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Efecto de la densidad de explantes y el volumen de medio de
cultivo sobre la multiplicación in vitro de arándano
(Vaccinium corymbosum L.) variedades Brigitta y Legacy
Effect of explant density and volume of cultivation medium on in-
vitro multiplication of blueberry (Vaccinium corymbosum L.) varieties
"Brigitta" and "Legacy"
Mario Rodríguez Beraud*, Daniza Morales Ulloa
Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco, Rudecindo Ortega 02950, Temuco, Chile.
Recibido 17 noviembre 2014. Aceptado 25 enero 2015.
Resumen El objetivo fue evaluar la multiplicación in vitro de dos variedades de arándano (Vaccinium corymbosum L.),
“Brigitta” y “Legacy”, en respuesta a cinco densidades de explantes (5, 10, 15, 20 y 25) y cuatro volúmenes de
medio (10, 20, 30 y 40 mL) utilizando para ambas variedades el medio WPM (Woody Plant Medium) en un
diseño completamente al azar con 20 tratamientos y 12 repeticiones por tratamiento. Transcurrido 45 días se
evaluó: altura de brote, número de brotes/explante, número de nudos/brote y número de brotes/frasco. Brigitta
obtuvo la mayor altura del brote en tratamientos con densidades y volúmenes elevados, mientras que Legacy
obtuvo el mayor promedio de altura del brote con densidades intermedias y volúmenes elevados. En cuanto al
número de brotes/explante, el volumen de medio no influyó en la variedad Brigitta, en cambio, altas
densidades la afectaron significativamente, mientras que en Legacy el máximo número de brotes se alcanzó
con densidades bajas y volúmenes intermedios. En relación al número de nudos por explante Brigitta obtuvo
los valores más bajos comparados con Legacy, pero en ambas variedades se produjo una disminución del
número de nudos con menores volúmenes de medio. Para el número de brotes por frasco Brigitta obtuvo las
mayores respuestas con densidades elevadas, superando los 40 brotes por frasco. En cambio, en Legacy el
resultado máximo se obtuvo con la densidad 25 explantes en 30 mL de medio. Por lo tanto, se concluye que
ambas variedades fueron influenciadas tanto por el volumen del medio como la densidad de explantes.
Palabras clave: cultivo in vitro, micropropagación, explantes, brote.
Abstract The objective of the investigation was to evaluate the in-vitro multiplication of two varieties of blueberry
(Vaccinium corymbosum L.), “Brigitta” and “Legacy” in response to five explants densities (5, 10, 15, 20 and
25) and four flask volumes (10, 20, 30 and 40 mL) for cultivation. For both varieties the cultivation medium
WPM (Woody Plant Medium) was used. The experiment was completely randomized with 20 treatments and
12 repetitions per treatment. After 45 days of cultivation we evaluated the height of shoots, number of
shoots/explant, number of nodes/shoot and number of shoots/flask. Variety “Brigitta” had highest shoots at
higher densities and flask volumes, while variety “Legacy” had the highest average shoot height with
intermediate densities and high volumes. Regarding the number of shoots/explant, the volume of the medium
had no influence on “Brigitta”, however, higher plant densities affected this parameter. With variety “Legacy”
the maximum number of shoots was achieved with lower plant densities and intermediate culture volumes per
flask. In relation to the number of nodes per explant "Brigitta had lower numbers as compared to “Legacy”,
but with both varieties the number of nodes decresed with smaller volumes of medium in the flasks. For the
number of shoots per flask, “Brigitta” responsed best at higher densities exceeding 40 shoots per flask. In
contrast, “Legacy” produced maximum results at density of 25 explants in 30 mL of medium. It is concluded
that for the optimum multiplication of both varieties the correct selection of both, the planting density and the
volume of multiplication medium are important.
Keywords: in vitro culture, micropropagation, explants, shoots.
Scientia Agropecuaria Sitio Web: http://revistas.unitru.edu.pe/index.php/scientiaagrop
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Universidad Nacional de Trujillo
Scientia Agropecuaria 6 (1): 31 – 40 (2015)
_________
* Autor para correspondencia © 2015 Todos los Derechos Reservados
E-mail: [email protected] (M. Rodríguez). DOI: 10.17268/sci.agropecu.2015.01.03
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1. Introducción
El cultivo de arándano fue introducido a
Chile en la década de los 80 por el Instituto
de Investigaciones Agropecuarias (INIA)
ante la necesidad de diversificar la
fruticultura de exportación del país y con
el propósito de incorporar a la agricultura
intensiva zonas que eran ocupadas con
cultivos de baja rentabilidad, desde allí ha
mostrado un importante aumento en
superficie plantada (Buzeta, 1997). Chile
concentra la mayor superficie de cultivo de
arándano de Sudamérica y es el segundo
productor a nivel mundial, y al año 2013
alcanzó las 14.506 ha con una producción
de 136.436 t, las cuales se encuentran
distribuidas entre las regiones de Atacama
y Los Lagos (Bravo, 2014).
El incremento de las plantaciones ha traído
una creciente demanda por plantas, en
especial las plantas in vitro por su demos-
trada calidad y homogeneidad (Litwinczuk
et al., 2005). La micropropagación en
arándano se inició hace aproximadamente
30 años (Cohen y Elliot, 1979; Zimmer-
man y Broome, 1980) y ha demostrado ser
un método eficaz y no generar variabilidad
genética si se utiliza organogénesis directa
(Gajdošová et al., 2006).
Numerosos estudios han publicado las
condiciones del cultivo, medios basales, y
reguladores del crecimiento para el óptimo
desarrollo in vitro de Vaccinium
corymbosum. Wolfe et al. (1983) estudia-
ron el empleo de distintos medios basales,
demostrando que Woody Plant Medium
(WPM) (Lloyd y McCown, 1980) fue el
más apto para el crecimiento de brotes de
siete medios probados en arándano
variedad “Bluecrop”, a partir de este
estudio, la mayoría de los investigadores
han utilizado WPM como medio basal para
la micropropagación de arándanos (Wolfe
et al., 1986; Reed y Abdelnour, 1991;
Isutsa et al., 1994; González et al., 2000).
Otros estudios, se han centrado en la
búsqueda de las citoquininas adecuadas
para el establecimiento y multiplicación in
vitro, donde destacan, la isopentenil-
adenina (2iP) y la zeatina (Reed y
Abdelnour, 1991; Debnath y McRae, 2005;
Fira et al., 2008). También se ha estudiado
el empleo de tidiazurón (TDZ) para inducir
brotes adventicios, no obstante, la mayoría
de las investigaciones han observado una
baja respuesta del arándano respecto a esta
hormona (Cao y Hammerschlag, 2000;
2002; Debnath, 2005a; 2005b; Meiners et
al., 2007). Otro factor es la concentración
de sacarosa, donde se ha reportado la
proliferación de brotes en arándano en
medios contenidos desde 15 mM (Cao et
al., 1998) a 88 mM (Zimmerman y
Broome, 1980; Wolfe et al., 1983). Los pH
de los medios de cultivo para arándanos
son mayoritariamente ácidos, al respecto,
Ostrolucká et al. (2004) obtuvieron la
mejor regeneración en pH 5,0 para la
variedad Duke. Otros factores están
relacionados a las condiciones ambientales
como la irradiación de luz, temperatura del
aire, humedad relativa, dióxido de carbono
(CO2), y concentraciones de etileno
(Aitken-Chrisie et al., 1994; Zimmerman,
1995).
No obstante, todas estas investigaciones se
basan en el estudio de los factores físico-
químicos que condicionan el crecimiento y
desarrollo del cultivo in vitro, pero existe
poca información sobre las condiciones
físicas como densidad de explantes y
volumen de medio en la multiplicación in
vitro de arándano, la cual es fundamental
para la micropropagación comercial razón
por la cual se desarrolló la presente
investigación en dos de las variedades de
arándano alto (V. corymbosum) “Brigitta”
y “Legacy”, más plantadas en Chile. De
acuerdo a lo anterior el objetivo de este
estudio fue determinar la mejor
combinación entre densidad de explantes y
volumen de medio que permitan la mayor
producción de brotes/frasco en dos
variedades de arándano alto.
2. Materiales y métodos
2.1. Material vegetal
Como fuente de explantes se utilizaron
plantas in vitro de V. corymbosum,
variedades Brigitta y Legacy, procedentes
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de la Universidad Católica de Temuco,
Chile, que se encontraban en fase de
multiplicación en medio WPM, el explante
consistió en trozos de tallos apicales de
aproximadamente 1,5 cm.
2.2. Condiciones de cultivo
El medio de cultivo utilizado para ambas
variedades fue WPM (Lloyd y McCown,
1980), suplementado con 4 mg L-1
de
isopenteniladenina (2iP), 30 g L-1
de
sacarosa, 7 g L-1
de agar (Merck) y
ajustado a pH 5,2 con KOH (1N) y HCl
(1N). La esterilización de medios de
cultivo se realizó en una autoclave (Speedy
Autoclave HL-340) con las siguientes
condiciones: 121 ºC con 15 N/m2 por 15
min. La siembra se realizó en una cámara
de flujo laminar (ESCO AHC-5A1) en
frascos de 200 mL y fueron tapados con
papel aluminio y sellados con parafilm.
Los explantes se incubaron por 45 días a
25 ± 3 ºC, con un fotoperíodo de 16 h luz y
una intensidad lumínica de 3000 lux.
2.3. Evaluaciones realizadas
Una vez trascurrido 45 días del inicio del
experimento se evaluó: altura del brote,
número de brotes por explante y número
de nudos por brote. Las plantas se
midieron con un pie de metro digital.
También se calculó el número de brotes
totales por frasco multiplicando el número
de brotes por explante por la densidad
respectiva.
2.4. Análisis estadístico
Se utilizó un diseño completamente al azar
para todos los tratamientos. Se utilizaron
cinco combinaciones de densidades de
explantes (5, 10, 15, 20, 25 explantes por
frasco) por cuatro volúmenes de medio de
cultivo (10, 20, 30, 40 mL), totalizando 20
tratamientos. La unidad experimental
correspondió a un frasco de 200 mL. Se
utilizaron 12 frascos (repeticiones) por
tratamiento los que contenían un número
variable de explantes y de medio según
tratamiento. Los datos fueron analizados
utilizando el programa estadístico SPSS
versión 15 (SPSS, 2006). Se aplicó la
prueba de normalidad (Shapiro-Wilk) y se
analizó la homogeneidad de varianzas
(estadístico de Levene). Para las diferen-
cias significativas entre promedios (p ≤
0,05) se aplicó el test paramétrico (T2 de
Tamhane).
3. Resultados y discusión
3.1. Altura del brote
La densidad de explante como el volumen
de medio influyeron significativamente (p
≤ 0,05) sobre la altura del brote, siendo
significativa también su interacción, para
ambas variedades, no obstante, ante el mis-
mo tratamiento los brotes de Legacy fue-
ron generalmente más largos (Figura 1A y
1B), por ser una variedad más vigorosa.
En la variedad Brigitta, los crecimientos
más altos del brote se lograron con
densidades y volúmenes de medio eleva-
dos (25 explantes por frasco con 30 y 40
mL de medio) superando los 33 mm de
altura (Figura 1A), siendo significativa-
mente superior (p ≤ 0,05) al tratamiento de
20 explantes por frasco con 10 mL de
medio donde se obtuvieron los promedios
más bajos. Lo anterior puede ser atribuido
a la falta de nutrientes por las elevadas
densidades de explantes, ya que con el
tratamiento con 25 explantes y 10 mL de
medio, los resultados fueron similares
significativamente. Además, hay que
considerar que el volumen del medio y
forma del recipiente pueden afectar la
composición del gas al interior de éste, y
en consecuencia pueden afectar el
crecimiento y desarrollo del cultivo
(Pereira et al., 2006). Contrariamente a los
resultados obtenidos, Mazri (2013) obtuvo
disminuciones en la longitud del brote al
aumentar la densidad de brotes en el
medio. No obstante, las plantas más largas
derivadas de las altas densidades no
representan necesariamente una ventaja, ya
que en algunos casos se observaron
etioladas debido probablemente a la
competencia por luz, lo cual puede
perjudicar su posterior aclimatación. En
este sentido, Hamad y Taha (2009)
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reportaron que al aumentar el número de
brotes del grupo, se reduce la capacidad de
formación de brotes por brotes indivi-
duales, y aumenta la longitud del tallo. A
esto se suma que las plantas in vitro por lo
general se caracterizan por tener un pobre
desarrollo de la capa de cera epicuticular y
de los estomas, ya que éstas no tienen la
función normal de transpiración. Debido a
la mayor humedad relativa que se encuen-
tra dentro de los frascos, las plantas in
vitro no tienen la capacidad para resistir el
estrés hídrico después del trasplante a las
condiciones ex vitro (Chen, 2004).
Figura 1. Efecto de la densidad de explantes y el volumen de medio de cultivo sobre la altura del
brote (A, B), número de brotes por explante (C, D) y número de nudos por explante (E, F) en V.
corymbosum variedad Brigitta (A, C, E) y Legacy (B, D, F). Barras y líneas verticales representan
el promedio ± el error estándar. Letras distintas indican diferencia significativa (p ≤ 0,05) dentro de
los tratamientos, según test T2 de Tamhane. n=12.
Densidad (explantes/frasco)
5 10 15 20 25
Nº
de n
udos/e
xpla
nte
0
2
4
6
8
10
12
14
10 mL
20 mL
30 mL
40 mL
ede
bcde
abc
a
ab
cde
de
cde
abc
abcdeabcde
de
bcde
cde
abcd
ede
abcde
abc
Densidad (Nº de explantes/frasco)
5 10 15 20 25
Nº
de n
udos/e
xpla
nte
0
2
4
6
8
10
12
14
10 mL
20 mL
30mL
40 mL
d
bcd
ab
cdbcd
abcd
bcd
abcd
bcdabcd
ababcd
abcd
bcdbcd
ababcd
abcabcd
a
B
Densidad (Nº de explantes/frasco)
Nº
de b
rote
s/exp
lan
te
0
1
2
3
4
10 mL
20 mL
30 mL
40 mL
aba
abc
abc
abcd
abcd
abcd
cde
de
cde
e
de
de
de
ab
abcd
abcd
abcde
bcdebcde
5 10 15 20 25
A
Densidad (Nº de explantes/frasco)
Alt
ura
del
bro
te (
mm
)
0
10
20
30
40
50
60
10 mL
20 mL
30 mL
40 mL
cde bcde
bc
cdefgh
cdefg
defghefgh
fgh
cdefg
cdecde
b
h
fgh
cdefcdef
fgh
bcd
aa
5 10 15 20 25
B
Densidad (Nº de explantes/frasco)
Nº
de b
rote
s/ex
pla
nte
0
1
2
3
4
10 mL
20 mL
30 mL
40 mL
abcd
a
abc
defg
abcdef
abcab
abcde
fg
defg
cdefg
cdefg
fg
bcdef
abcde
bcdef
g
efg
abcde
cdef
5 10 15 20 25
A
Densidad (Nº de explantes/frasco)
Alt
ura
del
bro
te (
mm
)
0
10
20
30
40
50
60
10 mL
20 mL
30 mL
40 mL
fghi
efghicdef
defg
hi
bcd
bcd
bcd
cde
bcd
aba
ghi
cdebc
i
efghi
efgh
ab
cde
5 10 15 20 25
C
B
E F
D
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En la Figura 1A se aprecia que para el caso
de Brigitta no hubo un incremento de la
altura del brote con el aumento del
volumen de medio para las densidades 5 y
10 explantes por frasco, lo que indica que
el volumen no afecta la altura del brote
para estas densidades, la baja altura del
brote que se obtuvieron en estas densida-
des se puede explicar por la mayor
intensidad de luz que ingresa al frasco a
causa de la baja densidad, lo que provoca
una mayor temperatura y tensión del medio
de cultivo en el interior del frasco,
dificultando la absorción de nutrientes en
las plantas. Al respecto, Chen (2004)
observó que al aumentar la evaporación del
medio hubo una disminución de la
humedad relativa, induciendo un menor
crecimiento del brote, lo que ocurre en las
densidades bajas. A partir de la densidad
15 explantes por frasco el volumen de
medio de cultivo provocó el aumento del
crecimiento del brote, el que obtuvo una
respuesta de 27,89 mm de altura en el
tratamiento con 15 explantes en 40 mL de
medio. Con la densidad de 20 y 25
explantes por frasco ocurrió algo similar a
la densidad anterior, donde la altura del
brote se fue incrementando al ir aumentado
los volúmenes de medio, lo que significa
que con altas densidades el efecto del
volumen se hace más evidente debido a la
competencia que existe entre las plantas
por agua y nutrientes, obteniendo la mayor
altura del brote en los tratamientos con 25
explantes por frasco en 30 y 40 mL de
medio, estas plantas se caracterizaron por
ser altas pero con baja proliferación por
explante. Kozai et al. (1995) informan
resultados similares en el cultivo in vitro
de papa (Solanum tuberosum), quienes
señalaron que al ir aumentando los
volúmenes de medio el crecimiento del
brote se fue acrecentado, agregando
además, que la humedad relativa es mayor
en densidades elevadas, debido a que se
encuentra una mayor cantidad de plantas
transpirando induciendo un menor
crecimiento del brote. En el caso de la
variedad Legacy, la altura del brote (Figura
1B) obtuvo los mayores resultados en la
densidad intermedia, presentando
diferencias significativas sobre el resto de
las densidades, respecto al volumen de
medio de cultivo, las plantas más altas
fueron aquellas que se encontraban en los
tratamientos con volúmenes más elevados.
Similar a lo reportado por Reis et al.
(2007), quienes informaron que con
mayores volúmenes de medio se obtienen
mayores longitudes de brotes y viceversa,
ya que con mayores volúmenes hay mayor
disponibilidad de nutrientes para las
plántulas, obteniendo además un mayor
vigor del brote, una coloración más verde y
alta tasa de supervivencia (88%).
La densidad 5 explantes por frasco, fue la
única que no presentó diferencias
significativas en la altura del brote al
aumentar los volúmenes de medio en el
caso de Legacy (Figura 1B), lo que indica
que a densidades bajas se encuentran
satisfechos los requerimientos de disponi-
bilidad de nutrientes y no hay efectos de
competencia. En la densidad 10 explantes
por frascos en 10 mL de medio (Figura
1B), se obtuvo una baja altura de brote con
un promedio de 26,65 mm, mientras que al
aumentar los volúmenes a 20, 30 y 40 mL
de medio, fue mayor el crecimiento del
brote pero entre estos tres no hubo
diferencia significativa.
En la densidad de 15 explantes por frasco,
se observó algo similar a lo ocurrido en el
tratamiento anterior, al incrementar los
niveles de medio de cultivo, aumentó la
altura del brote, obteniendo en el volumen
de 40 mL de medio, dos de los tres mejores
resultados a esta variable (Figura 2e),
superando los 42 mm de altura del brote
(Figura 1B).
En tanto a lo ocurrido en la densidad 20
explantes por frasco disminuyó el
promedio de altura del brote en relación a
la densidad anterior, esto se puede explicar
debido al mayor crecimiento de las plantas
en la variedad Legacy, en comparación con
la variedad Brigitta, ya que estas últimas
no alcanzaron a superar los 34 mm de
altura del brote. En este sentido, Assis et
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al. (2012) señalan que se observan mejores
respuestas en volúmenes de medio de 15 y
25 mL de medio MS (50%) en relación a
WPM (100 y 50%), por lo que sugieren un
volumen de 15 mL para una mayor
economía del medio.
En la densidad 25 explantes por frasco se
incrementó la altura del brote al aumentar
el volumen de medio, demostrando que el
volumen influye significativamente en el
crecimiento del brote cuando las
densidades son elevadas. A esto podemos
sumarle que las altas densidades de
explantes presentan una mayor humedad
relativa en comparación con las densidades
más bajas, induciendo un mayor
crecimiento del brote.
Figura 2. Multiplicación in vitro de V.
corymbosum a los 45 días. Variedad Brigitta (a,
b, c, d), 25 explantes en 40 mL de medio (a), 5
explantes en 20 mL de medio (b), 25 explantes
en 10 mL de medio (c), 20 explantes en 20 mL
de medio (d). Variedad Legacy (e, f, g, h), 15
explantes en 40 mL de medio (e), 5 explantes
en 20 mL de medio (f), 25 explantes en 10 mL
de medio (g), 25 explantes en 40 mL de medio
(h). (Barra = 1 cm).
Orellana (1998) puntualizó la necesidad de
valorar experimentalmente la densidad de
explantes por frasco debido a que este
parámetro puede ocasionar deficiencias en
el sistema; ya que una baja densidad
ocasionaría pérdidas de espacio y medio de
cultivo, y con ello la subutilización de los
recipientes; mientras que una alta densidad
propiciaría un crecimiento limitado de los
brotes. Mientras que Castro y González
(2002) sostuvieron que para lograr un
desarrollo en las técnicas de cultivo de
tejidos es necesario proveer a las plantas
con suficientes cantidades de nutrientes
esenciales (incluyendo la sacarosa y
carbono como fuentes de energía bajo
condiciones heterotróficas), de tal manera
que los nutrientes no sean un factor
limitante para la multiplicación en el
desarrollo de las plantas.
3.2. Número de brotes por explante
El análisis estadístico indicó diferencias
significativas para los factores densidad de
explantes y volumen de medio así también
en la interacción del volumen de medio
por la densidad.
En la Figura 1 se observa que para las
densidades 5, 10 y 15 explantes por frasco
no presentaron diferencia significativa en
el número de brotes por explantes en la
variedad Brigitta al variar el volumen del
medio (Figura 1C), por lo que se puede
presumir que los recursos físicos y
químicos no fueron limitantes para el
desarrollo de estas plantas, alcanzando más
de tres brotes por explantes en los
tratamientos con cinco explantes por frasco
en la variedad Legacy (Figura 1D). En
tanto, los tratamientos con 20 y 25
explantes por frasco obtuvieron un
resultado inverso, los que no superaron los
2,3 brotes por explante, esto puede
explicarse por un mayor sombreamiento
entre plantas y por tanto una mayor
dominancia apical. En este sentido, Mazri
(2013), reportó algo similar, al obtener el
mayor número de brote por trozo cuando la
densidad utilizada era de un trozo por
frasco (14,7 brotes por explante en medio
WPM), sin embargo, teniendo en cuenta el
número de brotes regenerados por frasco y
M. Rodríguez y D. Morales / Scientia Agropecuaria 6 (1) 31 - 40 (2015)
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su morfología, se recomiendan más trozos
por frasco, ya que el número promedio de
brotes regenerados por frasco se podría
aumentar, a pesar de que el desarrollo del
trozo por frasco en densidades menores es
morfológicamente superior, siendo más
sanos y uniformes, en comparación a
aquellos desarrollados en mayores densida-
des, los cuales mostraron anormalidades
morfológicas (hiperhidricidad y parde-
amiento). También se ha reportado que una
mayor densidad de explantes en el frasco
produce una mayor acumulación del gas
etileno reduciendo la disponibilidad de
oxígeno para la respiración de las plantas,
inhibiendo la brotación (Zobayed et al.,
2001; Hazarika, 2006). Por otra parte,
Williams (1995) sostuvo que los tejidos
vegetales (explantes) pueden contribuir a
cambios en el medio de cultivo, ya sea por
absorción de sustancias desde el medio o
exudación al medio, alterarando el pH de
éste, favoreciendo o inhibiendo el desa-
rrollo de las plantas, debido a que difunden
compuestos secundarios en el medio de
cultivo a partir de los explantes, que
reducen el número de brotes, provocándose
además, el agotamiento y competencia por
nutrientes (Aicha et al., 2014). A esto se le
añade que las altas densidades de explantes
provocan un aumento de la humedad
relativa al interior del frasco, lo que
disminuye la brotación. Shende y Rai
(2005) obtuvieron una regeneración de
múltiples brotes utilizando una baja hume-
dad relativa en cultivo de Buchanania
lanzan.
En cuanto a la variedad Legacy análisis de
los efectos principales y las interacciones
entre éstos, indicaron que existen
diferencias significativas. En la densidad 5
y 10 explantes por frasco no presentaron
diferencias significativas (Figura 1D) supe-
rando los 2,5 brotes por explantes, al
respecto Lorenzo et al. (1998), estudiaron
el efecto del volumen de medio de cultivo
por explantes sobre la formación de brotes
de caña de azúcar, estos autores señalaron
que al aumentar la cantidad de medio de
cultivo por explantes se incrementó la
disponibilidad de nutrientes; sin embargo
elevadas cantidades de medio de cultivo
disminuyeron el número de brotes. No
obstante, hay que considerar que el espacio
interno disponible para el crecimiento de
explantes tiene un efecto significativo
sobre el desarrollo in vitro de explantes
(Assis et al., 2012). Esto se puede explicar
debido que en los tratamientos donde se
encuentran bajas densidades de explante, la
transpiración es menor, lo que conlleva
una menor humedad relativa, aumentando
la formación de brotes, pero con un menor
crecimiento de éste (Chen, 2004).
Por otra parte, en los tratamientos con
densidades de 15, 20 y 25 explantes por
frasco (Figura 1D), se observa una tenden-
cia aunque no significativa del aumento en
el número de brotes por explante al ir
incrementando los volúmenes de medio de
cultivo, obteniendo resultados que en lo
general estuvieron cercanos a los dos
brotes por explante, similar a lo reportado
por Pereira et al. (2006) quienes señalan
que a mayor volumen de medio se
proporcionan más nutrientes y por lo tanto
disminuye la competencia entre las
plántulas, lo que explicaría la tendencia
para obtener un mayor número de brotes al
aumentar el volumen de medio de cultivo.
A esto se puede agregar el efecto de
competencia entre las plantas, que en
densidades elevadas y volúmenes bajos
disminuyen la proliferación por explantes,
debido al déficit de nutrientes,
considerando además, el espacio en el
frasco, ya que éste varía con la forma del
recipiente y el volumen del medio,
pudiendo afectar el volumen de aire dentro
del contenedor y la profundidad del medio
de crecimiento en éste (Assis et al., 2012).
No obstante, existe una clara diferencia
significativa entre los tratamientos de 5
explantes/frasco comparativamente con los
tratamientos de 25 explantes/frasco, reve-
lando que una baja densidad promueve el
número de brotes/explante en la variedad
Legacy (Figura 1D),
La baja cantidad de brotes por explantes
también se puede explicar porque en altas
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densidades se libera una mayor cantidad de
toxinas reduciendo el pH, que al contacto
con las células de las plantas provoca una
conversión de fosfato inorgánico en fosfato
orgánico en la región extracelular. Esto
también va acompañado de una reducción
de ATPs que lleva a la disminución del
crecimiento de las plantas y un pobre
desarrollo de los brotes (Huda et al., 2009).
3.3. Número de nudos por explante
En la variedad Legacy, el análisis factorial
indica efectos significativos del volumen
de medio y densidad de explantes (Figura
1F), en tanto que en la variedad Brigitta
sólo lo es el factor densidad (Figura 1E).
La interacción de factores muestra diferen-
cias significativas para ambas variedades.
Brigitta obtiene valores promedios inferio-
res que Legacy oscilando entre 5,7 y 7,7 vs
7,7 y 12,1 nudos/explante respectivamente.
En Brigitta el mayor número de nudos está
asociado al tratamiento de 25 explantes /
frasco y 10 mL, en cambio el menor valor
se obtiene con 5 explantes/frasco y 10 mL
de medio de cultivo (Figura 1E). En
Legacy el valor promedio más alto se logra
con el tratamiento de 10 explantes por
frasco con 30 mL de medio y el menor en
los tratamientos de 5 y 25 explantes/frasco
con 10 mL de medio (Figura 1F). En
general, una menor densidad de medio
provoca una disminución del número de
nudos/explante en ambas variedades. Sin
embargo, el número de brotes por planta es
la variable que determina el mayor número
de nudos totales y por lo tanto, la mayor
tasa de multiplicación en explantes
sembrados horizontalmente (Fernández-
Lizarazo y Mosquera-Vásquez, 2012).
En la Tabla 1 se muestra el número de
brotes totales por frasco y el porcentaje de
respuesta entre la densidad de explantes y
volúmenes de medio de cultivo, donde los
resultados más elevados se pueden
observar entre las densidades 15 a 25
explantes en la variedad Brigitta, logrando
obtener más de 38 brotes por frasco, con
excepción del tratamiento que contenían
15 explantes en 10 mL de medio.
Tabla 1
Efecto de la densidad de explante y el volumen de medio de cultivo sobre el número de brotes por
frasco y el porcentaje de respuesta por tratamiento en V. corymbosum variedad Brigitta y Legacy a
los 45 días
Tratamientos Brigitta Legacy
N° de
explantes
frasco-1
Volumen de
medio
(mL)
Respuesta de
brotación
(%)
N° de
brotes
frasco-1
Respuesta
de brotación
(%)
N° de
brotes
frasco-1
5 10 100 16,5 ± 0,84 e 100 12,3 ± 0,68 h
5 20 100 17,7 ± 0,87 ed 100 13,3 ± 1,14 h
5 30 100 17,0 ± 0,98 ed 98 12,3 ± 0,81 h
5 40 100 14,6 ± 0,76 e 100 9,3 ± 0,48 h
10 10 96 26,5 ± 1,86 cd 100 20,8 ± 0,75 f
10 20 98 26,5 ± 1,68 c 99 24,9 ± 1,48 ef
10 30 99 26,6 ± 1,28 c 100 26,3 ± 1,03 ef
10 40 99 27,3 ± 1,05 c 100 23,0 ± 2,02 ef
15 10 98 34,1 ± 1,47 bc 98 23,3 ± 1,33 ef
15 20 99 38,8 ± 2,03 ab 100 27,5 ± 0,73 ef
15 30 100 38,7 ± 2,55 abc 97 28,6 ± 2,44 def
15 40 100 40,2 ± 1,86 ab 98 28,9 ± 1,79 def
20 10 97 41,9 ± 1,46 ab 98 30,1 ± 0,67 de
20 20 99 44,3 ± 1,95 ab 100 40,5 ± 2,09 bcd
20 30 100 47,3 ± 2,75 a 99 44,4 ± 1,83 bc
20 40 99 48,5 ± 1,54 a 97 40,0 ± 2,14 cd
25 10 99 45,8 ± 1,63 a 97 32,5 ± 0,97 de
25 20 99 52,9 ± 1,70 a 99 43,2 ± 1,49 bc
25 30 99 53,3 ± 2,88 a 99 56,6 ± 1,53 a
25 40 99 52,3 ± 2,36 a 98 49,7 ± 2,60 b
Letras distintas son diferentes significativamente de acuerdo al test de T2 de Tamanhe (p ≤ 0,05).
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Los promedios más bajos se obtuvieron en
tratamiento con densidades de cinco
explantes por frasco los que no lograron
superar los 18 brotes por frasco. En este
sentido, Assis et al. (2012) observaron
diferencias significativas en los medios de
cultivo cuando se contrastaron en diferen-
tes volúmenes de medio, reportando un
mayor número de brotes en los volúmenes
de 10, 15 y 25 mL de medio MS.
En la variedad Legacy se observa que el
tratamiento de 25 explantes en 30 mL de
medio logra el mayor número de brotes
totales por frasco, alcanzando un promedio
de 56,58 brotes por frasco a diferencia de
los resultados más bajos que pertenecen a
los tratamientos con la densidad de cinco
explantes por frasco en todos sus
volúmenes de medio, los que no lograron
superar los 14 brotes por frasco (Tabla 1).
Por lo tanto, cuando se aumenta la
densidad de explantes por frascos, el
número promedio de brotes regenerados se
reduce, y el brote regenerado tiene tallo
delgado y hojas pequeñas, observándose
además, pardeamiento en los tejidos desde
la segunda semana del periodo de cultivo
(Aicha et al., 2014).
En cuanto al porcentaje de explantes que
formaron brotes fue alto, ya que todos los
tratamientos en ambas variedades fueron
iguales o superiores al 96% (Tabla 1). Por
lo que Hamad y Taha (2009) no sugieren
una mayor formación de brotes por
explante individual, ya que éste no sería un
buen indicador para la producción
comercial a gran escala, siendo la
producción total de brotes y el costo por
brote individual los parámetros más
importantes y esenciales.
4. Conclusiones
Respecto a la variable altura del brote, las
dos variedades fueron influenciadas tanto
por el volumen de medio de cultivo como
por la densidad de explantes empleadas.
En la variedad Brigitta los brotes más
largos se obtuvieron con densidades y
volúmenes elevados, en cambio en la
variedad Legacy los brotes más largos se
observaron con densidades de 15 explantes
por frasco en 30 y 40 mL de medio.
En cuanto al número de brotes por frasco
ambas variedades presentan un promedio
máximo alrededor de 50 brotes, sin
embargo Brigitta alcanza estos promedios
con densidades entre 20 y 25 explantes por
frasco en todos los volúmenes de medio,
en cambio Legacy solo lo consiguió con la
densidad de 25 explantes por frasco con
altos volúmenes de medio.
Por lo tanto es posible mejorar la
producción de brotes con el manejo de la
densidad de explantes y volumen de medio
lo cual es dependiente de la variedad. En
general una alta densidad de explantes
asegura una alta producción de brotes por
frasco.
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