Con Extravasación hemorragia hemorragia de plasma inusual Sin choque Síndrome de choque por dengue Dengue Clásico Dengue hemorr ágico
Figura 3. La enfermedad por dengue puede presentarse de manera asintomática o sintomática. Las sintomáticas suelen presentarse como cuadros clínicos inespecíficos, dengue clásico (con hemorragias o sin ellas), dengue hemorrágico (con síndrome de choque por dengue o sin él.). OMS 8
5
6.2.1.1 Dengue Clásico (trancazo o quebrantahuesos).
Se caracteriza por la presencia de enfermedad febril (más de 38.5º C) de inicio brusco,
caracterizada por cefalea intensa (generalmente frontal), mialgias, artralgias y dolor de ojos
(retrocular) que se incrementa con los movimientos oculares. En diferentes proporciones se
pueden presentar otros datos, como exantema transitorio, petequias y equimosis, fotofobia,
insomnio, prurito, diarrea, náusea, vómito, dolor abdominal y anorexia (los síntomas gástricos
pueden presentarse en más del 50% de los casos); hiperestesia, linfadenopatía, dolores
generalizados, congestión faríngea, bradicardia relativa y conjuntivitis; pueden observarse
leucopenia y trombocitopenia. La fiebre y los demás signos y síntomas pueden ser recurrentes
(gráfica en silla de montar) y por lo general hay un verdadero ataque al estado general; este
cuadro dura de tres a siete días, el paciente permanece con astenia y en ocasiones con estados
depresivos por semanas. En menores de cinco años puede presentarse sólo como una
enfermedad febril exantemática.
La fiebre dura aproximadamente 5 días, durante los cuales también está el periodo de
contagio y la presencia del virus en la sangre. 6,12
6.2.1.2 El Dengue Hemorrágico (DH) y Síndrome de Choque por Dengue (SChD).
El DH pueden aparecer precedido o no de un dengue clásico. En el DH hay fiebre y
malestar general, se pueden presentar hemorragias, éstas pueden ser leves o intensas, externas
o internas. Hay trastornos en la sangre y los líquidos corporales que pueden manifestarse como
sangrado por alteraciones en la coagulación, observándose sangrado nasal, sangrado en las
encías, vómito con sangre, aparición de moretones o enrojecimiento de la piel. En las mujeres
puede ocurrir un incremento en la cantidad o duración del periodo menstrual. 12
El dato cardinal para el diagnóstico clínico de la pérdida de plasma en el dengue
hemorrágico es la presencia de trombocitopenia y hemoconcentración. Para la vigilancia
epidemiológica de DH y SChD se considera trombocitopenia al conteo de plaquetas igual o
menor a 100 000/ µl de sangre. 12
6
Para determinar la hemoconcentración, se recomienda observar uno o más de los
criterios que se mencionan a continuación, aunque no todos son aceptados en la mayor parte
de las publicaciones: 12
1. Incremento del hematocrito en 20% o más (por ejemplo de 40 a 48%) durante la fase
crítica de la enfermedad.
2. Decremento del hematocrito en 20% o menos (por ejemplo de 48 a 40%) entre la fase
crítica y la convalecencia.
3. Tendencia del hematocrito (por ejemplo 40, 43, 45 en muestras subsecuentes).
4. Valor de la relación hematocrito/hemoglobina: el valor normal es de 3.0 o 3.1; si la
relación es de 3.2 a 3.4 se considera sugestiva, si es de 3.5 o mayor es indicativa de
hemoconcentración.
5. Presencia de derrame pleural o ascitis.
6. Hipoalbuminemia.
Otros datos que suelen acompañar al DH son: dolor en área hepática, dolor abdominal,
derrame pleural, ascitis, edema en diversos órganos, hepato y esplenomegalia, tiempos
prolongados de coagulación, leucopenia inicial y leucocitosis posterior, hiponatremia,
hipoalbunemia, hipotensión con tendencia al acortamiento en el intervalo sistólico/diastólico.
Suelen presentarse además los siguientes datos: niveles elevados de aspartato sérico,
aminotransferasa, nitrógeno y urea en sangre, hipoproteinemia, albuminuria, y en algunos
casos, reducción de los factores de coagulación y factores fibrinolíticos como fibrinógeno,
protrombina, tiempo prolongado de protrombina y parcial de tromboplastina; la radiología
puede revelar un derrame pleural o líquido libre en cavidad abdominal. Durante el cuadro
pueden presentarse complicaciones graves, como choque, insuficiencia hepática y renal; el
daño hepático puede ser severo, por lo que deberá monitorizarse el funcionamiento del hígado
en forma sistemática; asimismo se puede encontrar un cuadro de encefalopatía por hipoxia,
edema cerebral, daño hepático, hemorragia intracraneal o alteraciones hidroelectrolíticas;
también es frecuente un cuadro respiratorio no cardiógeno. Por su lado, la insuficiencia renal
suele ser consecuencia de la hipovolemia, especialmente en el SChD, por lo que deberá
tenerse especial cuidado en el manejo de líquidos. 12
El síndrome de choque por dengue suele presentarse en el curso de un cuadro de DH,
por lo general entre el tercero y quinto días de evolución; sin embargo, puede hacerlo
7
inmediatamente a dos o tres días después de un dengue clásico y excepcionalmente en
pacientes asintomáticos o con cuadros febriles inespecíficos de dengue. 12
Como en todo cuadro de choque, hay manifestaciones de insuficiencia circulatoria: piel
fría y congestionada, cianosis peribucal o de las extremidades, vómito, llenado capilar lento,
taquicardia, tensión arterial disminuida o imperceptible, o bien reducción de la tensión
diferencial (sistólica/diastólica) a menos de 20 mm/Hg, pulso rápido y débil o imperceptible,
oliguria; puede haber además inquietud, agitación y alteraciones en el estado de conciencia,
como letargo o confusión. 12
Si el cuadro no se corrige en forma oportuna puede conducir a acidosis metabólica,
sangrados severos, falla orgánica múltiple y coagulación intravascular. La muerte o
recuperación ocurre por lo regular en un lapso de 12 a 48 horas, por lo que el manejo
durante esta fase es crítico para el pronóstico del paciente. 8, 12
Para el diagnóstico de DH y SChD es básico observar la secuencia de los
acontecimientos clínicos y de laboratorio, por tanto es imprescindible realizar un monitoreo
con valoración y toma de muestras periódicas. 12
Se han identificado signos de alarma que hacen inminente el cuadro de choque en un
paciente de DH y permiten el inicio oportuno del manejo (canalización y administración de
líquidos intravenosos): 8, 12
- Dolor abdominal intenso y sostenido, que pasa de ser uno de los componentes sintomáticos
del cuadro al dato cardinal.
- Vómito persistente.
- Caída brusca de la temperatura, de hipertermia a hipotermia, con frecuencia acompañada de
sudoración, adinamia y lipotimias.
- Inquietud o somnolencia. 12
El espectro clínico en el DH/SChD es amplio, causado por una alteración
inmunológica sistemática y que depende de los órganos más afectados y los signos y síntomas
predominantes, por lo que el diagnóstico diferencial debe incluir desde cuadros infecciosos
inespecíficos, graves y que se deterioran rápidamente, incluyendo exantemas, hemorragias sin
causa aparente a cualquier nivel, cuadros purpúricos, de abdomen agudo, hasta cuadros de tipo
psicótico; por tanto el médico debe tener siempre presente la posibilidad de DH. 6,12
6.2.2 HOSPEDERO.
8
El humano es el único hospedero conocido del virus de dengue11, la susceptibilidad es
universal y la exposición depende básicamente de los hábitos de la población, la circulación de
los distintos serotipos y la presencia y densidad del vector en la comunidad. Dentro de los
factores asociados a la presentación de formas hemorrágicas, destaca el antecedente de una
infección por virus de dengue por otro serotipo, los padecimientos concomitantes (diabetes
mellitus, anemia, asma, y otros estados que causan compromiso inmunológico) y la virulencia
de la cepa viral. 6
Existe una fuerte relación entre la respuesta secundaria de anticuerpos y el dengue
hemorrágico o el síndrome de choque por dengue (SChD). 13 La teoría más aceptada para
explicar el SChD, dice que los anticuerpos formados durante infecciones previas al paso del
tiempo alcanzan niveles subneutralizantes que, durante una nueva infección por otro serotipo,
no destruyen al virus y forman un complejo antígeno-anticuerpo que al ser fagocitado por el
monocito favorece la replicación viral (amplificación inmunológica). Los monocitos
sensibilizados facilitan la formación de complejos inmunes, presentando una respuesta
aberrante del tipo del fenómeno de Arthus, con liberación y estimulación de diversas
sustancias y mecanismos vasoactivos, como anafilotoxinas, factor de permeabilidad,
activación de la cascada del complemento y otros; que provocan aumento de la permeabilidad
vascular, lisis linfoblástica y de plaquetas, alteraciones en los mecanismos de coagulación,
disminución de linfocitos, derrames cavitarios, edema en diversos órganos, sangrados en
distintos niveles y de intensidad variable, que pueden llegar hasta el estado de choque.6,13,14
El aspecto más importante de este cuadro es que se trata de un fenómeno autolimitado
en donde los linfocitos no sensibilizados permiten restablecer la homeostasis en el curso de 48
a 72 horas, por lo que el papel del médico es mantener al paciente durante este tiempo y
vigilar el ingreso de líquidos intravenosos, ya que los líquidos extravasados permanecen en el
organismo y una vez controlado el cuadro se reabsorberán, lo cual representa un riesgo para
complicaciones graves, como el edema pulmonar. 6,12
Como ya se mencionó anteriormente el humano es el único hospedero que desarrolla
infección por dengue; existen otros hospederos que no desarrollan la infección pero participan
en el ciclo de transmisión del virus en forma rural; estos son los Macacos y los Chimpancés.
9
Debido a que no existe un modelo animal que desarrolle la infección por dengue como
en el humano, el estudio de la inmunopatogénesis del dengue actualmente tiene muchas
lagunas. 15 Esto se refleja en que hasta el momento no se dispone de una vacuna efectiva ni de
tratamiento específico para la enfermedad.15, 16
La tasa de reproducción y mortalidad del virus, una vez dentro del humano, que es su
hábitat natural, son inalterables por las condiciones del entorno, no importa cual sea su cepa
(variante genética) o serotipo.
6.2.3 VECTOR.
Varias especies de mosquitos Aedes son capaces de transmitir el virus, sin embargo, el
Aedes aegypti es el vector más común y efectivo para el dengue, el mosquito adulto tiene un
dorso con bandas color plateado o amarillo blanquecino sobre un fondo obscuro o un dibujo
característico en forma de lira en el dorso del tórax, las patas se presentan conspicuamente
bandeadas y el último artero de las patas es blanco; el abdomen de la hembra tiende ha ser
puntiagudo (figura 4). 7, 11, 13, 17, 18
Figura 4. Fotografía del Aedes aegypti.
Este género está extremadamente distribuido dentro de las latitudes 40° S y 40º N y es
altamente susceptible a temperaturas extremas. Sus nichos ecológicos están localizados a
10
altitudes no mayores a 1000 m sobre el nivel del mar .7 Existen estudios que reportan, en las
zonas tropicales y subtropicales altitudes menores de 600 m sobre el nivel de mar como
indicativos de una alta proliferación del vector.19
En México, el Aedes aegypti es la única fuente de infección para el hombre, y a su vez
el hombre infectado es el único reservorio para el mosquito. El Aedes aegypti es un mosquito
de actividad diurna, que se ha asociado a todas las epidemias urbanas y suburbanas de
dengue.6
Los machos nacen un poco antes que las hembras ya que deben madurar sexualmente y
se alimentan de azúcares presentes en la naturaleza.7 Las hembras son las que además de
ingerir azúcares necesitan ingerir sangre, el contenido de isoleucina en la sangre humana es
usada para la vitelogénesis (formación y maduración de huevos) y síntesis de energía de
reserva7, 17. El mosquito hembra, realiza su primera ingesta de sangre 24 horas después de
haber emergido y de esa manera, cuando pica sobre una persona infectada, adquiere el virus;
existe un periodo de incubación entre 8-12 días, durante el cual el virus se multiplica en el
epitelio intestinal, en los ganglios nerviosos, en el cuerpo graso y las glándulas salivales. En
estas condiciones el mosquito permanece infectado y asintomático, siendo capaz de transmitir
la infección y funcionar como vector el resto de su vida7 (en promedio de 30 días) 6, en dicho
periodo puede transmitir la infección al humano (transmisión indirecta) o a su progenie
(transmisión directa o trasovárica8); los huevos pueden resistir condiciones de desecación. 21
El Aedes aegypti, tiene dos etapas bien diferenciadas en su ciclo de vida: fase acuática
con tres formas evolutivas diferentes: (huevo, larva y pupa) y fase aérea o de adulto (ver figura
5). El horario de actividad de picadura de los mosquitos es en horas de baja intensidad de la
luz solar; en general, se inicia al amanecer (6:00 a 8:00 horas) o antes del anochecer (17:00 a
19:00 horas). La alimentación puede estar condicionada a la posibilidad de obtener sangre de
los habitantes de las casas, pudiendo modificar su actividad y picar aún en horas de la noche y
en el día. 6
El Aedes aegypti en condiciones naturales sobrevive un promedio de entre 15 y 30
días, su ciclo para poner huevecillos es de aproximadamente cada tres días (figura 5). Su
alimentación es en cualquier momento de acuerdo a la disponibilidad (puede picar varias
veces a las personas de una casa). Las proteínas contenidas en la sangre le son indispensables
para la maduración de los huevecillos. Para poder completar el ciclo de vida del mosquito, las
11
hembras tienen que alimentarse aproximadamente cada tres días, antes de alimentarse buscan
el sitio donde pondrán los huevecillos (oviposición).6 Prefieren depositar sus huevecillos en
recipientes artificiales de color obscuro y de diámetro ancho, especialmente los que se
localizan en áreas sombreadas y con agua limpia. Se sabe que los dos ovarios de la hembra
producen hasta 100 ó 120 huevecillos por ciclo, los cuales se depositan de 30-50 por cada
oviposición, justamente por arriba del nivel de agua y son capaces de resistir la desecación;
tienen la longitud de un milímetro y al principio son de color blanco pero después de dos horas
se tornan obscuros.7 Entre cada ciclo gonotrófico (ciclo de reproducción), el Aedes aegypti
pica o se alimenta varias veces de uno o varios huéspedes, hasta satisfacer sus necesidades
alimenticias, lo que representa un factor de importancia en su capacidad como transmisor de
enfermedades. 17
Suele encontrarse cerca de las habitaciones humanas o en el peridomicilio, posado en
lugares oscuros y protegidos, como armario, bajo los muebles y en áreas con vegetación
abundante (macetas, jardines interiores).6
Figura 5. Ciclo Biológico del Vector. La hembra adulta ya fecundada, deposita sus huevos en recipientes adecuados, de los cuales emergen las larvas que pasan por 4 estadios de madurez. Posteriormente pasa a la etapa de pupa, en la cual ocurre la metamorfosis a mosquito adulto. SNVE6
12
Debido a la importancia de los mosquitos en el ámbito de la salud se han establecido
las claves de Darsie & Mitchell. 20 Estas claves, dan a cada parte del mosquito un nombre (ver
figura 6). Dependiendo de la morfología se les da una clave única, que permite identificar así a
cada uno de los mosquitos de las diferentes especies. 20
Figura 6. Partes del mosquito hembra del género culicidae. Ap: lóbulo antepronotal; aPo: área postespiracular; ApR: área preespiracular; C-1, C-2, C-3: coxa anterior, media y posterior, respectivamente; Ce: cercos; E: espiráculo; Esc: escutelo; Est: esterito abdominal; Fe: fémur; Ha: halterio; Mks: mesokatepisterno; Mm: mesanepimero; Mpn: mesoposnoto; Ms: mesómero; Ppn: postpronoto; Ta1, Ta2, Ta3, Ta4, Ta5: tarsómeros 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente; Te: tergito abdominal; Ti: tibia (los números romanos indican el segmento abdominal correspondiente). Darsie & Mitchell. 20 6.2.4 VIRUS.
El agente causal es un virus de la familia Flaviviridae,16,22 del grupo de los arbovirus
(arthopod-borne-virus). Se trata de virus esféricos con envoltura, de 40-50 nm de diámetro con
cápside icosaédrica y genoma de ácido ribonucleico (RNA) monocatenario, no segmentado, de
polaridad positiva (ver figura 7A).14 El genoma opera directamente como RNA mensajero
13
policistronico. El virión consiste de una nucleocápside con simetría cúbica, encerrada en una
estructura lipoproteíca procedente de la célula hospedera. El poseer esta estructura lo hace
lábil a la inactivación por solventes orgánicos, cambios de pH y temperatura.7,23
A
B
Figura 7. A. Estructura general del virus del dengue. B. Organización del genoma del virus del dengue. El genoma del virus del dengue se representa como un fragmento (parte superior de la figura), el cual es traducido en una poliproteína (parte media de la figura) que codifica 10 proteínas: C, pM , E y 7 NS (encargadas de la replicación viral). La respuesta antigénica de anticuerpos y células T para cada proteína es presentado en la parte inferior con signos de (+) dependiendo de la capacidad de respuesta de cada proteína. 6A. SNVE6 y 6B. Modificada de bibliografía 14.
14
El genoma (figura 7B), está compuesto por una sola molécula de RNA de cadena
sencilla lineal de 10 703 nucleótidos y de alta variabilidad genómica. Por si mismos, los
ácidos nucléicos genómicos del virus, son infecciosos, por lo que las autoridades de salud
recomiendan manejar este virus en el nivel de bioseguridad 2.6
El virus se adhiere a las células, se replica en el citoplasma y se ensambla en el retículo
endoplasmático. Su genoma codifica una poliproteína que luego es procesada en 10
polipéptidos: 3 estructurales (una proteína de nucleocapside C o V2, una membranosa prM, o
V1 y una glicoprotéina de envoltura E: hemaglutinante y de adherencia, o V3) y 7 no
estructurales, de los cuales destacamos NS1 (++), que puede inducir, como E (+ + +) y prM
(+), una respuesta inmune protectora (figura 7B).14
Se reconocen 4 serotipos antigénicos llamados DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 sobre la
base de ensayos de neutralización del efecto citopático.11,23 Estas respuestas antigénicas que
diferencian a cada serotipo, se encuentran relacionadas con variantes en su genoma (proteínas
C y prM), esto permite en la actualidad el uso de técnicas moleculares como es la
Retrotranscripción y Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR), para la determinación
de estos serotipos sin recurrir a las técnicas mas laboriosas antes utilizadas (Ver apartado
5.2.6.).16
Existe heterogeneidad de cepas dentro de cada serotipo que se correlacionan con
variantes en las secuencias de RNA, cuya identificación en las proteínas prM, E y NS1 tiene
utilidad epidemiológica.22
En la actualidad la secuencia completa de la región NS1 fue publicada en el banco de
genes con el siguiente número de acceso gi: 25059131 y está siendo analizada para compararla
con diferentes cepas ya referenciadas.25
Como ya fue mencionado anteriormente, cualquiera de los serotipos tiene la capacidad
de causar dengue hemorrágico. Aunque estudios recientes en el sureste de Asia demuestran
que el serotipo 2 es más agresivo que los otros. Esto llevó a la clasificación de las cepas del
serotipo 2 en diferentes genotipos y cada una con diferentes asociaciones epidemiológicas. El
genotipo selvático comprende las cepas del oeste de África y mantiene su ciclo de vida en
primates no-humanos (hospedero) y mosquitos residentes de la selva (vector). Este genotipo
parece no estar involucrado en la enfermedad en humanos. 22
15
Entre las cepas epidémicas del serotipo del virus 2 podemos encontrar los siguientes
genotipos: Americano, SE Asiático y Subcontinental Indiano. 22
El genotipo Americano fue detectado en el oeste del hemisferio en 1950 y en el sur del
Océano Pacífico en 1970; este ha sido aislado de pacientes que presentan fiebre por dengue.
El genotipo SE Asiático es el más agresivo capaz de causar dengue hemorrágico, se detectó en
América en 1980. Este genotipo parece haber desplazado al genotipo Americano a través del
oeste del hemisferio, sugiriendo que el genotipo asiático se transmite más eficientemente.22
Los mecanismos de transmisión pueden variar dependiendo de la cepa, por lo que se
propone que:
� Algunas cepas pueden infectar y replicarse más eficientemente en las células
blanco, reflejando esto una viremia más fuerte en el humano y permitiendo así
infectar más mosquitos.
� Algunas cepas pueden infectarse o transmitirse al mosquito vector más
eficientemente que otras cepas. Esto fue demostrado en las cepas de un mismo
serotipo. Un análisis de virus de la cepa de DEN2 del genotipo SE Asiático y del
genotipo Americano mostró que el genotipo SE Asiático es más eficiente para
infectar el mosquito Aedes aegypti que el genotipo Americano. 22
El patrón heterogéneo entre cepas de dengue se ha demostrado serológicamente y
molecularmente, pero no está claro cuales cambios genómicos se relacionan con la virulencia
en una cepa en particular. De aquí se deduce que los cambios genéticos se relacionan con la
expresión de alguna propiedad biológica del virus y que, la identificación de tales cambios
pudiera ser de utilidad en el establecimiento de nuevas estrategias de control de esta
enfermedad. 11
6.2.5 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
Debido a la variedad de cuadros clínicos que presenta la enfermedad por dengue, es
confundible fácilmente con otras enfermedades virales, respiratorias y gastrointestinales, por
lo que es importante realizar diagnóstico diferencial. Entre las enfermedades más comunes que
se confunden con dengue, están: 26
16
Dengue clásico: Dengue Hemorrágico:
Influenza Sepsis bacteriana
Rubéola Meningococemia
Sarampión Leptospirosis
Enterovirosis Hepatitis
Tifoidea Otras fiebres hemorrágicas virales
Leptospirosis
Hepatitis viral
Otras Arbovirosis: fiebre amarilla o virus que producen encefalitis.
6.2.5. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
La extensión geográfica de la enfermedad hacia nuevas áreas, su incremento en el
número de brotes y situaciones endémicas, así como en su severidad, han conducido al
desarrollo de sistemas de vigilancia para su prevención y control, donde la confirmación de la
presencia del virus en el laboratorio, ocupa un papel prioritario. 16
El diagnóstico de laboratorio puede brindar información temprana y precisa a las
autoridades de salud, lo que favorece a la toma inmediata y oportuna de las medidas
adecuadas para el control. Dada la emergencia y reemergencia del dengue y del DH, su
diagnóstico se convierte de primer orden, lo que permitirá diferenciar el dengue de otras
enfermedades y así poseer mayor soporte de la vigilancia epidemiológica de la
enfermedad.16
Para la determinación de la presencia del virus y la identificación del serotipo se
dispone del aislamiento viral en cultivos celulares (observación del efecto citopático inducido)
y la técnica de reacción en cadena de polimerasa o RT-PCR (detección de componentes virales
(ácidos nucleicos)). 9
La RT-PCR es una técnica ampliamente utilizada en el diagnóstico del dengue porque
permite la detección del agente de forma directa en muestras de suero, células infectadas,
sobrenadantes celulares, mosquitos y larvas infectadas, así como las muestras de tejidos
17
frescos y embebidas en parafina en fallecidos por DH. También se ha empleado en el estudio
genómico de cepas de dengue, lo que ha permitido clasificar los genotipos en cepas.16
La RT-PCR ha permitido diagnosticar dengue desde el primer día de la
enfermedad. Con esta técnica el RNA viral es detectado en casi un 90%. La especificidad y
sensibilidad de cualquier sistema inmunoenzimáico no es comparable con la RT-PCR,
durante los primeros 5 días de la enfermedad. 25
Ya que la presencia del virus en la sangre es fugaz, para estas pruebas se requiere que
las muestras sean tomadas antes del tercer día de haber iniciado el cuadro clínico (para
aislamiento viral) y dentro de la primera semana para PCR. El resultado positivo confirma
de manera irrefutable el diagnóstico.
A partir del aislamiento viral es factible realizar la tipificación del genotipo, determinar
su origen geográfico (topotipo) y la virulencia de la cepa. El tiempo de almacenamiento y
traslado de la muestra para estas técnicas no debe pasar de 3 días. 6
6.2.6.1 Pruebas serológicas
Cuando no es posible realizar el aislamiento viral, existe el recurso de las pruebas
serológicas. Estas nunca son específicas como el aislamiento del agente, pero en cambio son
muy sensibles y aunque no permiten una identificación microbiológica exacta, es decir, no
permite identificar el agente infectante, son frecuentemente el único medio disponible para
confirmar el diagnóstico clínico. La especificidad de la serología llega sólo hasta evidenciar el
hecho de una infección reciente por flavivirus. Existen varias técnicas serológicas: 16
• La inhibición de la Hemoaglutinación (IH)
• Fijación del complemento (FC)
• Prueba de Neutralización de placa (NT)
• Las técnicas inmunoenzimáticas: ELISA IgM e IgG. Actualmente esta es la técnica
serológica de referencia.
• Inmunocromatografia Rápida (ICR o PanBio-test)
De acuerdo con la prueba usada, el diagnóstico serológico inequívoco lo da el aumento
significativo de cuatro veces o más en los títulos de anticuerpos específicos entre las muestras
séricas de la fase aguda y la fase de convalecencia. La batería antigénica de la mayoría de
18
estas pruebas, incluye los cuatro serotipos del dengue, otros flavivirus como el virus de la
fiebre amarilla, de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis de San Luis, o flavivirus
como el virus Chikungunya y el virus de la encefalitis equina. Idealmente estas pruebas deben
contener un antígeno no infectado de control. 27
La prueba de IH, es la más frecuentemente usada, es sensible, fácil de realizar, requiere
un equipo mínimo, pero los anticuerpos IH pueden persistir por tiempos prolongados, de hasta
48 años o más, por lo que esta prueba es ideal para estudios seroepidemiológicos. 27
La prueba FC, no es usada rutinariamente en el diagnóstico serológico de dengue. Es
más difícil de realizar, requiere personal altamente capacitado, se basa en el principio de que
el complemento es consumido durante las reacciones antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos FC
aparecen posteriores a los anticuerpos IH, son específicos de infección primaria, y persisten
por períodos cortos.27
La NT es la más específica y sensible prueba serológica para los virus de dengue. Esta
técnica también permite la identificación del serotipo del virus del dengue.
ELISA, es una prueba rápida y sencilla que requiere equipo poco sofisticado. El
desarrollo de anticuerpos IgM anti dengue, puede presentarse para el día quinto de la
enfermedad. Cerca del 93% de los pacientes desarrollan anticuerpos IgM detectables entre los
6-10 días del inicio de la enfermedad. La prueba Indirecta IgG-ELISA, es comparable con la
prueba IH, y es usada para diferenciar una infección primaria o secundaria por dengue. Esta
prueba es simple y fácil de realizar. No es específica y tiene reacciones cruzadas con otros
flavivirus. 27
Inmunocromatografía rápida (ICR PanBio-test) es más rápida y más sencilla ya
que determina simultáneamente la IgG e IgM con una simple adición de suero problema no así
para la prueba de Inhibición de la Hemoaglutinación7
Con esta técnica los anticuerpos IgM séricos son detectados en pacientes con
infección primaria de dengue de 3-5 días de infección y generalmente persisten niveles
detectables a los 30-90 días y detecta IgG hasta 8 meses después de haber presentado la
enfermedad. La ICR presenta reacción cruzada con otras infecciones por flavivirus como son
la encefalitis Japonesa, Fiebre amarilla, West Nile y encefalitis de San Luis. 7
El fundamento de esta prueba se basa en que los anticuerpos séricos del tipo IgM e
19
IgG, cuando están presentes se combinan con antihumanos IgG e IgM, lo cuales están
inmovilizados en la líneas trazadas del test. Las proteínas recombinantes del dengue son
rehidratadas con el buffer y reaccionan con los anticuerpos monoclonales, formando
complejos, los cuales se ponen en contacto con las inmunoglobulinas, capturadas en la
membrana del test y forman una franja púrpura/rosa. Es una técnica, relativamente sencilla y
rápida; posee una alta sensibilidad, se recomienda utilizarla en el diagnóstico de dengue
reciente (IgM). 7
6.2.7 TRATAMIENTO 8
En los casos de deshidratación como consecuencia de fiebre alta, anorexia y vómito,
se recomienda proporcionar abundantes líquidos por vía oral. Se puede utilizar la
solución de rehidratación oral que recomienda la OMS, para el tratamiento de cuadros
diarreicos graves (NaCl, 3.5 g; NaHCO3, 2.5 g; KCl, 1.5 g, glucosa, 20 g, disueltos en
un litro de agua). Si durante la fase febril hay riesgo de convulsiones por hiperpirexia, se
pueden administrar antipiréticos como el Acetominofén en las siguientes dosis: 8
<1 año 60 mg / dosis
1-3 años 60-120 mg/ dosis
3-6 años 120 mg/ dosis
6-12 años 240 mg/ dosis
Estas dosis deben administrarse si la temperatura corporal es >39° C, pero no más de 6
dosis en un periodo de 24 horas.
Los salicilatos no deben usarse, ya que pueden complicar el cuadro hemorrágico
debido a que inhiben la agregación plaquetaria e interfieren con la formación de protrombina.
En los casos DH o SChD la pronta y eficaz compensación de la pérdida de líquidos
puede salvar la vida del paciente. La administración de soluciones, plasma, electrolitos, sangre
total, etc; puede revertir el cuadro de choque rápidamente y prevenir la coagulación
intravascular diseminada. El pronóstico depende del reconocimiento precoz del choque, por
lo que es necesario tener una vigilancia adecuada de estos pacientes; el periodo crítico es
durante la transición de la fase febril a la fase afebril, que generalmente ocurre después del
tercer día de inicio del cuadro clínico. 8
20
La determinación constante del número de plaquetas y del valor del hematocrito,
tiene gran utilidad en el diagnóstico y pronóstico. El valor del hematocrito es una guía útil
para el tratamiento (refleja el grado de extravasación del plasma y la necesidad de
administrar líquidos por vía intravenosa). La hemoconcentración suele preceder a las
alteraciones de la presión sanguínea y del pulso. 8
El tratamiento de los casos de DH y SChD consiste en la administración por vía
intravenosa de solución salina fisiológica, solución de glucosa al 5%, Ringer de lactato y en
caso de acidosis metabólica, se puede administrar bicarbonato de sodio (0.167 mol/litro).
La rehidratación, principalmente en niños, deberá hacerse bajo vigilancia médica, ya
que pueden presentarse signos de insuficiencia cardiaca.
En casos de choque profundo, se puede administrar plasma (20-30 ml/kg de peso
corporal) o un substituto de plasma (p.e. Dextrán 40) a razón de 10-15 ml/kg de peso
corporal. 8
La administración intravenosa de líquidos se puede continuar hasta por 24 o 48
horas después de la recuperación de los signos vitales y del valor del hematocrito; sin
embargo, se deberán tener precauciones, ya que se puede causar hipervolemia, edema
pulmonar o insuficiencia cardiaca. Los niveles de electrolitos y gases sanguíneos deben
determinarse en los pacientes graves. 8
En algunos pacientes se ha utilizado con éxito el sulfonato sódico de carbazocromo
(AC-17), que impide la permeabilidad vascular. 17 La transfusión de sangre está indicada en
casos con hemorragia severa. El plasma congelado y/o el concentrado de plaquetas están
indicados en algunos casos, cuando la coagulación intravascular diseminada causa
hemorragia masiva. El tratamiento de los casos de DH y SChD utilizando esteroides, ha
sido útil en casos aislados. 8
21
6.3 JUSTIFICACIÓN
El dengue es una de las enfermedades más relevantes a nivel mundial, por lo que su
estudio epidemiológico es necesario. En la actualidad la necesidad de profundizar en su
estudio se ve reflejada en el aumento de casos por año en todas las zonas tropicales y
subtropicales donde se desarrolla el vector y se estima que un 80% de la población de estas
áreas ha padecido una o más infecciones por dengue. 10
En la Ciudad de Colima a la población que se diagnóstica clínicamente como dengue,
se le realiza una prueba serológica confirmatoria (IgM-ELISA); de esta población un 87% da
resultados negativos a la presencia de anticuerpos IgM contra dengue, por lo que es de suma
importancia considerar la utilización de una prueba de diagnóstico temprano como es la RT-
PCR.
En el Estado de Colima no se ha realizado un estudio de este tipo previamente, la
técnica utilizada en este estudio es muy específica y rápida, de modo que puede ser
implementada como una técnica de diagnóstico temprano.
También es conocido que los serotipos del virus de dengue han circulado ampliamente
en nuestro país desde principios de los años ochenta. En Colima se documentaron los 4
serotipos del dengue en el año 1996, pero en la actualidad se desconoce como es la
distribución de dichos serotipos. 10
En lo que respecta a los casos de dengue hemorrágico presentes en el país, el Estado
de Colima es uno de los más afectados, ocupando el 13% de los casos de dengue hemorrágico
(DH) reportados desde 1984 hasta el 2002; esta cifra lo coloca en el segundo lugar con 783
casos de DH de un total de 6251. 6
Se ha observado que la incidencia de DH está relacionada con la presencia de 2 o más
serotipos de virus del dengue. En Colima hasta un 40% de la población ha estado expuesta a
la infección.1 Con todo lo anterior, es de suma importancia definir si en la actualidad persisten
varios serotipos circulando en forma endémica y sentar las bases para poder determinar si el
aumento de casos de dengue y su severidad se deben a la presencia de algunos serotipos
circulantes o a la presencia de una nueva cepa más agresiva en los últimos años.
Con los datos arrojados de este estudio, las autoridades correspondientes podrán
evaluar y fortalecer las medidas de control de la enfermedad.
22
6.4 OBJETIVO GENERAL
• Identificar la presencia del virus del dengue por la técnica Retrotranscripción y
Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) en suero de pacientes febriles.
6.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Identificar la presencia del virus del dengue en muestras sanguíneas de pacientes
febriles.
• Identificar a que serotipo pertenecen las muestras positivas a virus del dengue.
• Comparar el diagnóstico presuntivo de los pacientes incluidos en el estudio con los
resultados obtenidos por la técnica RT-PCR para dengue.
• Buscar asociación entre la presencia de la enfermedad por dengue con la edad,
sexo, estación del año y municipio del estado que habita la población estudiada.
VII.- MATERIAL Y MÉTODOS
23
7.1. DIAGRAMA DE FLUJO DE LA METODOLOGÍA
Se tomó una muestra de sangre periférica a 215 pacientes febriles de los principales
centros de atención médica de Colima; el suero fue separado por centrifugación y se purificó
el RNA por la técnica de Chomczynski y Sacchi.28 Posteriormente se llevó a cabo una
reacción de RT-PCR con el Kit One Step Platinum Taq, utilizando oligonucleotidos
específicos para cada serotipo, diseñados en nuestro laboratorio. Los fragmentos de cDNA
obtenidos fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 2.2%, teñidos con
bromuro de etidio y observados en un documentador de geles. Las bandas fluorescentes
observadas fueron comparadas con aquellas obtenidas del RNA específico de DEN1, DEN2,
DEN3 y DEN4, amablemente donadas por el Dr. Farfán de la Universidad Autónoma de
Yucatán, los cuales fueron utilizados como controles positivos.
Pacientes (Consentimiento informado)
Muestra sanguínea
Suero Extracción de RNA
RT-PCR ELECTROFORESIS
TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO
7.2
VISUALIZACION DE FRAGMENTOS DE DNA
DEN1=568 pb DEN2= 656 pb DEN3= 237pb DEN4= 496 pb
24
UNIVERSO DE TRABAJO
El estudio se llevó a cabo en el Estado de Colima, que cuenta con una población de
542, 627 habitantes. 29
El muestreo en humanos se realizó por conveniencia, en los centros de atención médica
con mayor demanda del estado, en los municipios de: Manzanillo, Tecomán, Armería, Villa de
Álvarez, Coquimatlán y Colima.
7.3 DISEÑO DEL ESTUDIO
Es un estudio descriptivo transversal.
7.4 OBTENCIÓN DE DATOS
• MUESTREO
El número de personas incluidas en el estudio se determinó con base en el porcentaje
de pacientes positivos a Dengue (IgM), que refieren cuadro clínico compatible con dengue, el
cual fue de 12.67%, en un estudio realizado en el 2002.1
Con una precisión del 5% y al 95% de confiabilidad con la fórmula de una
proporción30, 31:
N= ( z12- α / 2 P (1-P)) / d2
Donde: N = número de individuos en la población, z = área bajo la curva de una
distribución normal, P = proporción muestral, d = porcentaje de error.
Entonces: N = ((3.84)(0.1267)(0.8733))/ (0.0025)
N= 169.95 = 170 Pacientes
Ajustando el 15% por pérdidas =170(1 / 1-0.15) = 200 pacientes
Criterios de inclusión: Pacientes que acudieron a los centros de atención médica con cuadro
febril, (38.5 °C o mayor, axilar o anal) sin evidencia de foco de infección clara.
La justificación para incluir a todos los pacientes con cuadro febril sin foco de
infección aparente, fue en primer lugar, que la identificación del virus del dengue por RT-
PCR, sólo puede hacerse en la etapa temprana de la enfermedad, cuando la concentración del
virus del dengue en sangre es detectable (esto ocurre del 1° al 5° día de infección)25 y la
25
presencia de fiebre es uno de los primeros síntomas en infecciones por dengue sintomáticas,
por lo que existe mayor probabilidad de identificar el virus en estos pacientes.1 En segundo
lugar, la infección por dengue puede presentarse como un cuadro febril simple o acompañado
de una gran diversidad de síntomas atípicos. 11 Y por último, en Colima se ha encontrado que
las infecciones febriles que clínicamente corresponden a dengue tienen un 87% de
probabilidad de no serlo, 1 de modo que no es recomendable incluir en este estudio, solamente
a estos pacientes y en su lugar, sí incluir a todos los pacientes con cuadros febriles.
Criterios de exclusión: casos en que se documente claramente presencia de enfermedad por
HIV por razones de bioseguridad (no se cuenta con la infraestructura para el manejo de ese
virus).
Criterios de eliminación: Muestra de pacientes que no se conservaron en condiciones
adecuadas 6,32 (ver anexo 12.2).
7.5 DEFINICIÓN DE LAS VARIABLES
Tabla II. Clasificación de las variables basándose en su naturaleza, relación, nivel de medición e indicadores.
VARIABLES
NATURALEZA
POR SU RELACIÓN
NIVEL DE MEDICIÓN
INDICADORES
Serotipo del virus dengue
CUALITATIVA DEPENDIENTE NOMINAL POSITIVO : DEN1,DEN2, DEN3 y DEN4 NEGATIVO
Edad * CUANTITATIVA INDEPENDIENTE DISCRETA ⟨1 año : # meses ⟩ 1 año : # años
Sexo CUALITATIVA INDEPENDIENTE NOMINAL Masculino : M Femenino : F
Estación CUALITATIVA INDEPENDIENTE NOMINAL Primavera: 21/03/06-20/06/06 Verano:21/06/06-20/09/06 Otoño:21/09/06-20/12/06 Invierno:21/12/06-20/03/06
Municipio CUALITATIVA INDEPENDIENTE NOMINAL Armería Colima Comala Coquimatlán Cuauhtémoc Manzanillo Minatitlán Tecomán Villa de Álvarez
* Esta variable se subclasificó por décadas para su análisis final.
26
7.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE DATOS. 33, 34, 35
Para el análisis estadístico se los resultados se utilizó el paquete estadístico de Excel y
Epinfo 2005.
Se estimó la incidencia acumulada de la infección por dengue en pacientes febriles en
base al número de personas positivas entre el número de personas muestreadas y en base al
tiempo de muestreo.
Incidencia acumulada se refiere a casos nuevos de morbilidad que se presentan en una
comunidad determinada, en un lugar dado y en un periodo específico
Se aplicó Prueba exacta de Fisher o X2, con corrección de Yates en busca de
asociación de la presencia de la infección por dengue con edad, sexo y Municipio.
La prueba de X2 es una prueba no paramétrica que utiliza datos absolutos (frecuencias
de mediciones nominales). En este caso se utiliza para estimar la asociación entre un factor de
riego y la enfermedad.
Para el cálculo de esta prueba se utilizan tablas de contingencia y la fórmula general
es:
X2 = Σ ((O-E) 2 / E )
Donde: O = frecuencias observadas E = frecuencias esperadas
Los valores críticos con los que se comparara el resultado serán a un grado de libertad,
al 95% de confiabilidad y el 5% de precisión.
Una alternativa a esta prueba cuando la muestra total es menor a 20, incluye cero
alguna de las casillas o si existen frecuencias pequeñas (menores a cinco), es la utilización de
la prueba exacta de Fisher con corrección de Yates. La prueba exacta de Fisher utiliza el
mismo principio que la X2 y la corrección de Yates es una prueba similar a la continuidad
utilizada para datos continuos. Esta prueba se utiliza cuando el número de grados de libertad
es uno y el número de frecuencias es pequeño.
27
Otra prueba de asociación ampliamente utilizada es la razón de disparidad (Odds Ratio
o OR) o de productos cruzados ya que se define como la relación del producto de las
diagonales de una tabla de contingencia 2x2. Si el resultado de esta prueba es mayor a uno, el
factor evaluado será de riesgo y si por lo contrario es menor a uno se considera como factor
protector.
Para evaluar el resultado de esta prueba debe tenerse en cuenta el intervalo de
confianza (al nivel de significancia utilizado, para este caso es del 95%), el cual se define
como la probabilidad de que los intervalos de confianza definidos contengan el valor de la
media poblacional es del 95%. Entre más amplio sea el intervalo menor será la precisión con
que se está estimando el parámetro poblacional.
El intervalo de confianza (IC) se expresa por límites inferior y superior; el límite
inferior debe ser superior a uno para insinuar relación entre el factor de riesgo y la
enfermedad. Para la hipótesis de prevención, el límite superior de la razón de disparidad es
menor a uno.
7.7 METODOLOGÍA
La Técnica se estandarizó con los controles positivos que muy amablemente donó el
Dr. José Arturo Farfán Ale, investigador de la Universidad Autónoma de Yucatán.
1. La toma de la muestra se realizó de común acuerdo con el personal de
laboratorio de los Centros de atención médica involucrados, durante el periodo de
julio del 2004 a septiembre del 2005; Se solicitó al paciente su autorización para la
toma de sangre, el cual firmó de común acuerdo en la carta de consentimiento
informado (ver anexo 12.1), posteriormente se procedió a la toma de la muestra
sanguínea. Se extrajeron aproximadamente 4-5 ml de sangre en un tubo seco
estéril. La transportación de la muestra al laboratorio se realizó en hielo. El suero
se separó por centrifugación.32 (ver anexo 12.2) del cual se extrajo el RNA con la
siguiente técnica:
TÉCNICA DE CHOMCZYNSKI Y SACCHI PARA EXTRACIÓN D E RNA. 28
• A 0.5ml de suero se le agregaron 0.5 ml de Trizol (en este paso el suero
puede ser congelado a -70º C durante varias semanas), se agregó 0.1 ml
28
de cloroformo y se agitó manualmente durante 30 segundos, se incubó a
temperatura ambiente por 3 minutos. Se centrifugó a 10,000 rpm/15
min/4º C.
• Se transfirió la fase acuosa a un tubo nuevo y se agregaron 0.25 ml de
isopropanol. Se incubó a temperatura ambiente por 10 minutos. Se
centrifugó a 12,000 rpm/15 min/ 4º C.
• Se eliminó el sobrenadante por decantación. Se agregaron 0.25 ml de
etanol frío al 75%, preparado en agua libre de RNAsas (agua tratada con
dietil pirocarbonato; H2O-DEP).
• Se eliminó el etanol con sistema de vacío y se resuspendió el RNA en
H2O-DEP (aproximadamente en 20 µl). Se congeló a -70º C hasta el
corrimiento de la reacción de RT-PCR.
2. La obtención de cDNA a partir de RNA viral, y la amplificación del cDNA, se
llevaron a cabo mediante la técnica de RT-PCR, utilizando el “kit: RT-PCR One step
Platinum Taq (Invitrogen),33 con los oligonucleótidos iniciadores “primers”
(presentados en la tabla III), diseñados en el laboratorio de regulación génica del
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas (CUIB) de la Universidad de
Colima (U de C), basándonos en las secuencias de nucleótidos publicadas en el
banco de genes para el virus del dengue con los siguientes números de acceso:
gi|51850378|, gi|14585842|, gi|13926152|, gi|9280544|, gi|51233484|, gi|11119731|, gi|19744844|,
gi|323449|, gi|4337012|, gi|6581078|, gi|323447|, gi|6841605|, gi|323654|, gi|9626681|, gi|46575862|,
gi|14485523|, gi|323660|, gi|13540386| gi|14328931|, gi|17129645|, gi|1854040|, gi|1854036|,
gi|17129647|, gi|51850372|, gi|14195698|, gi|8927332|, gi|27656962|, gi|33468372|, gi|14328929|,
gi|51850386|, gi|50080845|, gi|12711599|, gi|323468|, gi|50657545|, gi|37543957|, gi|50347096|,
gi|12659201|, gi|14269097|.
3. El diseño fue rectificado comparando las secuencias de los primers con todas las
secuencias del banco de genes mediante la herramienta informática “Blast”
nucleótido a nucleótido, para eliminar la posibilidad de reacciones inespecíficas.
29
TABLA III.- Oligonucleótidos iniciadores.
PRIMERS VIRUS FRAGMENTOS (pb)
F-5´- AACATCCATCACCCAGAAAGG -3´
R-5´- GAGCTTGAGGTGTTATGATTGC -3´
DEN1 568 pb
F-5´-TCAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACC-3´
R-5´-CCAAGICCCTTCIGAIGACATCCA-3´
DEN2 656 pb
F-5´- CACTTCCTTGACCCAGAAAGTG -3´
R-5´- CTTCCTTAGGGTCGCCAATTG -3´
DEN3 237 pb
F-5´- TCAACGATAACATTGCTGTGCT -3´
R-5´- GTTCGCTGGATTCCTGTTTGC -3´
DEN4 496 pb
Estos “primers” fueron diseñados en el laboratorio de regulación génica del CUIB de la U de C, con base en las secuencias de nucleótidos de virus del dengue publicadas en banco de genes.
4. Se preparó una reacción por muestra, utilizando un cóctel de primers para DEN1,
DEN3 y DEN4; aparte una reacción para DEN2, esto debido a las diferentes
temperaturas de alineamiento y la observación previa de no haber obtenido
productos de amplificación inespecíficos con primers de otro serotipo. La técnica
para preparar las reacciones fue la siguiente:
TÉCNICA DE RETROTRANSCRIPCIÓN Y REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA. 28, 36, 37
• Para llevar a cabo esta técnica se utilizó el Kit para RT-PCR One step
Platinum Taq siguiendo las indicaciones de la casa comercial (ver tabla
IV).
Tabla IV. Instrucciones para la preparación del cóctel.
COMPONENTES VOLUMEN/ 25 µµµµl CONCENTRACIÓN
FINAL
Mezcla de reacción 2X
(Buffer, dNTPs)
12.5µl 1X
RNA problema 9µl 1 µg/µl
F-primer 1 µl 1 µg/100µl
R-primer 1 µl 1 µg/100µl
RT/Platinum Taq Mix 0.5 µl Desconocida
MgSO4 5mM 1µl 1.6µM
30
• Se agitó el cóctel gentilmente y se centrifugó suavemente.
• Las muestras fueron sometidas al siguiente protocolo de amplificación
(tabla V).
Tabla V. Protocolo de amplificación para RT-PCR.
A: síntesis de cDNA y
pre-desnaturalización
B: Amplificación por
PCR
C: Extensión
final
D: Conservación
Un ciclo de:
50º C por 30 minutos
94º C por 2 minutos
35 ciclos de:
Desnaturalización:
94º C / 15 segundos
Alineamiento:
(esta temperatura
cambia para cada
serotipos)
DEN2
63º C/ 45 segundos
DEN1, DEN3 y DEN4:
57º C/ 30 segundos
Extensión:
72º C por 30 segundos
Un ciclo de:
72 º C / 10 min.
Un ciclo de:
4º C al infinito.
• Una vez terminado este paso las muestras se refrigeraron o se procedió a su
análisis por electroforesis.
4. Una vez amplificado el cDNA, los productos se sometieron a electroforesis
en geles de agarosa al 2.2%, los cuales se prepararon de la siguiente manera:
TÉCNICA DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 2.2% . 28 ,33
• Se preparó el gel de Agarosa al 2.2%.
o Se prepararon 100 ml de agarosa al 2.2% en TBE 1X (ver tabla VI).
La agarosa se fundió con calor y se colocó en un molde para su
gelificación.
31
Tabla VI. Preparación de soluciones patrón.
Soluciones COMPONENTES
BUFFER TBE 5X (Tris-Boratos-
EDTA)
54g de Tris + 27.5g ácido bórico + 20 ml de EDTA 0.5 M
(pH 8.0) y aforar a un litro
BUFFER DE CARGA 0.25% de azul de bromofenol + 0.25% de xilen-cianol +
30% de glicerol en agua.
• El gel se colocó en una cámara para electroforesis horizontal (B3 Owl) con
TBE 0.5X como buffer de corrimiento.
• Los marcadores de peso molecular (100 pb y 50 pb DNA ladder;
Invitrogen), las muestras y los controles positivos fueron colocados en los
pozos del gel acompañados de buffer de carga (tabla VI)
• El corrimiento se realizó a 100 V durante 2 horas.
5. Después del corrimiento, los geles fueron teñidos con solución acuosa de
bromuro de etidio (0.5µg/ml) 28. En el gel teñido se buscó identificar las bandas
(del tamaño que indica la tabla VII), para cada uno de los serotipos del virus del
dengue, con ayuda de luz ultravioleta. Se obtuvo una imagen digital de cada gel
mediante un documentador de geles Gel-Doc (Bio-Rad).
Tabla VII. Número de pares de bases de cada uno de los fragmentos amplificados de virus del dengue.
SEROTIPO TAMAÑO
DEN1 568 pb
DEN2 656 pb
DEN3 237 pb
DEN4 496 pb
5. Para llevar el control del procesamiento de las muestras se utilizó un formato de
recolección de datos (Ver anexo 12.3).
32
7.8 ASPECTOS ÉTICOS
Este estudio fue realizado respetando los puntos sugeridos por la Ley General de Salud
y la declaración de Helsinki.
Este estudio está clasificado con riesgo mínimo según la ley General de Salud
(Reglamento de la Ley General de Salud en materia de investigación para la salud, Título
segundo, capitulo I, artículo 17, inciso II); se sometió al comité institucional de ética en
investigación del CUIB donde fue aprobado en el acta número 1/2004 y al comité de ética del
Instituto Mexicano del Seguro Social aprobado con el número 0601.
En las instituciones que no contaban con un comité de ética, fue evaluado por el
comité de enseñanza y epidemiología en donde fue aprobado.
Con todas las instituciones involucradas se estableció un convenio para el respeto de
los derechos de los pacientes, se solicitó participación con consentimiento informado (ver
anexo 12.1) y se aseguró la confidencialidad de los datos.
Con respecto al agente infeccioso que se trabajó (virus del dengue) este estudio está
clasificado en el nivel 2 de bioseguridad 38 y en el laboratorio de trabajo del CUIB se cuenta
con el equipo e instalaciones necesarias para el manejo de este.
33
VIII.- RESULTADOS
Se analizaron 215 muestras para identificar la presencia de RNA de virus de dengue
mediante RT-PCR. De las muestras analizadas 28 muestras resultaron positivas para dengue,
de estas 26 muestras fueron positivas para el DEN3 y 2 para DEN1.
La incidencia acumulada de infección por dengue en pacientes febriles es = 13.02% en 15
meses de muestreo.
La figura 8 muestra una imagen del corrimiento de los controles positivos donados por
el Dr. Farfán Ale de la Universidad Autónoma de Yucatán. La figura 9 es una imagen de los
geles con muestras positivas.
Figura 8. Controles del virus del dengue para cada uno de los serotipos. DEN1 =568 pb, DEN2 = 656, DEN3= 237 y DEN4= 496. CN= control negativo (sin RNA), M = marcador de peso molecular: 50pb ladder.
34
Figura 9. Electroforesis de muestras positivas para dengue. Los carriles 1-9 DEN3, carriles 10 y 11 DEN1. M= marcador de peso molecular: 100pb ladder.
El serotipo DEN1, solo se detectó circulando en el municipio de Tecomán, por lo tanto
éste fue en el único municipio donde se identificaron 2 serotipos circulando (tabla VIII). En la
tabla VIII se describen las características demográficas de los municipios estudiados en el
Estado de Colima39, ya que está reportado que los parámetros de altitud , población y
servicios públicos juegan un papel importante en la dinámica de transmisión del dengue.
Tabla VIII. Características demográficas de los municipios del Estado de Colima38. Casos y serotipos identificados en cada uno de los municipios.
MUNICIPIO HABITANTES ALTITUD (Metros)
CASOS SEROTIPOS
Armería 28,574 40 2 DEN3 Colima 129,958 500 10 DEN3 Comala 19,384 600 ---
Coquimatlán 18,756 320 --- Cuauhtémoc 26,771 940 --- Ixtlahuacán 5,478 200 ---
Manzanillo 125,143 5 2 DEN3 Minatitlán 8,466 640 --- Tecomán 99,289 30 12 DEN3, DEN1
Villa de Álvarez 80,808 530 2 DEN3
35
En el presente estudio se realizó un análisis retrospectivo del diagnóstico clínico de los
28 casos positivos identificados por RT-PCR; encontrando que la infección por dengue solo
fue detectada acertadamente por el personal de salud en un 12.5% (4 casos) de los pacientes y
el 88.8% (24 casos) de pacientes fueron diagnosticados y tratados erróneamente; con
diagnósticos diferentes a infección por dengue, ver tabla IX. De los 4 casos diagnosticados
acertadamente, dos fueron reportados como dengue clásico y 2 como DH.
Tabla IX. Diagnósticos clínicos de la población incluida en el estudio
DIAGNÓSTICO TOTAL
(n=215)
POSITIVOS A DENGUE
Síndrome febril indiferenciado 100 13 (13.00%)
Dengue 32 4 (12.50%)
Faringitis 12 0
Infección en vías urinarias 13 5 (38.46 %)
Hepatitis 4 3 (75.00% )
Púrpura trombocitopenica
idiopatica
1 1 (100%)
F. Tifoidea 4 1 (25.00%)
Neumonía 6 1 (16.66 %)
Otros 43 0
36
La tabla X describe la población analizada, porcentajes, los valores de (p) de la prueba de
Fisher con corrección de Yates o X2 y OR e intervalo de confianza.
Tabla X. Descripción de la población analizada.
* Límites en rango no confiable (rango muy amplio); ** n ≠ de 215 por encuesta incompleta
MUNICIPIO
CANTIDAD n=215
POSITIVOS/ PORCENTAJE
VALOR DE (p) DE LA X2, OR E INTERVALO DE CONFIANZA.
COLIMA 73 10 (13.69%) p=0.99 OR =1.09 IC (0.44-2.68) TECOMÁN 67 12 (17.91%) p=0.22 OR =1.80 IC (0.74-4.35)
V. DE ÁLVAREZ 25 2 (8.00 %) p=0.33 OR =0.55 IC (0.08-2.62)* MANZANILLO 23 2 (8.69%) p=0.39 OR =0.61 IC (0.09-2.93)*
COQUIMATLÁN 12 0 ARMERÍA 9 2 (22.22%) p=0.33 OR =1.98 IC (0.27-11.29)*
CUAUHTÉMOC 4 0 MINATITLÁN 1 0
COMALA 1 0 GÉNERO n=215
FEMENINO 104 10 (9.61%) p=0.26 OR=0.58 IC (0.23-1.42) MASCULINO 111 18 (16.21%) p=0.21 OR=1.82 IC (0.75-4.50)
ESTACIONES n= 215 PRIMAVERA 31 1 (3.22%) p=0.06 OR=0.19 IC (0.01-1.42)*
VERANO 90 14 (15.55%) p=0.46 OR=1.46 IC (0.61-3.47) OTOÑO 42 10 (23.80%) p=0.03 OR=2.69 IC (1.04-6.88)
INVIERNO 52 3 (5.76%) p=0.12 OR=0.34 IC (0.08-1.25)* RANGO DE EDAD n=209**
0-10 37 4 (10.81%) p=0.49 OR=0.83 IC (0.22-2.77)* 11-20 31 4 (12.90%) p=0.56 OR=1.05 IC (0.28-3.57)* 21-30 47 8 (17.02%) p=0.40 OR=1.64 IC (0.60-4.38) 31-40 22 1 (4.54%) p=0.20 OR=0.31 IC (0.01-2.33)* 41-50 23 2 (8.69%) p=0.43 OR=0.64 IC (0.10-3.12)* 51-60 22 2 (9.09%) p=0.46 OR=0.68 IC (0.10-3.31)* 61-70 13 0 71-80 6 2 (33.33%) p=0.16 OR=3.73 IC (0.45-25.6)* 81-90 8 3 (37.5%) p=0.06 OR=4.64 IC (0.81-24.5)*
37
IX.- DISCUSIÓN
Es importante remarcar que el presente estudio no tiene como finalidad evaluar la
atención médica y el control sanitario implementado para la enfermedad de dengue en el
Estado de Colima, simplemente presenta una breve descripción de la problemática de esta
enfermedad, remarcado la importancia de implementar una prueba de diagnóstico temprana
como la RT-PCR para facilitar al personal médico el manejo de estos pacientes, para evitar o
disminuir la presencia de formas graves de dengue (DH y SChD) y evitar así la mortalidad.
Es importante en primer lugar, abordar que las cifras reportadas de casos de dengue a
través de los años en el Estado de Colima según el boletín epidemiológico de la secretaría de
salud,40 (información basada en casos de dengue diagnosticados serológicamente) y el anuario
estadístico del Instituto Nacional de Estadística Geografía e Informática (INEGI)41
(estadísticas teóricas: diagnóstico clínico para dengue reportado en los informes médicos), del
año 2000 al 2005 difiere enormemente (tabla XI); esto por sí solo habla de que no existe una
unificación de la información en el estado y que se han utilizado diferentes criterios de
inclusión de los sujetos de estudio y diferentes métodos de diagnóstico, señalando la necesidad
de una reorganización de los programas para que la información sea fidedigna.
Tabla. XI. Casos reportados de infección por dengue en el Estado de Colima del año 2000 al 2005. 40, 41
AÑO CASOS DE DENGUE
REPORTADOS EN EL
ANUARIO ESTADÍSTICO
(INEGI)
CASOS DE DENGUE
REPORTADO EN EL
BOLETÍN
EPIDEMIOLÓGICO (SSA)
2000 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2
2001 0 15
2002 9,003 2,379
2003 0 37
2004 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 5
2005 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 106
38
En el presente estudio se encontró, que de la población febril que acude a la sala de
urgencia el 13.02% de ellos fueron positivos para dengue, en un periodo de 15 meses que duró
el muestreo. Esto difiere de lo reportado en el estudio realizado entre el 2001 y 2002 a
población abierta (Tasa de incidencia de 1.7% en 7 meses)1 en el cual se determinó la
presencia de IgG e IgM contra dengue; en este estudio solo el 12.67 % de los casos positivos
detectados refirieron sintomatología sugestiva de dengue. Esta variación se debe a que el
diseño de los estudios es diferente, por lo tanto los criterios de inclusión de los pacientes son
distintos al igual que las técnicas de diagnóstico utilizado.
Hasta el momento, nuestro estudio ha identificado en el Estado de Colima DEN1 y
DEN3, si tomamos en cuenta que la presencia de dos o más serotipos diferentes de dengue,
favorecen la aparición de DH; esto podría explicar porqué el Estado de Colima ocupa el
segundo lugar nacional en la presencia de casos de dengue hemorrágico (valor subestimado;
tabla XI); este hallazgo no puede compararse con lo reportado en la bibliografía, ya que en el
año 1996 se reportó la presencia de los 4 serotipos (estudio de la presencia de anticuerpos) y
en el año siguiente sólo se reportó el serotipo DEN36. Por otro lado, al investigar en los
sectores de salud en la sección de epidemiología, sobre cuál fue el serotipo causante de la
epidemia del 2002; no se obtuvo un documento oficial con dicha información, por lo que no es
posible evaluar el comportamiento cíclico de esta enfermedad a través de los años y comparar
ésta con los hallazgos de esta investigación.
Está reportado que las localidades con mayor incidencia de dengue son aquellas que
tienen mayor población, menores condiciones de marginación y mayor dotación de servicios
públicos.19, 41 La ubicación en regiones tropicales y subtropicales, por debajo de los 600 m
sobre el nivel del mar (altitud), es indicativa de las condiciones ecológicas propicias para la
proliferación de altas densidades del vector19, 42.
Como muestra la tabla VIII, todos los municipios de Colima se encuentran a una
altitud adecuada para la proliferación del vector, pero lo importante de esto es que las
poblaciones con mayor número de habitantes fueron en las que se detectó el virus circulando
(Colima, Tecomán, Manzanillo, Armería y Villa de Álvarez). Esto indica que las medidas de
control implementadas deberían de estar mayormente dirigidas a estos municipios, sin restarle
importancia a los municipios menos poblados, ya que el constante desplazamiento de los
habitantes de estas poblaciones a las zonas donde se ha detectado el virus, para abastecer sus
39
necesidades, facilita también el desplazamiento del virus19.
En lo que respecta al diagnóstico clínico al compararlo con los resultados de la RT-
PCR se observa que un alto porcentaje (88.8 %) de pacientes fueron diagnosticados y tratados
erróneamente, (ver tabla IX). Esto se debe probablemente a que el personal médico no cuenta
con las herramientas de diagnóstico adecuado, no considera que las infecciones por dengue
pueden presentar un cuadro clínico atípico6 y no se diagnostica dengue cuando no existen
brotes endémicos francos (lo cual tampoco puede asegurarse ya la prueba de diagnóstico
usada; ELISA; tiene reactividad cruzada con otros flavivirus). 1
Los datos anteriores indican que los parámetros clínicos utilizados actualmente para
diagnosticar dengue en el Estado de Colima deberían ser evaluados; además esto demuestra
que la estadística de la incidencia de infección por dengue en Colima está subestimada (ver
tabla XI), es decir si con los valores que actualmente se reportan, Colima ocupa el 2º lugar
nacional de dengue hemorrágico6, que lugar ocuparía si las cifras se aproximaran más a lo
real.
Si se toman en cuenta todos los datos referentes al problema de diagnóstico, se puede
sugerir la implementación de la técnica de RT-PCR como método de diagnóstico temprano; de
esta manera, se podría mejorar la atención a los pacientes infectados y no infectados, con virus
de dengue y se ayudaría también a la vigilancia epidemiológica (detección de brotes), con
valores reales de incidencia. Si se emplea a gran escala, esta prueba es más económica que la
prueba de ELISA usada actualmente.
En lo que respecta a la asociación de la presencia de la infección con dengue con el
municipio que habitan, género, época del año y edad se encuentra lo siguiente:
• Municipio
No se encontró diferencia significativa de la presencia de la infección por dengue en los
diferentes municipios; pero resalta en la tabla X que los OR para los municipios de Colima,
Tecomán y Armería son mayores a uno, aunque el límite inferior del intervalo de confianza es
menor a uno, lo que no sustenta estadísticamente que el habitar en ellos presenta mayor riesgo
de presentar infección por dengue. Las personas incluidas en el estudio pertenecen a 9
municipios del Estado de Colima y se encontró infección por dengue en 5 de ellos (Colima,
Tecomán, Villa de Álvarez, Armería y Manzanillo). La incidencia de casos de dengue, en
cada uno de estos municipios se muestra en tabla X.
40
De la población analizada de la ciudad de Colima, el 17.8 % de ella pertenecen a los
estados de Jalisco y Michoacán, en los límites de Colima, por lo cual ellos acuden a los
servicios médicos en este municipio, donde fueron captados en este estudio. Se analizaron 13
pacientes que no pertenecen al Estado de Colima, uno de ellos fue positivo para infección para
DEN3. Aunque ésta población no fue objeto de nuestro estudio, es una población que vive en
la periferia y viaja constantemente al estado, debido a su proximidad. Podría considerarse que
dicha población está en el mismo riesgo de padecer cuadros graves de la enfermedad.
Género
El género de los pacientes, no mostró asociación significativa con la presencia de la
enfermedad; en la tabla X puede verse que la proporción de la población del género masculino
y femenino incluida en el estudio es casi igual, pero aún así la presencia de la infección por
dengue se encontró en mayor proporción en el género masculino, encontrándose un OR= 1.82
con IC (0.75 - 4.50).
Hasta la actualidad el estudio de la asociación del género con la infección por dengue es
contradictoria como lo muestra la revisión de Debariti y Schimmer del 2005 43, donde se
reportó: 1) tres estudios independientes en India y Singapur reporta que la infección por
dengue es el doble en hombres que en mujeres. 2) en el sur de América, ambos géneros son
por igual afectados, pero típicamente se ha descrito que hay una relación de 0.65:1 de hombre
a mujer. 3) en México hay una proporción alta de mujeres afectadas. 4) también se reporta que
en el género masculino predomina la infección por dengue no agresiva y el género femenino
presenta los cuadros más severos de la infección; debido a que las mujeres presentan una
respuesta inmunológica más competente que los hombres, una mayor producción de
citoquinas y un incremento en la permeabilidad capilar, 5) otro estudio en México sugiere que
la mujer está predispuesta a la infección por dengue, debido al tiempo que pasa en la vivienda
pero otro estudio se contrapone y menciona que hay una baja incidencia en mujeres, debido a
que ellas permanecen más tiempo en la casa, por lo que están menos expuestas a la infección.
Por lo que sería conveniente considerar lo que mencionan Debariti y Schimmer 42 donde
resaltan que las diferencias del género tanto en la infección y en la severidad de la enfermedad
requieren ser estudiadas para poder identificar los factores sociales y biológicos que influyen
en el patrón de la infección a nivel comunidad.
41
Estación del año
La incidencia y epidemias de dengue han sido asociadas a la temporada de lluvias y al
fenómeno “El Niño” ya que se relacionan con una alta proliferación del vector. Se han
realizados estudios para evaluar los factores climatológicos y las estaciones del año, pero
ninguna información al momento ha establecido el impacto de éstos sobre la presencia de la
infección por dengue. 43
En el Estado de Colima se encontró la presencia de la infección por dengue mediante RT-
PCR, en todas la épocas del año, pero mayormente en verano y otoño. Se encontró que hay
asociación estadísticamente significativa (p=0.03 OR= 2.69 IC=1.04- 6.88) de la presencia de
la enfermedad en otoño. En el verano el OR fue de 1.46, pero la (p) no fue significativa, aún
así puede verse en la tabla IX, cómo en estas dos épocas hay mayor presencia de casos y los
OR son más altos.
Además, según la OMS 8 la transmisión del Dengue es mayor en la época de verano, que
es la época donde prolifera mayormente el vector, por lo que las medidas sanitarias
implementadas contra esta infección se enfocan en esta temporada del año en la mayor parte
de las zonas donde existe la presencia de esta enfermedad. Esto podría explicar porque en
verano la incidencia de casos de infección por dengue es menor que en otoño.
En el presente estudio la mayor parte de la población incluida fue captada durante el
verano, seguido por invierno, otoño y primavera. Pero el mayor número de casos positivos a
infección por dengue se detectó en otoño seguido por verano, invierno y primavera.
Es importante que se note que la presencia de infección por dengue se detectó en todas las
épocas del año, que el control del vector no debería estar dirigido a una sola época y que solo
se reforzara ante un brote franco de casos de dengue.
El control debería implementarse como una prevención, sin olvidar que ningún agente
químico ha sido tan efectivo en el control del vector como la educación y participación
comunitaria en forma conjunta. 43
Edad
La edad de la población analizada se subclasificó por décadas para buscar posible
asociación de ésta con la presencia de la enfermedad, pero no hubo asociación. Se encontraron
OR mayores a uno en el rango de 11-20, 21-30, 71-80 y 81-90 pero el intervalo de confianza
no está en rango confiable (intervalo muy amplio).
42
En la actualidad en lo que respecta a este punto, La Organización Mundial de la Salud
reporta que el dengue clásico es una enfermedad infantil 8,43 y una de las causas más
importantes de hospitalización pediátrica en el suroeste de Asia. También hay evidencia que
muestra mayor incidencia de DH en grupos de edad no pediátrica 43 Algunos estudios en el
suroeste de Asia y en Latinoamérica reportan una alta asociación de DH en grupos de edad
mayor 43.
Este parámetro debería ser estudiado más a fondo; también la respuesta inmune y el grado
de severidad de la enfermedad deberían ser evaluados para cada grupo de edad.
Respecto a las pruebas de asociación realizadas para la presencia de la infección por
dengue con el municipio que habitan, género, estación del año y edad no se encuentra
significancia en la prueba de X2 pero en la prueba de OR en algunas variables, este valor
excede de uno aunque el intervalo de confianza no es confiable. Para estos casos se
recomiendan dos opciones; en primera, aumentar el tamaño de la muestra y en segunda,
realizar una regresión logarítmica (un análisis para múltiples variables), el propósito de ésta es
producir una ecuación matemática que relacione la probabilidad de que las variables
analizadas sean un factor de riesgo. Para construir este modelo se recomienda seleccionar las
variables donde el valor de (p) de X2 sea menor a 0.25 y de ellas incluir aquellas que podrían
tener más peso sobre la variable respuesta. Se realizaron modelos con estas variables y no se
encontró asociación estadística significativa. Con ello proponemos que para encontrar posible
asociación lo más conveniente es aumentar el tamaño de muestra.
Continuar con investigaciones de Dinámica del virus del dengue en el estado, es
importante ya que Colima es una zona con brotes epidémicos de dengue (el más reciente en el
2002), esto podría deberse a la circulación de al menos los dos serotipos identificados al
momento; por otro lado, hay estudios que sugieren que la recombinación de diferentes
serotipos virales produce una nueva cepa con propiedades biológicas diferentes a las que la
originaron42, presentando así un riesgo mayor de que la población que ya ha estado en
contacto con alguno de los serotipos del dengue, desarrolle cuadros graves de la enfermedad.
Los serotipos DEN2 y DEN4 que no se detectaron en el estado, remarcan el
comportamiento cíclico que presenta la enfermedad, por lo que sería importante mencionar
que en años siguientes podría detectarse la presencia de estos dos serotipos en nuestro estado.
43
El hecho de no haber encontrado muestras positivas para DEN2 y DEN4, no significa
que no existan. La no detección podría deberse a que estos serotipos produzcan una infección
menos severa (probablemente no hay sintomatología por la presencia de anticuerpos
neutralizantes para estos serotipos), que no obligue a los enfermos a acudir a los centros
hospitalarios, o que la aparición de estos serotipos sea cíclica y que nuestro estudio se realizó
en una época de baja incidencia para ellos y algo menos probable sería que los virus de estos
serotipos tuvieran una mayor labilidad, que no permita su detección bajo las condiciones de
este estudio.
44
X.- CONCLUSIONES
Por el momento podemos concluir que:
• La incidencia acumulada de infección por dengue en pacientes febriles es de 13.02%
en 15 meses.
• En el estado se encuentran circulando al menos 2 serotipos del virus del dengue (DEN1
y DEN3).
• La presencia de infección por dengue se detectó todo el año, pero en la época de otoño
y verano se detectó mayor incidencia. En la época de otoño hay significancia
estadística que sustenta mayor riesgo de la presencia de infección por dengue.
• La presencia de la enfermedad no está asociada al sexo ni edad de los pacientes, pero
el género masculino tiene mayor riesgo de presentar la infección por dengue en la
población de Colima.
• Los serotipos del virus se identificaron solo en 5 municipios de Colima por lo que
podría pensarse, que el habitar en uno de ellos significa mayor riesgo de presentar la
enfermedad; pero solo en el Municipio de Tecomán se detectó la presencia de los dos
serotipos encontrados, por lo que se podría justificar la presencia de mayor número de
casos sintomáticos.
• Colima es una zona endémica para dengue.
Lo anterior resalta la necesidad de replantear las medidas de control sanitario (todas
las épocas de año, en zonas con brotes de dengue), para evitar que se presenten cuadros
graves de la enfermedad, la necesidad realizar un estudio en búsqueda de DEN2 y DEN4 y
que se considere la implementación de la técnica de RT-PCR como prueba de diagnóstico
temprano y apoyo a las cifras epidemiológicas.
45
XI.- PERSPECTIVAS
Este estudio origina una infinidad de preguntas que faltan por responderse para esta
enfermedad. En primera, los serotipos detectados a que genotipo (variante genética dentro de
un mismo genotipo) pertenecen y si han presentado algún cambio genómico que modificó las
características biológicas del virus haciendo éste más agresivo o más benigno al humano; ya
que según un estudio realizado en el 2002 en Colima, un 84.4% de la población ha presentado
infección primaria del dengue7, por lo que se esperaría que los casos de DH fueran en aumento
y cada vez más agresivos; también sería de suma importancia un estudio que analizara el
cuadro clínico que presentan los pacientes con infección por dengue y que comparara los
resultados de las pruebas que actualmente se usan como confirmatorias (ELISA), con la
técnica utilizada en este estudio (RT-PCR), ya que se sabe que la prueba de ELISA presenta
reacción cruzada con otros virus que presentan cuadro clínico muy similar a dengue. Además,
de que con la RT-PCR se detecta la enfermedad en los primeros días, evitando así el mal
diagnóstico o pérdida de seguimiento de pacientes.
Por otro lado, debido a la localización del estado (presencia del puerto de Manzanillo)
y al clima proclive para el desarrollo de mosquitos, sería conveniente desarrollar búsqueda de
otras virosis (fiebre del oeste del Nilo, encefalitis japonesa, entre otras) o enfermedades
bacterianas fácilmente confundibles con dengue.
La técnica de RT-PCR ha mostrado ser una herramienta fácil y específica para la
detección temprana de dengue. Es importante que en el estado se implemente esta prueba de
diagnóstico para el adecuado manejo de los pacientes.
46
XII.- BIBLIOGRAFÍA
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50
XIII. ANEXOS
13.1 CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO.
(Para la extracción de una muestra sanguínea para el diagnóstico molecular del virus del
dengue).
El que suscribe ______________________________________________________
(Nombre del paciente o del responsable del paciente en caso de ser menor de edad)
de _____________años de sexo _________________con domicilio en_________________
_________________________________________________________________________
(Calle/ número/ colonia/ municipio)
Por este medio y sin ningún tipo de presión, acepto que se me extraiga una muestra de
sangre, para él diagnóstico de enfermedad por dengue. Se me explica que este procedimiento
se está realizando debido a que Colima es una zona endémica para el dengue, y que se desea
investigar más a fondo esta enfermedad en el estado para tomar nuevas medidas de Salud
Pública o fortalecer las ya establecidas; por lo que se invita a participar a toda persona que
acuda a las instituciones de salud con cuadro febril, para el diagnóstico de enfermedad por
dengue.
De esta misma manera se me ha informado que la extracción de la muestra sanguínea
implica un riego mínimo y que todo el material que se utilizará en el proceso es nuevo y
estéril.
Si posteriormente a la toma de mi muestra surge alguna inquietud de mi parte, en lo
referente a lo que compete al consentimiento que estoy firmando, puedo acudir a esta misma
institución donde se me atenderá sin ningún problema.
Este consentimiento puede ser revocado antes de iniciado el proceso.
ATENTAMENTE: _____________________________
(FIRMA)
51
13.2 COLECCIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO DE L VIRUS DEL
DENGUE6,26.
1. Obtener una muestra de sangre total (4-5 ml) en tubos sin anticoagulante estériles. Puede
ser sangre total con EDTA.
2. Permitir la formación del coágulo sanguíneo a temperatura ambiente, por un lapso de 30
minutos.
3. Colocar la muestra a 4 – 8oC (en el refrigerador o en una cava con hielo normal) hasta su
envío al laboratorio (puede transportarse a temperatura ambiente), en un lapso no mayor de 3
a 4 días después de colectada, preferiblemente no separar el suero si no se realiza en
condiciones de esterilidad.
52
13.3. FORMATO DE RECOLECCIÓN DE DATOS DEL PROCESAMI ENTO DE
MUESTRAS.
FOLIO DE
MUESTRA
FECHA DE
EXTRACCIÓN
RNA
FECHA
DE RT-
PCR
FECHA DE
ELECTROFORESIS
RESULTADO