NAC 2018 Coordination and Collaboration to increase Thai Competitiveness in Aquaculture
การประยกตใชเทคโนโลย RNAi
(Application of RNA interference technology)
ดร.วรรณวมล ศกดเสมอพรหม
หองปฏบตการเทคโนโลยชวภาพกง ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต และ ฏ
หนวยวจยเพอความเปนเลศเทคโนโลยชวภาพกง คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยมหดล
13 2 61 13 มนาคม 2561
• เชอกอโรคกงในประเทศไทยเชอกอโรคกงในประเทศไทย
ไ
แบคทเรยตายดวน
พ.ศ.2555
ไวรสตวแดงดวงขาว
พ.ศ.2537
ไวรสแหลมสงห
ไวรสหวเหลอง
พ ศ 2533
ไวรสแหลมสงห
พ.ศ.2543
ปรสตไมโครสปอรเดย พ.ศ.2533ตงแต พ.ศ.2555
การควบคมโรคกงโดยการยบยงการแสดงออกของยนเปาหมายดวย
อารเอนเอสายค (dsRNA) ผานกระบวนการ RNA interference (RNAi)
**dsRNA ขนตอนการทางาน
กาหนดยนเปาหมายDICER
dsRNA
DNA
ขนตอนการทางาน
mRNA สงเคราะห dsRNARISC
ยนเปาหมายถกทาลายโปรตน
การทดสอบในระดบ
สงเคราะห dsRNA
RISCmRNA
การทดสอบในระดบ
หองปฏบตการ
องคประกอบ RNAi ในกง และยนเปาหมาย
Hairpin RNA
Long dsRNA (250-500 bases)
DICER-1DICER-2
dsRNA cleavage
siRNA
(20-25 bases)
DICER 1
AGO
ยนเปาหมาย
• ยนไวรสRISC
ยนเปาหมาย YHV-protease and LSNV/YHV-RNA
dependent RNA polymerase.
WSSV-VP28, WSSV051
• ยนกง e.g. viral binding protein,
PmRab7
ตวอยางการนา dsRNA มาใชควบคมโรคกง
Itsathitphaisarn et al., 2017
• การใช dsRNA เพอควบคมโรคกง
ในระดบฟารม
การผลต การนาไปใช
กระบวนการผลตทใชตนทนตา กระบวนการนาสง dsRNA เขาส
และไดครงละปรมาณมาก
กงอยางมประสทธภาพ
• การใช dsRNA เพอควบคมโรคกง
ในระดบฟารม
การผลต การนาไปใช
กระบวนการนาสง dsRNA เขาสกระบวนการผลตทใชตนทนตา
กงอยางมประสทธภาพ
และไดครงละปรมาณมาก
• การสงเคราะห dsRNA จากระบบแบคทเรยds
In vivo transcription:
เซลลผผลต – แบคทเรยสายพนธ HT115 บมท 37˚C
˚ ตอเชอทอตราสวน 1:100
16-18 ชวโมงHT115 RNase deficient
เขยาท 37 C จนกวา OD=0.4
กระตนการสราง RNA ดวย IPTG และ
เขยาตอท 37˚ เปนเวลา 4 ชวโมง
การสกด RNA3 5 mg/100 ml การสกด RNA3-5 mg/100 ml
• การสงเคราะห dsRNA จากระบบแบคทเรย
1 2 3 4
ds
1. RNA จากแบคทเรยสายพนธ JM109 ทไดรบการถายพkb
1 2 3 4
ลาสมดทสามารถถอดรหสได dsRNA
2. RNA จากแบคทเรยสายพนธ HT115 (DE3) ทไดรบการ
ไ d RNA1
ถาย พลาสมดทสามารถถอดรหสได dsRNA
3. RNA จากแบคทเรยสายพนธ HT115 (DE3) ทไดรบการ
ถาย พลาสมดทสามารถถอดรหสได dsRNA และยอยดวย0.5
RNase A
4. การยนยนความเปน dsRNA โดยการยอย dsRNA ททาให
บรสทธแลวดวยเอนไซม RNase III ทจาเพราะตอ dsRNA0.1
บรสทธแลวดวยเอนไซม RNase III ทจาเพราะตอ dsRNA
Saksmerprome et al., 2009
• การเลยงแบคทเรยทสามารถสราง
dsRNA ในระดบหองปฏบตการ
BIOTEC, NSTDA Thailand
• การใช dsRNA เพอควบคมโรคกง
ในระดบฟารม
การผลต การนาไปใช
กระบวนการนาสง dsRNA เขาสกระบวนการผลตทใชตนทนตา
กงอยางมประสทธภาพ
และไดครงละปรมาณมาก
• การนา dsRNA ไปใชds
การฉดโดยตรง
• การนา dsRNA ไปใช
ds
• การฉดเขากลามเนอ
สามารถกาหนดปรมาณ dsRNA ทตองการ
ใหได
มความบรสทธสง
เหมาะสาหรบใชทดสอบสมมตฐานใน
งานวจย
ตองเพมขนตอนการสกด ซงจะทาใหเปนการเพมตนทน
ใ ใ ตองใชบคคลทมประสบการณในการดาเนนงาน
ไมสามารถทาไดในระดบฟารม ยกเวนการนาไปใชในพอแมพนธ
Monodon Slow Growth Syndrome (MSGS)
• ไวรสแหลมสงหในกงกลาดา
y ( )
ไวรสแหลมสงหในกงกลาดา
กงไมตดเชอ กงตดไวรสแหลมสงหกงไมตดเชอ
Coefficient of variation > 35%
ตวอยางการใชวธฉดเขากลามเนอในการแกปญหาโรคกง
Saksmerprome et al., 2017
• การนา dsRNA ไปใช
จานวนตวอยางนอยทสดทสามารถพบการตดเชออยางนอย 1 ตว
ds
ขนาดประชากรกง
(ตว)
การระบาดของโรค (%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 20 25 30 35 40
100 96 78 63 52 45 39 34 31 28 25 17 13 10 9 7 6
100 96 78 63 52 45 39 34 31 28 25 17 13 10 9 7 6
1000 258 138 94 71 57 48 41 36 32 29 19 14 11 9 8 6
10000 294 148 98 74 59 49 42 36 32 29 19 14 11 9 8 6
≥100000 298 149 99 74 59 49 42 36 32 29 19 14 11 9 8 6*WIN Episcope 2.0 online at http://www.winepi.net/uk/index.htm
แมกงทไดรบการฉด dsRNA ใหลก PL ทมการ
แมกงทไดรบการฉดนาเกลอ ใหลก PLทมการ
ระบาดของโรค 40%
ระบาดของโรค 4%
ใ ไมสามารถแบงกลมเพอใหไดกลมลกกงปลอดเชอ
ได
แบงกลมลกกงใหมจานวนตอกลมตามตาราง
มอยางนอย 1 กลม เปนกลมทปลอดโรค ทาให
สามารถรกษาสายพนธก งทดไวไดแบบปลอดโรค
Saksmerprome et al., 2017
• การนา dsRNA ไปใชds
ผสมอาหาร
• การนา dsRNA ไปใชds
• การผสมอาหาร
การผสม dsRNA กบ
การผสมแบคทเรยทสามารถ
สราง dsRNA กบอาหารกง ใ
หรอ อาหารกงโดยตรง**ตองการการเพมความเสถยรของ dsRNA
ไ โ**ตองใชแบคทเรยทหยดการทางานแลว หรอตอง
มมาตรการปองกนการปนเปอนสส งแวดลอมเชน การทา encapsulation กบไคโตซาน
หรอ Viral-like particle
ตวอยางการใชวธผสมอาหารในการแกปญหาโรคกงญ
ใ • การใหอาหารกงผสมแบคทเรยทสามารถสราง dsRNA ทจาเพาะตอ
ไวรสแหลมสงห
นาหนกสดทาย (9 สปดาหหลงจากใหอาหาร)
อาหารสตร 1 อาหารสตร 2
อาหารปกต
(6 mg dsRNA/ kg
feed)
(12 mg dsRNA/ kg
feed)
นาหนกเฉลย
(กรม) 20.370 23.588 22.960
SD 6 28 5 05 4 38SD 6.28 5.05 4.38
CV (%) 30.84 21.43 19.07
Saksmerprome et al., 2013
• การนา dsRNA ไปใชds
ใชอาหารมชวต
เปนตวนาพา
• การนา dsRNA ไปใชds
• การใชอาหารมชวตเปนตวนาพาThammasorn et al. 2013
อารทเมยปกต
ใชไ ใ ฟ
Artemia enrichment อารทเมยทกนแบคทเรยสราง dsRNA
สามารถใชไดจรงในระดบฟารม
เปน encapsulation โดยธรรมชาต
รางวลผลงานวจยจากสภาวจยแหงชาต 2560 ระดบดรางวลผลงานวจยจากสภาวจยแหงชาต 2560 ระดบด
สาขาเกษตรและชววทยา
“การประยกตใชเทคโนโลยอารเอนเออนเทอรเฟยแรนซ เพอ
จดการปญหาโตชาในกงกลาดาทเกดจากไวรสแหลมสงห”จดการปญหาโตชาในกงกลาดาทเกดจากไวรสแหลมสงห
ควบคมไวรสแหลมสงหในกง
อยางครบวงจร
• งานวจยทอยในระหวางการดาเนนงาน
• การตดตอสารพนธกรรมในคลอโรพลาสตของสาหรายเซลลเดยว
• การตดตอสารพนธกรรมในคลอโรพลาสตของสาหรายเซลลเดยว
Chlamydomonas
โ• เปนอาหารกงโดยตรง
• ไมมการปนเปอนของยนตานยาปฏชวนะใน
สาหรายลกผสมสาหรายลกผสม
• เปนมตรกบสงแวดลอม
• การใชเทคโนโลย RNAi ในการควบคมโรคท
เกดจากเชอปรสต ไมโครสปอรเดย EHPเกดจากเชอปรสต ไมโครสปอรเดย EHP>> อยในระหวางการทดสอบประสทธภาพของ
dsRNA ทจาเพาะตอ EHP ในการปองกน/รกษาดร. กลยาณ ศรธญญลกษณา-แดงตบ ดร. อนภาพ ประชมวด
ป ป โหองปฏบตการปฏสมพนธระหวางกงและเชอกอโรค
ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต สวทช.
• ขอจากดในการใชเทคโนโลย RNAi ในระดบฟารม
ประเทศไทยยงอยในระหวางการรางพระราชบญญตความปลอดภยทาง ญญ
ชวภาพ ทาใหยงไมมกลไกหรอกฎหมายในการกากบดแลอาหารสตวทม
สวนผสมของ GMOs หรอทสารพนธกรรม
“Monsanto has used RNAi in the development of improved
oils in soybeans and as a new way of protecting plants from
pests that attack the roots of corn plants underground.”
https://monsanto.com/innovations/research-development/articles/rnai-agriculture/
“AquAdvantage salmon is a genetically modified (GM) Atlantic AquAdvantage salmon is a genetically modified (GM) Atlantic
salmon developed by AquaBounty Technologies. It was approved
by US FDA and the Canadian Food Inspection Agency to sell in
market.”
• ความรวมมอ / ทนวจย/
Prof. Saul Purton
• การใชเทคโนโลย RNAi ในระดบฟารม
• เทคโนโลย RNAi มความปลอดภยในการนาไปใชในระดบฟารมหรอไม??
ds-MR-IAGLezer et al., 2015
+ ลกกงตวผ
ทงหมด
• dsRNA ตกคางในตวกงนอยกวา 7 วน และ
หายไปทงหมด หลงจาก 14 วนหายไปทงหมด หลงจาก 14 วน
• การแสดงออกของยนกลบมาเปนปกตหลงจากฉด
กง 28 วน
• ไมมการปนเปอนของอารเอนเอสายคเมอกงเขาส
ระยะเจรญพนธ
• เชอกอโรคในกง
สถานการณโรคกง สงหาคม พ ศ 2560 กรมประมงสถานการณโรคกง สงหาคม พ.ศ.2560, กรมประมง
• เชอกอโรคในกงในประเทศไทยเชอกอโรคในกงในประเทศไทย
แบคทเรยตายดวน
พ.ศ.2555
???ไวรสตวแดงดวงขาว
พ.ศ.2537พ.ศ.2537
ไวรสหวเหลอง ไวรสหวเหลอง
พ.ศ.2533
ไวรสแหลมสงห พ.ศ.2543ปรสตไมโครสปอรเดย
พ.ศ.????พ.ศ.????