由来のCas9タンパク質に対する

マウスモノクローナル抗体です。 ウェスタンブロッティング

においてニッポンジーンの野生型Cas9タンパク質で良好

な結果が得られることを確認しています。

Streptococcus pyogenes

● 組換えCas9タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体　● ウェスタンブロッティングにおいて高感度に検出可能

● T7 Endonuclease I と反応Bufferのプレミックス試薬● 二本鎖DNAのミスマッチを認識し切断● PCRと電気泳動でミスマッチを簡単に検出※4

● 変異導入クローンのスクリーニングが可能

本品は、T7 phage由来のT7 Endonuclease Iと、その反応

バッファーが1液タイプになったプレミックス試薬です。本品

に含まれるT7 Endonuclease I は、二本鎖DNAのミスマッチ

を認識し、切断する活性を有しており、ゲノム編集技術を用

いた変異導入の確認に利用できます。

Cas9 Nuclease による二重鎖切断（DSB)

修復エラーによる塩基の挿入・欠失

❷ 変性・アニーリング

ミスマッチを認識し切断

genome DNA

❶ 標的配列領域を PCR増幅PCR product

■ 概要

製品名 容量 希望納入価格(税別)Code No.

313-08801 T7 Endonuclease I reaction Mix 50 µl 15,000円

■ 特長

■ 構成品

T7 Endonuclease I reaction Mix　・・・・・　50 µl × 1本

■ 実験例 各種 Indel 切断の確認

2種類のDNA断片を混合して変性、再アニールすることで

理論上50％のDNAが Indel (挿入欠失: insertion/deletion)

を持つDNA断片を調製した。1～18塩基の異なるIndelを持

つDNA断片9μl（250 ng）に本品1μlを加え、37℃ 15分間

反応させた後、アガロースゲル電気泳動（2% Agarose S）

を行った。結果、本品は Indel 1～18塩基まで認識、切断

できることを確認した。

図3. 変異導入確認の実験フロー

基質DNAの準備

酵素反応 ❸ 基質 DNA ＋ 本品（37℃, 15 min.）

❹ アガロースゲル電気泳動

WT MU

ミスマッチを含む 2本鎖断片を形成

（※4） 本製品に PCR 酵素は含まれません。

Indel（1～18塩基）

本品(37℃,15min.)

WT MU

変性、アニーリング

断片A 断片D断片B,C

0 1 2 3 6 9 12 15 18

Indel (塩基数)

M

M: Gene Ladder 100

← 断片 B,C

800 bp

400 bp

← 断片 A,D

製品名 容量 希望納入価格（税別)Code No.

310-08431 Anti-Cas9 Monoclonal Antibody 50 µg 55,000円

■ 特長

■ 概要

免疫動物

抗　体

タイプ

精　製

形　状

マウス

Cs9 Nuclease protein NLS

モノクローナル

アフィニティー,イオン交換

1×PBS, 50% Glycerol

■ 実験例1 2 3 4 5 6

Lane1 : Lane2 :Lane3 :Lane4 :Lane5 :Lane6 :

0.625 ng1.25 ng2.5 ng

5 ng10 ng20 ng

（Cas9）

[Cas9タンパク質]　Cas9 Nuclease protein NLS

[一次抗体]　Anti-Cas9 Monoclonal Antibody(1µg/µl） 1:1000

[HRP標識二次抗体]　1:5000

[HRP検出試薬]　イムノスター®Zeta(富士フイルム和光純薬㈱) 露光時間 30 sec.

ウェスタンブロッティング

ゲノム編集ツールガイドRNA調製から変異導入の確認まで

in vitro 転写でのガイドRNA合成

Cas9タンパク質の準備

Cas9およびgRNAの細胞導入

変異導入の確認

CUGA®7 gRNA Synthesis Kit

Cas9 Nuclease protein NLS (3 µg/µl)Cas9 Nuclease protein NLS (15 µg/µl)

T7 Endonuclease I reaction Mix

【関連製品】Cas9タンパク質の検出

ゲノム編集の実験フロー

ステップ1

ステップ2

ステップ3

Anti-Cas9 Monoclonal Antibody

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.2

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.3・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.3

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.4

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.4

ステップ4

ゲノム編集

T7 Endonuclease I reaction Mix変異導入の確認（ミスマッチ切断酵素）

Anti-Cas9 Monoclonal Antibody【関連製品】Cas9タンパク質の検出（Cas9モノクローナル抗体）

4

本　　社 〒540-8605 大阪市中央区道修町三丁目1番2号 TEL：06-6203-3741 (代表)東京本店 〒103-0023 東京都中央区日本橋本町二丁目4番1号 TEL：03-3270-8571 (代表)

フリーダイヤル 0120-052-099 フリーファックス 0120-052-806　

〒930‐0834 富山市問屋町二丁目7番18号

TEL： 076‐451‐6548 FAX： 076‐451‐6547URL： https://www.nippongene.com

■ 概要

製品名 容量 希望納入価格（税別）Code No.

314-08691 50 回分 54,000円

■ 特長 ■ 構成品

■ 実験例

① gRNA合成量の比較

本キットは、ゲノム編集に必要なガイドRNA（gRNA）を合成・精製

するためのキットです。独自開発した改良型T7 RNA Polymerase

(CUGA®7 RNAポリメラーゼ)をin vitro転写反応に用いることで、

目的のgRNAを正確かつ大量に調製することができます。本キット

にはin vitro転写反応用試薬およびスピンカラムを用いたgRNA

精製用試薬が含まれています。

CUGA7 Enzyme Solution

5×Transcription Buffer

0.1 M DTT

NTP Mix

DNase I (RNase free)

gRNA Binding Buffer

gRNA Wash Buffer

Spin Column

ddWater (RNase free)

50 µl

200 µｌ

100 µl

300 µl

100 µl

30 ml

40 ml

50 本

・・・・

・・・・

・・・・・・・・・・・・・・・・

・・・・・・・・・・・・・・・・

・・・・・・

・・・・・・・

・・・・・・・・

・・・・・・・・・・・・・・

・・・・・

[ 50 回分 ]

1 ml×5本

（※1）本品に in vitro転写反応に必要な鋳型DNAおよび鋳型DNA調製用試薬は含まれておりませんので、別途ご用意いただく必要が

あります。

CUGA®7 gRNA Synthesis KitCUGA®

本品とA社gRNA合成キット(in vitro転写法）を用いて、1時間毎の

反応時間別のgRNA合成量を比較した。各社マニュアルに従って

精製し合成量を比較した結果、本品はA社と比べて約3倍のgRNA

を合成できた。

本品とA社キットを用いて、37℃で2時間反応させ、精製したgRNA

（250 ng）をアガロースゲル電気泳動により比較した。結果、本品

で合成したgRNAは目的のgRNAのみ合成することができた。

1　 　 2

Lane1 : CUGA®7

Lane2 : A社

3％ Agarose 21

1×TAE

EtBr染色

目的の転写産物

不完全な転写産物

本品で合成したgRNA（ⒶsgRNA）と化学合成gRNA(ⒷcrRNA/tracrRNA)を用いて、標的配列を含むDNA

断片をin vitroで切断した。結果、本品で合成したgRNAは化学合成品と同等に機能することを確認した。

ⒶsgRNA

ⒷcrRNA/tracrRNA

(※2) Cas9 Nuclease protein NLS (Code No.319-08641, 316-08651)

M: Gene Ladder Fast 2

Lane1： Control（基質DNA）

Lane2： 2 pmol Cas9※2 ＋ 2 pmol 化学合成gRNA (ⒷcrRNA/tracrRNA)

Lane3： 2 pmol Cas9※2 ＋ 50 ng 本品で合成したgRNA (ⒶsgRNA)

② 電気泳動による比較

③ 化学合成gRNAとの比較（in vitro切断チェック）

● 化学合成gRNAと同等に機能する

0

10

20

30

40

50

0 1 2 3 4

RNA合

成量

（µg

）

反応時間（hr）

CUGA®7

Ａ社

CUGA®7

A社

RN

A合

成量

（µg）

反応時間（hr）

CUGA®7 RNAポリメラーゼは、野生型T7 RNA Polymeraseよりも

転写効率が高く、目的のgRNAを正確かつ大量に合成できます。

in vitro転写反応からgRNA精製までの必要試薬が全て含まれています※1。

また、精製に必要なスピンカラムも含まれるため、コストパフォーマンスに

優れたキットです。

本品で合成したgRNAと化学合成 gRNA（crRNA/tracrRNA）は

in vitro切断チェックで同等の結果が得られています。

● in vitro転写でgRNAを正確かつ大量に合成

M　 1　 2　 3

4,000 bp

2,000 bp

1,000 bp

製品名 容量 希望納入価格（税別）Code No.

319-08641

316-08651

75 µg

300 µg

23,000円

75,000円

Cas9 Nuclease protein NLS (3 µg/µl)

Cas9 Nuclease protein NLS (15 µg/µl)

本品は、Streptococcus pyogenes由来のCas9 ヌクレアーゼで、

大腸菌で発現・精製した組換えタンパク質です。核移行シグナル

（NLS）を有しており、ガイドRNAと組み合わせることでゲノム編集

に利用することができます。

● 15 µg/µlの高濃度品をラインナップ● 核移行シグナル（NLS）が付加され、in vitro実験でも高効率● 低エンドトキシン (1 EU/µg 未満)

(※3) 総胎児数あたり

受精卵注入

注入胚数 移植胚数

産仔作出結果

総胎児数 ノックアウト匹数(％)※3 ノックイン匹数(％)※3

123 114 116/11

(54.5％)

6/11

(54.5％)

表1. Cas9 Nuclease protein NLSを用いた遺伝子変異動物作製

② ノックインマウスの作出（マイクロインジェクション法） Surveyor assay

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Wt

(A） ノックアウト個体候補

PCR-RFLP

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Wt

(B） ノックイン個体候補

図2. ノックアウト 及び ノックイン個体候補の確認(A）Surveyorアッセイによる変異導入の確認。変異導入され

たサンプルでは、Cel-Iヌクレアーゼにより切断されたPCR

産物が観察された（➡）。 (B）PCR-RFLPによる変異導入の

確認。ドナーDNAに予め制限酵素（BamHI）サイトを付加し、

PCR後、BamHIで消化した（➡）。

マウス 遺伝子を標的として、Cas9 Nuclease protein NLS (3 µg/µl) とgRNA

およびノックインドナーDNAを混合し、C57BL/6Jマウス受精卵の前核と細胞質に

マイクロインジェクションした。マウス2細胞期胚を仮親に移植し、誕生した仔マウ

スについて遺伝子ノックインの有無を確認した（表1及び図2）。結果、誕生した

11匹の仔マウスのうち6匹のマウスにおいて遺伝子ノックインが確認された。

Smpd3

■ 概要

■ 特長

■ 実験例 ＜データ提供 ： 株式会社 特殊免疫研究所＞

① ヒトiPS細胞の遺伝子ノックイン（エレクトロポレーション法）

図1. エレクトロポレーション・限界希釈後のシングルクローン iPS細胞株の遺伝子型判定（ホモKIサンプル例）

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2101 02 03 04 05 06 07 08 09

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2101 02 03 04 05 06 07 08 09

HindIII で切断されない

EcoRI で切断される

[装置] :

[細胞数] :

[Cas9タンパク質] :

[セレクション方法] :

[薬剤選抜] :

4D-Nucleofector (Lonza)

0.5×106 cells/EP

100 pmol Cas9タンパク質 (15 µg/µl)

限界希釈・ピックアップ

無

Cas9 Nuclease protein NLS (15 µg/µl) を用いて、ヒト末梢血単核球（PBMC）由来

iPS細胞201B7株のノックイン（KI）細胞株を作製した。また、ドナーDNAとして、ＸＸ

遺伝子に存在する制限酵素（HindIII）サイトをEcoRI に置換した150 ntのssODNを

使用した。

ゲノム編集により、HindIIIサイトがある標的配列にノックアウト（KO）、ノックイン（KI）

などの遺伝子変異が生じると、HindIIIでは切断されない。また、ssODNにはEcoRI

サイトを付加しているため、ssODNによるKIに成功するとEcoRIによって切断される

バンドが生じる。よって、図1において両アレルKI（ホモKI）候補は6、16、21レーンの

サンプルである。

● 転写反応からgRNA精製までの必要試薬を含む

起　源

備　考

遺伝子組換え大腸菌

1 EU/μg 未満 （ゲル化比濁法による内在エンドトキシン試験）

10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA,

1 mM DTT, 50％ Glycerol酵素形状

高濃度Cas9タンパク質は、使用の際にグリセロール

やバッファー類の持ち込みを最小限に抑えることが

できます。特にエレクトロポレーションによるCas9

タンパク質の導入など、添加量が制限される場合に

おいて有効です。

高濃度Cas9タンパク質（15 µg/µl）

gRNAgRNA

Cas9

PAM

：変異体候補マウス

：ノックイン候補マウス

：野生型マウス

：マーカー

Wt

M

[注入溶液]：

・Cas9タンパク質(最終濃度30 ng/µl)

・gRNA（最終濃度50 ng/µl）

・100 base ssODN（最終濃度100 ng/µl）

[注入方法]： 細胞質と前核の2step-injection

[マウス系統]： C57BL/6J Jcl

[ssODN]： loxPを含む一本鎖オリゴヌクレオチド

ノックイン細胞株のシークエンス解析はWEBで公開！

101 bp

Cas9 Nuclease protein NLSCas9タンパク質の準備

CUGA® 7 gRNA Synthesis Kitin vitro 転写でのガイドRNA合成キット

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