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DIVERSITY and ABUNDANCE of GRAM POSITIVE BACTERIA in a TIDAL FLAT ECOSYSTEMH STEVENS T BRINKHOFF B RINK J VOLLMERS 2007
Présenté par :
DIAGNE AhmedMaster 1 Biologie et Ecologie marine
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Objectif de l’étude
• Montrer l’abondance et la diversité des bactéries gram+ dans un écosystème sous influence de marée.
• Différence entre les bactéries gram+ à affinité marine et celles à affinité d’eau douce par analyse DGGE.
• Montrer que les bactéries gram+ sont indigènes et non introduites à ce milieu .
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Techniques utilisées
• Isolement des bactéries par dilution avec différents substrats supplémentaires au milieu de culture.
• L’hybridation Fluorescente in situ(Fish)→ utilise des sondes fluorescentes qui reconnaissent des taxons précis (classe,genre ou espèce).
• Electrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE) afin de séparer les molécules d’acides nucléiques par leur migration sous l‘action du dénaturant.
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Isolement des bactéries par dilution avec différents substrats supplémentaires dans le milieu de culture(eau de
mer)
• En mai : 63 isolats dont 17 sont gram+
►Actinobactéria (gram+) 27%
►Proteobactéria (alpha et gamma) 65%
Ce résultat chiffré met en évidence l’abondance des bactéries gram+ dans cet environnement côtier.
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Affiliation phylogénétique de l’Actinobacteria basée sur les séquences des gènes codant pour l’ARNr 16S
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Affiliation phylogénétique de l’Actinobacteria basée sur les séquences des gènes codant pour l’ARNr 16S
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Analyse de l’arbre phylogénétique
Les séquences sont principalement groupées dans six familles de bactéries gram+.
→ Microbacteriaceae : groupe I ,II
→ Micrococcaceae : groupe III IV V VI
→ Nocardiaceae :groupe VII VIII
→ Pseudonocardiaceae : groupe IX
→ Nocardiodacae : groupe X
→ Baccili : groupe XI XII XIII XIV XV
►La diversité des bactéries gram+ est prouvée par les différents groupes de famille représentés dans l’arbre phylogénétique
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L’analyse du DGGE des modèles de bandes d’actinobacteria-spécifique de la libre vie(LF) et des communautés associées au particules (PA) collectés aux stations 1-5 à proximité de la station B de la mer de Wadden
Les échantillons marins sont semblables par la Bande DG3 et différents de ceux de l’eau douce par la bande DG1.
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Croissance des bactéries gram+ dans divers gamme de salinité (1‰ – 45 ‰)
→ La majorité des groupes de bactéries gram+ semble bien croître différemment dans les gammes de salinité qui avoisinent ce milieu côtier.
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Mise en évidence du statut indigène des bactéries gram+ dans l’environnement marin
La communauté bactérienne gram+ semble être indigène à cet environnement marin par :
►l’Adaptation des bactéries gram+ aux conditions de salinité ambiante de la mer de Wadden.
►Leur milieu de vie est caractérisé par une forte entrée de nutrients, dynamique de salinité, lumière, oxygène et température (habitat exceptionnel).
►Différence entre les bactéries gram+ marines et celles d’eau douce.
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Remarques
• La diversité bactérienne gram+ que reflète l’arbre phylogénétique est peu fiable car non vérifiée par la méthode de Bootstrap.
• Cette diversité est plus importante que celle observée par les études antérieures d’autres auteurs(Suzuki et al,1997).
• Le statut d’indigène devrait tenir compte de l’apport des marées qui pourrait influencer le milieu.
• Faire une étude se rapportant à l’effet des marées sur la composition spécifique de ce milieu côtier.
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Merci pour votre attention
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Localisation de la mer de Wadden
N↑
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Les endroits(A et B) de collecte des échantillonsstation1 conduite d’eau doucestation2-5 sont marines
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Procédures expérimentales de certaines techniques utilisées
• Lieu de collecte des échantillons :– Réalisée le 27 mai et le 25 octobre 1999 dans la mer de wadden Est
Frisian,Allemagne– Endroits de collecte A ( 53°37’N ; 07°08’E ) B (53°42’N ; 07°43’ E )
► Isolement des bactéries :
l’inoculum est 1ml d’eau
une série de 10 dilutions est effectuée
rajout de substrat supplémentaire :Agar ,alginate, caséine , cellulose, chitine, laminarin , (Difco,Allemagne)
croissance par turbidité vérifiée au microscope
diverses bactéries ont été isolées
la pureté des isolats est examinée par analyse du DGGE
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Amplification des gènes ribosomiaux 16S par la méthode du PCR
• Utilisation des amorces : S-C-Act-235-a-S-20 et S-C-Act-878-a-A-19(stach et al,2003)
• La chromatographie a été rajoutée à l’analyse du DGGE (Muyzer et al, 1998)
• Dénaturation prolongée de 40 à 60 secondes entre 67°C et 72°C.
• Avec le PCR (Polymérase Chain Réaction) les produits étaient bien amplifiés et épurés (Sambrook et al, 1989)
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Analyse séquentielle de l’arbre phylogénétique
• L’identification des séquences est réalisée par la comparaison avec les séquences déjà connues.
• l’analyse phylogénétique par le logiciel ARB(Ludwig et al,2001)
• Le calcul des arbres n’a considéré que les ordres à point d’ébullition de 1300.
• Les ordres les plus courts ont été rajoutés à l’arbre final