elektronska mikroskopija mikrografije in ultrastrukture

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA BIOLOGIJO

Nejc DRAGANJEC

ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJAMIKROGRAFIJE IN ULTRASTRUKTURE

POROČILO O VAJAH PRI PREDMETUFUNKCIONALNA BIOLOGIJA CELICEMolekulska in funkcionalna biologija MSc

Mentor: asist. dr. Nada ŽNIDARŠIČMentor: dr. Magda TUŠEK ŽNIDARIČ

Ljubljana, 2014

Draganjec N., Elektronska mikroskopija – mikrografije in ultrastrukturePoročilo o vajah, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2014

II

KAZALO

1 Uvod 2

2 Ultrastruktura virusov in bakterij (vaje 19. 12. 2013) 32.1 Bakteriofagi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.2 Rikecije . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

3 Ultrastruktura živalskih celic (vaje 23. 12. 2013) 83.1 Hepatopankreas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83.2 Gonade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

5 Viri 22


1

SLIKE

2.1 Bakteriofag T4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.2 Rickettsia slovaca v celici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.3 Rickettsia slovaca okoli jedra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.4 Kolonija Rickettsia slovaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.1 Hepatopankreas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93.2 Golgijev aparat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103.3 Jedro z jedrcem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113.4 Jedrne pore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123.5 Zgornja meja ločljivosti TEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133.6 GER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.7 Lizosom z bakrom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.8 Bazalna lamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163.9 Gonade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183.10 Spermatozoj . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193.11 Prerez flagela . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.12 Spermatozoj med razvojem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21


2

1 UVOD

Ker je valovna dolžina elektronskega žarka 100.000-krat krajša od valovne dolžinevidne svetlobe, je teoretična ločljivost elektronske mikroskopije 0,001 nm. Toda zaradinapak magnetnih leč je dejanska maksimalna ločljivost osnovnih tehnik elektronskemiroskopije okoli 0,1 nm oz 1 Å. Praktično ločljivost pa določa tudi vrsta vzorca innjegove značilnosti. Praktično dosegljiva ločljivost bioloških vzorcev je zaradi njihovihlastnosti okoli 1 nm (Echin, 2009; Egerton, 2005; Goodhew et al., 2001; Khan, 212;Watt, 1997).

Poznamo dve osnovni vrsti elektronskih mikroskopov (presevni elektronski mikroskopoz. TEM in vrstični elektronski mikroskop oz. SEM), ki se po svojih značilnostihin principu delovanja precej razlikujeta. Konstrukcija TEM je v osnovi podobnasvetlobnemu mikroskopu. Vir “svetlobe” nadomesti elektronska puška oz. linearnipospeševalnik iz katode in anode. Katoda poskrbi za vir elektronov in anoda zapospeševanje v smeri preparata. Snop elektronov nato potuje po koloni, v katerimoramo vzdrževati visoki vakum. Za fokusiranje in radialno pospeševanje snopa poskrbisistem elektromagnetnih leč, ki delujejo kot kondenzor, objektiv in projektiv. Medsnopom elektronov in preparatom pride do interakcij (odboj, elastično in neelastičnosipanje), katerih frekvenca je odvisna od elektronske gostote preparata. Klasičnapriprava preparatov za TEM je postopek iz 6 korakov: fiksacija, dehidracija, vklapljanje,rezanje, prenos na nosilec in kontrastiranje s težkimi kovinami (Echin, 2009; Egerton,2005; Goodhew et al., 2001; Khan, 212; Watt, 1997).


3

2 ULTRASTRUKTURA VIRUSOV IN BAKTERIJ (VAJE 19. 12. 2013)

2.1 BAKTERIOFAGI

Elektronsko mikroskopijo virusov se dandanes uporablja za hitro diagnostiko kužnihdelcev (npr. pri porajajočih se boleznih in osebah ter živalih z imunsko pomanjkljivostjo),za skrajšanje postopka na celičnih kulturah (npr. virus Nipah, SARS, metapneumovirus,bocavirus), za iskanje novih povzročiteljev, kadar reagenti ali diagnostične metode nisona razpolago, pri “odprtem pogledu”, kadar je možnih več povzročiteljev, ter pri kontrolikvalitete in dobre laboratorijske prakse (npr. ugotavljanje specifičnosti antigenov inmetod). Metode elektronske mikroskopije so bile v virologiji preteklosti že večkratključne. Eno izmed prvih odkritij ob pomoči elektronske mikroskopije je bila 1948odkrita razlika med virusom črnih koz (Orthopox, Poxviridae) in virusom varičele zostra(Varicellovirus). 1952 smo dobili prvo mikrografijo poliovirusa, 1976 je bil v Zairu odkritvirus Ebola, v novejših časih pa nam je elektronska mikroskopija leta 2003 podala kardve diagnozi, in sicer diagnozo SARS na Kitajskem in virusa opičjih koz pri prerijskihpsih in ljudeh v ZDA (Goodhew et al., 2001; Watt, 1997).

Postopek priprave virusnega preparata za elektronsko mikroskopijo gre vedno skozi4 glavne stopnje: 1. odvzem in prenos kužnine, 2. delo s kužnim in zelo kužnimmaterialom, 3. koncentriranje virusov v suspenziji do koncentracije najmanj 106/mlin 4. priprava vzorca za opazovanje. Priprava vzorca za opazovanje nudi dva možnapristopa. En pristop je negativno kontrastiranje in drugi pristop je vlaganje vzorcev inpriprava ultratankih rezin. Vzorci, ki smo jih pri vajah opazovali mi, so bili pripravljeniz negativnim kontrastiranjem (Echin, 2009; Egerton, 2005; Khan, 212; Watt, 1997).

S tehniko negativnega kontrastiranja izkoriščamo elektronsko prepustnost virusov.Kontrastnost povečamo z uporabo negativnih kontrastnih sredstev, kar pomeni, das težkimi kovinami okolju zmanjšamo prepustnost za elektrone. Ker le elektroni, kiprehajajo skozi vzorec, dajo sliko virusa, so virusi svetlejši od okolice. Kontrastnasredstva, ki se uporabljajo najpogosteje, so fosforvolframova kislina (2 %), amonijevmolibdat (1 %) in uranilni acetat (1 %). Vzorec se nanaša na bakrove mrežice sstandardno 400 polji, prevlečene s plastičnim filmom (formvar ali pioloform) in ojačanez ogljikom (Egerton, 2005; Frank, 1992; Goodhew et al., 2001; Khan, 212; Watt, 1997).

Preparat, ki smo ga gledali na vajah, je bil negativno kontrastiran premaz bakteriofagov,zaradi velikosti najverjetneje bakteriofagov T4, ki so med največjimi fagi in dosegajo200 nm v dolžino 100 nm v širino. Značilna je tudi opažena bazalna plošča, vzorec narepu pa namiguje na prisotnost kontraktilne prevleke, ki je še ena izmed lastnosti fagovT4, a je zaradi slabega kontrasta in ostrine ne moremo nedvomno potrditi (Madigan


4

et al., 2012).

Slika 2.1: Označene ultrastrukture: (1) kapsida, (2) bazalna plošča, (3) vrat z vzorcem, ki bi lahkopredstavljal kontraktilno prevleko, (4) kontrastno sredstvo, ki ga je bilo na preparatu nekoliko preveč,(5) ovratnik (Madigan et al., 2012).


5

2.2 RIKECIJE

Rikecije so obligatne intracelularne G - bakterije, ki lahko rastejo znotraj citoplazmegostiteljskih evkariontskih celic. Za rikecije je težko predvideti virulentnost in zmožnostpatogeneze na človeku, saj obstaja velika variabilnost v virulenci že med osebki istevrste (Boldis et al., 2009).

Preparat, ki smo ga opazovali, so bile pripravljene ultratanke rezine z rikecijami(Rickettsia slovaca) okuženih celic.

Slika 2.2: Označene ultrastrukture: (1) proste zunaj celične Rickettsia slovaca, (2) proste Rickettsiaslovaca v citoplazmi, (3) jedro, (4) citoplazemske vakuole, (5) napihnjen endoplazmatski retikulum, (6)napihnjen/otečen mitohondrij, (7) prosta Rickettsia slovaca znotraj jedra (Boldis et al., 2009).


6

Slika 2.3: Označene ultrastrukture: (1) tvorjenje septuma med delečo se Rickettsia slovaca, (2) dolgaoblika Rickettsia slovaca (več kot 2 mikro metra), (3) mitohondrij, (4) jedro, (5) jedrce, (6) Rickettsiaslovaca med prodiranjem proti/v jedro (Boldis et al., 2009).


7

Slika 2.4: Označene ultrastrukture: (1) kolonija Rickettsia slovaca v obliki krofa (“doughnut colonies”),(2) citoplazemske vakuole, (3) aktinski repi, fenotip rikecij (Boldis et al., 2009).


8

3 ULTRASTRUKTURA ŽIVALSKIH CELIC (VAJE 23. 12. 2013)

3.1 HEPATOPANKREAS

Preparat je bil pripravljen iz hepatopankreasa mokrice (Porcellio scaber), ki je modelniorganizem in vivo poskusov na mnogih področjih, uveljavljeni pa so predvsem v toksiko-loških raziskavah. Kopenski raki enakonožci so široko razširjena skupina, ki igra ključnoekološko vlogo v dekompoziciji organske snovi podrastja. Hepatopankreas je centralnimetabolni organ teh živali, pomembno vlogo pa ima tudi pri skladiščenju mineralov(Longo et al., 2013; Znidaršič et al., 2003).


9

Slika 3.1: Označene ultrastrukture: (1) apikalni del celic S hepatopankreasa, (2) glikogen (minimalnakoličina v primerjavi s celicami B), (3) mitohondriji, (4) granulirani elektronsko gosti depoziti pocitoplazemski površini plazemske membrane , (5) maščobne kaplje, (6) avtofagna vakuola (Longo et al.,2013; Znidaršič et al., 2003).


10

Slika 3.2: Označene ultrastrukture: (1) Golgijev aparat, (2) mitohondriji, (3) jedro, (4) jedrnamembrana (Longo et al., 2013; Znidaršič et al., 2003).


11

Slika 3.3: Označene ultrastrukture: (1) jedrce, (2) jedro, (3) jedrna membrana, (4) mitohondriji (Longoet al., 2013; Znidaršič et al., 2003).


12

Slika 3.4: Označene ultrastrukture: (1) kromatin, (2) jedrne pore, (3) jedrna membrana, (4) ribosomi,(5) maščobna kaplja (Longo et al., 2013; Znidaršič et al., 2003).


13

Slika 3.5: Zgornja meja povečave in resolucije elektronskega mikroskopa, ki smo ga na vajah uporabljali.Označene ultrastrukture: (1) jedrna membrana, (2) ribosomi (Longo et al., 2013; Znidaršič et al.,2003).


14

Slika 3.6: Označene ultrastrukture: (1) lizosom z izmerjenim premerom, (2) membrana lizosoma, (3)ribosomi, (4) granulirani endoplazmatski retikulum (Longo et al., 2013; Znidaršič et al., 2003).


15

Slika 3.7: Označene ultrastrukture: (1) mitohondrij, (2) lizosom, (3) v lizosomu vskladiščen baker, (4)notranja membrana mitohondrija (Longo et al., 2013; Znidaršič et al., 2003).


16

Slika 3.8: Označene ultrastrukture: (1) bazalna lamina B celice, (2) mitohondriji, (3) ribosomi, (4)bazalni labirint z značilnimi invaginacijami (Longo et al., 2013; Znidaršič et al., 2003).


17

3.2 GONADE

Gonade so pripadale živali iz razreda Bivalvia, glede na ultrastrukturne lastnostispermatozojev morda celo Mytella sp.. Pomembnost morfologije spermatozojev zataksonomijo je do sedaj poudarilo že veliko študij in v preteklosti je bila primerjavaspermatozojev že večkrat uspešno uporabljena za določanje filogenetskih odnosovznotraj razreda Bivalvia. Že samo na podlagi prisotnosti ali odsotnosti akrosomalahko osebek uvrstimo med dve poddružini. Osebki, katerih spermatozoji ne posedujejoakrosomalnega podaljška, spadajo v poddružino Modiolinae, osebki katerih spermatozojiakrosomalni podaljšek imajo, pa v poddružino Mytilinae (Introíni et al., 2010). Slednjedrži tudi za naš preparat.


18

Slika 3.9: Označene ultrastrukture: (1) močno izraženi mitohondriji, (2) jedro z močno kompaktiranoDNA, (3) akrosom, (4) prečni prerezi flagelov z značilno strukturo citoskeleta, (5) sub-akrosomalnaregija, (6) prečni prerez akrosoma (Introíni et al., 2010).


19

Slika 3.10: Označene ultrastrukture: (1) proksimalni centriol, (2) distalni centriol, (3) lep vzdolžniprerez flagela, (4) prečni akrosoma (Introíni et al., 2010).


20

Slika 3.11: Označene ultrastrukture: (1) 2 centralna samostojna mikrotubula, (2) plazmalema, (3) 9dvojnih mikrotubulov iz A in B tubula (Introíni et al., 2010).


21

Slika 3.12: Označene ultrastrukture: (1) spermatozoj med razvojem, (2) mitohondrij, (3) jedro z žeprecej kompaktirano DNA (Introíni et al., 2010).


22

LITERATURA

Boldis V., Strus J., Kocianová E., Tusek-Znidaric M., Stefanidesová K., Spitalská E. 2009.Ultrastructural study of the life cycle of Rickettsia slovaca, wild and standard type,cultivated in L929 and Vero cell lines. Folia microbiologica 54, 2: 130–6 ISSN 1874-9356 doi:10.1007/s12223-009-0019-4 URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19418250

Echin P. 2009. Handbook of sample preparation for scaning electron microscopy andx-ray microanalysis. Springer Science Business Media ISBN 9780387857305

Egerton R. F. 2005. Physical Principles of Electron Microscopy. Boston, MA: SpringerUS ISBN 978-0-387-25800-3 doi:10.1007/b136495 URL http://www.springerlink.com/index/10.1007/b136495

Frank J. 1992. Electron tomography. New York: Springer Science Business Media ISBN9781475721652

Goodhew P. J., Humphreys J., Beanland R. 2001. Electron microscopy andanalysis. London, New York: Taylor & Francis 3rd edn. ISBN 0748409688URL http://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=zuxPIVmGLGsC&oi=fnd&pg=PR9&dq=Electron+Microscopy+and+Analysis&ots=-V0PqeZKYI&sig=wcoH4wJoBYOxcIYyeoP9Oe_CvD8

Introíni G. O., Maester F. M., Leite F. P. P., Recco-Pimentel S. M. 2010. Spermultrastructure of Mytella (Bivalvia) populations from distinct habitats along thenorthern coast of São Paulo State, Brazil. Biocell : official journal of the SociedadesLatinoamericanas de Microscopía Electronica ... et. al 34, 3: 103–11 ISSN 0327-9545URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21443140

Khan M. 212. The transmission electron microscope. Rijeka: InTech ISBN9789535104506

Longo G., Trovato M., Mazzei V., Ferrante M., Conti G. O. 2013. Ligiaitalica (Isopoda, Oniscidea) as bioindicator of mercury pollution of marinerocky coasts. PloS one 8, 3: e58548 ISSN 1932-6203 doi:10.1371/journal.pone.0058548 URL http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3589354&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

Madigan M. T., Martinko J. M., Stahl D. A., Clark D. P. 2012. Brock Biology of Micro-organisms. San Francisco, CA: Benjamin Cummings 13th edn. ISBN 9780321649638

Watt I. M. 1997. The principles and practice of electron microscopy. Cam-

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19418250


http://www.springerlink.com/index/10.1007/b136495

http://www.springerlink.com/index/10.1007/b136495

http://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=zuxPIVmGLGsC&oi=fnd&pg=PR9&dq=Electron+Microscopy+and+Analysis&ots=-V0PqeZKYI&sig=wcoH4wJoBYOxcIYyeoP9Oe_CvD8




http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3589354&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3589354&tool=pmcentrez&rendertype=abstract


23

bridge: Cambridge University Press 2nd edn. ISBN 9781139170529 doi:10.1017/CBO9781139170529 URL http://ebooks.cambridge.org/ref/id/CBO9781139170529

Znidaršič N., Strus J., Drobne D. 2003. Ultrastructural alterations of the hepatopancreasin Porcellio scaber under stress. Environmental toxicology and pharmacology 13, 3:161–74 ISSN 1382-6689 doi:10.1016/S1382-6689(02)00158-8 URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21782651

http://ebooks.cambridge.org/ref/id/CBO9781139170529

http://ebooks.cambridge.org/ref/id/CBO9781139170529

