ex vivo vezava probiotikov na Črevesno … · slika 2: prerez stene tankega ĉrevesa (povzeto po...

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ZOOTEHNIKO

Ljubljana, 2016

Simona ĈAMPA

EX VIVO VEZAVA PROBIOTIKOV NA ČREVESNO SLUZNICO

TANKEGA ČREVESA PRAŠIČEV IN TEKMOVANJE Z E. coli O8:K88

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij

EX VIVO ADHESION OF PROBIOTICS ON THE INTESTINAL

MUCOSA OF THE SMALL INTESTINE OF PIGS AND

COMPETITION WITH E. coli O8:K88

GRADUATION THESIS

University Studies

Ĉampa S. Ex vivo vezava probiotikov na ĉrevesno sluznico tankega ĉrevesa prašiĉev… E. coli O8:K88.

Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za zootehniko, 2016

II

Diplomsko delo je zakljuĉek Univerzitetnega študija kmetijstvo - zootehnika. Opravljeno

je bilo na Katedri za mlekarstvo Oddelka za zootehniko Biotehniške fakultete Univerze v

Ljubljani.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za zootehniko je za mentorico diplomskega dela

imenovala znan. svet. dr. Bojano Bogoviĉ Matijašić in za somentorico dr. Petro Mohar

Lorbeg.

Recenzentka: prof. dr. Irena Rogelj

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: prof. dr. Janez SALOBIR

Ĉlanica: znan svet. dr. Bojana BOGOVIĈ MATIJAŠIĆ

Ĉlanica: dr. Petra MOHAR LORBEG

Ĉlanica: prof. dr. Irena ROGELJ

Datum zagovora:

Podpisana izjavljam, da je diplomsko delo rezultat lastnega raziskovalnega dela. Izjavljam,

da je elektronski izvod identiĉen tiskanemu. Na univerzo neodplaĉno, neizkljuĉno,

prostorsko in ĉasovno neomejeno prenašam pravici shranitve avtorskega dela v elektronski

obliki in reproduciranja ter pravico omogoĉanja javnega dostopa do avtorskega dela na

svetovnem spletu preko Digitalne knjiţnice Biotehniške fakultete.

Simona ĈAMPA



III

KLJUĈNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK UDK 636.4.084/.087:579(043.2)=163.6

KG prašiĉi/prehrana ţivali/krmni dodatki/probiotiki/E. coli O8:K88/vezava ex

vivo/zaviranje patogenov

KK AGRIS L51/5300

AV ĈAMPA, Simona

SA BOGOVIĈ MATIJAŠIĆ, Bojana (mentorica)/MOHAR LORBEG, Petra

(somentorica)

KZ SI-1230 Domţale, Groblje 3

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko

LI 2016

IN EX VIVO VEZAVA PROBIOTIKOV NA ĈREVESNO SLUZNICO TANKEGA

ĈREVESA PRAŠIĈEV IN TEKMOVANJE Z E. coli O8:K88

TD Diplomsko delo (univerzitetni študij)

OP XI, 60 str., 5 pregl., 14 sl., 18 pril., 99 vir.

IJ sl

JI sl/en

AI Z uporabo probiotikov kot krmnih dodatkov je mogoĉe do doloĉene mere prepreĉiti

ali omiliti oz. skrajšati trajanje drisk pri prašiĉih, ki jih povzroĉajo bakterije iz vrste

Escherichia coli. Pri tem igra pomembno vlogo uspešna vezava probiotikov na

ĉrevesno sluznico in sposobnost tekmovanja za vezavo s patogenimi bakterijami.

Namen naše naloge je bil ugotoviti, ali sta se probiotiĉna seva Lactobacillus gasseri

K7 in Lactobacillus gasseri LF221 sposobna vezati na sveţe tkivo ĉrevesne sluznice

prašiĉev (ex vivo) ter tekmovati z Escherichia coli O8:K88 za vezavo v testnih

razmerah tekmovanja, izkljuĉevanja ali izpodrivanja. Rezultati so pokazali, da sta

seva L. gasseri K7 in L. gasseri LF221 sposobna vezave na ĉrevesno sluznico

prašiĉev v razmerah ex vivo. Prav tako so se na ĉrevesno sluznico dobro vezale

bakterije seva E. coli O8:K88. Seva L. gasseri K7 ter L. gasseri LF221 nista

izkazala statistiĉno znaĉilnega vpliva na vezavo E. coli na ĉrevesno sluznico

prašiĉev (ex vivo) v testnih razmerah tekmovanja, izkljuĉevanja ali izpodrivanja.

Rezultati tega dela so koristni s stališĉa morebitne uporabe probiotiĉnih sevov L.

gasseri K7 in LF221 za zaviranje infekcij pri tej vrsti ţivali.



IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Dn

DC UDC 636.4.084/.087:579(043.2)=163.6

CX pigs/animal nutrition/feed additives/probiotics/E. coli O8:K88/ex vivo

adhesion/zaviranje patogenov

CC AGRIS L51/5300

AU ĈAMPA, Simona

AA BOGOVIĈ MATIJAŠIĆ, Bojana (supervisor)/MOHAR LORBEG, Petra (co-

supervisor)

PP SI-1230 Domţale, Groblje 3

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Animal Science

PY 2016

TI EX VIVO ADHESION OF PROBIOTICS ON THE INTESTINAL MUCOSA OF

THE SMALL INTESTINE OF PIGS AND COMPETITION WITH E. coli O8:K88

DT Graduation Thesis (University studies)

NO XI, 60 p., 5 tab., 14 fig., 18 ann., 99 ref.

LA sl

AL sl/en

AB Probiotics as feed additives can to a certain extent prevent, mitigate or shorten the

duration of diarrhea in pigs, caused by bacteria of the species Escherichia coli. An

important role in such activity plays successful adhesion of probiotics on the

intestinal mucosa and their ability to compete with pathogenic bacteria for adhesion

sites. The aim of our study was to examine whether the probiotic strains

Lactobacillus gasseri K7 and Lactobacillus gasseri LF221 are capable of adhesion

to the fresh tissue of the intestinal mucosa of pigs (ex vivo) and compete with

Escherichia coli O8: K88 binding in the test conditions of competition, exclusion or

displacement. The results showed that the strain L. gasseri K7 and L. gasseri LF221

exhibit the ability of adhesion to the intestinal mucosa of piglets in the ex vivo

conditions. The successful adhesion of E. coli O8:K88 was also demonstrated.

Strains L. gasseri K7 and L. gasseri LF221, however, were not demonstrated to

exhibit any statistically significant effect on the adhesion of E. coli to porcine

intestinal mucosa (ex vivo) in the test conditions of competition, exclusion or

displacement. The results of this work are beneficial from the standpoint of the

potential use of probiotic strains L. gasseri K7 and LF221 to inhibit infection in this

animal species.



V

KAZALO VSEBINE

str.

Kljuĉna dokumentacijska informacija (KDI) III Key Words Documentation (KWD) IV Kazalo vsebine V Kazalo preglednic VIII Kazalo slik VIII Kazalo prilog IX Okrajšave in simboli XII

1 UVOD 1

2 PREGLED OBJAV 3

2.1 PREBAVILA 3

2.2 MIKROBIOTA PREBAVNEGA TRAKTA 10

2.2.1 Razvoj mikrobiote pri prašičih 13

2.3 PROBIOTIKI 14

2.3.1 Definicija 14

2.3.2 Zgodovina probiotikov 14

2.3.3 Pogoji, uporaba probiotikov 15

2.3.4 Probiotiki za živali 16

2.3.5 Zakonodaja o krmnih dodatkih 18

2.3.6 Načini delovanja probiotikov in probiotičnih krmnih dodatkov 19

2.3.6.1 Kompetitivno izkljuĉevanje 19

2.3.6.1.1 Vezava na steno prebavnega trakta z namenom prepreĉevanja

kolonizacije s patogenimi mikroorganizmi 20

2.3.6.1.2 Tekmovanje s patogenimi bakterijami za hranila v ĉrevesju 20

2.3.6.2 Bakterijski antagonizem 21

2.3.6.3 Imunska modulacija 21

2.4 LACTOBACILLUS GASEERI LF221 in LACTOBACILLUS GASEERI

K7 22

2.5 ESCHERICHIA COLI 23

2.6 RAZISKOVANJE FUNKCIONALNIH LASTNOSTI

PROBIOTIKOV 24

2.7 PROBIOTIKI KOT NADOMESTILO ZA ANTIBIOTIKE 24

3 MATERIAL IN METODE 26

3.1 IZVEDBA POSKUSA 26

3.1.1 Poskusne živali 26

3.1.2 Potek poskusa 26

3.1.2.1 Potek dela 26

3.2 MATERIAL 27

3.2.1 Črevesna sluznica iz tankega črevesa 27

3.2.2 Bakterijski sevi 27

3.2.3 Gojišča 27

3.2.3.1 Trda gojišĉa 27

3.2.3.2 Tekoĉa gojišĉa in diluenti 27



VI

3.3 METODE 28

3.3.1 Obdelava kontrolnih vzorcev črevesne sluznice 28

3.3.2 Optimiziranje protokola vezave bakterij – spiranje nevezanih

bakterij 29

3.3.3 Priprava standardiziranih bakterijskih suspenzij 30

3.3.4 Priprava črevesnega tkiva 31

3.3.5 Vezava ali adhezija 32

3.3.6 Spiranje 33

3.3.7 Homogeniziranje 33

3.3.8 Razredčitve in nacepitve na komercialni selektivni gojišči 33

3.3.9 Barvanje po Gramu 33

3.4 STATISTIĈNA OBDELAVA PODATKOV 34

3.4.1 Statistični model 34

4 REZULTATI 35

4.1 REZULTATI MIKROSKOPIRANJA ĈREVESNE SLUZNICE S

PRIPETIMI TESTNIMI LAKTOBACILI 35

4.2 REZULTATI KONTROLE SPIRANJA VZORCEV (VZOREC »0«) 36

4.3 NAĈIN SPIRANJA (PO ADHEZIJI) 37

4.4 PRIMERJAVA MED KONCENTRACIJO SUSPENZIJE IN

VEZANIMI CELICAMI 38

4.5 VEZAVA 39

5 RAZPRAVA IN SKLEPI 44

6 POVZETEK 50

7 VIRI 52

ZAHVALA

PRILOGE



VII

KAZALO PREGLEDNIC

str.

Preglednica 1: pH vrednosti razliĉnih predelov prašiĉjega prebavnega trakta

(Ewing, 2008) 5

Preglednica 2: Probiotiki, obiĉajni v ţivalski prehrani (Yirga, 2015) 17

Preglednica 3: Razlike v kemiĉni zgradbi celiĉne stene po Gramu pozitivnih in

negativnih bakterij 34

Preglednica 4: Kontrola izpiranja prvotne mikrobiote iz košĉkov jejunuma

(vzorec niĉ »0«) 36

Preglednica 5: Povpreĉne koncentracije suspenzij E. coli, ter sevov K7 in LF221

(log KE/ml) v posameznih poskusih celotne naloge, izraţene v

logaritemskih vrednostih 39



VIII

KAZALO SLIK

str.

Slika 1: Prebavni sistem prašiĉa (povzeto po Oregon state University, 2004) Ошибка!

Закладка не определена.

Slika 2: Prerez stene tankega ĉrevesa (povzeto po Histologija tankega ĉrevesa,

2016) 6

Slika 3: Ĉrevesna resica in mikroresice (povzeto po Resica-zgradba, 2016) 8

Slika 4: MO prebavnega trakta (povzeto po Mikroorganizmi prebavil, 2016) 11

Slika 5: Mikrobiološke interakcije v ĉrevesju (povzeto po Yirga, 2015) 19

Slika 6: Kopiĉenje nepatogenih bakterij na patogene (povzeto po Ewing in Cole,

1994) 20

Slika 7: Nepatogene in patogene bakterije pogosto tekmujejo za hranila (povzeto

po Ewing in Cole, 1994) 21

Slika 8: Mikroskopski preparati (a-f) ĉrevesne sluznice s pripetimi laktobacili

(L. gasseri K7), pripravljeni z barvanjem po Gramu. Celice laktobacilov

so obarvane vijoliĉno, celice enterocitov pa sivo - rumeno 36

Slika 9: Vpliv postopka spiranja 37

Slika 10: Primerjava koncentracije laktobacilov v suspenziji s številom vezanih

laktobacilov 38

Slika 11: Vezava L. gasseri K7 na tanko ĉrevo prašiĉev pri razliĉni zaĉetni

koncentraciji 39

Slika 12: Vezava L. gasseri LF221na tanko ĉrevo prašiĉev pri razliĉni zaĉetni

koncentraciji 41

Slika 13: Zaviranje vezave E. coli, na ĉrevesno sluznico tankega ĉrevesa prašiĉev,

z L.gasseri K7, pri razliĉnih koncentracijah dodane suspenzije E. coli,

pod pogoji izkljuĉevanja (K7/Ec), izpodrivanja (Ec/K7) in tekmovanja

(K7+Ec) 42

Slika 14: Zaviranje vezave E. coli na ĉrevesno sluznico tankega ĉrevesa prašiĉev

z L. gasseri LF221, pri razliĉnih koncentracijah dodane suspenzije E.

coli, pod pogoji izkljuĉevanja (LF/Ec), izpodrivanja (Ec/LF) in

tekmovanja (LF+Ec) 43



IX

KAZALO PRILOG

Priloga A: Vpliv poskusa in vpliv skupine v modelu (Laktobacili) - preglednica

ANOVA, metoda najmanjših kvadratov.

Priloga B: P - vrednosti za posamezne vplive modela (log Lb.).

Priloga C: Vpliv poskusa in skupine v modelu (E. coli) - preglednica ANOVA,

metoda najmanjših kvadratov.

Priloga D: P - vrednosti za posamezne vplive modela (log E. coli).

Priloga E: Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi skupin vezane E. coli in

p-vrednosti za vpliv skupin, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov.

Priloga F: Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi skupin vezanih

laktobacilov K7 oz. LF221 in p-vrednosti za vpliv skupin, pridobljeni z

metodo najmanjših kvadratov.

Priloga G: Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi skupin vezane E. coli in

p-vrednosti za vpliv skupin, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov.

Priloga H: Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi skupin vezanih

laktobacilov K7 oz. LF221 in p-vrednosti za vpliv skupin, pridobljeni z

metodo najmanjših kvadratov.

Priloga I: Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezane E. coli in

njihove p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in skupino v prvem

poskusu, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov.

Priloga J: Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi skupin vezanih

laktobacilov K7 oz. LF221 in p-vrednosti za vpliv interakcije med

poskusom in skupino v prvem poskusu, pridobljeni z metodo najmanjših

kvadratov.

Priloga K: Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezanih laktobacilov K7

oz. LF221 in njihove p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in

skupino v drugem poskusu, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov.

Priloga L: Razlika med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezane E. coli in

njihove p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in skupino v tretjem


Priloga

M:

Razlika med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezanih laktobacilov K7


skupino v tretjem poskusu, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov.

Priloga N: Razlika med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezane E. coli in

njihove p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in skupino v

ĉetrtem poskusu, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov.



X

Priloga O: Razlika med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezanih laktobacilov K7


skupino v ĉetrtem poskusu, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov.

Priloga P: Razlika med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezane E. coli in

njihove p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in skupino v petem


Priloga R: Razlika med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezanih laktobacilov K7


skupino v petem poskusu, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov.

Priloga S: Kontrola izpiranja prvotne mikrobiote iz košĉkov jejunuma (vzorec niĉ

»0«).



XI

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

MKB mleĉnokislinske bakterije

SCAN Scientific Comittee of Animal Nutrition

GRAS Generally regarded as safe

MO mikroorganizmi

IML-PRO Inštitut za mlekarstvo in probiotike

EMB gojišĉe, ki vsebuje eozin, metilensko modro, laktozo in saharozo

MRS gojišĉe po de Man, Rogosa in Sharpe

PBS fosfatni pufer s soljo

NaCl natrijev klorid

Na2HPO4 di-natrijev-hidrogen-fosfat-anhidrid

KH2PO4 kalijev dihidrogen fosfat

H2O voda

L. rod Lactobacillus

LF Lactobacillus gasseri LF221

K7 Lactobacillus gasseri K7

Ec Escherichia coli O8:K88

SD standardna deviacija

KE/ml število kolonijskih enot v 1 mililitru

KE/g število kolonijskih enot v 1 g vsebine

FAO Organizacija zdruţenih narodov za prehrano in kmetijstvo

(Food and Agricultural Organization of the United Nations)

WHO Svetovna zdravstvena organizacija (World Health Organization)

Pos.1 poskus 1



1

1 UVOD

Probiotiki so ţivi mikroorganizmi (MO), ki ob zauţitju v zadostni koliĉini pozitivno

delujejo na zdravje gostitelja (FAO/WHO, 2001). Tako delujejo bodisi neposredno, ali pa

posredno z okrepitvijo fizioloških oz. obrambnih mehanizmov.

Probiotiki se vedno bolj uporabljajo v ţivinorejski dejavnosti. Pospešena proizvodnja

namreĉ povzroĉa rušenje bakterijskega ravnovesja v prebavilih proizvodnih ţivali in

poslediĉno ĉrevesna obolenja pri teh. Sledi neuĉinkovita prebava in absorpcija hranil, nato

pa slabši proizvodni rezultati. Do nedavnega so se kot krmni dodatki, ki so zmanjšali pojav

drisk in izboljšali konverzijo krme, ter s tem poveĉali prirast ţivali, mnoţiĉno in

nekontrolirano uporabljali antibiotiki. Njihovi ostanki v ţivalskih proizvodih prispevajo k

širjenju proti antibiotikom odpornih mikroorganizmov, kar predstavlja tveganje za zdravje

potrošnikov. V Evropski uniji so leta 2006 uvedli popolno prepoved uporabe antibiotikov

kot krmnih dodatkov (Cho in sod., 2011). Probiotiki predstavljajo moţno alternativo

antibiotikom. Potrebno pa je še veliko pojasniti glede uĉinkovitosti in osnovnih

mehanizmov njihovega delovanja. Uspešen probiotiĉni sev mora ustrezati številnim

zahtevam. Med najpomembnejšimi sta sposobnost preţivetja v prebavnem traktu in

tekmovanja s preostalo ĉrevesno mikrobioto, seveda pa tudi varnost. V ĉrevesju se

bakterijam uspe zadrţati in delovati le, ĉe se razrašĉajo hitreje, kot pa poteka sama

peristaltika ĉrevesja, ali pa ĉe se veţejo na epitelne celice ĉrevesja (Fuller in Cole, 1988).

Sposobnost vezave probiotikov na ĉrevesno sluznico, ter uspešno tekmovanje za vezna

mesta na ĉrevesni sluznici oz. prepreĉevanje vezave predstavnikov Escherichia coli (E.

coli, ki so najpogostejši povzroĉitelji drisk pri prašiĉih, so torej pomembni kriteriji za

izbiro probiotiĉnih sevov.

Osnovni namen diplomske naloge je bil prouĉiti sposobnost vezave humanih izolatov

Lactobacillus gasseri K7 in Lactobacillus gasseri LF221 na ĉrevesno sluznico prašiĉev ter

sposobnost vezave oz. inhibicije vezave E. coli O8:K88 na ĉrevesno sluznico prašiĉev (ex

vivo). Z obema obravnavanima probiotikoma so bili predhodno uspešno opravljeni ţe

številni testi in vitro ter in vivo.

Testiranje probiotiĉnih sevov oziroma izolatov je nujen in dolgotrajen proces, pri katerem

lahko uporabimo razliĉne pristope in vitro, ex vivo in in vivo. Rezultati pomagajo pri

odkrivanju dejanskega dogajanja v prebavilih.

Cilji naloge:

Ugotoviti, ali sta se seva L. gasseri LF221 in L. gasseri K7 sposobna vezati na

ĉrevesno sluznico prašiĉev.

Ugotoviti sposobnost vezave seva E. coli O8:K88 na ĉrevesno sluznico prašiĉev.

Ugotoviti, ali pride do tekmovanja, izkljuĉevanja ali izpodrivanja E. coli O8:K88 s

strani laktobacilov.



2

Hipoteze:

1. Seva L. gasseri K7 in L. gasseri LF221 sta sposobna vezave na ĉrevesno sluznico

(ex vivo).

2. Bakterije seva E. coli O8:K88 so se sposobne vezati na ĉrevesno sluznico prašiĉev

(ex vivo).

3. Seva L. gasseri K7 ter L. gasseri LF221 bosta uspešno tekmovala z Escherichia

coli za vezavo na ĉrevesno sluznico v razliĉnih testnih razmerah (tekmovanje,

izkljuĉevanje, izpodrivanje).



3

2 PREGLED OBJAV

2.1 PREBAVILA

Prebavila oziroma prebavni sistem predstavlja dolga prebavna cev (tractus alimentarius),

ki sega od ustne odprtine do zadnjika (anus). Prebavna cev sestoji iz treh plasti: sluznice

(tunica mucosa), ţlezno mišiĉne plasti (tunica muscularis) in vezivnotkivne ali serozne

opne (tunica serosa). Dele prebavne cevi izven seroznih open obdaja rahlo vezivno tkivo

(tunica adventitija) (Rebesko, 1983).

Notranjost prebavne cevi obdaja sluznica, ki v bliţini telesnih odprtin prehaja v zunanjo

koţo. V ustni votlini, poţiralniku in predţelodcih preţvekovalcev, kjer je sluznica

izpostavljena moĉnejšim mehaniĉnim vplivom, ta prevzame nekatere lastnosti koţe, zaradi

ĉesar se tudi imenuje koţna ali kutana sluznica. Ta je zaradi slinske in sluzne ţleze vlaţna

in spolzka, je brez ţlez in zgrajena iz veĉplastnega epitela, ki leţi na papilarni osnovi. Na

moĉno izpostavljenih mestih vrhnji epitel oroţeni (Rebesko, 1983).

Ĉrevesna sluznica prebavnega trakta je v stalnem stiku z vsebino ĉrevesja. Predstavlja

povezavo med metabolizmom ţivali in okoljem, zato ima funkcijo ĉrevesne bariere.

Prepreĉuje vdor patogenih bakterij in antigenov v telo in prepreĉuje translokacijo bakterij

iz ĉrevesa v krvni obtok in druga tkiva (Ewing in Cole, 1994; Kocijanĉiĉ in sod., 2005;

Petroviĉ in Zorc, 2005; Zorc in sod., 2006).

Plasti ĉrevesne stene so enakomerno pretkane s kolagenskimi vlakni, ki se med seboj

škarjasto kriţajo (škarjasta mreţa). Ta mreţa se premika s pomoĉjo mišiĉnih trakcev

mišiĉne opne (tunika muskularis), ki so v njo vrinjeni, kar je za motoriĉno delovanje

ĉrevesja (peristaltika) velikega pomena (Rebesko, 1983).

Prebavila se zaĉenjajo z ustno votlino (cavum oris) in ţrelom (pharynx), ki se nadaljuje v

poţiralnik (oesophagus). Slednji sega do ţelodca (ventriculus seu gaster), v katerega se

izliva. Za ţelodcem se nahaja tanko ĉrevo, ki ga sestavljajo dvanajstnik (duodenum), tešĉe

ĉrevo (jejunum) in kratko vito ĉrevo (ileum). Tanko ĉrevo se izliva v debelo ĉrevo

(intestinum crassum), ki ga sestavljajo slepo ĉrevo (caecum), debelo ĉrevo (colon) in danka

(rectum) (Rebesko, 1983).



4

Slika 1: Prebavni sistem prašiĉa (povzeto po Oregon state University, 2004)

V ustih se hrana preţveĉi. Ţleze slinavke izloĉajo slino, v kateri so voda, mucin, pri

nekaterih rastlinojedih ţivalih in ĉloveku pa še amilaze, ki pomagajo pri razgradnji škroba

v maltozo.

Dobro preţveĉena in napojena hrana potuje po poţiralniku v ţelodec. Prašiĉi, perutnina in

ljudje so nepreţvekovalci in imajo enodelen ţelodec. Zaradi tega se ne zanašajo na

simbiotski odnos z mikrobioto v prebavnem traktu, kot preţvekovalci, pri katerih je to za

preţivetje zelo pomembno. Pri nepreţvekovalcih pa bakterijska populacija prebavnega

trakta hrane ni sposobna razkrojiti in fermentirati v tolikšni meri, da bi razcepila

neprebavljive materiale do snovi, ki jih telo lahko absorbira. Manj raznolika mikrobiota v

primerjavi s preţvekovalci torej pomeni, da imajo nepreţvekovalci manjšo sposobnost

prebavljanja, zato so zanje potrebe po hrani z višjo hranilno vrednostjo nujne. Slabo

kakovostno, revno krmo, ki vsebuje velike koliĉine celuloze, lignina in strukturnih

ogljikovih hidratov, ne izkorišĉajo dobro, zato potrebujejo kakovostnejšo prehrano, sploh

kar se tiĉe vsebnosti aminokislin in vitaminov (Ewing in Cole, 1994).

Ţelodec je organ prebave in skladišĉenja. Pri odraslem prašiĉu je njegova kapaciteta okrog

8 litrov. Ĉeprav je to enodelen ţelodec, ga delimo na štiri poglavitnejše cone (srĉna,

ţelodĉna, pilorusna in poţiralniška). Hormon pilorin v pilorusni regiji stimulira

proizvodnjo ĉrevesnega soka. pH prašiĉjega ţelodca je okrog 2. V konĉni fazi proteazni

encimi v ĉrevesnem soku razcepijo polipeptide v krajše aminokislinske verige. Protein je

konĉno razdeljen na enostavne peptide ali aminokisline. Poţiralniški del ţelodca ne

proizvaja nobenih ţleznih izloĉkov. V poţiralniku so v vseh obdobjih ţivljenja ţivali

prisotni laktobacili (Tannock in Smith, 1970). Tip in število bakterij, še posebej

laktobacilov in streptokokov, je odvisno od njihove sposobnosti vezave in koloniziranja

površine sluznice.

Normalna vrednost pH v ţelodcu prašiĉev je pod 3,5. Takšna vrednost pH ima dvojno

funkcijo: omogoĉa nemoteno delovanje ţelodĉnih encimov in prepreĉuje vdor nezaţelenih



5

mikroorganizmov v tanko ĉrevo. Pri slabo razvitih prebavilih novorojenih prašiĉev za

zadostno zakisanje poskrbijo mleĉnokislinske bakterije, ki mleĉni sladkor (laktozo)

spremenijo v mleĉno kislino in tako ustvarijo ustrezno vrednost pH. Problem nastane

vselej ob spremembi krme. Zadrţevanje te v prebavilih, dokler se encimski sistem tankega

ĉrevesa ne pripravi nanjo, in pa višji pH v ţelodcu omogoĉa razvoj nevarnih patogenih

mikroorganizmov (Bolduan in sod., 1988).

pH ĉrevesja se od ust, preko ţelodca, pa vse do danke moĉno spreminja (Preglednica 1).

Vsebina ţelodca je moĉno kisla zaradi klorovodikovih kislin, proteaz in ţolĉnih soli, ter

lahko doseţe tudi pH 1,5. Vendar pa je pH odraslih ţivali ponavadi okrog 2,5-4,5 (še

posebej pri prašiĉih) in 4,5-7 pri mladih sesnih pujskih. pH ţelodca je v obratnem

sorazmerju z zastopanostjo bakterij. Kadar je koncentracija mikrobov visoka, se poveĉa

fermentacija v lumnu, ĉrevesna prebava (razgradnja krme do oblike, primerne za

absorpcijo) pa se zato odvija kasneje. Visoka zakisanost ţelodca limitira rast

mikroorganizmov (Ewing in Cole, 1994).

pH slepega in debelega ĉrevesa je bolj nevtralen (pH 6-8), zato tu poteka mnogo

mikrobioloških aktivnosti. Višje pH vrednosti bi ĉrevesnim patogenom, npr. E. coli, nudile

ugodne pogoje za prehitro rast (Ewing in Cole, 1994).

Preglednica 1: pH vrednosti razliĉnih predelov prašiĉjega prebavnega trakta (Ewing, 2008)

Podroĉje pH

Ţelodec

Dvanajstnik

Slepo ĉrevo

Ostali predeli debelega ĉrevesa

1,5-6,0

6,0-8,5

6,0-9,0

8,0-9,0

Ĉrevesni kanal (intestinum) sestoji torej iz prednjega, tanjšega dela, to je tanko ĉrevo

(intestinum tenue) in zadnjega, širšega dela, imenovanega debelo ĉrevo (intestinum

crassum). Kanal sega od ţelodĉnega vratarja (pilorusa) do kratkega konĉnega dela,

zadnjika (anus) (Rebesko, 1983).

Tanko ĉrevo je dolg, cevast, zavit organ, ki se priĉne pri ţelodĉnem vratarju (pilorusu) in

konĉa pri ileo-cekalnem delu (vito ĉrevo se tu odpira v debelo ĉrevo). Njegova dolţina pri

odraslem prašiĉu lahko meri tudi nad 20 metrov in zavzema eno tretjino volumna

prebavnega trakta (Ewing, 2008).

Tanko ĉrevo je sestavljeno iz treh delov (slika 1):

dvanajstnika (duodenum), predstavlja zaĉetni, proksimalni del tankega ĉrevesa,

vanj se izlivajo izloĉki trebušne slinavke in ţolĉ jeter,

tešĉega ĉrevesa (jejunum), ki zavzema kar 85% celotne dolţine tankega ĉrevesa,

vitega ĉrevesa (ileum), ki predstavlja konĉni, distalni del tankega ĉrevesa (Ewing,

2008).

Stena tankega ĉrevesa (slika 2) je sestavljena iz štirih plasti (tunik): sluznice (mukoza) in

podsluznice (submukoza), gladko-mišiĉnega sloja (muscularis externa) in seroze (Ewing in

Cole, 1994; Pocajt in Širca, 1997).



6

Slika 2: Prerez stene tankega ĉrevesa (povzeto po Histologija tankega ĉrevesa, 2016)

Mukoza (sluznica) tankega ĉrevesa (slika 2) je sestavljena iz treh slojev: epitelni sloj, rahlo

vezivno tkivo (lamina proprija) in mišiĉna plast sluznice (muscularis mucosae) (Pocajt in

Širca, 1997; Kocijanĉiĉ in sod., 2005; Petroviĉ in Zorc, 2005; Tanko ĉrevo, 2015).

Epitelni sloj ali epitelij (epithelium) je sluznica, ki jo tvorijo enoskladne visokoprizmatske

vpojne celice, imenovane enterociti in gobletove celice. Izloĉajo sluz (mukus), ki šĉiti

epitelij. Mukus med drugimi sestavljajo glikoproteini in imunoglobulini. Vse epitelijske

celice sluznice tankega ĉrevesa nastanejo iz istih izvornih celic, ki so na dnu vdolbinic oz.

Liberkühnovih kript. Ĉrevesni epitelij se nenehno obnavlja, saj se vsak dan odlušĉi in na

novo razvije veĉ kot milijarda epitelijskih celic (Pocajt in Širca, 1997; Kocijanĉiĉ in sod.,

2005; Petroviĉ in Zorc, 2005; Tanko ĉrevo, 2015).

Ĉrevesni epitelij je sluznica z najveĉjo površino, v kateri se usklajeno odvijajo prebava,

absorpcija, endokrine in imunske funkcije. Epitelne celice izloĉajo sluz (mukus), ki šĉiti

prebavni trakt in tudi omogoĉa razliĉnim bakterijam, da se pripenjajo in se tako v ĉrevesju

zadrţijo dalj ĉasa. Te bakterije lahko pomagajo pri razgrajevanju hrane ter sodelujejo pri

vzpostavljanju, delovanju in obnovi imunskega sistema (Kocijanĉiĉ in sod., 2005; Petroviĉ

in Zorc, 2005; Pocajt in Širca, 1997; Tanko ĉrevo, 2015).



7

Lamino proprio je pomembna bariera proti vdoru patogenih bakterij. Tvorijo jo limfociti,

makrofagi in mnoge druge celice, ki so del ĉrevesnega imunskega sistema in sodelujejo pri

imunskem odzivu. V Lamino proprio se skoraj do mišiĉne plasti sluznice med resicami

vdirajo jamice epitelija, imenovane Liberkühnove kripte. Izloĉajo baziĉen ĉrevesni sok, z

veliko koliĉino sluzi in encimov, potrebnih za razgradnjo hrane. Ĉrevesni sok tu izloĉajo

tudi številne ţleze (Pocajt in Širca, 1997; Kocijanĉiĉ in sod., 2005; Petroviĉ in Zorc, 2005).

Sluznica (tunica mucosa) ima zaradi velike površine veliko absorptivno (vsrkovalno in

izloĉevalno) sposobnost. (Kocijanĉiĉ in sod., 2005 in Petroviĉ in Zorc, 2005). To

poveĉanje ji omogoĉajo tri vrste gub, iz katerih je sestavljena:

1) Kerckringove gube (plicae circulares) (Slika 2) so gube, ki potekajo preĉno glede na

luminalno površino tankega ĉrevesa, ter so spiralaste, kroţne oblike. Nahajajo se v

dvanajstniku, najbolj izrazite so v tešĉem in v prednjem delu vitega ĉrevesa, nato se

zniţujejo in proti koncu tega izginejo. S pomoĉjo peristaltike mešajo zauţito hrano,

absorptivno površino pa poveĉajo za 3-krat (Kocijanĉiĉ in sod., 2005; Petroviĉ in Zorc,

2005).

2) Ĉrevesne resice ali vili (villi intestinales) (Slika 3) so izrastki sluznice, visoki okrog 1

mm, ki podobni prstkom segajo daleĉ v lumen ĉrevesa. Absorptivno površino sluznice

poveĉajo za 10-krat. Prekrivajo jih epitelne celice (epitelij), veĉinoma sestavljen iz

absorptivnih enterocitov. Sredino resic zapolnjujejo prepletena ţivĉna vlakna, krvne ţilice,

limfne kapilare, gladke mišiĉne celice in rahlo vezivo z limfociti. Najpogostejše in najvišje

so v zaĉetku dvanajstnika, do konca vitega ĉrevesa se postopoma skrajšajo, razredĉijo in

tako zmanjšajo tudi površino resic (Kocijanĉiĉ in sod., 2005; Petroviĉ in Zorc, 2005). Na

velikost resic vplivajo prehrana, starost in vrsta ţivali, ter izloĉki ţelodca, trebušne

slinavke in jeter. Dokazano je, da se prašiĉem po odstavitvi zaradi stresa resice skrajšajo

(Ewing in Cole, 1994), prav tako so zapisi o popolni deformaciji resic in kript pri ĉloveku z

boleznijo imenovano celiakija (Dolinšek in sod., 2006).



8

Slika 3: Ĉrevesna resica in mikroresice (povzeto po Resica-zgradba, 2016)

Pri pujskih so v fetalnem obdobju resice ozke, nepravilnih višin in sorazmerno redke. Prvih

deset dni po rojstvu pa se moĉno poveĉata masa tankega ĉrevesa in masa sluznice. Moĉno

se poveĉujeta tudi premer in dolţina tankega ĉrevesa (Cranwell, 1995). Po pribliţno 14.

dnevu ţivljenja je morfologija tankega ĉrevesa pri pujskih podvrţena velikemu zmanjšanju

mase resic in hkrati poveĉanju širine resic in kanalov kript. Med odstavitvijo pa so

spremembe še veĉje (Cranwell, 1995).

Med resicami so vdolbinice, imenovane Lieberkühnove kripte (glandulae intestinales)

(slika 2). To so cevaste ĉrevesne ţleze, ki izloĉajo baziĉni ĉrevesni sok z veliko sluzi in

encimi, potrebnimi za razgradnjo hrane. Tudi kripte poveĉajo absorpcijsko površino

ĉrevesa. Vsebujejo pri regeneraciji tkiva pomembne ĉrevesne izvorne oz. matiĉne celice, ki

so osnova za nastanek razliĉnih vrst epitelijskih celic (enterocitov, ĉašastih celic,

enteroendokrinih celic) (Pocajt in Širca, 1997; Kocijanĉiĉ in sod., 2005; Petroviĉ in Zorc,

2005; Tanko ĉrevo, 2015; The Histology Guide, 2016).

3) Mikroresice ali mikrovili (Slika 3) se nahajajo na epitelijskih celicah oz. enterocitih

resic. Vsaka celica ima od 3000 do 7000 mikroresic. Absorptivno površino tankega ĉrevesa

poveĉajo za 20-krat. Dolge so pribliţno 1 µm, njihov premer pa je 0,1 µm. Prekriva jih

posebna plazemska membrana, kjer so prisotni tudi glavni sluzniĉni prebavni encimi (npr.

aminopeptidaze, lipaze, disaharidaze) (Kocijanĉiĉ in sod., 2005; Petroviĉ in Zorc, 2005,

The Histology Guide, 2016).

Submukozo (Slika 2) sestavljajo vezivno tkivo, krvne in limfne ţile, ţivci, ţivĉni vozli,

lahko tudi mašĉobne celice. Tu so Brunnerjeve ţleze, ki izloĉajo viskozno tekoĉino, ki šĉiti

proksimalni del tankega ĉrevesa in nevtralizira kislo vsebino, ki pride iz ţelodca

(Kocijanĉiĉ in sod., 2005; Petroviĉ in Zorc, 2005).



9

Mišiĉni sloj (Slika 2) je iz vzdolţne in kroţne mišiĉnine. Te mišice omogoĉajo

peristaltiĉno gibanje ob procesu prebave, saj se ritmiĉno krĉijo. Medtem ko vzdolţna

mišiĉnina s krĉenjem prestavlja vsebino ĉrevesa naprej proti debelemu ĉrevesu, kroţna

mišiĉnina omogoĉa stik s sluznico ter meša ĉrevesno vsebino s prebavnimi sokovi

(Petroviĉ in Zorc, 2005; Pocajt in Širca, 1997).

Seroza (Slika 2) sestoji iz plošĉatega epitelija na zunanji strani tankega ĉrevesa. Razen

proti koncu dvanajsternika, je sicer prisotna po vsej dolţini tankega ĉrevesa (Petroviĉ in

Zorc, 2005).

Ko delno prebavljena hrana prispe v tanko ĉrevo, se tu izvrši pomemben, dokonĉen del

prebave. Razgradnja krme poteka s pomoĉjo ţolĉa, izloĉkov trebušne slinavke in

dvanajstnika. Ogljikovi hidrati in mašĉobe se cepijo na osnovne sestavne dele, ki jih stena

tankega ĉrevesa absorbira, nato potujejo do jeter in kasneje v krvni obtok. Pomembna je

mikrobna fermentacija (tako pri monogastriĉnih ţivalih, še bolj pa pri preţvekovalcih) in

proizvodnja encimov ter hormonov. Številĉnost mikrobiote proti debelemu ĉrevesu

narašĉa. Tu poteka glavni del absorpcije konĉnih produktov prebavnih procesov.

Absorpcija pa poteka laţje zaradi resic (Ewing in Cole, 1994).

Glavne fiziološke naloge tankega ĉrevesa so torej prebava hrane in absorpcija hranil,

elektrolitov in vode, pomembne pa so tudi metabolna, endokrina (tvorba hormonov),

imunska (obramba pred bakterijami, endotoksini in antigeni), ţivĉna (tvorba

nevrotransmiterjev) in sekretorna dejavnost (Kocijanĉiĉ in sod., 2005; Ross in sod., 2004;

Ovejero in Negri, 1993).

Debelo ĉrevo

Debelo ĉrevo je sestavljeno iz slepega ĉrevesa (caecum), debelega ĉrevesa (kolon), danke

(rektum) in anusa.

Debelo ĉrevo nima resic, ima pa tankemu ĉrevesu podobno histološko zgradbo, vendar

debelejšo sluznico z globljimi kriptami. Epitelij ne vsebuje Panethovih celic, katerih

funkcija v tankem ĉrevesu je tudi zašĉita izvornih celic, protimikrobno delovanje in

vzdrţevanje ĉrevesne intestinalne pregrade. Je pa epitelij debelega ĉrevesa zgrajen iz

kolumnarnih absorptivnih (vpojnih) celic s progastimi mejami, veliko gobletovih (ĉašastih)

in endokrinih celic, in pa matiĉnih celic, toda ne Panethovih. Površinske epitelne celice so

obrnjene v lumen in se tedensko obnavljajo. Lamina proprija in submukoza sta podobni kot

v tankem ĉrevesu. Zunanji mišiĉni sloj debelega ĉrevesa je iz treh vzdolţnih plasti gladkih

mišic, pri anusu pa kroţne mišice tvorijo analni sfingter (The Histology Guide, 2016;

Ewing, 2008).

Dokonĉen razkroj hrane v debelem ĉrevesu omogoĉa veĉ milijard tu ţiveĉih bakterij. Pri

tem nastajajo plini ogljikov dioksid, vodik, vodikov sulfid in metan. Sluznica v debelem

ĉrevesu izloĉa sluz, ki maţe iztrebke in jim lajša pot, protitelesca v njej pa organizem

šĉitijo pred bakterijskimi okuţbami. Ne izloĉa pa prebavnih sokov in encimov, saj je



10

prebava hrane tukaj ţe konĉana, dokonĉna razgradnja neprebavljenih sestavin pa je

odvisna od bakterij (Rebesko, 1983; Ĉerne, 1996; Petroviĉ in Zorc, 2005; McDonald in

sod., 2010).

Funkcije debelega ĉrevesa so resorpcija vode, natrija in nekaterih vitaminov, iz kaše,

katera prihaja iz tankega ĉrevesa, pa mora tvoriti iztrebke, ter vse do izpraznitve zadrţevati

blato (McDonald in sod., 2010).

2.2 MIKROBIOTA PREBAVNEGA TRAKTA

Ĉrevesna mikrobiota vsebuje raznolike mikroorganizme, ki naseljujejo prebavila. Sem

spadajo poleg bakterij tudi virusi, glive in arheje, ki so prav tako obiĉajni prebivalci

ĉrevesja (Quigley, 2013).

Mikrobiota predstavlja enega izmed najbolj izpopolnjenih mikrobnih ekosistemov. Pri

vsakem posamezniku je mikrobiota stabilna in zanj specifiĉna. Število mikroorganizmov

narašĉa vzdolţ prebavne poti. Pri zdravem osebku prevladujejo zdravju koristni

mikroorganizmi, prisotnih pa je tudi nekaj patogenov (Rajilić Stojanović in de Vos, 2014;

Qin in sod., 2010; Ley in sod., 2006).

Študij ĉrevesne ekologije je postal eden najbolj atraktivnih. Sodobne, molekularno

genetske metode odkrivajo tudi tiste vrste, ki jih s klasiĉnimi mikrobiološkimi metodami ni

bilo moţno videti (Scheinbach, 1998; Dunne in sod., 2001). Pri ĉloveku je znanih ĉez 1000

razliĉnih filotipov ĉrevesnih bakterij, od katerih je veĉji del striktnih anaerobov (Qin in

sod., 2010; Rajilić Stojanović in de Vos, 2014). Mikrobna populacija prebavnega trakta je

zelo dobro prilagojena na okolje gostitelja, med posamezniki in razliĉnimi starostnimi

skupinami pa se zelo razlikuje. Vsaka sprememba v mikrobnem ravnoteţju lahko povzroĉi

preobrat iz koristnega v škodljivo delovanje (saj mikrobiota prispeva tako k homeostazi

zdravja, kot patogenezi bolezni (Quigley, 2013).

Bakterije vstopajo v telo skozi ustno votlino in nadaljujejo pot po prebavnem traktu. V

ţelodcu jih veĉinoma uniĉi ţelodĉni sok, zato jih ostane le malo, najpogosteje po Gramu

pozitivne fakultativno anaerobne bakterije, npr. Streptococcus, Staphylococcus in

Lactobacillus. Podobna, vendar številĉnejša je nato populacija bakterij v tankem ĉrevesu

(dvanajstnik in tešĉe ĉrevo). Najveĉ je po Gramu pozitivnih aerobov, nekaj pa je tudi

koliformnih in anaerobnih bakterij (Goldin in sod., 1988).

Bakterije so prokariotski organizmi. Se hitro namnoţujejo (npr. generacijski ĉas bakterije

E. coli je v ugodnih pogojih 15-20 minut), zaradi svoje majhnosti pa so izredno

prilagodljive. Lahko so sferiĉne, paliĉaste ali zavite oblike, glede na delitev nastanejo tudi

pari (diplokoki), grozdasti skupki (stafilokoki), veriţice (streptokoki, streptobacili) ali

paketi po 4 do 8 celic (sarcine) (Smole-Moţina in Marić, 1992). Bakterije se glede na

razlike v zgradbi celiĉne stene, ki jih ugotovimo z diferencialnim barvanjem po Gramu,

delijo v dve veliki skupini: po Gramu pozitivne (G+) in po Gramu negativne (G-

).



11

Naseljenost z mikrobioto v prebavnem traktu ĉloveka, ki je zelo podoben prašiĉjemu,

narašĉa od zelo redko naseljenega ţelodca, prek dvanajstnika in tankega ĉrevesa do obilno

naseljenega debelega ĉrevesa. Tekom ţivljenja sta število in sestava bakterijske zdruţbe

vzdolţ prebavil spremenljiva. Skupno število bakterij v ţelodcu je obiĉajno pod 104

kolonijskih enot /g vsebine (CFU/g; colony forming units), od tega je število bifidobakterij

(BF) do 102

CFU/g, laktobacilov (LB) do 103

CFU/g. Vzrok nizkemu številu je kisla

vsebina (Goldin in sod., 1988; Teskaĉ in sod., 2008; Medigan in Martinko, 2005).

V tankem ĉrevesu najdemo razliĉno veliko bakterij glede na predel. Do 104 KE/ml vsebine

jih je v zaĉetnem delu, do 105 KE/g v jejunumu, sledi ileum z 10

4-10

9 CFU/g bakterij.

Glavni omejitveni dejavnik za poselitev bakterij v tankem ĉrevesu je hiter prehod hrane, ter

izloĉki ţolĉa in pankreasnih encimov (Goldin in sod., 1988; Teskaĉ in sod., 2008; Medigan

in Martinko, 2005).

Debelo ĉrevo je precej gosteje poseljen mikrobni ekosistem. Gram vsebine vsebuje od 109

do 1012

KE bakterij. Prevladujejo anaerobne bakterije, ki jih je veliko veĉ kot aerobnih.

Koliĉinsko sta tako pri ţivalih kot pri ĉloveku najpomembnejši skupini Bacteroides (do

30%) in bifidobakterije (do 25%). Številĉno prevladujejo po Gramu negativne vrste

Bacteroides (npr. Bacteroides ovatus, Bacteroides fragilis in Bacteroides

thetaiotaomicron). V tem rodu so tako proteolitiĉne kot saharolitiĉne vrste. Najštevilĉnejše

anaerobne bakterije so predstavnice Bacteroides, Bifidobacterium, Fusobacterium,

Clostridium, Eubacterium, Peptococcus in Peptostreptococcus. V manjšem obsegu so

prisotne še številne druge vrste (Goldin in sod., 1988; Teskaĉ in sod., 2008).

Slika 4: MO prebavnega trakta (povzeto po Mikroorganizmi prebavil, 2016)

Nekateri mikroorganizmi rastejo na površini resic (epitelija), drugi ţivijo prosto v lumnu

ĉrevesja, tretji pa se razrašĉajo po kanalih kript in po epiteliju. V vsakem posamezniku se

vzpostavi znaĉilna zdruţba bakterij, ki so med seboj v ravnovesju. Za to ravnovesje skrbi



12

stalna selekcija s snovmi okolja prebavil, kot npr. vodikov sulfid, hlapljive mašĉobne in

ţolĉne kisline, lizolecitin, lizocin in imunoglobini. Razen tega se morajo bakterije

spopadati še s konstantnim peristaltiĉnim gibanjem hrane iz prednjih delov ĉrevesja proti

zadnjim. V ĉrevesju jim uspe ostati, ĉe se razrašĉajo hitreje, kot poteka sama peristaltika

ĉrevesja, ali ĉe se veţejo na epitelne celice ĉrevesja (Fuller in Cole, 1988).

Pri mleĉnokislinskih bakterijah, vkljuĉno z bifidobakterijami, je bilo dokazano, da lahko

ovirajo vezavo in/ali invazijo patogenov na ĉrevesnih epitelnih celicah. Vezava je prvi

pogoj za kolonizacijo gastrointestinalne ĉrevesne sluznice, zaviranje vezave pa je lastnost,

ki lahko pomaga prepreĉiti ali zmanjšati infekcijo (Bogoviĉ Matijašić in sod., 2006).

Mikroorganizmi, ki naseljujejo sluznico, predstavljajo uĉinkovito oviro za patogene

bakterije, saj zasedajo mesta pripenjanja in s tem prepreĉujejo njihovo vezavo na sluz ali

ĉrevesne epitelne celice, proizvajajo protimikrobne snovi in tekmujejo s patogenimi

bakterijami za hranilne snovi (Vaughan in sod., 1999). Raziskave kaţejo, da tudi

uravnavajo homeostazo gostiteljevih obrambnih mehanizmov, ter da obstaja komunikacija

med mikroorganizmi, ĉrevesnimi epitelnimi celicami in imunskimi celicami.

Bakterije, ki prebivajo na površini ali v notranjosti sluznice, sodelujejo v interakcijah z

imunskim sistemom gostiteljice, medtem ko so tiste, ki prosto zapolnjujejo lumen,

dejavnejše pri presnovi hrane in interakcijah s presnovki. Ţivijo v soţitju z gostiteljem in

korist je obojestranska. Ni dvomov o tem, da imajo velik pomen pri ohranjanju zdravja in

razvoju bolezni. Problem pri raziskovanju predstavlja nedostopnost populacij v tankem in

debelem ĉrevesu, zato je bila veĉina raziskav ĉrevesne mikrobiote narejena na podlagi

fekalnih vzorcev, kar pa predstavlja veliko omejitev, saj ne pokaţe popolne slike dogajanja

v ĉrevesju (Carroll in sod., Chang, Y. H., Packey, C. D., Sartor, E. B., Ringel Y. 2011;

Swidsinski in sod., 2005; Quigley, 2013).

Mikrobioti v prebavilih pripisujemo vrsto uĉinkov na gostitelja, med katerimi so

najpomembnejši naslednji:

uĉinkovanje na bakterije v prebavilih s kislinami (mleĉna, ocetna, maslena,

propionska kislina) in vodikovim peroksidom protimikrobnimi snovmi

(bakteriocini in drugimi), ki jih izloĉajo,

tekmovanje s patogenimi mikrobi za vezna mesta na sluznicah (npr. E. coli s K88

antigenom),

tekmovanje za hranila,

spodbujanje imunskega sistema,

vpliv na imunski sistem.

Vsaka sprememba v mikrobnem ravnoteţju lahko povzroĉi preobrat iz koristnega v

škodljivo delovanje. Do škodljivega delovanja pa privede tudi prehajanje bakterij skozi

sluznico ĉrevesja ob nepravilnem delovanju sluzniĉne ovire. Dokazi na ţivalih kaţejo, da

so vzroki za prehajanje poveĉana prepustnost ĉrevesne sluznice, prehitra rast bakterij v

tankem ĉrevesu in nepravilnosti v imunski zašĉiti gostitelja. Ţivi MO, ki z limfo pridejo v

notranje organe, npr. jetra, se lahko razširijo po vsem telesu in povzroĉijo sepso, odpoved

organov, šok ali smrt. Ciroza jeter, pankreatitis, ĉrevesna vnetja in ĉrevesno zaprtje so



13

bolezni, pri katerih prihaja do poveĉanega prehajanja bakterij (Guarner in Malagelada,

2003).

Na sestavo in delovanje mikroorganizmov torej vplivajo gostitelj, bakterijski dejavniki in

okolje. Vlogo mikrobiote, ki jo lahko smatramo kar za organ, pri vzdrţevanju zdravja

oziroma razvoju bolezni, so v preteklosti podcenjevali. Številna nova dognanja pa kaţejo

na povezave med bolezenskimi stanji in mikrobioto ter odpirajo moţnosti za terapevtsko

uporabo mikroorganizmov, preko spreminjanja mikrobiote (Quigley, 2013; Marchesi in

sod., 2016).

2.2.1 Razvoj mikrobiote pri prašičih

Ob rojstvu je ĉrevesje pujskov sterilno in predstavlja idealen medij za hitro razrast bakterij,

ki jih ţival dobi iz okolja (Maxwell in Stewart, 1995; McDonald in sod., 2010). Ţe po treh

urah je prisotna manjša populacija mikroorganizmov. Pri veĉini ţivali najprej kolonizirajo

ĉrevo nepatogeni sevi vrste Escherichia coli, ter predstavniki rodov Streptococcus in

Lactobacillus. Kasneje, ko aerobne bakterije porabijo kisik, postanejo dominantne

anaerobne bakterije, npr. Clostridium. 10-12 ur po rojstvu vsebuje 1 g blata ţe 108 - 10

9

bakterij. Laktobacili postanejo glavni prebivalci ţelodca in tankega ĉrevesa po prvem

dnevu. Prisotnost Bacteroides sp. je opaţena šele 32 ur po rojstvu, po tem ĉasu pa

predstavljajo najštevilĉnejši deleţ uravnovešene mikrobiote debelega ĉrevesa (Maxwell in

Stewart, 1995).

Novorojeni prašiĉek pridobi mikrobioto v porodnem kanalu, iz bliţnje okolice, glavni vir

pa predstavlja materino blato. Doloĉene bakterije imajo lastnosti, ki jim omogoĉijo dobro

tekmovalnost, zaradi ĉesar njihovo število zelo poraste, tako da predstavljajo glavni del

mikrobiote. Problemi se lahko pojavijo s prisotnostjo patogenih mikroorganizmov, ki pa

motijo razvoj normalne mikrobiote (Maxwell in Stewart, 1995). Škodljive, strupene ali

patogene bakterije, ki kolonizirajo v prebavnem traktu, proizvajajo strupene odpadne

produkte, ti pa vodijo k plinjenju, napenjanju, driski, zaprtju, razjedam ali zastrupitvi s

hrano (FEFANA). S probiotiki lahko na naraven naĉin zajezimo to invazijo patogenov.

Koristni mikroorganizmi proizvajajo encime, ki dopolnjujejo prebavne sposobnosti

gostitelja, njihova prisotnost pa predstavlja oviro pred preplavitvijo patogenov (Yirga,

2015).

Pri prašiĉih poteka glavni del mikrobne prebave v debelem ĉrevesu, kjer sodelujejo

mikroorganizmi. Pred tem prebavni encimi mikrobiota tankega ĉrevesa ţe opravijo svojo

nalogo. Lastno amilazo vsebujejo samo nekatere vrste, npr. Bifidobacterium bifidum,

Streptococus equinus, S. bovis, Clostridium butyricum in Cl. perfingens, medtem ko veĉina

vrst ĉrevesnih bakterij pri prašiĉih razgrajuje monosaharide (fruktozo, glukozo in

galaktozo). Bakterije vrste Cl. butyricum pri prašiĉu predstavljajo glavni izvor alfa-amilaze

v debelem ĉrevesu, v slepem ĉrevesu pa se z njihovo pomoĉjo prebavi surovi škrob. Kuhan

škrob se prebavi ţe v tankem ĉrevesu. Laktobacili in streptokoki fermentirajo maltozo in

maltotriozo do mleĉne kisline iz katere kasneje nastanejo hlapne mašĉobne kisline. Prašiĉ

nima lastnih celulolitiĉnih encimov, zato mikrobiota pomembno prispeva k prebavi hrane

(Ĉerne, 1996).



14

2.3 PROBIOTIKI

2.3.1 Definicija

Izraz probiotik, z današnjim pomenom, je prvi uporabil Parker leta 1974 (cit. po Fuller,

1992). Probiotike je oznaĉil kot organizme in snovi, ki prispevajo k ĉrevesnemu

mikrobnemu ravnoteţju. Izraz je uporabil za opis dodatkov ţivalski krmi, ki pospešujejo

rast. Parkerjevo definicijo je preoblikoval Fuller (2006), ki je opisal probiotike kot ţive

mikrobne dodatke krmi, ki ugodno vplivajo na ţival gostiteljico, z izboljšanjem njenega

ĉrevesnega mikrobnega ravnoteţja. Dolgo je bila definicija omejena samo na uporabo v

ţivalski prehrani.

Razširitev definicije na uporabo v ĉloveški prehrani je prispevala k razvoju in dodajanju

probiotikov na razliĉnih podroĉjih (respiratorni trakt, urogenitalni trakt, koţa). Po Huis in't

Veldu in Havenaarju (1991) se glasi opis probiotikov kot »mono- ali mešanih kultur ţivih

mikroorganizmov, ki uĉinkujejo koristno na ĉloveka in ţival z izboljšanjem lastnosti

obstojeĉe (lastne) mikrobiote«.

Leta 1988 sta Guarner in Schaafsma zapisala, da so to ţivi mikroorganizmi, ki ob zauţitju

ob zadostni koliĉini pozitivno delujejo na zdravje neposredno, ali posredno z okrepitvijo

fizioloških oziroma obrambnih mehanizmov. Kasneje je bil uveden tudi pojem probiotiĉno

aktivna snov, saj so ugotovili, da stimulacija imunskega sistema ni omejena zgolj na ţive

celice, kot je bilo najprej mišljeno, ampak gre za celiĉne komplekse (mrtve celice ali dele

celic) mleĉnokislinskih bakterij ali drugih probiotiĉnih mikroorganizmov, ki tudi vplivajo

na imunski odgovor in na funkcijo ĉrevesne sluznice (Naidu in sod., 1999).

Danes uveljavljena definicija probiotikov, ki sta jo sprejeli tudi organizaciji FAO in WHO,

pravi, da so to ţivi MO, ki ob zauţitju v zadostni koliĉini pozitivno delujejo na zdravje

gostitelja (FAO/WHO, 2001; Hill in sod., 2014).

2.3.2 Zgodovina probiotikov

Uţivanje hrane z mikrobiološko aktivnostjo se je zaĉelo ţe v zaĉetku ĉloveške civilizacije.

Fermentirano mleko je najverjetneje bilo prvo ţivilo, ki je vsebovalo aktivne

mikroorganizme. Znanstvene raziskave o pozitivnih uĉinkih uţivanja fermentiranih

mleĉnih izdelkov pa so se priĉele v zaĉetku 20. stoletja (Jimenez, 2010; Yirga, 2015).

Konec 19. stoletja so bili narejeni zapisi o prvi uporabi mikroorganizma Bacterium terumo.

Te bakterije je Arnold Canani pri zdravljenju pljuĉne tuberkuloze s sprejem neposredno

vnesel v pljuĉa in ugotovil pozitivne uĉinke (Fuller, 1999).

V zaĉetku prejšnjega stoletja so ugotovili, da Bolgari povpreĉno ţivijo dalj ĉasa, kar naj bi

bilo posledica uţivanja jogurta. Nobelov nagrajenec Ilija Metchnikov, ki je takrat deloval

na Pasteurjevem inštitutu v Parizu, je pojasnjeval, da Lactobacillus bulgaricus in

Streptococcus thermophilus iz jogurta izpodrineta ĉrevesne mikrobe, ki proizvajajo toksine



15

(avtointoksikacija). Deloma je bila kasneje trditev ovrţena, saj organizmi iz jogurta v

ĉrevesu ne preţivijo najbolje, okrepilo pa se je prepriĉanje, da je uţivanje teh in drugih

mleĉnokislinskih mikroorganizmov zelo koristno (Fuller, 1999; Jimenez, 2010). Delo

Metchnika je vodilo do sodobnih jogurtov, pridobljenih iz mleka, fermentiranega z

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus in Streptococcus thermophilus (Fuller, 1999).

Danes vemo, da ti dve vrsti ponavadi uporabljajo in sta tipiĉni za jogurte, vendar pa slabo

preţivita.

Japonci so leta 1930 s sevom Lactobacillus casei priĉeli pripravljati limonin mleĉni

napitek Yakult. Ta je petinšestdeset let kasneje prišel tudi na evropsko trţišĉe in je prvi

izmed t.i. funkcionalnih ţivil (Reid, 2015).

Do intenzivnejšega trgovanja s probiotiki je prišlo šele po letu 1960, ko so jih zaĉeli

uporabljati pri farmskih ţivalih. Leta 1968 je King dosegel pomembno poveĉanje rasti pri

prašiĉih z dodajanjem Lactobacillus acidophilus krmi ţivali (Fuller, 1999).

Objave Swann Committee v zvezi z zlorabljanjem antibiotikov v veterinarski praksi in

prireji ţivali leta 1969 so spodbudile nadaljnjo uporabo probiotikov za farmske ţivali.

Predlagano zmanjšanje uporabe antibiotikov v ţivalski prehrani, kjer ti niso uporabljeni v

terapevtske namene, je spodbudilo razvoj probiotikov za ţivali (Fuller, 1999).

Nasprotovanje uporabi antibiotikov je povzroĉala tudi skrb po zmanjšanju njihovih

stranskih uĉinkov, npr. diareji, ki pogosto spremlja tako zdravljenje. Vedeli so tudi, da

antibiotiki sicer lahko zmanjšajo kolonizacijo ĉrevesja pišĉancev s salmonelo, a se ustvari

problem ogroţenosti zdravja ljudi zaradi širjenja rezistence proti antibiotikom med

bakterijami. Pravkar izvaljeni pišĉanĉki so lahko zavarovani pred kolonizacijo salmonele v

ĉrevesju, ĉe jim predhodno dajemo suspenzijo preparata ĉrevesne vsebine zdravih odraslih

pišĉancev. To spoznanje Nurme in Rantala iz leta 1973 je predstavlja naslednji mejnik v

razvoju probiotikov za ţivali (Fuller, 1999).

Podpora probiotikom je prihajala tudi s strani lobijev, usmerjenih proti prekomerni uporabi

aditivov v prehrani, ki so antibiotike videli kot tuje substance, katere ne bi smele biti

prisotne v krmi ţivali, medtem ko so probiotiki predstavniki mikroorganizmov, ki so

naravnoprisotni v favni in v ĉrevesju zdravih ţivali brez kakršnegakoli škodljivega uĉinka

(Fuller, 1999).

V ZDA so Rettger in njegovi sodelavci v prepriĉanju, da je kolonizacija in rast v ĉrevesju

prvi pogoj probiotiĉne aktivnosti, uporabili ĉrevesne izolate vrste L. acidophilus. Vse veĉje

poznavanje ĉrevesne mikrobiote pokazalo, da je mleĉnokislinska mikrobiota ĉrevesja

veliko bolj obseţna in zapletena, kot so vedeli v preteklosti, in zato tudi dopušĉa uporabo

velikega števila razliĉnih rodov mikroorganizmov (Fuller, 1999).

2.3.3 Pogoji, uporaba probiotikov

Probiotiki so mikroorganizmi, ki pomagajo vzpostaviti ĉrevesno mikrobioto ţivali in ljudi

v uravnovešeno stanje (Fuller, 1999). Poznamo bakterijske probiotike, kulture kvasovk in



16

plesni ter kombinirane pripravke. Najpomembnejšo skupino probiotiĉnih bakterij

predstavljajo mleĉnokislinske bakterije (MKB), katere veljajo za varne bakterije (Rogelj in

Bogoviĉ Matijašić, 2004). MKB so prisotne tudi v prebavilih ţivali in ljudi. Sevi, ki so

najpogosteje v probiotiĉnih izdelkih, so predstavniki vrst Lactobacillus acidophilus (na

primer sev La5), L. casei (predvsem sev Shirota), L. rhamnosus (naprimer sev GG),

Bifidobacterium bifidum in Bifidobacterium animalis ssp. lactis (naprimer sev BB12). Za

probiotiĉne lahko razglasimo le tiste seve MKB, pri katerih so bili uĉinki dokazani.

Bakterijski sev, ki ga uporabljamo kot probiotiĉni, mora tekmovati z obstojeĉo mikrobioto

za hranljive snovi, atmosferske potrebe in mesta pripenjanja na ĉrevesni epitelij.

Izbira probiotika vedno temelji na kriterijih, ki vkljuĉujejo varnost in kliniĉne uĉinke.

Potrebno je:

poznati vrsto in lastnosti, ki so povezane z varnostjo (izvor, identifikacija,

karakterizacija, virulenca, invazivnost, rezistenca proti antibiotikom),

prouĉiti farmakokinetiĉne lastnosti seva (preţivetje in aktivnost v ĉrevesu, vezava

in s tem kolonizacija, moţna invazivnost, odnos med odmerkom in uĉinkom),

raziskati interakcije med sevom in gostiteljem (vezava na ĉrevesno tkivo,

selektivna stimulacija koristnih bakterij in zaviranje škodljivih,

stimulacija/supresija imunskega odgovora, kliniĉni stranski uĉinki). Vedno veĉ

pozornosti je namenjeno varnosti probiotikov (FAO/WHO, 2002).

Posebno pozornost pri prouĉevanju varnosti je treba posvetiti enterokokom, ki jih

uporabljajo kot probiotike. Posamezniki tega rodu so namreĉ lahko patogeni, nekateri pa so

tudi sposobni prenesti gene za odpornost proti antibiotikom (vankomicin) na druge

mikroorganizme (Franz in Holzapfel, 2004).

2.3.4 Probiotiki za živali

Probiotike za ţivalih uporabljajo za ponovno vzpostavitev uravnoteţene mikrobiote, ki je

bila prizadeta zaradi razliĉnih negativnih dejavnikov okolja. Bolezni z njimi ni moţno

pozdraviti in prav tako probiotiki niso specifiĉni za posamezno bolezen, kot je to pri

zdravilih, ki jih uporabljajo v veterinarski medicini. Zato probiotikov ne predpisujejo

veterinarji. Delovanje probiotikov na gostitelja vkljuĉuje neposredne uĉinke na mikrobioto,

ali posredne uĉinke, vkljuĉno z nekaterimi, ki se lahko pojavijo znotraj tkiv gostitelja, kot

npr. imunski odgovor (SCAN, 2000; Matsuzaki, 1998; Dunne in sod., 1999). Pri ţivalih je

zanimiva predvsem kontrola moţnih patogenov (Tortuero in sod., 1995), z namenom

prepreĉevanja bolezni in smrti, še posebej pri mladih prašiĉih. Ugodno delovanje mikrobov

se kaţe tudi preko kakovosti ţivalskih proizvodov(Vanbelle, 2001).

Mikroorganizmi, prisotni v probiotikih za ţivali, so izbrani na podlagi raziskav.

Najpogosteje so to predstavniki rodov Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus,

Pediococcus in Enterococcus. Te skupine, skupaj z Bacillus sp., kvasovkami in nitastimi

glivami, so glavne komponente probiotikov, danes splošno uporabljenih pri farmskih

ţivalih. Razliĉni probiotiĉni preparati lahko vsebujejo samo en sev, ali pa vsebujejo mnogo

sevov in imajo tako širši spekter delovanja (Fuller, 1999; Yirga, 2015).



17

Probiotiki, ki se obiĉajno uporabljajo v prehrani ţivali, so prikazani v preglednici 2.

Preglednica 2: Probiotiki, obiĉajni v ţivalski prehrani (Yirga, 2015)

Rod Vrsta

Bifidobacterium B. lactis

B. longum

B. pseudolongum

B. thermophilum

B. bifidum

Enterococcus E. faecalis

Lactobacillus L. acidophilus

L. amylovorus

L. brevis

L. casei

L. farciminis

L. fermentum

L. plantarum

L. reuteri

L. rhamnosus

Lactococcus L. lactis

Leuconostoc L. citreum

L. lactis

L. mesenteroides

Pediococcus P. acidilactici

P. pentosaceus subsp. pentosaceus

Streptococcus S. infantarius

S. salivarius

Bacillus B. cereus

B. licheniformis

B. subtilis

Saccharomyces S. cerevisiae (S. boulardii)

S. pastorianus (S. carlsbergensis)

Aspergillus A. oriza

A. niger

Rod Bifidobacterium taksonomsko sicer ne pripada mleĉnokislinskim bakterijam, vendar

pa ima nekaj sorodnih lastnosti (npr. so po Gramu pozitivne, fermentativne, tvorijo laktat)

in si delijo z MKB iste ekološke niše zato jih pogosto povezujejo. Probiotikom podobne

uĉinke imajo tudi kvasovke (npr. S. boulardii) (Saarela in sod., 2002).

Fuller (2006) je navajal številne potencialne dobrodejne uĉinke probiotikov pri farmskih

ţivalih:

boljša odpornost ţivali proti infekcijskim boleznim,

poveĉan prirast,

izboljšana konverzija krme,

izboljšana prebava,



18

veĉja sposobnost absorpcije hranilnih snovi,

boljša oskrba z esencialnimi hranilnimi snovmi,

poveĉanje mleĉnosti,

izboljšana kakovost mleka,

poveĉana produkcija jajc,

izboljšana kakovost jajc,

izboljšana kakovost klavnih trupov,

manjše onesnaţevanje.

Dejansko so se probiotiki najbolj izkazali pri prepreĉevanju in kot podporna terapija pri

infekcijah s patogenimi mikroorganizmi, kot so E. coli, Salmonella, Campylobacter,

Clostridium in rotavirusi. Tako prispevajo k zmanjšanju uporabe antibiotikov (De

Magalhaes in sod., 2015).

2.3.5 Zakonodaja o krmnih dodatkih

Uredba Evropskega parlamenta in Sveta (ES) št. 1831/2003 o dodatkih za uporabo v

prehrani ţivali 2003 definira krmne dodatke kot snovi, mikroorganizme ali pripravke, ki

niso niti posamiĉna krmila niti premiksi in se namenoma dodajajo krmi ali vodi za ţivali.

V skladu z zgoraj navedeno Uredbo, krmne dodatke razvršĉamo v eno ali veĉ kategorij,

odvisno od njihovih funkcij in lastnosti:

tehnološki dodatki (se dodajajo krmi iz tehnoloških razlogov),

senzoriĉni dodatki (izboljšujejo organoleptiĉne lastnosti krme ali vizualne lastnosti

proizvodov ţivalskega izvora),

nutritivni dodatki (za prehranske namene, na primer vitamini, elementi v sledovih,

aminokisline…),

zootehniški dodatki (ugodno vplivajo na prirejo zdravih ţivali ali na okolje),

kokcidiostatiki in sredstva proti histomonijazi.

To so snovi, ki za nemoteno delovanje ţivalskega organizma sicer niso nujno potrebne,

njihov vpliv pa se kaţe v boljši proizvodnji ţivali. Obiĉajno se uporabljajo v zelo majhnih

koliĉinah. Pri tem morajo biti izpolnjene temeljne zahteve, da ne delujejo škodljivo niti na

ţivalsko telo, niti pozneje na porabnika ţivalskih proizvodov.

V evropskem registru krmnih dodatkov (European Union Register of Feed Additives)

najdemo tudi razliĉne probiotiĉne seve, ki so uvršĉeni v kategorijo zootehniških dodatkov,

funkcionalno skupino stabilizatorjev mikrobiote, ki so opisani kot » mikroorganizmi ali

druge kemijsko definirane snovi, ki imajo, ĉe z njimi krmimo ţivali, ugoden vpliv na

mikrofloro prebavil«.



19

2.3.6 Načini delovanja probiotikov in probiotičnih krmnih dodatkov

Slika 5: Mikrobiološke interakcije v ĉrevesju (povzeto po Yirga, 2015)

Probiotiki v prebavnem traktu s svojim delovanjem zmanjšujejo okuţbe ĉrevesja in

nastanek diareje, zaradi razliĉnih probiotikov z razliĉnimi mehanizmi oz. naĉini delovanja,

pa imajo tudi bolj splošen vpliv (Fuller, 1992; Cho in sod., 2011). Dobro zdravje osebka je

pogojeno z ugodnim mikrobnim ravnovesjem v ĉrevesju. Probiotiki, kot podpora naravni

ĉrevesni mikrobioti, pripomorejo k temu, zato se ţivalim dodajajo v obliki krmnih

dodatkov. Delovanje probiotiĉnih krmnih dodatkov temelji predvsem nakompetitivnem

izkljuĉevanju, bakterijskem antagonizmu in imunski modulaciji (Hughes in Heritage,

2002; Steiner, 2009).

2.3.6.1 Kompetitivno izkljuĉevanje

Kompetitivno izkljuĉevanje temelji na zašĉitni sposobnosti normalne mikrobiote pred

škodljivimi patogeni. Kulture izbranih, koristnih mikroorganizmov, dodanih krmi,

tekmujejo s potencialno škodljivimi bakterijami, pri ĉemer tekmujejo za vezavo na

ĉrevesno sluznico ter porabljajo iste organske substrate (predvsem ogljik in energijo) kot

druge bakterije (Steiner, 2009). Vezava na steno prebavnega trakta lahko sluţi ali

prepreĉitvi naselitve patogenih mikroorganizmov, ali tekmovanju za hranila (Yirga, 2015).



20

2.3.6.1.1 Vezava na steno prebavnega trakta z namenom prepreĉevanja

kolonizacije s patogenimi mikroorganizmi

Škodljive bakterije se morajo najprej pritrditi na ĉrevesno steno, da lahko tam delujejo

(McDonald in sod., 2010). Zato je priĉakovan uĉinek dodajanja probiotikov poveĉanje

kolonizacije koristne mikrobiote v ĉrevesju in poslediĉno zaviranje vezave škodljivih

patogenov na ĉrevesni epitelij, s ĉimer se blokirajo receptorska mesta in je prepreĉena

pritrditev drugih bakterij, vkljuĉno s škodljivimi vrstami (Cho in sod., 2011). S takšnim

ravnanjem probiotiĉne bakterije izkljuĉujejo patogene in jim tako prepreĉijo povzroĉitev

okuţb (Hughes in Heritage, 2002).

Slika 6: Kopiĉenje nepatogenih bakterij na patogene (povzeto po Ewing in Cole, 1994)

Kompetitivno izkljuĉevanje je lahko tudi rezultat vezave nepatogenih bakterij na patogene

v predelih prebavnega pretoka (Slika 6), kar povzroĉi odstranitev patogenov iz ĉrevesja

(Ewing in Cole, 1994).

Kompetitivno izkljuĉevanje je lahko tudi rezultat vezave nepatogenih bakterij na patogene,

posledica zdruţevanja pa prepreĉuje vezavo patogenov na pritrdilna mesta in vodi k

njihovi odstranitvi iz ĉrevesa (slika 6) (The living gut).

Razliĉne študije so pokazale, da je potencial probiotikov zmanjšanje nevarnosti okuţb in

ĉrevesnih obolenj. Prav tako so pokazale, da je bila rast E.coli uspešno zavrta z razliĉnimi

sevi Lactobacillus. Poroĉali so tudi, da je kombinacija razliĉnih mleĉnokislinskih bakterij

bistveno zniţala raven Salmonelle v vsebini slepiĉa pišĉancev, ki so jim oralno dozirali

patogene. Pri prašiĉih je prehransko dopolnilo z Enterococcus faecium zavrlo vezavo E.

coli na epitelij tankega ĉrevesa (Yirga, 2015).

2.3.6.1.2 Tekmovanje s patogenimi bakterijami za hranila v ĉrevesju

Probiotiki lahko tekmujejo za hranila in absorpcijska mesta s patogenimi bakterijami (sliki

5 in 7). Tekmovanje za energijo in hranilne snovi med probiotiki in drugimi bakterijami

povzroĉi zatiranje patogenih vrst. Probiotiki imajo dobro fermentativno sposobnost in



21

spodbujajo prebavo. Znano je, da laktobacili proizvajajo mleĉno kislino in proteolitiĉne

encime, ki lahko izboljšajo prebavo hranil v prebavnem traktu (Yu in sod., 2008). Razliĉne

študije kaţejo, da probiotiki izboljšajo presnovo surovih beljakovin in pridobivanje

energije iz njih, v primerjavi s tistimi, ki niso tretirani s probiotiki (Yu in sod., 2008).

Slika 7: Nepatogene in patogene bakterije pogosto tekmujejo za hranila (povzeto po Ewing in Cole,

1994)

Nepatogene in patogene bakterije pogosto tekmujejo za hranila, npr. ogljik, dušik in

minerale. Nepatogene bakterije lahko uspešno konkurirajo patogenim in tako v veĉjem

obsegu kolonizirajo ĉrevesje.

2.3.6.2 Bakterijski antagonizem

Ko so probiotiĉni mikroorganizmi naseljeni v ĉrevesju, lahko proizvajajo snovi z

bakteriocidnim (ubijanje bakterij) ali bakteriostatiĉnim delovanjem (zaviranje rasti in

razmnoţevanja bakterij) (Hughes in Heritage, 2002; Steiner, 2009).

Mleĉnokislinske bakterije fermentirajo laktozo v mleĉno kislino, s ĉimer se zmanjša pH v

ĉrevesju na raven, ki je škodljive bakterije ne prenašajo. Proizvaja se tudi vodikov

peroksid, ki zavira rast po Gram-u negativnih bakterij (McDonald in sod., 2010).

2.3.6.3 Imunska modulacija

Imunska modulacija je za gostitelja ugodno uravnavanje imunskega sistema. Probiotiki

lahko delujejo kot spodbuda imunskemu sistemu. Mikrobne zdruţbe lahko podprejo

obrambo ţivali proti invaziji patogenov s stimulacijo ĉrevesnega imunskega odziva, s

stimulacijo proizvodnje protiteles in poveĉanjem aktivnosti fagocitov (McDonald in sod.,

2010). Nekateri probiotiĉni sevi, kot so predstavniki rodu Lactobacillus, so se izkazali, da

so sposobni stimulirati imunski sistem. Tako lahko delujejo ţive celice, ki se veţejo na

specifiĉne receptorje ali migrirajo skozi ĉrevesno steno, ali pa deli bakterijskih celic, ki se

sprostijo po razpadu mrtvih celic (Klaenhammer in sod., 2012).

Kar 70-80% imunskega sistema, ki je glavni obrambni mehanizem organizma, je v predelu

ĉrevesja. Skozi ĉrevo prihaja s hrano glavnina toksinov, mikroorganizmov in drugih

tujkov, ki jih morajo celice imunskega sistema (levkociti) nevtralizirati. Pri opravljanju te



22

vloge pa imajo pomoĉ. Reĉemo lahko, da so v ĉrevesju tri "obrambne linije" celic. Prvo

obrambno ĉrto predstavljajo bakterije (vkljuĉno s probiotiĉnimi), ki so na notranji strani

ĉrevesja (v ĉrevesni svetlini in v sluzi). Druga obrambna ĉrta so celice ĉrevesne stene, ki

prepušĉajo v notranjost organizma molekule in druge delce, predvsem tiste, ki so dovolj

majhne. Šele v tretji liniji so celice imunskega sistema, ki "ĉakajo" v limfi in krvnih ţilah

za ĉrevesno steno, "prepoznajo" morebitne tujke (strupene molekule, viruse,…), ki jih je

prepustila ĉrevesna stena, ter jih napadejo. Vloga probiotikov v tem obrambnem sistemu je

zelo pomembna. Nekatere študije kaţejo, da veţejo probiotiki nase karcinogene snovi iz

hrane, ki se skupaj s fekalijami izloĉijo iz organizma, ali pa jih razkrajajo (Rotovnik-

Kozjek, 2003).

2.4 LACTOBACILLUS GASEERI LF221 in LACTOBACILLUS GASEERI K7

V zbirki Inštituta za mlekarstvo in probiotike (IML-PRO) sta med drugim shranjena dva

humana bakterijska izolata, ki sta bakteriocinogena in imata širok spekter protimikrobne

aktivnosti. To sta Lactobacillus gasseri LF221 in Lactobacillus gasseri K7. Spadata v

skupino bakterij Lactobacillus acidophilus, ki so splošno priznane kot varne za uporabo pri

ljudeh. Oba seva sta bila izolirana iz blata dojenĉkov (Bogoviĉ Matijašić in sod., 2004).

Rod Lactobacillus je taksonomska skupina, ki spada v skupino mleĉnokislinskih bakterij,

vsebuje pa veĉ kot dvesto razliĉnih vrst. Znaĉilnost rodu so po Gramu pozitivne,

nesporogene bakterije, ki energijo dobivajo izkljuĉno s fermentacijo sladkorjev, prisotne pa

so v surovinah rastlinskega in ţivalskega izvora (Hammes in Hertel, 2006).

Sev Lactobacillus gasseri LF221 ima številne lastnosti probiotika. Raste v prisotnosti 1,5

% ţolĉa, preţivi pri vrednosti pH 2 in ima širok spekter protimikrobne aktivnosti. Iz

supernatanta so uspeli oĉistiti dva razliĉna bakteriocina, za katera se je na osnovi

ugotovljenega zaporedja nukleotidov genov za bakteriocina izkazalo, da se razlikujeta od

ţe opisanih bakteriocinov v literaturi. Poimenovali so ju acidiocin LF221 A in acidocin

LF221 B (Bogoviĉ Matijašić in sod., 1998).

Bakteriocini so poleg organskih kislin, vodikovega peroksida in diacetila, eni izmed

mnogih antimikrobnih substanc, ki jih proizvajajo mleĉno kislinske bakterije. Sestava

bakteriocinov je proteinska, vendar z bakterijskim naĉinom delovanja, proizvedenim z

vrsto mikroorganizmov (Tagg in sod., 1976). Zaviralni spekter acidocina B vsebuje tudi

nekatere ne-mleĉno kislinske bakterije, kot so Clostridium sporogenes, Listeria

monocytogenes in Brochothrix thermosphacta (Ten-Brink in sod., 1994; Van der Vossen in

sod., 1994). Acidiocin A je drugi bakteriocin L. acidophilus, katerega spekter delovanja

vkljuĉuje tudi zmoţnost zaviranja nekaterih patogenov, ki povzroĉajo kvarjenje hrane, med

katere spada tudi Listeria monocytogenes (Kanatani in sod., 1995). Delovanje

bakteriocinov seva LF221 je še obširnejše, saj zavirajo nekatere seve iz rodov, ki niso

laktobacili: Lactococcus, Staphylococcus, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus,

Clostridium, Listeria in Bacillus. Opaţeno je tudi delovanje proti oportunistiĉni bakteriji

Cl. difficile, katera povzroĉa z antibiotiki povezano diarejo ali celo ţivljenjsko nevarnemu

psevdomembranskemu kolitisu, ter proti drugim klostridijem. Sev LF221 je sposoben

zavirati tudi nekatere seve B. cereus (Bogoviĉ Matijašić in sod., 1998).



23

Sev Lactobacillus gasseri K7 je dobro raziskan probiotik z znanim celotnim genomom

(Treven in sod., 2014).

Je prav tako odporen proti ţolĉnim solem in nizkim vrednostim pH, ima širok spekter

protimikrobne aktivnosti, njegove produkcijske sposobnosti (tvorba bakteriocinov) pa so

veĉje kot pri sevu LF221 (Bogoviĉ Matijašić in Rogelj, 2000).

Sposoben je rasti v prisotnosti 0,3% ţolĉnih soli in dobro preţiveti v kislem okolju (pH=3).

Bakteriocini nastajajo med eksponentno fazo rasti. Maksimalna aktivnost teh v

supernatantu MRS kulture je bila zaznana po 8-urni inkubaciji. Med drugim zavira tudi

klostridije. Vegetativne celice Clostridium tyrobutyricum so pokazale veĉjo obĉutljivost za

bakteriocine K7 kot pa spore (Bogoviĉ Matijašić in Rogelj, 2000).

Vsaj zaĉasno je tudi sposoben preţiveti prehod skozi prebavni trakt in kolonizirati

ĉrevesno sluznico gnotobiotiĉnih in konvencionalnih prašiĉkov (Bogoviĉ Matijašić in sod.,

2003; Stojković, 2003).

V dosedanjih raziskavah so pri sevih LF221 in K7 ugotovili vrsto lastnosti, ki so predpogoj

za uporabo izbranih bakterij kot probiotikov. Oba humana izolata poleg organskih kislin,

kot pomembnih protimikrobnih dejavnikov, tvorita tudi bakteriocine s širokim spektrom

delovanja (Bogoviĉ Matijašić in Rogelj, 2000; Bogoviĉ Matijašić in Rogelj, 1999; Bogoviĉ

Matijašić in sod., 1998). Njuna sposobnost zaviranja vrst Clostridium, med katerimi sta

tudi patogeni oziroma oportunistiĉni vrsti C. difficile in C. perfringens (prve kot

povzroĉiteljice psevdomembranskega kolitisa, druge kot patogene bakterije, nevarne za

ljudi in ţivali), je zanimiva s stališĉa prepreĉevanja ali hitrejšega zdravljenja tovrstnih

infekcij tako pri ljudeh kot pri ţivalih (Bogoviĉ Matijašić in Rogelj, 2000; Bogoviĉ

Matijašić in Rogelj, 1999; Bogoviĉ Matijašić in sod., 1998; Rogelj in sod., 1999). Med

zanimivejšimi mikroorganizmi, ki jih je sposoben inhibirati LF221, so še posamezni sevi

Bacillus cereus, Listeria monocytogenes in Staphylococcus aureus (Bogoviĉ Matijašić in

sod., 1998). Dobro se veţeta na enterocite v celiĉni kulturi (Caco-2) (Bogoviĉ Matijašić in

sod., 2003).

2.5 ESCHERICHIA COLI

Vrsto E. coli je leta 1885 prvi opisal nemški zdravnik Escherich. Vrste iz rodu Escherichia

so tipiĉne predstavnice enterobakterij. So po Gramu negativni, fakultativno anaerobni

bacili. Veĉina sevov je gibljiva. Medtem ko virulentni sevi povzroĉajo okuţbe v prebavilih

in zunaj ĉrevesne okuţbe pri ĉloveku in ţivalih, so nevirulentni sevi E. coli del normalne

ĉrevesne mikrobiote (Andlovic, 2002).

Vrsta E. coli, je ena izmed najobiĉajnejših predstavnic ĉrevesne in fekalne mikrobiote,

spada med koliformne bakterije, ter je prisotna v ĉrevesju ţe takoj po rojstvu. Hkrati je to

tudi prva bakterijska vrsta, ki zaĉne po smrti razkrajati truplo (Batis in Brglez, 1984).



24

Medtem ko so nekateri sevi E. coli neškodljivi, drugi lahko povzroĉijo razliĉne okuţbe,

predvsem okuţbe seĉil, tudi mastitis, ĉrevesna obelenja in drugo V preteklih letih so

poroĉali o poveĉanju števila okuţb z E. coli, odpornimi proti veĉ antibiotikov hkrati, kar

predstavlja dodatno groţnjo za zdravje ljudi (Povzetek dejstev za splošno javnost, 2016).

2.6 RAZISKOVANJE FUNKCIONALNIH LASTNOSTI PROBIOTIKOV

Pri testiranju posameznih mikroorganizmov se lahko posluţujemo in vivo, in vitro ali ex

vivo pristopa.

Definicije, ki jih navaja Slovenski medicinski slovar (Kališnik, 2002) se glasijo:

in vivo = v ţivem organizmu,

in vitro = v umetnem okolju (npr. v epruveti ali v posodi za kulturo tkiva),

ex vivo = v poskusnih razmerah zunaj ţivega organizma.

Raziskave in vivo se izvajajo na ţivem organizmu, torej ţivali ali ĉloveku. So zelo drage in

zamudne, za izvedbo potrebujemo veĉje število ţivali oz. ljudi. Kljub temu so potrebne,

tudi pri prouĉevanju uĉinkov probiotikov (Lavrenĉiĉ, 2003).

Zaradi vse ostrejše zakonodaje, ki prepreĉuje ali omejuje najrazliĉnejše posege na ţivalih,

so raziskave in vivo še teţavnejše. Z metodami in vitro simuliramo pogoje, ki so podobni

tistim, ki so v gostitelju (npr. v prebavilih) (Lavrenĉiĉ, 2003). Obiĉajno prva selekcija

zanimivih sevov poteka in vitro, zanimivejše seve pa nadalje testirajo še in vivo, da

pridobijo podatke o njihovi uĉinkovitosti.

2.7 PROBIOTIKI KOT NADOMESTILO ZA ANTIBIOTIKE

Odkritje antibiotikov pomeni enega najpomembnejših mejnikov v razvoju medicine.

Njihova uporaba je moĉno zmanjšala smrtnosti zaradi infekcijskih bolezni, hkrati pa

omogoĉila razvoj vse veĉ bakterijskih sevov, ki so odporni (rezistentni) proti posameznim

ali celo veĉ razliĉnim antibiotikom. Pojav bakterijske odpornosti proti antibiotikom je znan

ţe od samega zaĉetka njihove uporabe v zdravljenju bakterijskih okuţb. Širitev odpornih

bakterijskih sevov omogoĉa preobseţna in velikokrat nekritiĉna uporaba antibiotikov,

(predvsem dodajanje antibiotikov za spodbujanje rasti farmskih ţivali). Tako je zaradi

široke uporabe penicilina ţe konec 40-ih let prejšnjega stoletja prišlo do selekcije in

razširjanja proti penicilinu odpornih bakterijskih sevov. Odpornost proti penicilinu so

najprej zasledili pri vrsti Staphylococcus aureus. Ţe leta 1950 je bilo veĉ kot 50% sevov te

vrste odpornih proti penicilinu (Seme, 2002).

V posebno skupino antibiotikov štejemo heterogeno skupino antibiotikov – promotorjev

rasti, ki se uporabljajo kot dodatek ţivalski hrani (angleški naziv feed grade). V preteklosti

so tudi v Evropi te spojine dodajali krmi zaradi boljših prirastov ţivali. Za ta namen se

uporabljajo le antibiotiki, ki se sicer ne uporabljajo v humani ali veterinarski medicini.

(Pokorny in sod., 1992). Medtem ko so v Evropi tovrstno uporabo antibiotikov dokonĉno

prepovedali leta 2006, so nekateri antibiotiki še vedno dovoljeni v Aziji, Avstraliji in ZDA.



25

S 1. januarjem 2006 v EU ni veĉ dovoljeno uporabljati nutritivnih antibiotikov

(flavofosfolipol, natrijev monenzin, natrijev salinomicin, avilamicin) v prehrani ţivali. To

pa ne velja za posebno skupino antibiotikov imenovanih kokcidiostatiki in sredstev proti

histomonijazi. Njihova uporaba je še vedno dovoljena, vendar v toĉno doloĉenih koliĉinah

(Uredba Komisije (ES) št. 574/2011 z dne 16. junija 2011 o spremembi Priloge I k

Direktivi 2002/32/ES Evropskega parlamenta in Sveta glede mejnih vrednosti za nitrit,

melamin, Ambrosio spp. ter prenosa nekaterih kokcidiostatikov ali sredstev proti

histomonijazi in o konsolidaciji prilog I in II k Direktivi).

Razvojni oddelki farmacevtskih druţb so do zaĉetka 80. let uĉinkovito razvijali in

sintetizirali nove antibiotike, s katerimi se je moĉno razširil spekter protibakterijskega

delovanja. Po tem obdobju pa so, prepriĉani, da je cilj dokonĉno doseţen, postopoma

upoĉasnili oz. celo ukinjali razvoj na tem podroĉju. Bakterije so doslej odgovorile na prav

vsak novi antibiotik s pojavom odpornih sevov, vĉasih hitreje, drugiĉ poĉasneje. Danes, po

veĉ kot 70 letih uporabe antibiotikov in razvoju stotin razliĉnih protimikrobnih zdravil,

ugotavljajo, da se pri zdravljenju okuţb s sevi nekaterih bakterijskih vrst nevarno

pribliţujemo stanju pred odkritjem penicilina (Seme, 2002; EFSA/ECDC, 2015).

Med moţnimi alternativami antibiotikom kot rastnim promotorjem so encimi, anorganske

in organske kisline, probiotiki in pa ukrepi obvladovanja okuţb, predvsem respiratornih, na

naĉin preventivne naselitve dobre mikrobiote (Yirga, 2015). Kombinacija razliĉnih

pristopov pa omogoĉa še bolj ugodno ravnovesje v ĉrevesju in s tem dobro poĉutje in

zmogljivost ţivali. Upoštevani so namreĉ razliĉni vidiki prebavnega trakta: mikrobiologija,

presnova hranilnih snovi in oskrba tkiv (Yirga, 2015).

Nekatere skupine naravno prisotnih bakterij se po uţivanju antibiotikov še dolgo potem, ko

zdravljenja ni veĉ, ne opomorejo (Robinson in Young, 2010; Quigley, 2013).

Odkar je uporaba antibiotikov kot pospeševalcev rasti prepovedana, se trudijo najti druga

sredstva, ki bi prav tako pospeševala rast, izkorišĉanje krme in ugodno vplivala na zdravje

ţivali, bi pa bila bolj prijazna okolju in ĉlovekovemu zdravju.

Probiotiki delujejo po principu kompetitivnega izkljuĉevanja. Tako lahko prepreĉijo

nastanek bolezni, npr. dihal pri prašiĉih, ki bi sicer zahtevale antibiotiĉno zdravljenje

(Yirga, 2015).

Obstaja veliko dokazov o uĉinkovitosti probiotikov v preventivi in celo terapiji nekaterih

bolezni farmskih ţivali. Eden od primerov uĉinkovite rabe MKB probiotikov predstavlja

preventiva oz. zdravljenje diareje, ki je pri mladih ţivalih, vkljuĉno z mladimi pujski,

glavni vzrok obolevnosti in smrtnosti (Vanbelle, 2001).



26

3 MATERIAL IN METODE

3.1 IZVEDBA POSKUSA

3.1.1 Poskusne živali

V poskus so bili vkljuĉeni devet mesecev stari prašiĉi pitanci. Uporabili smo osrednji del

tankega t.i. tešĉega ĉrevesa – jejunuma. Ĉrevesje je bilo takoj po zakolu odvzeto, ohlajeno

in na ledu preneseno v laboratorij. Tu je potekalo nadaljnje izpiranje ter obdelava.

Pomembno je bilo, da so bile analize konĉane v ĉasu dveh ur po zakolu. Kasneje namreĉ

aktivnosti in ţivljenjske funkcije ĉrevesnih enterocitov upadajo.

3.1.2 Potek poskusa

3.1.2.1 Potek dela

Takoj po izkrvavitvi testnih prašiĉev smo odvzeli njihovo tanko ĉrevo. Obstojeĉo

mikrobioto smo sprali s pufrom, nato pa pripravili vzorce velikosti 10 cm2. Seva L. gasseri

K7 in L. gasseri LF221 smo predhodno namnoţili s kultivacijo v komercialnem gojišĉu

MRS. S centrifugiranjem smo odstranili preostalo gojišĉe, celice pa resuspendirali v pufru

z ustrezno pH vrednostjo, tako da smo dobili suspenzije s pribliţno 108 KE/ml.

Pripravljene vzorce tkiva smo vsakiĉ potopili v suspenzijo celic enega od preskušanih

sevov in inkubirali pri 37 °C 30 minut, s ĉimer smo omogoĉili vezavo preskušanih bakterij

na še vedno ţive ĉrevesne epitelne celice. Nevezne celice smo sprali z vzorcev tkiva. Na

koncu smo število vezanih celic ugotovili tako, da smo vzorce prenesli v steklenice s

fiziološko raztopino, vsakega posebej homogenizirali, pripravili razredĉitve, jih nacepili na

komercialno selektivno gojišĉe, inkubirali in prešteli zrasle kolonije.

V drugem delu poskusa smo vzorce tkiva po enaki zaĉetni obdelavi, torej vezavi v

suspenzijah bakterijskih celic in inkubaciji, fiksirali v 10 %-nem formalinu, dehidrirali z

narašĉajoĉimi koncentracijami alkohola in vkljuĉili v parafin.

Pripravljeno tkivo smo z mikrotomom narezali na rezine, debele 5 µm.

Tkivne rezine smo nato pobarvali z metodo po Gramu. Pri tem se po Gram-u pozitivne

bakterije obarvajo modro, po Gram-u negativne rdeĉe ali roţnato, jedra so rdeĉa, ostali

tkivni elementi pa rumeni (Mäyrä-Mäkinen in sod., 1983; Kos, 2001).



27

3.2 MATERIAL

3.2.1 Črevesna sluznica iz tankega črevesa

Pri poskusu smo uporabljali košĉke tešĉega ĉrevesa takoj po zakolu prašiĉev. Velikost

vzorcev je bila 10 cm2. Razrez ĉrevesa smo izvajali pravokotno na njegovo dolţino,

posamezen košĉek je bil dolg 2,5 cm, širok pa 4 cm.

3.2.2 Bakterijski sevi

Pred poskusom smo testne seve precepili v sveţe gojišĉe MRS in inkubirali 18 ur.

Uporabljeni so bili naslednji bakterijski sevi:

Lactobacillus gasseri LF221 (Zbirka IML-PRO, Oddelek za zootehniko,

Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani),

Lactobacillus gasseri K7 (Zbirka IML-PRO, Oddelek za zootehniko, Biotehniška

fakulteta, Univerza v Ljubljani),

Escherichia coli O8:K88 (Research Institute of Experimental Veterinary Medicine,

Košice, Slovaška).

3.2.3 Gojišča

3.2.3.1 Trda gojišĉa

Hranljivi agar MRS smo pripravili po navodilih proizvajalca (Merck, Darmstadt, Nemĉija).

Popolnoma raztopljenega smo nalili v 200 ml steklenice in dali v avtoklav, kjer je potekala

sterilizacija. Ohlajenega na 45 °C smo uporabljali za razlitje v petrijeve plošĉe in sicer kot

trdo gojišĉe, ustrezno za rast laktobacilov.

Po navodilih proizvajalca smo agar EMB (Merck, Darmstadt, Nemĉija) raztopili v

demineralizirani vodi. Suspenzijo smo nalili v 200 ml steklenice, zaprli in dali sterilizirati.

EMB je komercialno selektivno gojišĉe vijoliĉno rdeĉe barve. Njegova sestava ustreza

potrebam enterobakterij, katerim pripada tudi vrsta E. coli.

Sterilna hranljiva gojišĉa smo pred razlivanjem segreli v mikrovalovni peĉici in jih ohladili

na primerno temperaturo (45 °C) v vodni kopeli.

3.2.3.2 Tekoĉa gojišĉa in diluenti

Bujon MRS je tekoĉe gojišĉe za gojenje laktobacilov. Pripravili smo ga po navodilih

proizvajalca (Merck, Darmstadt, Nemĉija), odpipetirali v epruvete, ter avtoklavirali pri 121

°C. Potrebovali smo ga za pripravo 18-urne kulture sevov Lactobacillus gasseri K7 in

Lactobacillus gasseri LF221.



28

Fiziološko (¼ Ringerjevo) raztopino smo pripravili po navodilih proizvajalca (Merck,

Darmstadt, Nemĉija). Ena tableta zadostuje za 500 ml vode. Raztopino smo z avtomatskim

dispenzerjem porazdelili v epruvete po 9,4 ml, preostalo pa v steklenico (500 ml).

Sterilizacija je potekala v avtoklavu pri 121 °C 15 minut.

Pripravili smo 20-kratno zaloţno raztopino fosfatnega pufra (PBS)z naslednjo sestavo:

- 170 g NaCl (Merck, Darmstadt, Nemĉija),

- 42,9 g Na2HPO4 x 12 H2O (Merck, Darmstadt, Nemĉija),

- 10,8 g KH2PO4 (Merck, Darmstadt, Nemĉija).

Natehtane sestavine smo stresli v erlenmajerico z 800 ml destilirane vode, ter vsebino

premešali s pomoĉjo magnetnega mešala. Nato smo uravnali vrednost pH na 7,4, dopolnili

z vodo do 1000 ml in sterilizirali v avtoklavu. Zaloţno raztopino sterilnega pufra smo

hranili pri 4°C. Kadar smo potrebovali PBS v konĉni koncentraciji, smo 50 ml zaloţne

raztopine dodali 950 ml demineralizirane in sterilizirane vode.

3.3 METODE

3.3.1 Obdelava kontrolnih vzorcev črevesne sluznice

Na zaĉetku poskusa smo preverili, ali postopek obdelave vzorcev tankega ĉrevesa, ki smo

ga povzeli po literaturi, zadostuje za odstranitev obstojeĉe mikrobiote, vezane na ĉrevesno

sluznico tankega ĉrevesa ţivali.

Notranjost ĉrevesa smo trikrat sprali z ohlajenim pufrom PBS (glej shemo 1), ter s tem

odstranili vsebino. Nato smo, prav tako kot kasneje vsakiĉ v nadaljevanju poskusa,

jejunum razrezali na košĉke, velike 10 cm2. Potopili smo jih v PBS in inkubirali v

hladilniku pri 4°C, 30 minut, da se je sluz (mukus) odlušĉila. S pinceto smo nato prijeli

vsak posamezen košĉek ter ga narahlo še 3-krat sprali v ĉaši s cca. 150 ml vsakiĉ sveţega

pufra PBS. Dva od košĉkov smo dali v steklenici s po 100 ml ¼ Ringerjeve raztopine,

homogenizirali, dopolnili do 100 ml, razredĉili, nacepili na hranljivi gojišĉi MRS in EMB,

ter po inkubaciji pri 37 °C prešteli zrasle kolonije. Gojišĉa z agarjem MRS smo inkubirali

48 ur v anaerobnih razmerah (GenBOX anaer, Bio-Merieux, Marcy l'Etoile, Francija),

gojišĉa z EMB pa 24 ur v aerobnih. Ta vzorec smo oznaĉili z oznako »0«. Postopek smo

ponovili pri vsakem nadaljnjem poskusu.



29

SHEMA 1: Kontrola spiranja ĉrevesa s PBS

(VZOREC »0«)

ĈREVO (jejunum)

3x SPEREMO s PBS odstranitev ĉrevesne vsebine

RAZREZ jejunuma na košĉke (10 cm

2)

INKUBACIJA v PBS (4°C, 30 min) odlepljanje mukusa

ponovno 3x spiranje v PBS (150 ml)

potopitev košĉka v Ringerjevo raztopino

HOMOGENIZACIJA

RAZREDĈEVANJE

NACEPLJANJE na hranljivo podlogo (MRS, EMB)

INKUBACIJA (37 °C, 48 oz. 24 ur)

ŠTETJE KOLONIJ

3.3.2 Optimiziranje protokola vezave bakterij – spiranje nevezanih bakterij

V nadaljevanju smo ugotavljali, ali je enkratno spiranje po vezavi testnih laktobacilov

zadostno za odstranitev nevezanih bakterij. V poskusu pripenjanja na ĉrevesno sluznico

smo uporabljali dva testna seva, Lactobacillus gasseri LF221 in Lactobacillus gasseri K7.

Pet košĉkov jejunuma, pripravljenih kot je opisano v zaĉetku poglavja 3.3.1, smo potopili

v vsako od dveh steklenic, s po 200 ml pripravljene suspenzije ustrezne koncentracije (cca.

107

KE/ml) dveh sevov laktobacilov. Obe steklenici smo postavili v stresalnik, kjer smo

vzorce ob rahlem stresanju inkubirali 30 minut, pri 37 °C in 150 obratih/minuto (glej

shemo 2). Po konĉani inkubaciji v stresalniku smo iz obeh steklenic s pinceto pobrali vsak

posamezen košĉek ter ga sprali v pufru PBS. Uporabili smo štiri razliĉne naĉine spiranja:

1) prvi košĉek iz vsake od steklenic samo roĉno spiranje (narahlo, prijem s sterilno

pinceto),

2) naslednji košĉek najprej roĉno spiranje, nato še 5 minut v stresalniku pri 37 °C

in 150 obratih/minuto v 200 ml pufra PBS,

3) roĉno, nato dvakrat po 5 minut spiranja v stresalniku z vmesno menjavo pufra ali

4) roĉno in 3-krat po 5 minut spiranja v stresalniku z vmesno menjavo pufra.



30

SHEMA 2: Izvedba postopka spiranja košĉkov ĉrevesa po vezavi laktobacilov

ĈREVO (jejunum)

3x SPEREMO s PBS (500 ml) odstranitev vsebine ĉrevesa

RAZREZ jejunuma na košĉke (10 cm2)

INKUBACIJA v PBS (4°C, 30 min) odlepljanje mukusa

ponovno 3x spiranje v PBS (150 ml)

prenos tkiva v SUSPENZIJO SEVOV LF221 oz. K7 (cca 10

7 KE/ml)

INKUBACIJA v stresalniku (30 min, 37 °C, 150 obratov /min)

razliĉni naĉini SPIRANJA

3.3.3 Priprava standardiziranih bakterijskih suspenzij

Priprava 18-urnih kultur bakterijskih celic je potekala tako, da smo v epruvete s sterilnim

bujonom MRS (10 ml) odpipetirali 100 ml kulture L. gasseri K7, L. gasseri LF221 oz. E.

coli, prejšnji dan nacepljene iz zamrznjenih celic. Inkubirali smo 18 ur pri temperaturi 37

°C. Do uporabe smo epruvete potopili v mrzlo vodo z ledom in tako prepreĉili nadaljnje

razmnoţevanje.

Epruvete vseh treh 18-urnih kultur smo v nadaljevanju centrifugirali (3700 g, 5 minut).

Celice so se ob tem loĉile od bujona in ostale na dnu epruvet. Bujon smo previdno odlili,

vzeli sterilne steklenice z ustrezno koliĉino vode in PBS, ter s pipeto popolnoma izprali

sediment celic iz epruvet, in sicer v prvo steklenico celice seva LF221, v drugo seva K7,

ter v tretjo steklenico celice E. coli. Vsebino steklenic smo dobro premešali.

Ţeleli smo pripraviti suspenzije treh sevov s ĉimbolj enakimi koncentracijami. Na podlagi

podatkov, pridobljenih v predhodnih poskusih, smo suspenzije pripravili tako:

LF221: 142,5 ml vode (avtoklavirane)

7,5 ml pufra PBS (20-kratna koncentracija)

celice LF, pridobljene iz 6 ml 18-urne kulture

Skupaj: 150 ml.

K7: 142,5 ml vode (avtoklavirane)

7,5 ml pufra PBS (20-kratna koncentracija)

celice K7, pridobljene iz 4 ml 18-urne kulture

Skupaj: 150 ml.

E.coli: 237,5 ml vode (avtoklavirane)



31

12,5 pufra PBS (20-kratna koncentracija)

celice E. coli, pridobljene iz 1,2 ml 18-urne kulture

Skupaj: 250 ml.

Pripravljene suspenzije celic smo vsakiĉ razdelili v devet 200 ml sterilnih steklenic ter

dodali ustrezno koliĉino pufra PBS enkratne koncentracije, ohlajenega na 4 ˚C,v naslednjih

kombinacijah:

1) LF: 50 ml suspenzije LF + 50 ml pufra PBS (2 steklenici)

2) K7 : 50 ml suspenzije K7 + 50 ml pufra PBS (2 steklenici)

3) Ec : 50 ml suspenzije Ec + 50 ml pufra PBS (3 steklenice)

4) Ec + LF : 50 ml suspenzije LF + 50 ml susp. Ec (1 steklenica)

5) Ec + K7 : 50 ml suspenzije K7 + 50 ml susp. Ec (1 steklenica).

Koncentracije celic so bile pribliţno enake v prvih treh poskusih, v ĉetrtem in petem pa

smo uporabili 10x veĉje koncentracije laktobacilov, medtem ko je koncentracija E. coli

ostala enaka. Pri vsakem poskusu smo suspenzije bakterij tudi nacepili na ustrezna gojišĉa,

da smo ugotovili dejansko koncentracijo bakterijskih sevov (KE/ml). Laktobacile smo

nacepili na gojišĉe MRS ter inkubirali 48 h pri 37 °C v anaerobnih razmerah (GenBOX

anaer, Bio-Merieux, Marcy l'Etoile, Francija). E. coli smo nacepili na gojišĉe EMB,

kolonije pa prešteli po 24 h inkubacije pri 37 °C.

Kolonije smo prešteli, s pomoĉjo elektronskega števca kolonij (EŠKO, Ljubljana,

Slovenija), na tistih petrijevih plošĉah, kjer je zraslo od 30 do 300 kolonij. V primeru da je

bilo število kolonij na plošĉah niţje od 30, smo rezultat izrazili kot »manj kot 30 KE/ml oz.

na 10 cm2 vzorca«.

Število kolonijskih enot v 1 ml smo izraĉunali po formuli:

dnn

CN

)1,0( 21

… (1)

N - število kolonijskih enot (KE/cm2 oz. KE/ml)

ΣC - število preštetih kolonij na vseh plošĉah

n1 - število števnih plošĉ (30 do 300 kolonij) prve razredĉitve

n2 - število števnih plošĉ (30 do 300 kolonij) druge razredĉitve

d - razredĉitveni faktor, ki ustreza prvi razredĉitvi

3.3.4 Priprava črevesnega tkiva

Notranjost ĉrevesa smo s pomoĉjo lijaka vsakiĉ trikrat sprali z dobro ohlajenim pufrom

PBS in s tem odstranili vsebino. Nato smo z ostrim rezilom odvzeli deset košĉkov

jejunuma, velikih 10 cm2. Potopili smo jih v posodo s PBS, ter dali za 30 minut v hladilnik.

Ta inkubacija pri 4C je povzroĉila, da se je sluz (mukus) odlušĉila. En košĉek smo

homogenizirali in analizirali takoj, da smo se prepriĉali, ali je spiranje zadostovalo za

odstranitev prisotne mikrobiote. Preostalih devet košĉkov smo uporabili za poskus vezave.



32

3.3.5 Vezava ali adhezija

Z adhezijo smo ţeleli ugotoviti sposobnost vezave samostojnih ĉistih sevov LF221, K7 ter

E. coli ex vivo. Hkrati je bil namen ugotoviti, do kolikšnega tekmovanja (competition),

izkljuĉevanja (exclusion) oziroma izpodrivanja (displacement) E. coli pride s strani

laktobacilov oz. ĉe do ĉesarkoli omenjenega v primeru simulacije ex vivo vezave

probiotikov sploh pride.

Tekmovanje med E. coli in L. gasseri LF221 smo opazovali tako, da smo v testu uporabili

suspenzijo, ki je vsebovala oba seva hkrati (Ec+LF), tekmovanje med E. coli in sevom K7

pa z mešanico kultur E. coli in L. gasseri K7 (Ec+K7).

Morebitno izpodrivanje E. coli s strani laktobacilov smo opazovali tako, da smo

posamezne košĉke pomoĉili najprej v suspenzijo Ec, potem pa v suspenzijo enega od

testnih laktobacilov. Oznaka teh vzorcev je bila Ec/LF oziroma Ec/K7.

Izkljuĉevanje E. coli s strani laktobacilov je bilo simulirano na naĉin, da smo posamezne

košĉke ĉrevesa inkubirali najprej v suspenziji enega od testnih sevov laktobacilov, nato pa,

po vmesnem spiranju, v suspenziji Ec. Oznaki vzorcev sta bili LF/Ec in K7/Ec.

Košĉke ĉrevesne sluznice za teste adhezije smo pripravili tako, kakor je opisano zgoraj

(3.3.2). S sterilno pinceto (alkohol + ogenj) smo iz posode s PBS vzeli košĉek ĉrevesne

sluznice, ga narahlo 3x sprali v ĉaši z 250 ml pufra PBS, ki smo ga vmes vsakiĉ zamenjali,

ter s tem izprali še zadnje ostanke mukusa in vsebine ĉrevesja. Endogeno mikrobioto smo

torej preteţno odstranili, košĉke ĉrevesa pa smo nato prenesli v prej pripravljene steklenice

s suspenzijami:

v steklenico z oznako »LF« dva košĉka,

v steklenico z oznako »K7« prav tako dva košĉka,

v steklenico z oznako »Ec« tri košĉke,

v steklenico z oznako »LF+Ec« en košĉek,

v steklenico z oznako »K7+Ec« prav tako en košĉek ĉrevesa.

Vseh pet steklenic smo postavili za 30 minut v stresalnik, kjer je potekala vezava

preskušanih bakterij na še vedno ţive ĉrevesne epitelne celice, in sicer pri 37 ºC in hitrosti

stresanja 75 obratov na minuto.

Po en košĉek iz mešanic LF+Ec, K7+Ec, ter ĉistih suspenzij LF, K7 in Ec smo po konĉani

vezavi takoj sprali in prenesli v fiziološko raztopino (100 ml), kasneje pa homogenizirali in

razredĉitve nacepili na ustrezno gojišĉe. Drugega od obeh košĉkov iz steklenic LF in K7

smo prenesli v novi steklenici s suspenzijo seva E. coli, v katerih je nato potekala

inkubacija s sevom E. coli. Oznaĉili smo ju kot LF/Ec, oz. K7/Ec. Prav tako drugega od

treh košĉkov iz steklenice Ec smo dali v steklenico s sevom LF, ter oznaĉili Ec/LF, tretjega

pa v suspenzijo K7 in oznaĉili Ec/K7. Tudi te štiri steklenice smo inkubirali v stresalniku

pri enakih pogojih (30 min, 37 ºC, 75 obr/min).



33

3.3.6 Spiranje

Vsakega od košĉkov smo po konĉani vezavi najprej narahlo roĉno sprali v PBSu, prenesli

v steklenice s po 150 ml ohlajenega pufra in te postavili v stresalnik. Vzorce smo stresali 5

minut pri 150-ih obratih/minuto in 37 ºC. S tem so bile odstranjene bakterije, ki se niso

vezale na ĉrevesni epitel.

3.3.7 Homogeniziranje

Po spiranju v stresalniku smo košĉke še roĉno sprali v PBSu in prenesli v oznaĉene

steklenice s po 100 ml sterilne, dobro ohlajene fiziološke raztopine. Vsebine vseh devetih,

poleg teh pa tudi vsebino steklenice z oznako »0«, ki je vsebovala vzorec za preverjanje

uspešnosti odstranjevanja prvotne mikrobiote, so bile pripravljene za homogeniziranje, ki

smo ga opravili z aparatom Ultra Turrax T25 basic (Ika, Staufen, Nemĉija).

Hitrost homogeniziranja je bila 11000 obratov/minuto, ĉas pa 2-3 minute. Pred obdelavo

vsakega naslednjega vzorca je bilo potrebno homogenizator dobro oĉistiti ter sprati v 70%

alkoholu, nato pa še v pufru PBS. Sledilo je nadaljnje razredĉevanje ter nacepljanje na

selektivna gojišĉa.

3.3.8 Razredčitve in nacepitve na komercialni selektivni gojišči

Po pripravi suspenzij smo iz dobro premešanih vsebin steklenic z oznakami LF, K7, Ec,

LF+Ec in K7+Ec, ter prav tako iz homogeniziranega vzorca z oznako »0«, aseptiĉno

odpipetirali po 1 ml vsebine v sterilne epruvete z 9 ml fiziološke raztopine. Tako smo

dobili desetkrat razredĉene vzorce (razredĉitev 10-1

). Epruvete smo postavili v posodo z

ledom. V nadaljevanju smo pripravljali zaporedne 10-kratne razredĉitve posameznih

vzorcev do 10-5

. Razredĉitve smo nacepili v selektivna trda gojišĉa in inkubirali pri

ustreznih pogojih, opisanih zgoraj (3.3.3).

3.3.9 Barvanje po Gramu

Bakterije lahko loĉujemo na po Gramu pozitivne in po Gramu negativne, na podlagi

barvanja po Gramu. Za razliĉno barvanje je odgovorna celiĉna stena, ki obdaja citoplazmo

in citoplazemsko opno, bakterijski celici pa daje obliko in trdnost. Stena je po zgradbi

podobna mreţici, njena glavna sestavina pa je peptidoglikan ali murein, ki je kompleks N-

acetil glukozamina in N-acetil-muraminske kisline, vsebuje pa tudi alanin, glutaminsko

kislino, lizin in diaminopimeliĉno kislino. Murein je mreţasto grajen in je razliĉno

sestavljen pri po Gramu pozitivnih in negativnih bakterijah. Tako se kristali

metilvijoliĉnega barvila, ki nastanejo po dodatku raztopine joda, pri po Gramu pozitivnih

bakterijah ujamejo v debelo plast peptidoglikana, pri po Gramu negativnih pa ne. Po

spiranju z zmesjo acetona in etanola se tako le po Gramu negativne bakterije razbarvajo,

po Gramu pozitivne pa ostanejo vijoliĉne. V zadnjem koraku barvanja se po Gramu

negativne bakterije obarvajo z barvilom safranin rdeĉe.(Bratis in Brglez, 1984).



34

Preglednica 3: Razlike v kemiĉni zgradbi celiĉne stene po Gramu pozitivnih in negativnih bakterij

Gram + Gram -

Aminokisline glutaminska kislina in alanin

-

veĉina aminokislin

diaminopimeliĉna kislina

Lipidi do 2% lipidov 10-20% lipidov

Polisaharidi 36-60% polisaharidov 15-20% polisaharidov

Teihoiĉna kislina do 50% -

Murein veĉplasten enoplasten

3.4 STATISTIĈNA OBDELAVA PODATKOV

Za statistiĉno obdelavo smo uporabili statistiĉni paket SAS/STAT (1994) iz programskega

paketa SAS.

Vse vrednosti, ki smo jih dobili po štetju mikroorganizmov na petrijevih plošĉah, smo pred

testiranjem pretvorili v logaritemske vrednosti.

3.4.1 Statistični model

Lastnosti v poskusu smo obdelali s statistiĉnim modelom. Kot sistematska vpliva smo v

model vkljuĉili poskus (Pi) in skupino (Sj), znaĉilnosti njunih vplivov pa testirali po metodi

najmanjših kvadratov. Za analizo razlik med skupinami smo uporabili test sredin in

Tukeyev test.

yijk = µ + Pi + Sj + PSij + eijk … (2)

yij – število vezanih kolonijskih enot seva K7 oz. LF221 oz. E. coli

- srednja vrednost

Pi - vpliv poskusa, (i = 1, 2, 3, 4, 5)

Sj - vpliv skupine, (j = 1, 2, ….., 7 oz. 8)

PSij – vpliv interakcije med poskusom in skupino

eij - ostanek



35

4 REZULTATI

4.1 REZULTATI MIKROSKOPIRANJA ĈREVESNE SLUZNICE S PRIPETIMI

TESTNIMI LAKTOBACILI

Rezultati mikroskopiranja ĉrevesne sluznice, ki je bila najprej obdelana tako, da smo

odstranili ĉrevesno vsebino, mukus in naravno mikrobioto, zatem pa jo izpostavili celicam

L. gasseri K7 ali L. gasseri LF221, so pokazali, da se oba seva veţeta na enterocite

ĉrevesne sluznice. Vezali so se dovolj ĉvrsto, da jih s spiranjem nismo odstranili s površine

vzorcev. Nevezane bakterije smo s spiranjem s fosfatnim pufrom pred barvanjem

odstranili. Celice laktobacilov so obarvane vijoliĉno, celice enterocitov pa sivo- rumeno.

Vezavo smo ovrednotili s štetjem na plošĉah, kar je opisano v nadaljevanju.

a b

c d



36

Slika 8: Mikroskopski preparati (a-f) ĉrevesne sluznice s pripetimi laktobacili (L. gasseri K7),

pripravljeni z barvanjem po Gramu. Celice laktobacilov so obarvane vijoliĉno, celice enterocitov

pa sivo - rumeno

4.2 REZULTATI KONTROLE SPIRANJA VZORCEV (VZOREC »0«)

Tekom poskusa smo dodatno izvajali kontrolo izpiranja prvotne mikrobiote iz vzorcev

ĉrevesne sluznice. Prvotno mikrobioto smo s spiranjem ţeleli odstraniti, da ne bi motila

preskusa.

Za preskus, ali je bilo odstranjevanje prvotne mikrobiote uspešno, smo homogenizirane

vzorce ĉrevesne sluznice nacepili na plošĉe z gojišĉema EMB (za E. coli) in MRS (za

laktobacile).

Preglednica 4: Kontrola izpiranja prvotne mikrobiote iz košĉkov jejunuma (vzorec niĉ »0«)

MRS: A B SD POVP. LOG A LOG B SD LOG POVP. Log

Pos. 1«0« 4000 4000 0 4000 3,60 3,60 0 3,60

Pos. 3«0« 48000 43000 3535,53 45500 4,68 4,63 0,03 4,66

Pos. 4«0« 1 0 0,71 0,5 0 0 0 0

Pos. 5«0« 3 2 0,71 2,5 0,48 0,30 0,12 0,39

EMB A B SD POVP. LOG A LOG B SD LOG POVP. Log

Pos. 1«0« 387000 384000 2121,32 385500 5,59 5,58 0,00 5,59

Pos. 3«0« 29000 22000 4949,75 25500 4,46 4,34 0,09 4,40

Pos. 4«0« 0 14 9,90 7 0 1,15 0,81 0,57

Pos. 5«0« 3 10 4,95 6,5 0,48 1 0,37 0,74

Legenda:

»0« košĉek jejunuma brez kakršnihkoli dodatkov, samo spran

A,B paralelki; košĉka jejunuma, velika 10 cm

SD standardna deviacija

POVP. povpreĉna vrednost števila mikroorganizmov, preštetih na plošĉah, dobljenih od paralelk A in B

LOG A logaritmirana vrednost rezultatov vzorca A

LOG B logaritmirana vrednost rezultatov vzorca B

Pos. poskus

e f



37

Preštete kolonije (KE) smo pretvorili v logaritemsko vrednost. Iz preglednice 4 je

razvidno, da so ostanki mikroorganizmov v prvih dveh poskusih veliko veĉji kot v

naslednjih, ĉeprav je bil naĉin izvajanja poskusa enak. Mleĉnokislinskih bakterij, ki smo

jih šteli na gojišĉu MRS, je bilo v vseh vzorcih manj kot 105

na 10 cm2, kar je bilo za

potrebe testiranja zadovoljivo. Z izjemo enega vzorca je bilo v vseh drugih vzorcih tudi

preostalih enterobakterij, ki smo jih nacepljali na gojišĉe EMB, manj kot 105

na 10 cm2,

kar pomeni za 2 log enoti manjše število od povpreĉnega števila vezanih E. coli v

preskusih.

4.3 NAĈIN SPIRANJA (PO ADHEZIJI)

Med procesom vezave se laktobacili veţejo na resice ĉrevesa. Nevezane laktobacile pa je

pred nadaljnjim postopkom obdelave potrebno sprati. V tem delu poskusa smo ugotavljali

najprimernejši naĉin spiranja vzorcev, potrebnega za odstranitev nevezanih bakterij.

6,6

6,7

6,8

6,9

7

7,1

7,2

7,3

7,4

7,5

1 2 3 4

Naĉin spiranja

Lo

g š

t. v

ezan

ih c

eli

c s

ev

ov

K7

in

LF

22

1 (

KE

/10

cm2

)

K7

LF221

Slika 9: Vpliv postopka spiranja

Legenda:

Spiranje 1 košĉek ĉrevesa smo spirali samo roĉno (narahlo s pomakanjem v pufru PBS)

Spiranje 2 najprej roĉno spiranje, nato še 5 minut v stresalniku (37 °C, 150 obratov/min. v 200 ml pufra

PBS)

Spiranje 3 roĉno, nato dvakrat po 5 minut v stresalniku

Spiranje 4 roĉno in še 3 x 5 minut v stresalniku z vmesno menjavo pufra

Glede na rezultate (slika 9) je razvidno, da je po prvem naĉinu spiranja, ki je vkljuĉevalo le

roĉno spiranje s pomakanjem v pufer, ostalo pripetih na vzorce sluznice znaĉilno veĉ

testnih laktobacilov kot pri ostalih treh postopkih, ki so vkljuĉevali še dodatne korake

inkubacije v stresalniku. Pri sevu K7 je število vezanih celic pri postopku 1 znaĉilno veĉje

(p<0,05) od števila, dobljenega pri ostalih treh postopkih. Rezultati postopkov 2, 3 in 4 se

med seboj ne razlikujejo. Podobno lahko zakljuĉimo za sev LF221.

Ţe en ciklus stresanja je odstranil slabše vezane laktobacile, saj se po enem ali dveh

dodatnih ciklih stresanja število vezanih laktobacilov ni veĉ znaĉilno zmanjšalo. Na



38

podlagi rezultatov tega preskusa smo v nadaljnjih testih uporabljali protokol, ki je

vkljuĉeval najprej roĉno in nato še enkratno pet minutno spiranje vzorcev v stresalniku, v

pufru PBS.

4.4 PRIMERJAVA MED KONCENTRACIJO SUSPENZIJE IN VEZANIMI

CELICAMI

y = 0,6286x + 2,5465

R2 = 0,8331

y = 0,4635x + 3,4926

R2 = 0,774

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9

Koncentracija celic v suspenziji (log KE/cm2 )

Ad

hezi

ran

e c

elice (

log

KE

/cm

2 )

LF

K7

Linearno (LF)

Linearno (K7)

Slika 10: Primerjava koncentracije laktobacilov v suspenziji s številom vezanih laktobacilov

Slika 10 prikazuje primerjavo med koncentracijo suspenzij sevov LF221 oz. K7 in

logaritemskim številom vezanih kolonijskih enot obeh laktobacilov. Pri tem je razvidno,

tako pri sevu LF221 kot K7, da je višji koncentraciji suspenzije sledilo tudi veĉje število

vezanih kolonijskih enot. Koeficient determinacije v primeru seva LF221 je znašal R2 =

0,8331 in je pomenil, da smo pojasnili 83,31% variabilnosti. V primeru seva K7 je bil R2 =

0,774 in je bilo pojasnjene 77,4% variabilnosti. V obeh primerih je dodana tudi regresijska

enaĉba. Linearna funkcija slabše opiše povezavo med izhodišĉnim številom laktobacilov v

suspenziji in številom laktobacilov, ki so se vezali na ĉrevesno sluznico (nizke vrednosti

R2).

Primerjava med koncentracijo suspenzije ter številom vezanih L. gasseri K7 in LF221

kaţe, da se nekoliko bolje veţe LF221, kar lahko izraĉunamo tudi z regresijsko enaĉbo. Pri

obeh sevih je razvidno, da je višji koncentraciji suspenzije sledilo tudi veĉje število

vezanih kolonijskih enot.

Koncentracija laktobacilov v suspenziji

(log KE/ml)

Šte

vil

o v

ezan

ih L

. ga

sser

i K

7 i

n L

F2

21

(KE

/10

cm

2)



39

4.5 VEZAVA

Preglednica 5: Povpreĉne koncentracije suspenzij E. coli, ter sevov K7 in LF221 (log KE/ml) v

posameznih poskusih celotne naloge, izraţene v logaritemskih vrednostih

Poskus 1 Poskus 2 Poskus 3 Poskus 4 Poskus 5

Ec 7,83 6,54 7,88 7,85 7,85

K7 7,13 6,07 7,77 7,76 7,76

LF 7,01 6,48 7,95 8,42 8,42

Koncentracije suspenzij sevov E. coli O8:K88, K7 ter LF221 v posameznem poskusu

celotne naloge (preglednica 5). Pri tem smo ţeleli, da bi bile koncentracije suspenzij E. coli

pri vseh petih poskusih ĉimbolj enake, pri obeh laktobacilih pa razliĉne. Najniţje

koncentracije suspenzij smo imeli v drugem poskusu.

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

Poskus 2

6,07

Poskus 1

7,13

Poskus 4

7,76

Poskus 5

7,76

Poskus 3

7,77

Šte

vil

o v

ezan

ih L

. g

ass

eri

K7

(KE

/10

cm

2)

Število dodanih L. gasseri K7 v poskusu (log KE/ml)

K7 K7/Ec Ec/K7 K7+Ec

Slika 11: Vezava L. gasseri K7 na tanko ĉrevo prašiĉev pri razliĉni zaĉetni koncentraciji

Legenda: Susp. K7 – koncentracija suspenzij seva L. gasseri K7 (KE/ml)

K7 - inkubacija tkiva v suspenziji samostojnih sevov L. gasseri K7

K7/Ec – inkubaciji tkiva v suspenziji L. gasseri K7 je sledila inkubacija v suspenziji E. coli (izkljuĉevanje)

Ec/ K7 - inkubaciji tkiva v suspenziji E. coli je sledila inkubacija v suspenziji L. gasseri K7 (izpodrivanje)

K7+Ec – inkubacija tkiva v mešanici obeh sevov (tekmovanje) Prikazane so srednje vrednosti ± SD dveh ponovitev. Zvezdica (*) ponazarja srednjo vrednost, ki se je

statistiĉno znaĉilno (p<0,05) razlikovala od kontrolnega vzorca, to je ĉiste kulture L. gasseri K7 (K7).

Slika 11 prikazuje uspešnost vezave L. gasseri K7 (KE/10 cm2) glede na koncentracijo

dodanih L. gasseri K7 (log KE/ml) v vseh petih poskusih. Pri tem smo v sliki po velikosti

razvrstili dodano koliĉino suspenzije (log KE/ml) in temu primerno razvrstili zaporedno

številko opravljenega poskusa. Prikazana je vezava L. gasseri K7 samostojnega seva, ter v

*

*

*

*

*



40

poskusih izkljuĉevanja (K7/Ec), izpodrivanja (Ec/K7) in tekmovanja (K7+Ec). Podatki

prikazujejo logaritmirane srednje vrednosti ± SD dveh ponovitev. Na sliki je opaziti, da se

je L. gasseri K7 sposoben vezati in da z narašĉanjem koncentracije suspenzije narašĉa tudi

koliĉina vezanega seva K7. Prav tako je opaziti, da je število vezanih K7 v primeru

izkljuĉevanja (K7/Ec) pri vseh poskusih nekoliko niţje od ostalih naĉinov (samostojno

vezanje seva, tekmovanje, izpodrivanje).

Primerjava statistiĉno znaĉilnega odstopanja od samostojno vezanega seva K7 kaţe, da je

to le pri poskusu 1, kjer je koncentracija dodane K7 (7,13 log KE/ml) in sicer statistiĉno

znaĉilno odstopa izkljuĉevanje (K7/Ec), (P<0,0001). Pri ostalih poskusih ni bilo statistiĉno

znaĉilnega odstopanja od samostojno vezanega seva K7.

Ĉe pa med sabo primerjamo vse naĉine vezave znotraj poskusa vidimo, v poskusu 2, kjer

je koncentracija dodane K7 (6,07 log KE/ml), statistiĉno znaĉilno odstopanje v primeru

izkljuĉevanja (K7/Ec) in tekmovanja (K7+Ec). Na grafu je statistiĉno znaĉilno odstopanje

ponazorjeno z zvezdico (*).V poskusu 1 se v tem primeru statistiĉno znaĉilno razlikujejo

vsi naĉini vezave. Pri ostalih poskusih ni bilo statistiĉno znaĉilnega odstopanja.



41

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

Poskus 2

6,48

Poskus 1

7,01

Poskus 3

7,95

Poskus 4

8,42

Poskus 5

8,42

Šte

vil

o v

ezan

ih L

. g

ass

eri

LF

22

1

(KE

/10

cm2)

Število dodanih L. gasseri LF221 v poskusu (log KE/ml)

LF LF/Ec Ec/LF LF+Ec

Slika 12: Vezava L. gasseri LF221na tanko ĉrevo prašiĉev pri razliĉni zaĉetni koncentraciji

Legenda:

Susp. LF – koncentracija suspenzij seva Lactobacillus gasseri LF221 (KE/ml)

Susp. Ec – koncentracija suspenzij E. coli (KE/ml)

Ec - inkubacija tkiva v suspenziji samostojne E. coli

LF/Ec – inkubaciji tkiva v suspenziji seva LF221 je sledila inkubacija v suspenziji E. coli (izkljuĉevanje)

Ec/LF - inkubaciji tkiva v suspenziji E. coli je sledila inkubacija v suspenziji seva LF221 (izpodrivanje)

LF+Ec – inkubacija tkiva v mešanici obeh sevov (tekmovanje) Prikazane so srednje vrednosti ± SD dveh ponovitev. Zvezdica (*) ponazarja srednjo vrednost, ki se je

statistiĉno znaĉilno (p<0,05) razlikovala od kontrolnega vzorca, to je ĉiste kulture L. gasseri LF221 (LF).

Slika 12 prikazuje uspešnost vezave seva L. gasseri LF221 (log KE/10 cm2) na ĉrevesno

sluznico prašiĉev. Podatki prikazujejo logaritmirane srednje vrednosti ± SD dveh

ponovitev. V sliki smo po velikosti razvrstili dodano koliĉino suspenzije (log KE/ml) in

temu primerno razvrstili zaporedno številko opravljenega poskusa. Vidimo, da se je L.

gasseri LF221 sposoben vezati na celice ĉrevesne sluznice. Z veĉjo koncentracijo dodane

suspenzije LF221 se poveĉa tudi število vezanih sevov. Tudi tu smo ţeleli, da bi bile

koncentracije suspenzij E. coli pri vseh petih poskusih ĉimbolj enake, pri laktobacilu pa

razliĉne (preglednica 5). Do najvišjega števila vezanih L. gasseri LF221 je prišlo v

poskusu 3, kjer smo dodali 7,95 KE/ml LF221, pri višji koncentraciji suspenzije pa se je

koliĉina vezanih laktobacilov nekoliko zmanjšala. Razlike so sicer majhne, lahko pa

pomislimo, da je prišlo do zasiĉenosti vezave laktobacila. Statistiĉna obdelava kaţe, da se

nobena od skupin izkljuĉevanja, izpodrivanja ali tekmovanja statistiĉno znaĉilno ne

razlikuje.



42

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

Poskus 2

6,54

Poskus 1

7,83

Poskus 4

7,85

Poskus 5

7,85

Poskus 3

7,88

Šte

vil

o v

ezan

ih

E. co

li

(KE

/10

cm2)

Število dodanih E. coli v poskusu (log KE/ml)

Ec K7/Ec Ec/K7 K7+Ec

Slika 13: Zaviranje vezave E. coli, na ĉrevesno sluznico tankega ĉrevesa prašiĉev, z L.gasseri K7, pri

razliĉnih koncentracijah dodane suspenzije E. coli, pod pogoji izkljuĉevanja (K7/Ec),

izpodrivanja (Ec/K7) in tekmovanja (K7+Ec)

Legenda:

Susp. Ec – koncentracija suspenzij seva E. coli (KE/ml)

K7 - inkubacija tkiva v suspenziji samostojnih sevov L. gasseri K7

K7/Ec – inkubaciji tkiva v suspenziji L. gasseri K7 je sledila inkubacija v suspenziji E. coli

Ec/ K7 - inkubaciji tkiva v suspenziji E. coli je sledila inkubacija v suspenziji L. gasseri K7

K7+Ec – inkubacija tkiva v mešanici obeh sevov Prikazane so srednje vrednosti ± SD dveh ponovitev. Zvezdica (*) ponazarja srednjo vrednost, ki se je

statistiĉno znaĉilno (p<0,05) razlikovala od kontrolnega vzorca, to je ĉiste kulture E. coli (Ec).

Slika 13 nam prikazuje vezavo oz. zaviranje vezave E. coli na ĉrevesno sluznico tankega

ĉrevesa prašiĉev z L. gasseri K7. Vseh pet poskusov smo na sliki razvrstili glede na

koliĉino dodane suspenzije E. coli in sicer od najmanjše (6,54 KE/ml), pa do najveĉje (7,88

KE/ml). Razliĉne so tudi dodane suspenzije K7 in sicer (6,07), (7,13), (7,76), (7,76) in

(7,77 KE/ml). Razvidno je, da se je E. coli sposobna vezati na epitelne celice ĉrevesa, tako

samostojno, kot ob uĉinkovanju seva L. gasseri K7. V poskusu dva, pri naĉinu, kjer je

inkubacija tkiva potekala samo v ĉisti suspenziji E. coli, je najverjetneje prišlo do napake

pri delu, zaradi tega na gojišĉu niso zrasle kolonije E. coli. Kljub temu primeri

izkljuĉevanja, izpodrivanja in tekmovanja kaţejo sposobnost vezave E. coli tudi v

celotnem drugem poskusu. Statistiĉno analizo smo opravili z GLM proceduro,

Studentovim t testom. Primerjali smo rezultate znotraj vsakega od petih poskusov.

Kontrolne vzorce so ponazarjale srednje vrednosti vezane samostojne oz. ĉiste E. coli (Ec).

V poskusu 2 tega rezultata nismo dobili, zato v tem primeru statistiĉna obdelava ni bila

mogoĉa. V dveh (poskusa 4 in 5) od petih preskusov smo opazili nekaj znaĉilnih razlik

* *

* * *



43

(p<0,05) v vezavi E. coli (Ec) v ĉisti kulturi od vezave v primerih tekmovanja,

izpodrivanja in izkljuĉevanja. Izkljuĉevanje (K7/Ec) in izpodrivanje (Ec/K7) E. coli s

strani laktobacila K7 v veĉini primerov ni bilo statistiĉno znaĉilno.

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

Poskus 2

6,54

Poskus 1

7,83

Poskus 4

7,85

Poskus 5

7,85

Poskus 3

7,88

Šte

vil

o v

ezan

ih E

. co

li

(KE

/10

cm2)

Število dodanih E. coli v poskusu (KE/ml)

Ec LF/Ec Ec/LF LF+Ec

Slika 14: Zaviranje vezave E. coli na ĉrevesno sluznico tankega ĉrevesa prašiĉev z L. gasseri LF221, pri

razliĉnih koncentracijah dodane suspenzije E. coli, pod pogoji izkljuĉevanja (LF/Ec),

izpodrivanja (Ec/LF) in tekmovanja (LF+Ec)

Legenda:

Susp. Ec – koncentracija suspenzij E. coli (KE/ml)

Ec - inkubacija tkiva v suspenziji samostojne E. coli

LF/Ec – inkubaciji tkiva v suspenziji seva LF221 je sledila inkubacija v suspenziji E. coli

Ec/LF - inkubaciji tkiva v suspenziji E. coli je sledila inkubacija v suspenziji seva LF221

LF+Ec – inkubacija tkiva v mešanici obeh sevov Prikazane so srednje vrednosti ± SD dveh ponovitev. Zvezdica (*) ponazarja srednjo vrednost, ki se je

statistiĉno znaĉilno (p<0,05) razlikovala od kontrolnega vzorca, to je ĉiste kulture E. coli (Ec).

Slika 14 nam prikazuje vezavo oz. zaviranje vezave E. coli na ĉrevesno sluznico tankega

ĉrevesa prašiĉev z L. gasseri LF221. Koliĉine dodane suspenzije LF221 v posameznem

poskusu so razliĉne in sicer pri 6,54 KE/ml E. coli je dodano (6,48 KE/ml) LF221, nadalje

(7,01), (8,42), (8,42), in pri 7,88 KE/ml dodane suspenzije E. coli je bilo suspenzije LF221

(7,95 KE/ml). Podatki prikazujejo srednje vrednosti ± SD dveh ponovitev. Razvidno je, da

se je E. coli sposobna vezati na epitelne celice ĉrevesa, tako v primeru, kjer smo tkivo

inkubirali samo v suspenziji E. coli, kot tam, kjer je uĉinkoval dodan sev LF221.

V poskusu 2, za tkivo samo v ĉisti suspenziji Ec., kjer je dodane E. coli 6,54 KE/ml, zaradi

najverjetnejše napake pri delu in poslediĉno manjkajoĉega rezultata, statistiĉna obdelava ni

bila mogoĉa. Sicer pa ta kaţe, da se, z eno izjemo (poskus 3, LF/Ec) nobena od skupin

*

*



44

izkljuĉevanja, izpodrivanja ali tekmovanja statistiĉno znaĉilno ne razlikuje od primerjalne

skupine, kjer smo tkivo inkubirali v suspenziji samostojne E. coli. Na sliki pa je razvidno,

da je v vseh poskusih najuspešnejša vezava E. coli v primeru tekmovanja, najmanj pa pri

izpodrivanju E. coli s strani LF221.

5 RAZPRAVA IN SKLEPI

5.1 RAZPRAVA

Vezava na ĉrevesno sluznico je pomemben kriterij za izbiro probiotiĉnih sevov. Narejen je

bil poskus vezave dveh probiotikov, L. gasseri LF221 in L. gasseri K7, na ĉrevesno

sluznico tankega ĉrevesa prašiĉev. Prej imenovani L. gasseri LF221 so kasneje

prerazporedili v vrsto L. gasseri. Ĉloveška probiotiĉna seva L. gasseri K7 in LF221 sta

izolirana iz razliĉnih otrok ter ob razliĉnem ĉasu, izkazalo pa se je, da producirata enake

bakteriocine. Ugotovili so, da so genski nukleotidni zapisi za bakteriocina seva K7,

poimenovana gassericin K7 A (GenBank EF392861) in gassericina K7 B (GenBank

AY307382), podobni zapisom za bakteriocine seva LF221 (acidocin LF221 A in acidocin

LF221 B) (Bogoviĉ Matijašić in Rogelj, 1998; Zoriĉ-Peternel in sod., 2010). V poskus v tem delu so bili vkljuĉeni devet mesecev stari prašiĉi pitanci. Uporabili smo

osrednji del tešĉega ĉrevesa (jejunuma). Prebavni sistem prašiĉev je primerljiv s

ĉloveškim, zato so prašiĉi veĉkrat uporabljeni kot testne ţivali znanstvenih poskusov, med

njimi tudi poskusov glede uporabe probiotikov (Goldin in sod., 1988; Singer in sod., 2003;

Jensen in sod., 2011).

Ohlajene vzorce ĉrevesne sluznice, ki smo jih takoj po ţrtvovanju ţivali na ledu prenesli v

laboratorij, smo sprali s pufrom, da smo odstranili obstojeĉo mikrobioto ĉrevesa, nato smo

narezali vzorce velikosti 10 cm2. Po ponovnem spiranju s pufrom smo nekaj vzorcev

sluznice pregledali s štetjem na plošĉah, da smo videli, kako uspešno smo odstranili

endogeno mikrobioto, rezultate pa imenovali »vzorec 0«. To kontrolo smo izvajali tekom

vseh petih neodvisnih poskusov. Ugotovili smo, da smo endogeno mikrobioto v veĉji meri

odstranili, saj je je ostalo za najmanj 2 log enoti manj kot se je na sluznico vezalo testnih

laktobacilov oz. E. coli.

Seva L. gasseri K7 in L. gasseri LF221, ki sta znana kot varna probiotika, ter sta

bakteriocinogena in imata širok spekter protimikrobne aktivnosti (Bogoviĉ Matijašić in

sod., 2004), smo predhodno namnoţili s kultivacijo v komercialnem gojišĉu MRS. S

centrifugiranjem smo odstranili preostalo gojišĉe, celice pa resuspendirali v pufru z

ustrezno pH vrednostjo, tako da smo dobili ustrezne koncentracije suspenzij, v katere smo

pomakali košĉke. Koncentracije suspenzij obeh laktobacilov in E. coli v petih neodvisnih

poskusih, nacepljene in preštete na petrijevih plošĉah so variirale:

- K7 od 1,2x106 KE/ml do 5,95x10

7 KE/ml,

- LF221 od 3x106 KE/ml do 2,65x10

8 KE/ml,

- E.c. od 3,5x106 KE/ml do 7,55x10

7 KE/ml.



45

Pripravljene vzorce tkiva smo vsakiĉ potopili v suspenzijo celic enega od preskušanih

sevov in inkubirali pri 37 °C 30 minut, s ĉimer smo omogoĉili vezavo preskušanih bakterij

na še vedno ţive ĉrevesne epitelne celice. Nevezane celice smo sprali z vzorcev tkiva. Na

koncu smo število vezanih celic ugotovili tako, da smo vzorce prenesli v steklenice s

fiziološko raztopino, vsakega posebej homogenizirali, pripravili razredĉitve, jih nacepili na

komercialno selektivno gojišĉe, inkubirali in prešteli zrasle kolonije.

Rezultate povpreĉnih koncentracij suspenzij sevov LF221, K7 ter E. coli v posameznem

poskusu smo pretvorili v logaritemske vrednosti (preglednica 5). Pri tem smo ţeleli, da bi

bile koncentracije suspenzij E. coli pri vseh petih poskusih ĉimbolj enake, kar je uspelo v

zadnjih štirih poskusih, pri obeh laktobacilih pa razliĉne (dokaj enake so v zadnjih treh

poskusih).

Znano je, da nekateri mikroorganizmi rastejo na površini resic (epitelija), drugi ţivijo

prosto v lumnu ĉrevesja, tretji pa se razrašĉajo po kanalih kript in po epiteliju. (Fuller,

1984). Ţeleli smo prešteti samo vezane mikroorganizme. Roĉno spiranje, s tresenjem

košĉka s pinceto v PBS, in nato še 5 minutno spiranje v stresalniku pri 37 °C, 150

obratih/min., v 200 ml pufra PBS, se je pokazalo kot najprimernejši naĉin spiranja

nevezanih laktobacilov. Postopek spiranja je bil uspešen in smo ga izvajali tekom vseh

poskusov.

Ugotavljali smo sposobnost ex vivo vezave L. gasseri K7 na ĉrevesno sluznico tankega

ĉrevesa prašiĉev. Po Kališniku (2002) metoda ex vivo pomeni delovanje v poskusnih

razmerah zunaj ţivega organizma. Delali smo s tkivom, katero je bilo dnevno sproti

odvzeto prašiĉem, v manj kot dveh urah po odvzemu pa smo priĉeli izvajati poskus.

Ţivljenjske funkcije ĉrevesa so torej bile še aktivne in tako je bilo ustvarjeno ĉimbolj

kompleksno in fiziološko ţivemu podobno ĉrevesno okolje.

Dokazana je ţe bila sposobnost vezave laktobacilov na plošĉate epitelijske celice v grlu in

poţiralniku prašiĉev in drugih ţivali Fuller in sod., 1978. Mäyrä-Mäkinen in sod. (1983) so

prouĉevali vezavo razliĉnih laktobacilov na stebriĉaste epitelne celice z in vitro metodo. Po

Kališniku, 2002 in vitro raziskave potekajo v umetnem okolju (v epruveti ali v posodi za

kulturo tkiva). Pri tem simuliramo pogoje, ki so podobni tistim v gostitelju (npr. v

prebavilih) (Lavrenĉiĉ, 2003).

Naš adhezijski test je bil izveden in prirejen po metodi Mäyrä-Mäkinen (1983). Sposobnost

vezave L. gasseri K7 na epitelne celice ĉrevesne sluznice smo dokazali (slika 11). Veĉji

koncentraciji dodanih laktobacilov je vedno sledilo veĉje število vezanih laktobacilov K7.

Opazimo, da je kljub veĉji razliki v koliĉini dodane suspenzije med drugim in prvim

poskusom napram prvim in ĉetrtim poskusom, vezava pri slednjem veĉja. Ta preskok

lahko pove, da je za dovoljšno vezavo in uspešno delovanje dobre mikrobiote v ĉrevesju

potrebna doloĉena koliĉina posameznega laktobacila. Zato moramo biti pozorni pri

navedbi vsebovane koliĉine ali roku uporabe izdelka z laktobacili, saj koliĉina laktobacilov

s starostjo izdelka pada, poslediĉno pa tudi število vezanih laktobacilov.

Ugotavljali smo tudi sposobnost ex vivo vezave L. gasseri LF221 na ĉrevesno sluznico

tankega ĉrevesa prašiĉev. Spencer in Chesson (1994) sta izolate, prvotno zrasle na MRS



46

agarju in preštete pod mikroskopom, razdelila na moĉno vezane in nevezane oz. slabo

vezane na enterocite jejunuma. V poskusu je bilo vkljuĉenih 43 laktobacilov izoliranih iz

razliĉnih delov prebavnega trakta, med njimi je bilo 11 primerkov sevov L. acidophilus,

nato L. fermentum, L. salivarius, L. delbruckii, L. plantarum in drugi. V nadaljevanju

poskusa na sveţe pripravljenih prašiĉjih enterocitih se je kot najmoĉneje vezan izkazal L.

fermentum, nasprotno od priĉakovanega, pa so se vsi sevi L. salivarius in veĉina sevov L.

acidophilus izkazali kot slabo vezani na enterocite jejunuma. V našem primeru je vezava

potekala dobro (slika 12), opaziti pa je, da je najboljša vezava potekala v poskusu 3 s 7,95

log ke/ml dodanih LF221, pri višji vrednosti dodanih laktobacilov pa je bila vezava

nekoliko slabša, kar kaţe tudi na vpliv dodane koliĉine suspenzije in morebitno zasiĉenost.

Spencer in Chesson (1994) tudi navajata veliko boljšo sposobnost vezave tistih trdno

vezanih Lactobacillus spp., ki so rasli na MRS trdem gojišĉu, kot pa v tekoĉem gojišĉu

MRS. V našem poskusu smo uporabili tekoĉe gojišĉe MRS, vezava pa je bila kljub temu

uspešna.

Mäyrä-Mäkinen in sod. (1983) navajajo, da so bili pri prašiĉih iz ĉrevesnega tkiva in blata

najpogosteje izolirani sevi vrst L. delbrueckii, L. acidophilus in L. fermentum. Pri tem se je

na epitelne celice prašiĉev dobro vezalo 13 od 22 sevov laktobacilov, kar dokazuje

uspešnost vezave. Splošno pa je vezava bila variabilna celo med sevi iste vrste. Sicer pa so

tudi dokazali, da adhezivni sevi pri prašiĉih tolerirajo nizek pH in ţolĉne kisline, kar je

pomembno za njihovo preţivetje pod pogoji, ki so v ţelodcu in ĉrevesju.

Primerjali smo tudi vezavo obeh sevov testnih laktobacilov L. gasseri. Relacija med

številom dodanih in vezanih celic v poskusu je bila doloĉena z regresijsko analizo pa

metodi najmanjših kvadratov (slika 15). Vidimo, da se sev LF221 veţe bolje kot sev K7.

Linearna funkcija slabše opiše povezavo med izhodišĉnim številom laktobacilov v

suspenziji in številom laktobacilov, ki so se vezali na ĉrevesno sluznico (nizke vrednosti

R2). Razvidno pa je, da z narašĉajoĉo koliĉino dodane suspenzije narašĉa tudi koliĉina

vezanih laktobacilov, tako pri K7 kot LF221. Koeficient determinacije v primeru seva

LF221 znaša (R2 = 0,833), s tem smo pojasnili 83,31% variabilnosti. Bogoviĉ Matijašić in

sod. (2003) prav tako navajajo, da višji koncentraciji suspenzije sledi veĉje število vezanih

kolonijskih enot, vse dokler ne pride do zasiĉenosti.

V nadaljevanju nas je zanimala reakcija laktobacilov v primerih, ko v realni situaciji

delovanja ĉrevesa prostora epitelnih celic ne zasedajo sami, ampak se morajo boriti s

posameznimi patogeni. Vkljuĉena so bile tudi bakterije E. coli, kot tipiĉni tipiĉne

predstavnice enterobakterij.

Preizkušali smo vezavo obeh sevov laktobacilov ter E. coli v razmerah tekmovanja

(laktobacili in E. coli dodani istoĉasno), izkljuĉevanja (laktobacili dodani pred E. coli)

oziroma izpodrivanja (E. coli dodana pred laktobacili).

Pri statistiĉni obdelavi podatkov smo za testiranje vezave laktobacilov na sluznico ĉrevesa,

simulirano kot izpodrivanje, izkljuĉevanje in tekmovanje, uporabili Studentov t test

(p<0,05) in sicer na podlagi primerjav s kontrolnimi primeri, katere so predstavljali ĉisti

sevi. Znaĉilnost posameznih vplivov nam povedo p – vrednosti.



47

Vpliv poskusa in vpliv skupine v modelu laktobacilov (model 1) smo obdelali z metodo

najmanjših kvadratov, ANOVA. V analizo je vkljuĉenih 5 poskusov, 8 skupin, vseh

opazovanj je bilo 80. Koeficient determinacije modela 1 znaša R2

= 0,920963. S tem

modelom smo torej pojasnili 92,1% variabilnosti. Vpliv poskusa je visoko statistiĉno

znaĉilen (p<0,0001), prav tako je visoko statistiĉno znaĉilen vpliv skupine (p<0,0001)

(priloga A).

Rezultati nadaljnje razdelitve na posamezne nivoje vplivov v modelu laktobacilov (model

1) kaţejo, da je vpliv poskusa 1 in 2 visoko statistiĉno znaĉilen (p<0,0001), poskusa 3

statistiĉno znaĉilen (p = 0,0421), poskusa 4 pa statistiĉno neznaĉilen (p = 0,6216). Vpliv

skupine je bil visoko statistiĉno znaĉilen v primeru tekmovanja (K7+Ec) in izkljuĉevanja

(K7/Ec), vpliv ostalih posameznih skupin je bil statistiĉno znaĉilen, medtem ko je vpliv t.i.

tekmovanja med sevom LF in E. coli (LF+Ec), statistiĉno neznaĉilen (p = 0,6491). (priloga

B).

Vpliv poskusa in vpliv skupine v modelu E. coli (model 2), smo obdelali z metodo

najmanjših kvadratov, ANOVA V analizo je vkljuĉenih 5 poskusov, 7 skupin. Vseh

opazovanj je bilo 70, zaradi manjkajoĉih podatkov jih je bilo v analizo vkljuĉenih 67.

Koeficient determinacije modela 2 znaša R2

= 0,8613 in pove, da smo z modelom pojasnili

86,13% variabilnosti. Vpliv poskusa je visoko statistiĉno znaĉilen (p<0,0001), prav tako je

na vezavo seva E. coli na sluznico ĉrevesa visoko statistiĉno znaĉilno vplivala skupina

(p<0,0001) (priloga C).

Rezultati nadaljnje razdelitve na posamezne nivoje vplivov modela 2 kaţejo, da sta

poskusa 1 in 2 visoko statistiĉno znaĉilno vplivala na število (log ke) vezanih sevov E. coli

(p<0,0001). Poskus 3 je statistiĉno znaĉilno vplival (p = 0,0078), poskus 4 pa je bil

statistiĉno neznaĉilen. Visoko statistiĉno znaĉilni sta bili skupini tekmovanja (K7+Ec) in

(LF+Ec), skupina izpodrivanja (Ec/LF) je vplivala statistiĉno znaĉilno (p = 0,0275), vpliv

ostalih skupin pa je bil statistiĉno neznaĉilen (priloga D).

Z metodo najmanjših kvadratov je bilo ugotovljeno, da je p – vrednost vsakega od nivojev

skupin, tako pri modelu 1, kot modelu 2, enaka p<0,0001, vpliv skupin je torej statistiĉno

znaĉilen. Pri tem je bil za model 1 uporabljen Tukey-ev test, za model 2 pa Tukey-

Kramarjev test.

Z metodo najmanjših kvadratov, vpliv interakcije med poskusom in skupino, pri vezavi L.

gasseri K7 (slika 11, priloga J) so v poskusu 2, kjer je bilo število dodanih laktobacilov K7

7,13 log KE/ml, statistiĉno znaĉilne razlike med izkljuĉevanjem (K7/Ec) in tekmovanjem

(K7+Ec). V poskusu 1 so statistiĉno znaĉilne razlike med izkljuĉevanjem (K7/Ec) in

izpodrivanjem (Ec/K7), med izkljuĉevanjem (K7/Ec) in vezavo ĉiste kulture K7 (K7), ter

med izkljuĉevanjem (K7/Ec) in tekmovanjem (K7+Ec). V tretjem, ĉetrtem in petem

poskusu ni bilo statistiĉno znaĉilnih razlik. Opaziti je, da je število vezanih L. gasseri K7 v

primeru izkljuĉevanja (K7/Ec) pri vseh poskusih nekoliko niţje od ostalih naĉinov

(samostojno vezanje seva, tekmovanje, izpodrivanje).

Dokazali smo tudi uspešnost vezave L. gasseri LF221 v primerih izkljuĉevanja,

izpodrivanja in tekmovanja, vendar statistiĉno znaĉilnih razlik ni bilo (slika 12). Do



48

najvišjega števila vezanih L. gasseri LF221 je prišlo v poskusu 3, kjer smo dodali 7,95 log

KE/ml LF221, pri višji koncentraciji dodane suspenzije pa se je koliĉina vezanih

laktobacilov nekoliko zmanjšala. Razlike so sicer majhne, lahko pa pomislimo, da je prišlo

do zasiĉenosti vezave laktobacila. Nekoliko veĉ LF221 je vezanih v primeru izpodrivanja

(Ec/LF). To bi morda lahko pomenilo, da je v primeru okuţbe ĉrevesja s sevi E. coli

smiselno uţivati L. gasseri LF221, saj se ta v primeru izpodrivanja (Ec/LF), kljub invaziji

patogena, še nekoliko uspešnejše veţe.

Vezavo oz. zaviranje vezave E. coli na ĉrevesno sluznico tankega ĉrevesa prašiĉev z L.

gasseri K7 smo dokazali (slika 13). Statistiĉno analizo smo opravili z metodo najmanjših

kvadratov, GLM proceduro, Tukey-Kramerjev test, odvisna spremenljivka je log E. coli;

Studentovim t testom. Primerjali smo rezultate znotraj vsakega od petih poskusov, vpliv

interakcije med poskusom in skupino. Kontrolne vzorce so ponazarjale srednje vrednosti

vezane samostojne oz. ĉiste E. coli (Ec). V poskusu 2 tega rezultata nismo dobili, zato v

tem primeru statistiĉna obdelava ni bila mogoĉa. Rezultati analiz preostalih poskusov nam

kaţejo, da se od vezave E. coli v ĉisti kulture (Ec) statistiĉno znaĉilno razlikuje (p<0,05)

samo t.i. tekmovanje (K7+Ec) med E. coli in K7 (p=0,0234), in sicer znotraj poskusa 4.

Izkljuĉevanje (K7/Ec) in izpodrivanje (Ec/K7) E. coli s strani laktobacila K7 ni statistiĉno

znaĉilno.

Vezavo oz. zaviranje vezave E. coli na ĉrevesno sluznico tankega ĉrevesa prašiĉev z L.

gasseri LF221 prikazuje slika 14. Nobena od skupin izkljuĉevanja, izpodrivanja ali

tekmovanja se statistiĉno znaĉilno ne razlikuje od primerjalne skupine, kjer smo tkivo

inkubirali v suspenziji ĉiste kulture E. coli. Na sliki pa je razvidno, da je v vseh poskusih

najuspešnejša vezava E. coli v primeru tekmovanja, najmanj pa pri izpodrivanju E. coli s

strani LF221. V poskusu 3, kjer je bilo najveĉ dodane E. coli, pa se vezava te statistiĉno

znaĉilno razlikuje med izkljuĉevanjem (LF/Ec) in tekmovanjem (LF+Ec).

Literature s podobno temo raziskovanja skorajda ni, zato je neposredna primerjava

nemogoĉa. Podobno kot v našem delu, so Spencer in Chesson (1994) opazili, da testiranje

v razmerah izkljuĉevanja (laktobacili dodani pred E. coli), tekmovanja (laktobacili in E.

coli dodani hkrati) in izpodrivanja (E. coli dodane pred laktobacili) vplivalo na vezavo

enterotoksigene E. coli na prašiĉje enterocite.

Raţman (2009) navaja, da so seva K7 in LF221 odkrili v ĉrevesni sluznici nekaterih

ţrtvovanih ţivali peti dan po zaĉetku dajanja (oralno), v blatu pa še šest dni po konĉanem

krmljenju s sevoma. To dokazuje, da sta seva sposobna pripenjanja na ĉrevesno sluznico in

imata dobre preţivitvene sposobnosti v prebavnem traktu (Raţman, 2009).

Stojković in sod. (2003) navajajo rezultate raziskave in vivo (v ţivem organizmu) o

inhibiciji E. coli z L. gasseri K7 na gnotobiotiĉnih pujskih. Laktobacili K7 so preţiveli in

zaĉasno kolonizirali prebavni trakt pujskov. Pri zaviranju E. coli s strani seva K7 so bili

prisotni razliĉni mehanizmi, kot stimulacija imunskega sistema in produkcija organskih

kislin ter tudi tekmovalno izkljuĉevanje. Opazovanje ţivali je pokazalo pozitivni uĉinek L.

gasseri K7 na kondicijo in zdravje prašiĉev. Vnetij ali razdraţenosti na ĉrevesju ţivali,

tretiranih s sevom K7 ni bilo opaziti, kar potrjuje varnost uporabe seva.



49

Bogoviĉ Matijašić in sod. (2004) so oba seva, LF221 in K7, odstavljenim pujskom

aplicirali v obliki suspenzije celic (in vivo poskusi) in, podobno kot pri miših, dokazali

prisotnost obeh sevov v blatu. Pri tem so opazili pozitivne uĉinke predvsem seva K7 na

prirast in do doloĉene mere tudi na konverzijo krme, kot pomembnih dejavnikov

ekonomske prireje prašiĉev. Vsi pujski so ostali zdravi in tudi ni bilo diareje. Kolonije

identiĉne sevom LF221 in K7 so bile izolirane le iz blata ţivali, ki so bile krmljene s sevi

LF221 oziroma sevi K7.

Ĉeprav je Fuller (2006) dvomil, da je vezava na ĉrevesni epitel pomemben kolonizacijski

faktor, se je zavedal, da je kolonizacija bistven predpogoj probiotiĉne aktivnosti, saj tako

probiotiĉnim mikroorganizmom med drugim omogoĉi ĉas za izvrševanje njihovih uĉinkov.

Vezava na ĉrevesni steni tudi upoĉasni premikanje organizmov s peristaltiko. In z našo

nalogo je bilo dokazano, da so tako L. gasseri K7, L. gasseri LF221, kot E. coli sposobni

vezave na ĉrevesno sluznico prašiĉev tudi ex vivo.

5.2 SKLEPI

Glede na rezultate, ki smo jih dobili z raziskavo, smo prišli do nekaterih pomembnih

sklepov:

Seva L. gasseri K7 in L. gasseri LF221 sta sposobna vezave na ĉrevesno sluznico (ex

vivo).

Bakterije seva E. coli O8:K88 so se sposobne vezati na ĉrevesno sluznico prašiĉev (ex

vivo).

Seva L. gasseri K7 ter L. gasseri LF221 nista izkazala statistiĉno znaĉilnega vpliva na

vezavo E. coli na ĉrevesno sluznico prašiĉev (ex vivo) v testnih razmerah tekmovanja,

izkljuĉevanja ali izpodrivanja.

Prvi dve hipotezi, ki smo si ju zastavili pred izvajanjem poskusa, smo tako potrdili, zadnje

pa ne.



50

6 POVZETEK

Namen našega dela je bil prouĉiti vezavo dveh sevov laktobacilov s probiotiĉnimi

lastnostmi, ki so jih dokazali v številnih predhodnih raziskavah in vitro in in vivo.

Zanimalo nas je, ali sta seva Lactobacillus gasseri K7 in Lactobacillus gasseri LF221

sposobna ex vivo vezave na ĉrevesno sluznico prašiĉev. Prav tako smo ugotavljali

sposobnost vezave Escherichia coli O8:K88 same na ĉrevesno sluznico ex vivo, kakor tudi

vezave v razmerah tekmovanja, izkljuĉevanja oziroma izpodrivanja.

Uporabili smo osrednji del prašiĉjega tankega ĉrevesa, to je tešĉega ĉrevesa ali jejunuma,

ki smo ga takoj po odvzemu na ledu prinesli v laboratorij in obdelali.

Ĉrevo smo vsakiĉ trikrat sprali s PBS in tako odstranili ĉrevesno vsebino, nato pa ga

razrezali na košĉke, velike 10 cm2. Sledila je inkubacija v hladilniku (4°C, 30 min), da se

je mukus-sluz odlušĉila, ter ponovno trikratno spiranje vsakega košĉka v PBS. Najprej smo

s štetjem na plošĉah preverili, ali smo iz vzorcev ĉrevesne sluznice uspeli odstraniti

endogeno mikrobioto. V ta namen smo vzorce homogenizirali, ustrezno razredĉili, nacepili

na hranljivi podlogi MRS za mleĉnokislinske bakterije ter EMB za enterobakterije,

inkubirali (37 °C, 48 oz. 24 ur) in nato prešteli kolonije. Ugotovili smo, da je prvotna

mikrobiota zadovoljivo izprana.

Pred poskusom smo testne seve L. gasseri K7, L. gasseri LF221 in E. coli O8:K88 nacepili

v sveţe gojišĉe in inkubirali 18 ur.

Z adhezijo smo najprej ţeleli ugotoviti sposobnost vezave ĉistih sevov L. gasseri LF221, L.

gasseri K7 ter E. coli ex vivo.

Tekmovanje med E. coli in L. gasseri LF221 smo izvedli tako, da smo v testu uporabili

suspenzijo, ki je vsebovala oba seva hkrati (Ec+LF), tekmovanje med E. coli in sevom K7

z mešanico kultur E. coli in L. gasseri K7 (Ec+K7).

Morebitno izpodrivanje E. coli s strani laktobacilov smo opazovali tako, da smo

posamezne košĉke pomoĉili najprej v suspenzijo E. coli, potem pa v enega od testnih

laktobacilov osnovnega vzorca. Oznaka teh je bila Ec/LF oziroma Ec/K7.

Izkljuĉevanje E. coli s strani laktobacilov je bilo simulirano na naĉin, da smo posamezne

košĉke ĉrevesa inkubirali najprej v suspenziji enega od testnih sevov laktobacilov, nato pa,

po vmesnem spiranju, v suspenziji E. coli. Oznaki vzorcev sta bili LF/Ec in K7/Ec.

Pri izvajanju poskusa vezave sevov na košĉke ĉrevesa smo po ţe zgoraj omenjeni zaĉetni

obdelavi ĉrevesa in po trikratnem spiranju vsakega košĉka v PBS, le te potapljali v

suspenzije celic preskušanih sevov in inkubirali pri 37 °C 30 minut, s ĉimer smo omogoĉili

vezavo preskušanih bakterij na enterocite ĉrevesne sluznice.

Nevezane celice smo, po prej dokazanem najprimernejšem naĉinu, sprali z vzorcev tkiva

najprej roĉno, nato še 5 minut v stresalniku (37 °C, 150 obratov/min. v 200 ml pufra PBS).



51

Vzorce smo prenesli v steklenice s fiziološko raztopino, homogenizirali, pripravili

razredĉitve, jih nacepili na komercialno selektivno gojišĉe, inkubirali in po metodi štetja na

plošĉah prešteli zrasle kolonije.

Za statistiĉno obdelavo smo uporabili statistiĉni paket SAS/STAT (1994) iz programskega

paketa SAS. Vse vrednosti, ki smo jih dobili po štetju mikroorganizmov na petrijevih

plošĉah, smo pred testiranjem pretvorili v logaritemske vrednosti. Lastnosti v poskusu smo

obdelali s statistiĉnim modelom. Kot sistematska vpliva smo v model vkljuĉili poskus (Pi)

in skupino (Sj), znaĉilnosti njunih vplivov pa testirali po metodi najmanjših kvadratov. Za

analizo razlik med skupinami smo uporabili test sredin in Tukeyev test.

Rezultati mikroskopiranja ĉrevesne sluznice so pokazali, da se oba seva, L. gasseri K7 in

L. gasseri LF221, veţeta na enterocite ĉrevesne sluznice.

Primerjava med koncentracijo suspenzije ter številom vezanih L. gasseri K7 in LF221 je

pokazala, da se nekoliko bolje veţe LF221, kar smo izrazili tudi z regresijsko enaĉbo. Pri

obeh sevih je razvidno, da je višji koncentraciji suspenzije sledilo tudi veĉje število

vezanih kolonijskih enot.

Tudi sev L. gasseri K7 se je uspešno vezal na ĉrevesno sluznico (ex vivo). V veĉini

preskusov nismo opazili, da bi bila vezava seva K7 v prisotnosti E. coli drugaĉna kot v

primeru, ko so bili vzorci izpostavljeni le laktobacilom seva K7. Podobno se je pokazalo

tudi pri preskušanju seva L. gasseri LF221 samega oziroma v kombinacijah z E. coli.

Sev E. coli O8:K88 je izkazal sposobnost vezave na ĉrevesno sluznico (ex vivo), tako v

primeru dodajanja ĉiste kulture kot tudi v razmerah izkljuĉevanja, izpodrivanja in

tekmovanja. Pri tem prisotnost sevov L. gasseri K7 ali L. gasseri LF221 ni znaĉilno

vplivala na vezavo E. coli na ĉrevesno sluznico prašiĉev.



52

7 VIRI

Andlovic A. 2002. Escherichia coli. V: Medicinska bakteriologija z imunologijo in

mikologijo. Gubina M., Ihan A. (ur.). Ljubljana, Medicinski Razgledi: 185-188

Batis J., Brglez I. 1984. Mikrobiologija za veterinarje: skripta. Splošni del. Ljubljana,

Biotehniška fakulteta, VTOZD za veterinarstvo: 112 str.

Bogoviĉ Matijašić B., Rogelj I. 1998. Bacteriocin complex of Lactobacillus gasseri LF221

— production studies in MRS media at different pH values and effect against

Lactobacillus helveticus ATCC 15009. Process Biochemistry, 33, 3: 345-352

Bogoviĉ Matijašić B., Rogelj I., Nes I. F., Holo H. 1998. Isolation and characterization of

two bacteriocins of Lactobacillus gasseri LF221. Applied Microbiology and

Biotechnology, 49: 606-612

Bogoviĉ Matijašić B., Rogelj I. 1999. Bacteriocinogenic activity of lactobacilli isolated

from cheese and baby faeces. Food Technology and Biotechnology, 37, 2: 93-100

Bogoviĉ Matijašić B., Rogelj I. 2000. Lactobacillus K7 – a new candidate for a probiotic

strain. Food Technology and Biotechnology, 38, 2: 113-119

Bogoviĉ Matijašić B., Narat M., Zoriĉ M. 2003. Adhesion of two Lactobacillus gasseri

probiotic strains on Caco-2 cells. Food Technology and Biotehnology, 41, 1: 83-88

Bogoviĉ Matijašić B., Narat M., Zoriĉ M., Rogelj I. 2006. Ability of Lactobacillus gasseri

K7 to inhibit E. coli adhesion in vitro on Caco-2 cells and ex vivo on pigs' jejunal tissue.

International Jurnal of Food Microbiology, 107, 92-96

Bogoviĉ Matijašić, B., Stojković, S., Salobir, J., Malovrh, Š., Rogelj, I. 2004. Evaluation of

the Lactobacillus gasseri K7 and LF221 strains in weaned piglets for their possible

probiotic use and their detection in the faeces. Animal Research, 53: 35-44

Bolduan G., Jung H., Schneider R. 1988. Recent advances in the nutrition of weaner

piglets. Pigs News and Information, 9, 4: 381-385

Carroll I. M., Ringel-Kulka T., Keku T. O., Chang, Y. H., Packey, C. D., Sartor, E. B.,

Ringel Y. 2011. Molecular analysis of the luminal-and mucosal-associated intestinal

microbiota in diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Americal Journal of

Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology, 301, 5: G799–G807

Cho J. H., Zhao P. Y., Kim I. H. 2011. Probiotics as a Dietary Additive for Pigs. Journal of

Animal and Veterinary Advances, 10: 2127-2134



53

Cranwell P. D. 1995. Development of the National Gut and Enzymes System. V: The

national Pig development and Survival. Varley M. A. (ur.). Leeds, Department of

Animal Physiology and Nutrition: 99-153

Ĉerne M. 1996. Morfološke, morfometrijske in histokemiĉne raziskave tankega ĉrevesa pri

malabsorpcijskem sindromu prašiĉev odstavljencev. Doktorska disertacija. Ljubljana,

Veterinarska fakulteta: 168 str.

De Magalhaes J. T., Bitencourt L. L., Teixeira leite M. C., do Carmo A. P., de Morase, C.

A. 2015. The use of probiotics to enhance animal performance. V: Probiotics and

Prebiotics: Current research and future trends. Venema K., do Carmo A. P. (ur.). UK,

Norfolk, Caister Academic Press: 459-468

Dolinšek J, Urlep-Ţuţej D, Miĉetić-Turk D. 2006. Sodobni principi diagnostike celiakije.

Zdravstveni Vestnik, 75: II-89-97

Dunne C., Murphy L., Flynn S., O'Mahony L., O'Halloran S., Feeney M., Morrissey D.,

Thornton G., Fitzgerald G., Daly C., Kiely B., Quigley E. M., O'Sullivan G. C.,

Shanahan F., Collins J. K. 1999. Probiotics: from myth to reality. Demonstration of

functionality in animal models of disease and in human clinical trials. Antonie Van

Leeuwenhoek, 76: 279-292

Dunne C., O’Mahony L., Murphy L., Thornton G., Morrissey D., O’Halloran S., Feeney

M., Flynn S., Fitzgerald G., Daly C., Kiely B., O’Sullivan G., Shanahan F., Collins J. K.

2001. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with

in vivo findings. American Journal of Clinical Nutrition, 73 (suppl.): 386S–392S

EFSA/ECDC. (European Food Safety Authority and European Centre for Disease

Prevention and Control). 2015. EU Summary Report on antimicrobial resistance in

zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2013. EFSA Journal,

13, 2: 4036

Ewing W. N., Cole D. J. A. 1994. The living gut. An introduction to micro-organisms in

nutrition. 1st

ed. Trowbridge, Redwood Books: 220 str.

Ewing W. N. 2008. The living Gut, 2nd ed. Nottingham, Nottingham University Press: 192

str.

FAO/WHO. 2001. Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including

Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria.Report of a Joint FAO/WHO Expert

Consultation on Evaluation, Argentina, 1-4 October 2001: 34 str.

http://www.mesanders.com/probio_report.pdf (5. jul. 2016)



54

FAO/WHO. 2002. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food: report of a Joint

FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in

Food, London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002.

http://www.who.int/foodsafety/fs_management/en/probiotic_guidelines.pdf (5. jul.

2016)

Franz C. M. A. P., Holzapfel W. H. 2004. The genus Enterococcus: Biotechnological and

safety issues. V: Lactic acid bacteria: Microbiology and Functional Aspects. Third

Edition. Salminen S., von Wright A., Ouwehand A. (ur.). CRC Press: 199-247

Fuller R., Barrow P. A., Brooker B. E. 1978. Bacteria associated with the gastric

epithelium of neonatal pigs. Applied and Environmental Microbiology, 35, 3: 582-591

Fuller R., Cole C. B. 1988. The scientific basis on the probiotic concept. V: Probiotics –

Theory and Applications. Stark, B. A., Wilkinson, J. M. (ur.). Chalcombe Publications,

Marlow: 1-14

Fuller R. 1989. Probiotics in Man and Animals. Journal of Applied Bacteriology, 66, 5:

365-378

Fuller R. 1992. History and Development of Probiotics. V: Probiotics. The Scientific

Basis. Fuller R. (eds.). London, Chapman & Hall: 1-8

Fuller R. 1999. Probiotics for farm animals. V: Probiotics: a critical rewiev. Tannock G.

(ur.). England, Horizon Scientific Press: 15-22

Goldin B. R., Lichtenstein A. H., Gorbach S. L. 1988. The roles of Intestinal Flora. V:

Modern nutrition in health and disease. 7th ed., Philadelphia, Lea & Febiger: 500-515

Guarner F., Malagelada J. R. 2003. Gut flora in health and disease. Lancet, 361, 9356:

512–519

Hammes W. P., Hertel C. 2006. The genera Lactobacillus and Carnobacterium. V: The

Prokaryotes, Vol. 4: Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria. Dworkin M., Falkow S. (ur.).

Springer Science & Business Media: 320-403.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi/ (25. maj 2016)

Hill C., Guarner F., Reid G., Gibson G. R., Merenstein D. J., Pot B., Morelli L., Canani R.

B., Flint H. J., Salminen S., Calder P. C. and Sanders M. E. 2014. The International

Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope

and appropriate use of the term probiotic. Nature Reviews Gastroenterology &

Hepatology, 11: 506-514

Histologija tankega ĉrevesa. 2016. SlidePlayer. The digestive system 2 (lekcija 16,

poglavje 24, sliĉica 18).

http://slideplayer.com/slide/8398599/ (5 jul. 2016)



55

Hughes P., Heritage J. 2002. Food and Agriculture Organization. Antibiotic growth-

promoters in food animals.

http://www.fao.org/docrep/007/y5159e/y5159e08.htm (5. jul. 2016)

Huis in't Veld J., Havenaar R. 1991. Probiotics and health in man and animal. Journal of

Chemical Technology and Biotechnology, 51, 4: 562-567

Jensen S. R., Fink L. N., Struve C., Sternberg C., Andersen J. B., Brynskov J., Nielsen O.

H., Brix S. 2011. Quantification of specific E. coli in gut mucosa from Crohn's disease

patients. Journal of Microbiological Methods, 86, 1: 111-114

Jimenez G. 2010. Probiotics in Animal Nutrition – a Century of Research.Webinar. Piglets.

Pig Progress. http://www.allaboutfeed.net/Nutrition/Feed-Additives/2010/7/Probiotics-

in-animal-nutrition---a-century-of-research-AAF011607W/ (5. jul. 2016)

Kališnik M. 2002. Slovenski medicinski slovar. Univerza v Ljubljani, Medicinska

fakulteta: 1007 str.

Kanatani K., Oshimura M., Sano K. 1995. Isolation and characterization of acidocin A and

cloning of the bacteriocin gene from Lactobacillus acidophilus. Applied and

Environmental Microbiology, 61, 3: 1061-1067

Klaenhammer T. R., Kleerebezem M., Kopp M. V., Rescigno M. 2012. The impact of

probiotics and prebiotics on the immune system. Nature reviews - Immunology, 12:

728-734

Kocijanĉiĉ A., Mrevlje F., Štajer D. 2005. Interna medicina. 3. izdaja, Ljubljana, Littera

picta: 493-496

Kos B. 2001. Probiotiĉki koncept: in vitro istraţivanja s odabranim bakterijama mlijeĉne

kiseline. Disertacija. Zagreb, Prehrambeno – Biotehnološki fakultet Sveuĉelišta u

Zagrebu: 144 str.

Lavrenĉiĉ A. 2003. Vaje pri predmetu Prehrana domaĉih ţivali. Ljubljana, Veterinarska

fakulteta: 116 str.

Ley R. E., Peterson D. A., Gordon J. I. 2006. Ecological and evolutionary forces shaping

microbial diversity in the human intestine. Cell, 124: 837-848

Marchesi J. R., Adams D. H., Fava F., Hermes G. D. A., et al. 2016. The gut microbiota

and host health: a new clinical frontier. Gut, 65: 330-339

Matsuzaki T. 1998. Immunomodulation by treatment with Lactobacillus casei strain

Shirota. International Journal of Food Microbiology, 41, 2: 133-140



56

Maxwell F. J., Stewart C. S. 1995. Microbiology of the gut and the role of probiotics. V:

The national Pig, Development and Survival. Varley M. A. (ur.). Leeds, CAB

International: 155-186

Mäyrä-Mäkinen A., Manninen M., Gyllenberg H. 1983. The adherence of lactic acid

bacteria of the columnar epithelial cells of pigs and calves. The Journal of Applied

Bacteriology, 55, 2: 241-245

McDonald P., Edwards R. A., Greenhalgh J. F. D., Morgan C. A., Sinclair L. A.,

Wilkinson, G. 2010. Animal Nutrition. 7th

ed. Toronto, Pearson Books: 714 str.

Medigan M. T., Martinko J. M. 2005. Microbial Interactions with Humans. V: Brock

Biology of Microorganisms. London, Pearson Prentice Hall: 700-725

Mikroorganizmi prebavil. 2016. SlidePlayer. Aspectos bioquímicos da interação dos

probióticos com a mucosa intestinal (sliĉica 10).

http://slideplayer.com.br/slide/2633364/ (5. jul. 2016)

Naidu A. S., Bidlack W. R., Clemens R. A. 1999. Probiotic spectra of Lactic Acid Bacteria

(LAB). Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 38, 1: 13-126

Ovejero A. F., Negri M. 1993. Fiziologija ĉloveka. Ljubljana, Mladinska knjiga: 34-37

Petroviĉ D., Zorc M. 2005. Histologija – uĉbenik. Ljubljana, Inštitut za histologijo in

embriologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani: 173-178

Oregon state University, Department of Animal Sciences, OSU Extended Campus (2004),

Applied Animal Nutrition, Introduction to feeding swine.

https://courses.ecampus.oregonstate.edu/ans312/ten/swine_1.htm (15. feb. 2015)

Pocajt M., Širca A. 1997. Anatomija in fiziologija za medicinske šole. Ljubljana, DZS: 97-

98, 107-117

Pokorny M., Filipović B., Ĉadeţ J., Japelj M. 1992. Proizvodnja antibiotikov in drugih

sekundarnih metabolitov. V: Biotehnologija. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 385-403

Povzetek dejstev za splošno javnost. 2016. ECDC (European Centre for Disease

Prevention and Control).

http://ecdc.europa.eu/sl/eaad/antibiotics-get-informed/factsheets/Pages/general-

public.aspx (20. jun. 2016)

Qin J., Li R., Raes J., Arumugam M., in sod. 2010. A human gut microbial gene catalogue

established by metagenomic sequencing. Nature, 464: 59-65

Quigley E. M. 2013. Gut Bacteria in Health and Disease. Gastroenterology & Hepatology,

9: 560–569



57

Rajilić Stojanović M., de Vos W. M. 2014. The first 1000 cultured species of the human

gastrointestinal microbiota. FEMS Microbiology Reviews, 38: 996-1047

Raţman, S. 2009. Vpliv sevov Lactobacillus gasseri LF221 in K7 na morfometriĉne

parametre resic in sestavo mikrobne zdruţbe tankega ĉrevesja pri odstavljenih pujskih:

Diplomsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek zootehniko: 55 str.

Rebesko B. 1983. Fiziologija z anatomijo domaĉih ţivali, Ljubljana, Drţavna zaloţba

Slovenije: 364 str.

Reid G. 2015. Regulatory and clinical aspects of dairy probiotics. FAO/WHO Expert

consultation on evaluation of health and nutritional properties of powder milk with live

lactic acid bacteria.

ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/reid.pdf (15. feb. 2015)

Resica-zgradba. 2016. SlidePlayer. The digestive tract (sliĉica 45).

http://slideplayer.com/slide/1703117/ (5. jul. 2016)

Robinson C. J., Young V. B. 2010. Antibiotic administration alters the community

structure of the gastrointestinal micobiota. Gut Microbes, 1, 4: 279–284

Rogelj I., Narat M., Hoĉevar I. 1999. The immune response in mice immunized with

Lactobacillus gasseri LF221 – a potential probiotic strain. Food Technology and

Biotechnology, 37, 3: 153-158

Rogelj I., Bogoviĉ Matijašić B. 2004. Probiotiki in varnost. V: Varnost ţivil. 22. Bitenĉevi

ţivilski dnevi 2004, Radenci, 18-19 marec 2004. Gašperlin L., Ţlender B. (ur.).

Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za ţivilstvo: 181-189

Ross M. H., Kaye G. I., Wojciech P. 2004. Histology. A text and atlas with cell and

molecular biology. 4th ed. Baltimore, Philadelphia, Williams&Wilkins: 475-478, 491-

501

Rotovnik-Kozjek N. 2003. Probiotiki in prebiotiki v onkologiji. Onkologija/ problemi in

perspektive: 35-37.

http://www.onko-i.si/fileadmin/onko/datoteke/dokumenti/1-2001-kozjek.pdf (24. avg.

2016)

Saarela M., Lähteenmäki L., Crittenden R., Salminen S., Mattila-Sandholm T. 2002. Gut

bacteria and health foods – The European perspective. International Journal of Food

Microbiology, 78, 1-2: 99–117

SCAN (Scientific Committee for Animal Nutrition). 2000. Report of the Scientific

Committee on Animal Nutrition on the assessment under directive 87/153/EEC of the

efficacy of micro-organisms used as feed additives.

http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scan/out40_en.pdf (18. feb. 2000)



58

Scheinbach S. 1998. Probiotics: Functionality and commercial status. Biotechnology

Advances, 16, 3: 581-608

Seme K. 2002. Mehanizmi bakterijske odpornosti proti antibiotikom. V: Medicinska

bakteriologija z imunologijo in mikologijo. Gubina M, Ihan A. (ur.). Ljubljana,

Medicinski razgledi: 439-446

Singer R.S., Finch R., Wegener H.C., Bywater R., Walters J., Lipsitch M. 2003. Antibiotic

resistance – the interplay between antibiotic use in animals and human beings. The

Lancet Infectious Diseases, 3, 1: 47-51

Smole-Moţina S., Marić V. 1992. Bakterije. V: Biotehnologija. Raspor P. (ur.), Ljubljana,

Bia: 29-42

Spencer R. J., Chesson A. 1994. The effect of Lactobacillus spp. on the attachment of

enterotoxigenic Escherichia coli to isolated porcine enterocytes. The Journal of Applied

Bacteriology, 77, 2: 215-220

Steiner T. 2009. Probiotics in Poultry and Pig Nutrition. Basics and Benefits, The Poultry

site.

http://www.thepoultrysite.com/articles/1564/probiotics-in-poultry-and-pig-nutrition-

basics-and-benefits/ (24. avg. 2016)

Stojković S. 2003. Prez ̌ivetje in uc ̌inkovitost sevov Lactobacillus K7 in LF221 v razlic ̌nih

okoljskih razmerah. Doktorska disertacija. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za

ţivilstvo: 133 str.

Stojković S., Rogelj I., Bogoviĉ Matijašić B., Bomba A., Nemcova R., Gancarĉikova S.,

Jonecova Z., Scirankova L., Košĉova J., Cigankova V., Pistl J., Buleca J. 2003.

Inhibition of Escherichia coli 08K88H9 ent- by Lactobacillus gasseri K7 – in vivo study

on gnotobiotic piglets. V: Milk & dairy products, European Dairy Congress 03,

Portoroţ, Slovenia, 15.-18. nov. 2003. Domţale, Biotehniška fakulteta, Oddelek za

zootehniko: 53 str.

Swidsinski A., Weber J., Loening-Baucke V., Hale L.P., Lochs H. 2005. Spatial

organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel

disease. Journal of Clinical Microbiology, 43, 7: 3380–3389

Tagg J. R., Dajani A. S., Wannamaker L. W. 1976. Bacteriocins of gram-positive bacteria.

Bacteriological Reviews, 40, 3: 722-756

Tanko ĉrevo. 2015. Wikipedia (7. sept. 2015).

https://sl.wikipedia.org/wiki/Tanko_%C4%8Drevo (23. apr. 2016)

Tannock G. W., Smith J. D. B. 1970. The micro-flora of the pig stomach and its possible

relationship to ulceration on the pars oesophagia. Journal of Comparative Pathology, 80:

359-367



59

Ten-Brink B., Minekus M., Van der Vossen J. M., Leer R. J., Huis in't Veld J. H. 1994.

Antimicrobial activity of Lactobacilli: preliminary characterization and optimization of

production of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus

M46. Journal of Applied Bacteriology, 77, 2: 140-148

Teskaĉ k., Hudournik N., Marinšek-Logar R., Kristl J. 2008. Pomen probiotikov kot

prehranskih dopolnil in zdravil. Farmacevtski Vestnik, 59: 287-292

The Histology Guide. Small intestine.

http://www.histology.leeds.ac.uk/digestive/small_intestine.php (2. maj 2016)

Tortuero F., Rioperez J., Fernandez E., Rodriguez M. L. 1995. Response of piglets to oral

administration of lactic acid bacteria. Journal of Food Protection, 58, 12: 1369-1374

Treven P., Trmĉić A., Bogoviĉ Matijašić B., Rogelj I. 2014. Improved draft genome

sequence of probiotic strain Lactobacillus gasseri K7. Genome Announcements, 2, 4: 1-

2

Uredba Evropskega parlamenta in Sveta (ES) št. 1831/2003 o dodatkih za uporabo v

prehrani ţivali. 2003. Uradni list Evropske unije L 268: 29

Uredba Komisije (ES) št. 574/2011 o spremembi Priloge I k Direktivi 2002/32/ES

Evropskega parlamenta in Sveta glede mejnih vrednosti za nitrit, melamin, Ambrosio

spp. ter prenosa nekaterih kokcidiostatikov ali sredstev proti histomonijazi in o

konsolidaciji prilog I in II k Direktivi. 2011. Uradni list Evropske unije L 159: 7

Vanbelle M. 2001. Current status and future perspectives in E.U. for antibiotics, probiotics,

enzymes and organic acids in animal nutrition. V: Gut environment of pigs. Piva A.,

Bach Knudsen K. E., Lindberg J. E. (ur.). Nottingham, Nottingham University Press:

231-256

Van der Vossen J. M. B. M., Van-Herwijnen M. H. M., Leer R. J., Ten-Brink B., Pouwels

P. H., Huis in't Veld J. H. J. 1994. Production of acidocin B, a bacteriocin of

Lactobacillus acidophilus M46 is a plazmid encoded trait: plasmid curing, genetic

marking by in vivo plasmid integration and gene transfer. FEMS Microbiology Letters,

166, 3: 333-340

Vaughan E. E., Mollet B., de Vos W. M. 1999. Functionality of probiotics and intestinal

lactobacilli: Light in the intestinal tract tunnel. Current Opinion in Biotechnology, 10, 5:

505-510

Yirga H. 2015. The Use of Probiotics in Animal Nutrition. Journal of Probiotics & Health,

3: 132

Yu H., Braun P., Yildrum M. A., Lemmens I., Venkatesan K., in sod. 2008. High-Quality

Binary Protein Interaction Map of the Yeast Interactome Network. Science, 322: 104-11



60

Zorc Pleskoviĉ R., Gošnak Dahmane R., Milutinović Ţivin A. 2006. Histologija. 1. izdaja.

Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Visoka šola za zdravstvo: 45-47

Zoriĉ-Peternel M., Ĉanţek Majheniĉ A., Holo H., Nes I. F., Salehian Z., Berlec A., Rogelj

I. 2010. Wide-Inhibitory Spectra Bacteriocins Produced by Lactobacillus gasseri K7.

Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2, 4: 233-240



ZAHVALA

Neskonĉno se zahvaljujem mentorici, znan. svet. dr.Bojani Bogoviĉ Matijašić, ki je vloţila

veliko ĉasa in potrpljenja in do konca verjela vame, ter mi pomagala, da smo nalogo

pripeljali do konca.

Zahvaljujem se somentorici dr. Petri Mohar Lorbeg, da mi je omogoĉila dokonĉati in

zagovarjati nalogo.

Posebna zahvala gre tudi recenzentki prof. dr. Ireni Rogelj za literaturo in strokovno

pomoĉ pri nastajanju dela. Ţe kot predavateljica ste mi bili vzgled in vedno z veseljem

preberem vaša dela.

Zahvaljujem se predsedniku komisije prof. dr. Janezu Salobirju.

Prav tako se zahvaljujem vsem ĉlanom kolektiva Inštituta za mlekarstvo in probiotike, ki

so mi pomagali pri izvedbi praktiĉnega dela diplomske naloge in mi svetovali.

Hvala dr. Nataši Siard in doc. dr. Špeli Malovrh.

Najlepša hvala vsem v knjiţnici in gospe Sabini Knehtl.

Iskreno se zahvaljujem vsem neimenovanim, ki so mi kakorkoli pomagali pri nastajanju

diplomskega dela.

Romĉ, klic v petek me je spodbudil. Hvala ti.

Hvala mojemu moţu Marku, sinovoma in mami! Brez vas mi ne bi uspelo.

Nekje – ĉisto na koncu, ko sem imela opravljene ţe vse izpite, veĉji del naloge, …, sem se

ustavila.

Sam Bog ve, zakaj!?

Ţelela sem si, da bi prej našla moĉ za dokonĉanje tega dela…

Pa vendar – bolje sedaj, kot nikoli!

Hvala vsem.

Tudi tebi, ki bereš te vrstice…

PRILOGE

Statistiĉna obdelava podatkov

Za testiranje vezave laktobacilov na sluznico ĉrevesa, simulirano kot izpodrivanje,

izkljuĉevanje in tekmovanje, smo uporabili Studentov t test (p<0,05) in sicer na podlagi

primerjav s kontrolnimi primeri, katere so predstavljali ĉisti sevi. Znaĉilnost posameznih

vplivov nam povedo p – vrednosti. Rezultati za posamezne vplive so navedeni v spodnjih

preglednicah.

Priloga A:

Vpliv poskusa in vpliv skupine v modelu (Laktobacili) - preglednica ANOVA, metoda

najmanjših kvadratov Vpliv Stopinje

prostosti

Vsota kvadratov Srednji kvadrat F-vrednost P>F

Poskus 4 23,4233 5,8552 138,84 <0,0001

Skupina 7 9,9956 1,4279 33,86 <0,0001

Priloga B:

P - vrednosti za posamezne vplive modela (log Lb.) Vpliv p - vrednost Vpliv p - vrednost

---------- Poskus: ---------- ---------- Skupina: ----------

1 <0,0001 Ec/K7 0,0016

2 <0,0001 Ec/LF 0,0228

3 0,0421 K7 0,0013

4 0,6216 K7+Ec <0,0001

5 - K7/Ec <0,0001

LF 0,0262

LF+Ec 0,6491

LF/Ec -

Priloga C:

Vpliv poskusa in skupine v modelu (E. coli) - preglednica ANOVA, metoda najmanjših

kvadratov Vpliv Stopinje

prostosti

Vsota kvadratov Srednji kvadrat F-vrednost P>F

Poskus 4 8,160 2,040 61,23 <0,0001

Skupina 6 3,4261 0,5710 17,14 <0,0001

Priloga D:

P - vrednosti za posamezne vplive modela (log E. coli) Vpliv p - vrednost Vpliv p - vrednost

----------Poskus: ---------- ----------Skupina: ----------

1 <0,0001 Ec 0,6059

2 <0,0001 Ec/K7 0,1504

3 0,0078 Ec/LF 0,0275

4 0,9108 K7+Ec <0,0001

5 - K7/Ec 0,3988

LF+Ec 0,0002

LF/Ec -

Metoda najmanjših kvadratov:

Z metodo najmanjših kvadratov je bilo ugotovljeno, da je p – vrednost vsakega od nivojev

skupin, tako pri modelu 1, kot modelu 2, enaka p<0,0001. Vpliv vseh skupin je torej bil

statistiĉno znaĉilen. Pri tem je bil za model 1 uporabljen Tukey-ev test, za model 2 pa

Tukey-Kramarjev test.

Metoda najmanjših kvadratov za vpliv SKUPINA, Tukey-Kramer, GLM, odvisna

spremenljivka je log E. coli

Priloga E:

Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi skupin vezane E. coli in p-vrednosti za

vpliv skupin, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov. Skupina Ec Ec/K7 Ec/LF K7+Ec K7/Ec LF+Ec LF/Ec

Ec 0,167834 0,230129 -0,421497 0,114746 -0,274189 0,045335

Ec/K7 0,5089 0,062295 -0,589331 -0,053087 -0,442023 -0,122499

Ec/LF 0,1356 0,9893 -0,651626 -0,115383 -0,504318 -0,184794

K7+Ec 0,0002 <0,0001 <0,0001 0,536243 0,147308 0,466832

K7/Ec 0,8430 0,9954 0,7923 <0,0001 -0,388935 -0,069411

LF+Ec 0,0407 <0,0001 <,0001 0,5507 0,0003 0,319524

LF/Ec 0,9985 0,7678 0,2797 <0,0001 0,9782 0,0044

Metoda najmanjših kvadratov za vpliv SKUPINA, Tukey, GLM procedura, odvisna

spremenljivka je log Lb:

Priloga F:

Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi skupin vezanih laktobacilov K7 oz.

LF221 in p-vrednosti za vpliv skupin, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov. Skupina Ec/K7 Ec/LF K7 K7+Ec K7/Ec LF LF+Ec LF/Ec

Ec/K7 -0,515351 0,007147 0,106082 0,605665 -0,510162 -0,343334 -0,301361

Ec/LF <,0001 0,522498 0,621434 1,121017 0,005189 0,172018 0,213990

K7 1,0000 <0,0001 0,098935 0,598519 -0,517309 -0,350481 -0,308508

K7+Ec 0,9416 <0,0001 0,9594 0,499583 -0,616244 -0,449416 -0,407443

K7/Ec <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 -1,115827 -0,948999 -0,907026

LF <0,0001 1,0000 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,166828 0,208801

LF+Ec 0,0087 0,5738 0,0068 0,0002 <0,0001 0,6114 0,041973

LF/Ec 0,0331 0,2931 0,0266 0,0009 <0,0001 0,3232 0,9998

Skupina*poskus: Metoda najmanjših kvadratov za vpliv skupina, odvisna sp.=Ec. V

zgornjem delu razpredelnice so navedene razlike povpreĉnih srednjih vrednosti med

skupinami, v spodnjem delu pa njihove p-vrednosti.

Priloga G:

Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi skupin vezane E. coli in p-vrednosti za

vpliv skupin, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov. Skupina Ec Ec/K7 Ec/LF K7+Ec K7/Ec LF+Ec LF/Ec

Ec 0,169780 0,216969 -0,377425 0,059706 -0,269175 0,064211

Ec/K7 0,2968 0,047189 -0,547205 -0,110074 -0,438955 -0,105569

Ec/LF 0,0639 0,9952 -0,594393 -0,157262 -0,486143 -0,152757

K7+Ec 0,0002 <,0001 <,0001 0,437131 0,108250 0,441636

K7/Ec 0,9776 0,7604 0,3160 <,0001 -0,328881 0,004505

LF+Ec 0,0115 <,0001 <,0001 0,7243 0,0013 0,333386

LF/Ec 0,9680 0,7929 0,3483 <,0001 1,0000 0,0011

Priloga H:


LF221 in p-vrednosti za vpliv skupin, pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov. Skupina Ec/K7 Ec/LF K7 K7+Ec K7/Ec LF LF+Ec LF/Ec

Ec/K7 -0,515351 0,007147 0,106082 0,605665 -0,510162 -0,343334 -0,301361

Ec/LF <,0001 0,522498 0,621434 1,121017 0,005189 0,172018 0,213990

K7 1,0000 <,0001 0,098935 0,598519 -0,517309 -0,350481 -0,308508

K7+Ec 0,7413 <,0001 0,8018 0,499583 -0,616244 -0,449416 -0,407443

K7/Ec <,0001 <,0001 <,0001 <,0001 -1,115827 -0,948999 -0,907026

LF <,0001 10,000 <,0001 <,0001 <,0001 0,166828 0,208801

LF+Ec 0,0002 0,1818 0,0001 <,0001 <,0001 0,2115 0,041973

LF/Ec 0,0011 0,0440 0,0008 <,0001 <,0001 0,0533 0,9981

Priloga I:

Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezane E. coli in njihove p-vrednosti za

vpliv interakcije med poskusom in skupino v prvem poskusu, pridobljeni z metodo

najmanjših kvadratov. Skupina Ec Ec/K7 Ec/LF K7+Ec K7/Ec LF+Ec LF/Ec

Ec 0,145543 0,376191 -0,307534 -0,323187 -0,112369 -0,161133

Ec/K7 1,0000 0,230648 -0,453077 -0,468730 -0,257912 -0,306676

Ec/LF 0,6261 0,9997 -0,683725 -0,699379 -0,488560 -0,537324

K7+Ec 0,8913 0,6545 0,0095 -0,015653 0,195165 0,146401

K7/Ec 0,8435 0,5963 0,0073 1,0000 0,210818 0,162055

LF+Ec 1,0000 0,9983 0,1958 0,9994 0,9982 -0,048764

LF/Ec 1,0000 0,9845 0,0999 1,0000 1,0000 1,0000

Priloga J:


LF221 in p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in skupino v prvem poskusu,

pridobljeni z metodo najmanjših kvadratov. Skupina Ec/K7 Ec/LF K7 K7+Ec K7/Ec LF LF+Ec LF/Ec

Ec/K7 -0,222744 0,051478 0,489622 1,406756 -0,245623 0,004234 0,288839

Ec/LF 0,9999 0,274223 0,712367 1,629500 -0,022879 0,226978 0,511584

K7 1,0000 0,9955 0,438144 1,355278 -0,297101 -0,047244 0,237361

K7+Ec 0,3296 0,0089 0,5555 0,917134 -0,735245 -0,485388 -0,200783

K7/Ec <,0001 <,0001 <,0001 0,0001 -1,652379 -1,402522 -1,117917

LF 0,9993 1,0000 0,9857 0,0057 <,0001 0,249857 0,534462

LF+Ec 1,0000 0,9998 1,0000 0,3462 <,0001 0,9990 0,284605

LF/Ec 0,9903 0,2517 0,9996 1,0000 <,0001 0,1851 0,9921

Priloga K:

Razlike med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezanih laktobacilov K7 oz. LF221 in

njihove p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in skupino v drugem poskusu,


Ec/K7 -0,885163 -0,266446 -0,436299 0,189912 -0,694618 -0,657301 -0,684611

Ec/LF 0,0003 0,618717 0,448864 1,075075 0,190545 0,227862 0,200552

K7 0,9971 0,0494 -0,169853 0,456358 -0,428172 -0,390855 -0,418164

K7+Ec 0,5642 0,5051 1,0000 0,626211 -0,258319 -0,221002 -0,248311

K7/Ec 1,0000 <,0001 0,4706 0,0434 -0,884530 -0,847213 -0,874523

LF 0,0125 1,0000 0,6027 0,9983 0,0003 0,037317 0,010008

LF+Ec 0,0250 0,9998 0,7703 0,9999 0,0006 1,0000 -0,027309

LF/Ec 0,0151 1,0000 0,6497 0,9991 0,0003 1,0000 1,0000

Priloga L:

Razlika med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezane E. coli in njihove p-vrednosti za

vpliv interakcije med poskusom in skupino v tretjem poskusu, pridobljeni z metodo


Ec 0,391174 0,293554 -0,006530 0,183853 -0,282412 0,372455

Ec/K7 0,5576 -0,097620 -0,397704 -0,207321 -0,673585 -0,018719

Ec/LF 0,9256 1,0000 -0,300084 -0,109701 -0,575965 0,078902

K7+Ec 1,0000 0,5279 0,9106 0,190383 -0,275881 0,378985

K7/Ec 0,9998 0,9986 1,0000 0,9996 -0,466264 0,188603

LF+Ec 0,9472 0,0113 0,0558 0,9576 0,2588 0,654867

LF/Ec 0,6431 1,0000 1,0000 0,6133 0,9997 0,0155

Priloga M:

Razlika med logaritmiranimi srednjimi vrednostmi vezanih laktobacilov K7 oz. LF221 in

njihove p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in skupino v tretjem poskusu,


Ec/K7 -0,555458 0,327286 0,508748 0,499742 -0,432504 -0,118544 -0,249073

Ec/LF 0,1367 0,882744 1,064206 1,055200 0,122955 0,436914 0,306385

K7 0,9532 0,0003 0,181462 0,172456 -0,759790 -0,445830 -0,576359

K7+Ec 0,2610 <,0001 1,0000 -0,009006 -0,941252 -0,627292 -0,757821

K7/Ec 0,2920 <,0001 1,0000 1,0000 -0,932245 -0,618286 -0,748815

LF 0,5822 1,0000 0,0035 <,0001 <,0001 0,313959 0,183431

LF+Ec 1,0000 0,5613 0,5193 0,0426 0,0498 0,9711 -0,130529

LF/Ec 0,9991 0,9786 0,0992 0,0036 0,0044 1,0000 1,0000

Priloga N:


vpliv interakcije med poskusom in skupino v ĉetrtem poskusu, pridobljeni z metodo


Ec -0,048455 0,107628 -0,630273 0,157320 -0,392061 -0,044012

Ec/K7 1,0000 0,156083 -0,581818 0,205775 -0,343606 0,004443

Ec/LF 1,0000 1,0000 -0,737902 0,049692 -0,499690 -0,151640

K7+Ec 0,0234 0,0510 0,0037 0,787594 0,238212 0,586261

K7/Ec 1,0000 0,9988 1,0000 0,0016 -0,549382 -0,201332

LF+Ec 0,5535 0,7678 0,1691 0,9913 0,0837 0,348049

LF/Ec 1,0000 1,0000 1,0000 0,0475 0,9991 0,7497

Priloga O:


njihove p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in skupino v ĉetrtem poskusu,


Ec/K7 -0,497260 -0,025933 -0,065631 0,462412 -0,540835 -0,408104 -0,458995

Ec/LF 0,3010 0,471327 0,431629 0,959672 -0,043575 0,089156 0,038265

K7 1,0000 0,4042 -0,039698 0,488345 -0,514902 -0,382171 -0,433062

K7+Ec 1,0000 0,5863 1,0000 0,528043 -0,475204 -0,342473 -0,393364

K7/Ec 0,4433 <,0001 0,3346 0,2023 -1,003247 -0,870516 -0,921407

LF 0,1692 1,0000 0,2411 0,3878 <,0001 0,132731 0,081840

LF+Ec 0,6958 1,0000 0,8046 0,9247 0,0004 1,0000 -0,050891

LF/Ec 0,4586 1,0000 0,5795 0,7599 0,0001 1,0000 1,0000

Priloga P:


vpliv interakcije med poskusom in skupino v petem poskusu, pridobljeni z metodo


Ec 0,190858 0,090501 -0,565362 0,220839 -0,289857 0,089535

Ec/K7 0,9996 -0,100357 -0,756220 0,029981 -0,480715 -0,101324

Ec/LF 1,0000 1,0000 -0,655863 0,130337 -0,380359 -0,000967

K7+Ec 0,0657 0,0027 0,0153 0,786200 0,275504 0,654896

K7/Ec 0,9967 1,0000 1,0000 0,0016 -0,510696 -0,131304

LF+Ec 0,9333 0,2165 0,6071 0,9581 0,1457 0,379392

LF/Ec 1,0000 1,0000 1,0000 0,0155 1,0000 0,6115

Priloga R:


njihove p-vrednosti za vpliv interakcije med poskusom in skupino v petem poskusu,


Ec/K7 -0,416130 -0,050651 0,033972 0,469506 -0,637230 -0,536953 -0,402966

Ec/LF 0,6591 0,365479 0,450102 0,885636 -0,221099 -0,120823 0,013164

K7 1,0000 0,8630 0,084623 0,520157 -0,586578 -0,486302 -0,352315

K7+Ec 1,0000 0,4994 1,0000 0,435534 -0,671201 -0,570925 -0,436938

K7/Ec 0,4121 0,0003 0,2250 0,5678 -1,106735 -1,006459 -0,872471

LF 0,0358 0,9999 0,0843 0,0194 <,0001 0,100277 0,234264

LF+Ec 0,1788 1,0000 0,3426 0,1080 <,0001 1,0000 0,133987

LF/Ec 0,7187 1,0000 0,9011 0,5612 0,0003 0,9997 1,0000

REZULTATI KONTROLE SPIRANJA VZORCEV (vzorec »0«)

Priloga S:

Kontrola izpiranja prvotne mikrobiote iz košĉkov jejunuma (vzorec niĉ »0«)

MRS: A B SD POVP. LOG A LOG B SD LOG POVP. Log

Pos. 1«0« 4000 4000 0 4000 3,60206 3,60206 0 3,60206

Pos. 3«0« 48000 43000 3535,534 45500 4,681241 4,633468 0,03378 4,657355

Pos. 4«0« 1 0 0,707107 0,5 0 0 0 0

Pos. 5«0« 3 2 0,707107 2,5 0,477121 0,30103 0,124515 0,389076

EMB A B SD POVP. LOG A LOG B SD LOG POVP. Log

Pos. 1«0« 387000 384000 2121,32 385500 5,587711 5,584331 0,00239 5,586021

Pos. 3«0« 29000 22000 4949,747 25500 4,462398 4,342423 0,084835 4,40241

Pos. 4«0« 0 14 9,899495 7 0 1,146128 0,810435 0,573064

Pos. 5«0« 3 10 4,949747 6,5 0,477121 1 0,369731 0,738561

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ZOOTEHNIKO

Simona ĈAMPA

EX VIVO VEZAVA PROBIOTIKOV NA ČREVESNO

SLUZNICO TANKEGA ČREVESA PRAŠIČEV IN

TEKMOVANJE Z E. coli O8:K88

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij

Ljubljana, 2016

ex vivo vezava probiotikov na Črevesno … · slika 2: prerez stene tankega ĉrevesa (povzeto po...

Documents