NAC 2018 Coordination and Collaboration to increase Thai Competitiveness in Aquaculture

การประยกตใชเทคโนโลย RNAi

(Application of RNA interference technology)

ดร.วรรณวมล ศกดเสมอพรหม

หองปฏบตการเทคโนโลยชวภาพกง ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต และ ฏ

หนวยวจยเพอความเปนเลศเทคโนโลยชวภาพกง คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยมหดล

13 2 61 13 มนาคม 2561

• เชอกอโรคกงในประเทศไทยเชอกอโรคกงในประเทศไทย

ไ

แบคทเรยตายดวน

พ.ศ.2555

ไวรสตวแดงดวงขาว

พ.ศ.2537

ไวรสแหลมสงห

ไวรสหวเหลอง

พ ศ 2533

ไวรสแหลมสงห

พ.ศ.2543

ปรสตไมโครสปอรเดย พ.ศ.2533ตงแต พ.ศ.2555

การควบคมโรคกงโดยการยบยงการแสดงออกของยนเปาหมายดวย

อารเอนเอสายค (dsRNA) ผานกระบวนการ RNA interference (RNAi)

**dsRNA ขนตอนการทางาน

กาหนดยนเปาหมายDICER

dsRNA

DNA

ขนตอนการทางาน

mRNA สงเคราะห dsRNARISC

ยนเปาหมายถกทาลายโปรตน

การทดสอบในระดบ

สงเคราะห dsRNA

RISCmRNA

การทดสอบในระดบ

หองปฏบตการ

องคประกอบ RNAi ในกง และยนเปาหมาย

Hairpin RNA

Long dsRNA (250-500 bases)

DICER-1DICER-2

dsRNA cleavage

siRNA

(20-25 bases)

DICER 1

AGO

ยนเปาหมาย

• ยนไวรสRISC

ยนเปาหมาย YHV-protease and LSNV/YHV-RNA

dependent RNA polymerase.

WSSV-VP28, WSSV051

• ยนกง e.g. viral binding protein,

PmRab7

ตวอยางการนา dsRNA มาใชควบคมโรคกง

Itsathitphaisarn et al., 2017

• การใช dsRNA เพอควบคมโรคกง

ในระดบฟารม

การผลต การนาไปใช

กระบวนการผลตทใชตนทนตา กระบวนการนาสง dsRNA เขาส

และไดครงละปรมาณมาก

กงอยางมประสทธภาพ

• การใช dsRNA เพอควบคมโรคกง

ในระดบฟารม

การผลต การนาไปใช

กระบวนการนาสง dsRNA เขาสกระบวนการผลตทใชตนทนตา

กงอยางมประสทธภาพ

และไดครงละปรมาณมาก

• การสงเคราะห dsRNA จากระบบแบคทเรยds

In vivo transcription:

เซลลผผลต – แบคทเรยสายพนธ HT115 บมท 37˚C

˚ ตอเชอทอตราสวน 1:100

16-18 ชวโมงHT115 RNase deficient

เขยาท 37 C จนกวา OD=0.4

กระตนการสราง RNA ดวย IPTG และ

เขยาตอท 37˚ เปนเวลา 4 ชวโมง

การสกด RNA3 5 mg/100 ml การสกด RNA3-5 mg/100 ml

• การสงเคราะห dsRNA จากระบบแบคทเรย

1 2 3 4

ds

1. RNA จากแบคทเรยสายพนธ JM109 ทไดรบการถายพkb

1 2 3 4

ลาสมดทสามารถถอดรหสได dsRNA

2. RNA จากแบคทเรยสายพนธ HT115 (DE3) ทไดรบการ

ไ d RNA1

ถาย พลาสมดทสามารถถอดรหสได dsRNA

3. RNA จากแบคทเรยสายพนธ HT115 (DE3) ทไดรบการ

ถาย พลาสมดทสามารถถอดรหสได dsRNA และยอยดวย0.5

RNase A

4. การยนยนความเปน dsRNA โดยการยอย dsRNA ททาให

บรสทธแลวดวยเอนไซม RNase III ทจาเพราะตอ dsRNA0.1

บรสทธแลวดวยเอนไซม RNase III ทจาเพราะตอ dsRNA

Saksmerprome et al., 2009

• การเลยงแบคทเรยทสามารถสราง

dsRNA ในระดบหองปฏบตการ

BIOTEC, NSTDA Thailand

• การใช dsRNA เพอควบคมโรคกง

ในระดบฟารม

การผลต การนาไปใช

กระบวนการนาสง dsRNA เขาสกระบวนการผลตทใชตนทนตา

กงอยางมประสทธภาพ

และไดครงละปรมาณมาก

• การนา dsRNA ไปใชds

การฉดโดยตรง

• การนา dsRNA ไปใช

ds

• การฉดเขากลามเนอ

สามารถกาหนดปรมาณ dsRNA ทตองการ

ใหได

มความบรสทธสง

เหมาะสาหรบใชทดสอบสมมตฐานใน

งานวจย

ตองเพมขนตอนการสกด ซงจะทาใหเปนการเพมตนทน

ใ ใ ตองใชบคคลทมประสบการณในการดาเนนงาน

ไมสามารถทาไดในระดบฟารม ยกเวนการนาไปใชในพอแมพนธ

Monodon Slow Growth Syndrome (MSGS)

• ไวรสแหลมสงหในกงกลาดา

y ( )

ไวรสแหลมสงหในกงกลาดา

กงไมตดเชอ กงตดไวรสแหลมสงหกงไมตดเชอ

Coefficient of variation > 35%

ตวอยางการใชวธฉดเขากลามเนอในการแกปญหาโรคกง

Saksmerprome et al., 2017

• การนา dsRNA ไปใช

จานวนตวอยางนอยทสดทสามารถพบการตดเชออยางนอย 1 ตว

ds

ขนาดประชากรกง

(ตว)

การระบาดของโรค (%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 20 25 30 35 40

100 96 78 63 52 45 39 34 31 28 25 17 13 10 9 7 6

100 96 78 63 52 45 39 34 31 28 25 17 13 10 9 7 6

1000 258 138 94 71 57 48 41 36 32 29 19 14 11 9 8 6

10000 294 148 98 74 59 49 42 36 32 29 19 14 11 9 8 6

≥100000 298 149 99 74 59 49 42 36 32 29 19 14 11 9 8 6*WIN Episcope 2.0 online at http://www.winepi.net/uk/index.htm

แมกงทไดรบการฉด dsRNA ใหลก PL ทมการ

แมกงทไดรบการฉดนาเกลอ ใหลก PLทมการ

ระบาดของโรค 40%

ระบาดของโรค 4%

ใ ไมสามารถแบงกลมเพอใหไดกลมลกกงปลอดเชอ

ได

แบงกลมลกกงใหมจานวนตอกลมตามตาราง

มอยางนอย 1 กลม เปนกลมทปลอดโรค ทาให

สามารถรกษาสายพนธก งทดไวไดแบบปลอดโรค

Saksmerprome et al., 2017

• การนา dsRNA ไปใชds

ผสมอาหาร

• การนา dsRNA ไปใชds

• การผสมอาหาร

การผสม dsRNA กบ

การผสมแบคทเรยทสามารถ

สราง dsRNA กบอาหารกง ใ

หรอ อาหารกงโดยตรง**ตองการการเพมความเสถยรของ dsRNA

ไ โ**ตองใชแบคทเรยทหยดการทางานแลว หรอตอง

มมาตรการปองกนการปนเปอนสส งแวดลอมเชน การทา encapsulation กบไคโตซาน

หรอ Viral-like particle

ตวอยางการใชวธผสมอาหารในการแกปญหาโรคกงญ

ใ • การใหอาหารกงผสมแบคทเรยทสามารถสราง dsRNA ทจาเพาะตอ

ไวรสแหลมสงห

นาหนกสดทาย (9 สปดาหหลงจากใหอาหาร)

อาหารสตร 1 อาหารสตร 2

อาหารปกต

(6 mg dsRNA/ kg

feed)

(12 mg dsRNA/ kg

feed)

นาหนกเฉลย

(กรม) 20.370 23.588 22.960

SD 6 28 5 05 4 38SD 6.28 5.05 4.38

CV (%) 30.84 21.43 19.07

Saksmerprome et al., 2013

• การนา dsRNA ไปใชds

ใชอาหารมชวต

เปนตวนาพา

• การนา dsRNA ไปใชds

• การใชอาหารมชวตเปนตวนาพาThammasorn et al. 2013

อารทเมยปกต

ใชไ ใ ฟ

Artemia enrichment อารทเมยทกนแบคทเรยสราง dsRNA

สามารถใชไดจรงในระดบฟารม

เปน encapsulation โดยธรรมชาต

รางวลผลงานวจยจากสภาวจยแหงชาต 2560 ระดบดรางวลผลงานวจยจากสภาวจยแหงชาต 2560 ระดบด

สาขาเกษตรและชววทยา

“การประยกตใชเทคโนโลยอารเอนเออนเทอรเฟยแรนซ เพอ

จดการปญหาโตชาในกงกลาดาทเกดจากไวรสแหลมสงห”จดการปญหาโตชาในกงกลาดาทเกดจากไวรสแหลมสงห

ควบคมไวรสแหลมสงหในกง

อยางครบวงจร

• งานวจยทอยในระหวางการดาเนนงาน

• การตดตอสารพนธกรรมในคลอโรพลาสตของสาหรายเซลลเดยว

• การตดตอสารพนธกรรมในคลอโรพลาสตของสาหรายเซลลเดยว

Chlamydomonas

โ• เปนอาหารกงโดยตรง

• ไมมการปนเปอนของยนตานยาปฏชวนะใน

สาหรายลกผสมสาหรายลกผสม

• เปนมตรกบสงแวดลอม

• การใชเทคโนโลย RNAi ในการควบคมโรคท

เกดจากเชอปรสต ไมโครสปอรเดย EHPเกดจากเชอปรสต ไมโครสปอรเดย EHP>> อยในระหวางการทดสอบประสทธภาพของ

dsRNA ทจาเพาะตอ EHP ในการปองกน/รกษาดร. กลยาณ ศรธญญลกษณา-แดงตบ ดร. อนภาพ ประชมวด

ป ป โหองปฏบตการปฏสมพนธระหวางกงและเชอกอโรค

ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต สวทช.

• ขอจากดในการใชเทคโนโลย RNAi ในระดบฟารม

ประเทศไทยยงอยในระหวางการรางพระราชบญญตความปลอดภยทาง ญญ

ชวภาพ ทาใหยงไมมกลไกหรอกฎหมายในการกากบดแลอาหารสตวทม

สวนผสมของ GMOs หรอทสารพนธกรรม

“Monsanto has used RNAi in the development of improved

oils in soybeans and as a new way of protecting plants from

pests that attack the roots of corn plants underground.”

https://monsanto.com/innovations/research-development/articles/rnai-agriculture/

“AquAdvantage salmon is a genetically modified (GM) Atlantic AquAdvantage salmon is a genetically modified (GM) Atlantic

salmon developed by AquaBounty Technologies. It was approved

by US FDA and the Canadian Food Inspection Agency to sell in

market.”

• ความรวมมอ / ทนวจย/

Prof. Saul Purton

• การใชเทคโนโลย RNAi ในระดบฟารม

• เทคโนโลย RNAi มความปลอดภยในการนาไปใชในระดบฟารมหรอไม??

ds-MR-IAGLezer et al., 2015

+ ลกกงตวผ

ทงหมด

• dsRNA ตกคางในตวกงนอยกวา 7 วน และ

หายไปทงหมด หลงจาก 14 วนหายไปทงหมด หลงจาก 14 วน

• การแสดงออกของยนกลบมาเปนปกตหลงจากฉด

กง 28 วน

• ไมมการปนเปอนของอารเอนเอสายคเมอกงเขาส

ระยะเจรญพนธ

• เชอกอโรคในกง

สถานการณโรคกง สงหาคม พ ศ 2560 กรมประมงสถานการณโรคกง สงหาคม พ.ศ.2560, กรมประมง

• เชอกอโรคในกงในประเทศไทยเชอกอโรคในกงในประเทศไทย

แบคทเรยตายดวน

พ.ศ.2555

???ไวรสตวแดงดวงขาว

พ.ศ.2537พ.ศ.2537

ไวรสหวเหลอง ไวรสหวเหลอง

พ.ศ.2533

ไวรสแหลมสงห พ.ศ.2543ปรสตไมโครสปอรเดย

พ.ศ.????พ.ศ.????